Metode Pengayaan untuk isolasi actinomycetes bioaktif dari sedimen bakau

di Kepulauan Andaman, India.

Abstrak

Berbagai metode sebelum perlakuan dan tiga media yang berbeda untuk isolasi bioaktif actinomycetes dari sedimen mangrove Andaman dan Nikobar , India . Sedimen dari empat lokasi yang berbeda hutan mangrove dikumpulkan dan sebelum ditreatmen dengan metode panas kering, dan media yang dilengkapi dengan cycloheximide 80 pg / mL dan asam nalidiksat 75 mg / mL . Rata-rata kepadatan di sampel sedimen actinomycetes dicatat sebagai 22 CFU-10-6/gm dalam medium KUA diikuti oleh 12 CFU-10-6/gm dalam medium AIA dan 8 CFU-10-6/gm dalam medium SCA . Sebanyak 42 actinomycetes diisolasi , dan semua isolat dievaluasi untuk aktivitas antibakteri mereka terhadap bakteri pathogen pada dua media yang berbeda . Di antara 42 isolat yang diuji , 22 spesies yang ditemukan metabolit antibakteri terhadap bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus , Bacillus subtilis , Salmonella typhi dan Klebsiella pneumoniae . Khususnya , strain actinomycete seperti A101 , A102 , A107 , A116 , A121 , A125 , A130 , F101 , F102 , F104 , F106 , De101 dan De102 secara signifikan menghambat pertumbuhan semua bakteri yang diuji . Strain ini , A107 diidentifikasi sebagai Streptomyces spp . Strain ini memiliki aktivitas maