BAB I

PENDAHULUAN1.1. LATAR BELAKANG

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberap macam. Pada bentuk basil, pembagiannya meliputi basil tunggal, diplobasil, dan triptobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus ( satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (berbentuk mirip buah anggur). Khusus pada spirilum hanya terbagi menjadi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.

Klasifikasi bakteri didasarkan pada kesamaan atau kemiripan sifat-sifat spesifik dan unik yang dimiliki bakteri. Suatu penataan klasifikasi secara sistematik ke dalam kelompok-kelompok disebut taksonomi. Bakteri diklasifikasikan berdasarkan sistem taksonomi seperti yang dikembangkan oleh Carolus Linnaeus untuk tanaman dan binatang pada tahun 1735.

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.

Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel.

1.2. TUJUAN PRAKTIKUM

Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari beberapa teknik pewarnaan yang dapat digunakan untuk identifikasi dan pengelompokkan mikroorganisme. Selain itu, praktikum ini bertujuan untuk mengamati dan menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah mikroskop.

1.3. MANFAAT PRAKTIKUM

Kegiatan praktikum ini diharapkan membuat praktikan dapat memahami teknik pewarnaan bakteri agar dapat digunakan untuk praktikum selainnya. Selain itu, diharapkan praktikan dapat mengamati dan menganalisis hasil reaksi pewarnaan bakteri di bawah mikroskop.

1

BAB II

STUDI PUSTAKA1.1. TEKNIK PEWARNAAN

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008)

Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora.

 Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengamati hal tersebut maka dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi. (Rizki, 2008)

Zat-zat warna bergabung secara kimiawi dengan protoplasma bakteri; bila sel belum mati, proses pewarnaan yang akan mematikannya. Jadi proses pewarnaan memang suatu proses yang drastis dan menyebabkan perubahan yang tidak alamiah.

Zat warna yang biasa dipakai adalah garam. Zat warna basa terdiri atas kation yang berwarna dengan anion yang tidak berwarna (misalnya biru metilen klorida), zat warna asam adalah sebaliknya (misalnya natrium eosinat). Sel bakteri kaya akan asam nukleat, mengandung muatan negatif dalam gugus fosfatnya. Muatan negative ini bergabung dengan zat warna basa yang bermuatan positif. Zat warna asam tidak mewarnai sel bakteri, karena itu dpaat digunakan untuk mewarnai latar belakang sehingga berwarna kontras.

Zat warna basa mewarnai sel bakteri secara merata kecuali bila RNA sitoplasma dirusak terlebih dahulu. Namun, teknik pewarnaan khusus dapat digunakan untuk membedakan flagel, simpai, dinding sel, selaput sel, granula , inti dan spora.

2.1.1. MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN

Pewarnaan mikroba dilakukan untuk mempelajari morfologi mikroba meliputi bentuk dan rangkainnya, mempelajari struktur-struktur khusus yang

2

dimiliki mikroba, dan untuk membedakan bakteri-bakteri ke dalam kelompok-kelompok yang berguna untuk klasifikasi dan diagnosis. Pewarnaan mikroba dilakukan dengan menambahkan satu atau lebih pewarna dengan teknik tertentu kepada sel mikroba yang diuji. Pewarna (dye) didefinisikan sebagai suatu senyawa organic yang mengandung suatu cincin benzene dan suatu gugus kromofor dan auksokrom. Kemampuan suatu pewarna untuk terikat ke komponen sel makromolekul (seperti protein atau asam nukleat) tergantung pada muatan elektrik yang ditemukan pada kromogennya. Zat-zat warna bergabung secara kimiawi dengan protoplasma bakteri, bila sel belum mati, proses pewarnaan yang akan mematikannya. Jadi proses pewarnaan memang suatu proses yang drastic dan menyebabkan perubahan yang tidak alamiah. Beberapa hal berikut yang harus diperhatikan untuk memperoleh hasil pewarnaan yang baik :

o Umur biakan sebaiknya 18-24 jam, kecuali bakteri Mycobacterium yang tumbuh sangat lambat karena morfologi dan struktur bakteri dapat mengalami perubahan jika biakan bakteri berumur lebih dari 24 jam.

o Zat warna yang digunakan harus zat warna dengan kualitas yang baik.o Sediaan bakteri yang disebarkan di atas gelas preparat harus

sedemikian tipis sehingga dapat memperlihatkan morfologi bakteri setelah diwarnai.

2.1.1.1. Jenis Pewarna berdasarkan muatan alaminya 2.1.1.1.1. Pewarna Asam

Pewarna ini jika terionisasi memberikan muatan negatif atau anionik pada kromogen, akan berikatan kuat dengan komponen sel yang bermuatan positif. Zat warna asam tidak mewarnai sel bakteri, karena itu untuk dapat digunakan untuk mewarnai bahan latar latar belakang sehingga berwarna kontras. Biasanya pewarna asam memiliki gugus karboksil dan fenolik hidroksil.Contoh : eosin, asam pikrat, asam Fuchsin.

2.1.1.1.2. Pewarna Basa Pewarna ini jika terionisasi memberikan muatan positif/kationik pada kromogen, akan mewarnai sel bakteri secara merata kecuali RNA sitoplasma dirusak terlebih dahulu. Biasanya pewarna basa berupa garam klorida atau nitrogen pentavalen.Contoh : metilen biru, basa Fuchsin, Kristal violet, safranin, malachite hijau.

2.1.1.2. Jenis Pewarna berdasarkan tujuan pewarnaan 2.1.1.2.1. Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis zat warna pada sediaan bakteri di gelas preparat yang telah difiksasi atau direkatkan.Pewarnaan sederhana digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis (kokus, basilus, spiral) dan susunannya (rantai, kluster, pasangan atau tetrad). Zat warna yang digunakan adalah

3

metilen blue, gentia violet, dan karbol fuksin. Waktu paparan antara pewarna dengan sel bakteri untuk tiap pewarna berbeda, misalnya karbol fuchsin butuh 15-30 detik, Kristal violet 60 detik dan metilen biru 1-2 menit.

2.1.1.2.2. Pewarnaan Diferensial Teknik pewarnaan diferesial menggunakan lebih dari satu macam zat warna, yang bertujuan untuk klasifikasi ke dalam kelompok-kelompok (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam) dan untuk visualisasi struktur (pewarnaan flagella, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, pewarnaan inti).

2.1.1.2.3. Pewarnaan Gram Pewarnaan ini ditujukan untuk mengklasifikasi ke dalam dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negatif. Pewarnaan gram merupakan salah satu pewarnaan diferensial di mana dibutuhkan lebih dari satu pewarna untuk mewarnai bakteri. Pewarnaan pertama disebut pewarna primer yang digunakan untuk mewarnai seluruh sel. Reagen yang ditambahkan yaitu zat penghilang warna. Tergantung dari komponen selular sel bakteri, penghilang warna ini dapat menghilangkan atau tidak menghilangkan pewarna primer. Pewarna akhir ialah pewarna tandingan yang memiliki warna kontras terhadap pewarna primer. Cara pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian zat warna dasar, kristal ungu. Kemudian diberikan larutan iodium sampai semua bakteri berwarna biru. Kemudian sel diberi alkohol. Sel gram positif akan mempertahankan kompleks Kristal ungu-iodium, dan tetap berwarna biru, sedangkan sel gram negative akan sama sekali hilang warnanya oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, zat warna kontras (misalnya zat warna merah safranin) dituangkan sehingga sel-sel gram negative yang telah kehilangan warna akan mendapatkan warna kontras, sekarang sel-sel gram positif tampak ungu.

2.1.1.2.4. Pewarnaan Tahan Asam Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol fuhsin (fuhsin basa yang dilarutkan dalam suatu campuran fenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam hidroklorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol-fuhsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam-alkohol, dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobacterium dan beberapa aktinomisetes yang serumpun) berwarna merah, yang lain akan berwarna sesuai warna kontras. Pewarnaan tahan asam terdiri atas pewarnaan Ziehl Neelsen dan pewarnaan Kinyoun Gabbett.

2.1.1.2.5. Pewarnaan FlagelTeknik pewarnaan yang sering digunakan untuk mewarnai flagel bakteri ialah pewarnaan Gray. Pada pewarnaan ini, mordan (zat

4

pengikat warna) digunakan untuk meningkatkan afinitas flagel terhadap zat warna dan memperbesar diameter flagel. Suspensi garam asam tanat dapat memperbesar flagel dan dinding sel sehingga flagel dapat dilihat dengan mudah di bawah mikroskop biasa ketika diwarnai dengan karbol fuksin.

2.1.1.2.6. Pewarnaan SporaPewarnaan spora bertujuan untuk membedakan antara spora bakteri dengan bentuk sel vegetative bakteri serta mengetahui letak spora di dalam sel bakteri. Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspense sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relative tidak dapat ditembus, tetapi zat warna dapat menembusnya setelah sediaan dipanaskan. Sifat tidak dqapat ditembus ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna vegetative. Sel vegetative akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai degan hijau malakit atau karbol fuhsin.

2.1.1.2.7. Pewarnaan KapsulPewarnaan kapsul bertujuan untuk membedakan kapsul dari sel bakteri. Pewarnaan kapsul disebut juga pewarnaan negatif, karena materi yang akan dilihat (kapsul) tidak diwarnai, yang diwarnai adalah daerah latar belakang dan badan sel bakteri. Bakteri akan tampak terang dengan latar belakang warna hitam. Zat warna yang dipakai adalah tinta cina. Kapsul tidak dapat diwarnai dengan pewarna asam maupun basa, karena kapsul adalah materi yang tidak memiliki muatan. Kapsul tidak dimiliki oleh semua bakteri. Bakteri yang memiliki kapsul umumya adalah yang memiliki pathogenesis yang tinggi, di mana kapsul tersebut melindungi sel bakteri dari fagositosis sel inang. Pewarnaan kapsul lebih sulit dibandingkan pewarnaan yang lain, karena kapsul adalah materi yang larut air sehingga mungkin dapat hilang dengan pembilasan yang berlebihan. Setelah diwarnai, kapsul akan tampak sebagai daerah bening yang melindungi sel bakteri. Sebelum dilakukan pewarnaaan dan diamati, sel bakteri harus difiksasi atau direkatkan dulu pada object glass. Fiksasi bertujuan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat merusak struktur sel sehingga sel tidak berubah saat diwarnai dan diamati. Fiksasi dapat dilakukan secara fisika (pemanasan) dan kimia (menggunakan senyawa kimia yang dapat berpenetrasi ke dalam komponen seluler dan menjadikan sel tersebut tidak aktif bdan tidak bergerak).

5

2.2. Klasifikasi bakteri 2.2.1. Eschericia coli

Gambar 2.2.1.1. Bakteri Escherichia coli

Kingdom : Bakteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escheriachia Spesies : E.coli

Escherichia coli biasanya hidup di dalam intestinum pada manusia ataupun hewan, memiliki gram negatif, berbentuk batang pendek, memiliki flagel dan fakultatif anaerob. Ukurannya 0,4-0,7 µm x 1,4 µm. Merupakan makhluk prokariot. Pada kondisi tertentu bisa menjadi pathogen atau dapat menyebabkan penyakit. Dan bakteri ini juga dapat menyebabkan keracunan makanan, dan yang paling sering adalah dapat menyebabkan diare serta beberapa penyakit yang sejenis (Anonim, 2008).

2.2.2. Bacillus subtilis

Gambar 2.2.2.1. Bakteri Bacillus subtilis

6

Domain : Bacteria Phylum : Firmicutes Class : Bacilli Order : Bacillales Family : Bacillaceae Genus : BacillusSpecies : B. subtilis

Bacillus subtilis selnya berbentuk basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Sebagian motil dan adapula yang non motil. Semua membentuk endospora yang berbentuk bulat dan oval.  Baccillus subtlis merupakan jenis kelompok bakteri termofilik yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45 °C – 55 °C dan mempunyai pertumbuhan suhu optimum pada suhu 60 °C – 80 °.

2.2.3. Klebsiella pneumonia

Gambar 2.2.3.1. Bakteri Klebsiella pneumoniae

Kingdom :  BacteriaPhylum :  ProteobacteriaClassis :  Gamma ProteobacteriaOrde : EnterobacterialesFamily : EnterobacteriaceaeGenus : KlebsiellaSpecies : K. pneumonia

Klebsiella pneumonia sering pula disebut bakteri Friedlander. Klebsiella pneumonia adalah bakteri Gram negatif yang berbentuk batang (basil). Klebsiella pneumonia tergolong bakteri yang tidak dapat melakukan pergerakan (non motil). Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, Klebsiella pneumonia merupakan bakteri fakultatif

7

anaerob.tergolong bakteri yang tidak dapat melakukan pergerakan (non motil). Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, Klebsiella pneumonia merupakan bakteri fakultatif anaerob.

2.2.4. Staphylococcus aureus

Gambar 2.2.4.1 Bakteri Staphylococcus aureus

Domain : BacteriaKerajaan : EubacteriaFilum : FirmicutesKelas : BacilliOrdo : BacillalesFamili : StaphylococcaceaeGenus : StaphylococcusSpesies : S. aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm.S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37oC dengan waktu pembelahan 0,47 jam. S. aureus merupakan mikroflora normal manusia. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernapasan atas dan kulit

8

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN3.1. ALAT DAN BAHAN

Dalam kegiatan praktikum ini, alat yang digunakan adalah tabung reaksi, object glass dan cover glass, sengekelit, pembakar Bunsen, pipet tetes, penjepit kayu, kertas saring, kertas lensa. Adapun bahan yang digunakan dalam kegiatan praktikum ini bahan biakan bakteri (Eschericihia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,Klebsiella pneumoniae), pewarna Kristal Violet, pewarna Karbol Fuchsin, pewarna metilen blue, Larutan Lugol, Larutan Alkohol, tinta cina, larutan NaCl 0,85%, air suling (aquadest).

3.2. CARA KERJA

Kegiatan praktikum ini dibagi dalam empat prosedur kerja berdasarkam teknik pewarnaannya dan teknik penyiapan preparat apusan bakteri , Yang pertama adalah teknik penyiapan preparat apusan bakteri. Pertama-tama siapkan object glass yang bersih, lewatkan terlebih dahulu di atas nyala api pembakar Bunsen untuk menghilangkan lemak-lemak yang masih menempel. Jarum Ose diflambir atau disterilkan dengan memijarkan bagian kawat logam di atas nyala api pembakar Bunsen sampai merah membara), biarkan hingga dingin. Bekerjalah di daerah aseptik dengan radius ± 20 cm dari pembakar Bunsen. Untuk membuat preparat apusan yang berasal dari biakan cair, ambil satu sengkelit biakan, kemudian tempatkan pada permukaan kaca benda yang bersih, kemudian ambil satu biakan dari agar miring dan suspensikan pada air suling yang ada pada permukaan object glass tersebut, sebelumnya teteskan satu tetes larutan NaCl 0,85% fisiologis steril pada permukaan object glass steril, kemudian ambil sengkelit satu sengkelit biakan dari agar miring dan suspensikan pada larutan NaCl yang ada di permukaan object glass tersebut. Kemudian ratakan biakan pada permukaan kaca benda dengan cara memutar jarum Ose dengan putaran yang searah hingga diperoleh apusan yang tipis. Rekatkan (fiksasi) apusan bakteri dengan cara melewatkan preparat di atas nyala api pembakar Bunsen, hingga preparat membentuk suatu lapisan tipis yang merekat pada object glass. Hindari pemanasan berlebihan karena akan merusak struktur bakteri.

Yang kedua adalah teknik pewarnaan sederhana. Pertama-tama, preparat yang telah dikeringkam dam dofiksasi diletakkan di object glass, tetesi preparat dengan zat warna yang tekah disaring, misalnya: air, karbol fuchsin, metilen blue. Diamkan selama 30-60 detik, kemudian bilas preparat dengan air mengalir. Jika masih basah, preparat dikeringkan di anatra dua kertas saring. Amati hasil pewarnaan. pewarnaan sederhana.

Yang ketiga adalah pewarnaan Gram. Pertama-tama preparat yang telah dikeringkan dan difiksasi (direkatkan) ditetesi dengan karbol gentian violet (pewarna primer), diamkan selama 5 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir, kemudian

9

tambahkan larutan lugol, diamkan 45-60 detik. Kemudian cuci preparat lagi dengan air mengalir. Teteskan preparat dengan alkolhol 96% sambil digoyang-goyang selama 30 detik atau sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur mengalir dari preparat. Cuci preparat dengan air mengalir, kemudia tetesi dengan karbol Fuchsin, diamkan selama 1-2 menit. Zat warna dibuang, bilas dengan air keran, keringkan di antara kertas saring atau di udara. Amati hasil pewarnaan.

Yang keempat adalah pewarnaan spora. Buat suspense pekat bakteri 0,5 mL air garam 0,85% dalam tabung reaksi. Tambahkan karbol fuchsin sama banyaknya dengan NaCl tadi (0,5 mL). Panaskan di atas api kecil selama 6 menit atau dengan waterbath bersuhu 800C selama 10 menit. Buat preparat dengan menuangkan suspense di atas, keringkan dengan melalukan preparat di atas pembakar Bunsen. Tetesi dengan H2SO4 1% untuk membuang zat warna yang berlebihan selama 1-3 detik. Bilas dengan air keran, tuangi air metilen blue diamkan selama 2-4 menit. Buang zat warna, bilas dengan air mengalir, keringkan di atas kertas saring atau di udara. Amati hasil pewarnaan.

Yang terakhir adalah pewarnaan kapsul. Pertama-tama teteskan NaCl 0,85% di atas object glasss, kemudian inokulasikan 1 mata sengkelit secukupnya biakan bakteri, campurkan. Letakkan di sebelah campuran tadi 1 tetes tinta cina. Campur tinta warma dengan bakteri, hapuskan dengan menggunakan object glass, fiksasi di atas api. Tuangi karbol fuchsin yang telah ditipiskan 1-10, panaskan 1-2 detik. Zat warna dibuang, bilas preparat dengan air mengalir. Keringkan di antara kertas saring atau udara. Amati hasil pewarnaan.

10

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN1.1. HASIL PENGAMATAN

Jenis pewarnan

Gambar Keterangan

Pewarnaan sederhana

Zat warna : karbol FuchsinSpesies : Escherichia coliBentuk : batangRangkaian : tersebar

Zat warna : metilen blueSpesies : Escherichia coliBentuk : batangRangkaian : menyebar

Pewarnaan Gram

Spesies : Staphylococcus aureusBentuk : bulatRangkaian : tunggal, pasangan, tandan anggurWarna : biru keunguanGram : positif (+)

11

Spesies : Escherichia coliBentuk : batangRangkaian : tunggal, pasanganWarna : merah mudaGram : negative (-)

Pewarnaan spora

Zat warna : karbol Fuchsin&Metilen blueSpesies : Bacillus subtilisBentuk : basil (batang)Rangkaian : pasangan, rantai

Pewarnaan kapsul

Zat warna : karbol FuchsinSpesies : Klebsiella pneumoniae

1.2. PEMBAHASAN

Pada kegiatan praktikum ini, yang harus dipahami benar adalah bagaimana praktikan dapat melakukan teknik pewarnaan bakteri dengan benar sesuai prosedur yang ada. Sebelum memulai kegiatan praktikum ini, praktikan diwajibkan untuk merendam tangan dalam larutan antiseptis, memakai masker dan nursecap . Hal ini dimaksudkan agar bagain tubuh kita tidak menjadi kontaminan ataupun terkontaminan oleh mikroorganisme yang digunakan. Prinsip kerja aseptis adalah prinsip kerja yang wajib dilakukan pada laboratorium mikrobiologi untuk mencegah kontaminasi.

Sebelum melakukan teknik pewarnaan, hendaknya praktikan mengerti cara memfiksasi bakteri di atas object glass, sebab dalam teknik pewarnaan bakteri harus

12

difiksasi terlebih dahulu. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api berlebihan agar struktur bakteri tidak rusak.

Ada empat teknik pewarnaan yang dilakukan dalam praktikum ini. Yang pertama adalah pewarnaan sederhana, pada teknik pewarnaan ini praktikan menggunakan spesies bakteri Escherichia coli dan dua jenis pewarna yang berbeda yaitu metilen blue dan karbol fuchsin. Escherichia coli berbentuk batang pendek dan susunannya dapat tunggal atau berpasangan. KDapat dilihat pada hasil pengamatan bahwa bakteri E. coli ini lebih jelas terlihat dengan karbol fuchsin yang berwarna merah, daripada metilen blue yang berwarna biru.. Sesuai dengan sifatnya kedua pewarna ini bersifat basa, sehingga dapat berikatan dengan asam nukleat yang merupakan komponen dinding sel bakteri yang bermuatan negatif.

Teknik pewarnaan yang kedua adalah teknik pewarnaan gram. Dalam kegiatan praktikum ini, praktikan menggunakan dua spesies bakteri yaitu Staphylococcus aureus dan Eschericia coli. Teknik pewarnaan gram tergolong pewarnaan diferensial sehingga menggunakan dua pewarna yang kontras. Object glass yang digunakan harus bersih, cara membersihkannya bias dengan melalukan object glass di atas nyala api Bunsen. Pembersihan ini dilakukan supaya object glass bebas dari lemak dan debu. Setelah di sterilisasi, object glass kemudian di beri satu tetes larutan NaCl 0,85% . Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.

Apabila sudah, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi, object glass kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Larutan iodin merupakan larutan mordant yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna metilen blue akan larut saat penambahan larutan alkohol.

13

Etanol ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek metilen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena strukturnya yang berbeda. Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue. Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif sebab bakteri Memberikan warna biru keuanguan dengan pewarna gram, sedangakn Escherichia coli Memberikan warna merah muda.

Teknik pewarnaan yang ketiga adalah teknik pewarnaan endospora. Endospore tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, seperti pewarnaan Gram atau pewarnaan sederhana karena zat warna sulit masuk ke dalam dinding sel endospore. Teknik pewarnaan spora yang digunakan dalam kegiatan praktikum ini adalah teknik pewarnaan klein yang menghasilkan warna merah untuk endospora dan biru untuk badan bakteri.

Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan.(Dwidjoseputro, 2001). Beberapa spesies Bacillus yang aerob dapat membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu dibentuk di dalam sel. (Dwidjoseputro, 2001).

14

Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies Bacillus. Begitu pula pada spesies Bacillus subtilis yang membentuk endospora pada saat dalam cekaman. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora,

Bacillus subtiis memiliki struktur batang dan susunannya berpasangan, rantai, serta seperti kumpulan buah anggur. Sporanya dihasilkan pada ujung bada bekteri sehingga dapat dilihat adanya warna merah pada ujung badan bakteri dan wearna biru untuk badan bakteri.

Yang terakhir adalah teknik pewarnaan kapsul. Kebanyakan bakteri mengeluarkan lendir pada permukaan selnya yang melapisi dinding sel. Jika lapisan lendir ini cukup tebal dan kompak maka disebut dengan kapsula. Pada beberapa bakteri adanya kapsula menunjukkan sifat yang virulen. Kapsula bakteri tidak berwarna sehingga untuk mengetahui ada tidaknya kapsula bakteri perlu dilakukan pewarnaan khusus (Hastuti, 2008). Pewarnaan ini menggunakan tinta cina untuk mearnai latar belakang dan karbol fuschsim. Setelah ditambahkan pewarna yang tidak menembus kapsul, maka kapsul dapat tampak dengan menggunakan mikroskop cahaya. Ini merupakan penampilan negatif kapsul yang terlihat jernih dengan latar belakang gelap

Kapsula merupakan lapisan polimer yang terletak di luar dinding sel. Jika lapisan polimer ini terletak berlekatan dengan dinding sel maka lapisan ini disebut kapsula. Tetapi jika polimer atau polisakarida ini tidak berlekatan dengan  dinding sel maka lapisan ini disebut lendir Baik kapsula maupun lendir terdiri dari polisakarida dan polipeptin (komplek polisakarida dengan protein). Kapsula bukan organ yang penting untuk kehidupan sel bakteri. Hal ini terbukti bahwa sel bakteri yang tidak dapat membentuk kapsula mampu tumbuh dengan normal dalam medium. Kapsula berfungsi dalam penyesuaian diri dengan lingkungannya. Misalnya berperan dalam mencegah terhadap kekeringan, mencegah atau menghambat terjadinya pencantelan bakteriofag, bersifat antifagosit sehingga kapsul memberikan sifat virulen bagi bakteri. Kapsula juga berfungsi untuk alat mencantelkan diri pada permukaan. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila dicuci dengan air. Karena  kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama.

Hal yang serupa juga dijelaskan dalam Dwidjoseputro (2005) bahwa lapisan lendir terdiri atas karbohidrat dan pada beberapa spesies tertentu, lendir itu juga mengandung unsur N atau P. Lendir bukan suatu bagian integral dari sel, melainkan suatu hasil pertukaran zat. Lendir memberikan perlindungan terhadap kekeringan, seakan-akan merupakan suatu ”benteng” untuk bertahan. Kapsula merupakan gudang cadangan makanan (Pelczar: 2007). Kapsula bakteri-bakteri penyebab penyakit (patogen) berfungsi untuk menambah kemampuan bakteri untuk menginfeksi. Selain itu, bakteri berkapsula juga menyebabkan adanya gangguan lendir dalam proses industri. (Pelczar:2007).

15

Ukuran kapsula sangat dipengaruhi oleh medium tempat ditumbuhkannya bakteri tersebut. Pada beberapa kejadian tebalnya kapsula hanya satu per sekian diameter selnya, namun dalam kasus-kasus lainya ukuran kapsula jauh lebih besar daripada diameter selnya.

Lapisan kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu diperlukan suatu pewarnaan khusus/ Satu lagi cara untuk perwarnaan kapsula bakteri adalah dengan pewarnaan negatif (pewarnaan tidak langsung). Pada pewarnaan negatif latarbelakangnya diwarnai zat warna negatif sedangkan bakterinya diwarnai dengan zat warna basa. Kapsula tidak menyerap warna sehingga terlihat lapisan terang yang tembus dengan latar belakang yang berwarna  (Waluyo, Lud: 2007).

Beberapa cara pewarnaan telah dikemukakan dalam usaha memperlihatkan adanya kapsul, cara tersebut antara lain adalah cara pewarnaan negatif dan cara pewarnaan kapsul (Irianto, 2006). Hasil pewarnaan dengan menggunakan cara pewarnaan negatif menunjukkan bakteri berwarna merah, sedangkan kapsul tampak sebagai daerah yang kosong di sekitar tubuh bakteri, dan latar belakang berwarna gelap. Cara pewarnaan negatif ini dikemukakan oleh Burri-Gins (Irianto, 2006). Menurut Tarigan (1988), pengecatan negatif bertujuan untuk mewarnai latar belakang atau bidang pandang di bawah mikroskop dan bukan untuk mewarnai sel-sel mikroba yang diperiksa. Pengecatan negatif dapat digunakan untuk melihat kapsul yang menyelubungi tubuh bakteri dengan hanya menggunakan satu macam cat saja. Sedangkan pewarnaan kapsul (pewarnaan positif) pertama dikemukakan oleh Tyler. Dalam pewarnaan positif ini digunakan senyawa kristal violet 0,18 gram. Hasil dari pewarnaan kapsula ini adalah kapsul tampak berwarna biru-ungu yang terletak disekitar tubuh bakteri. Sedangkan bakterinya sendiri berwarna biru kelam (Irianto, 2006).

Klebsiella pneumonia memiliki bentuk kapsul yang sangat tebal, kebanyakan terdiri dari polisakarida tapi ada juga yang terdiri dari polipetida. Kapsul berfungsi untuk melindungi bakteri dari tindakan fagositik leukosit dan memungkinkan patogen untuk menyerang tubuh. Endospora hanya terdapat pada bakteri, merupakan srtuktur yang dibentuk bakteri apabila berada dalam keadaan yang kurang menguntungkan dan dapat aktif kembali apabila lingkungan sekitarnya menguntungkan.

16

BAB V

KESIMPULAN

Teknik pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu jenis pewarna yang umumnya bersifat basa, tujuannya untuk melihat struktur dan susunan bakteri.

Teknik pewarnaan gram menggunakan dua pewarna kontras yang dapat memberi reaksi positif berupa warna biru sampai ungu untuk bakteri gram positif dan warna merah muda untuk bakteri untuk gram negative.

Teknik pewarnaan gram biasanya paling umum digunakan untuk mewarnai bakteri berdasarkan hilangnya pewarna primer pada proses pencucian.

Teknik pewarnaan endospora juga merupakan pewarnaan diferensial sebab menggunakan dua pewarna yang kontras. Tujuannya untuk melihat bentuk dan letak endospora pada satu bakteri.

Teknik pewarnaan kapsul termasuk pewarnaan negative, karena materi yang akan dilihat (kapsul) tidak diwarnai, yang diwarnai adalah latar belakangnya. Tujuannya untuk membedakan kapsul dari sel bakteri.

DAFTAR PUSTAKA17

Cappuccino, J.G and N.Sherman. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual. Adison-

Wesley Publishing company: California

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Pelczar Jr, Michael J. 1988. Dasar-dasar mikrobiologi jilid 2 terjemahan. Jakarta : Universitas Indonesia.

Jawetz, E.J.L. dan E.A. Adelberg. 2001. Mikrobiologi kedokteran. Edisi I. Diterjemahkan oleh Penerjemah Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga. Salemba Medika, Surabaya.

Radji, Dr. Maksum. 2009. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran. Penerbit Buku kedokteran . Penerbit Buku Kedokteran.

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Wiley.

Irianto, K. 2006. Mikrobiologi. Bandung: Yrama Widya.

Holt, J.G., N.R. Krieg, P. H. A, Sneath, J.T., Stanley S.T., Williams, 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th ed., Philadephia: Williams & Wilkins

Anonim, 2012. www.google.com/images diakses pada 25 September 2012 pukul 19.17

18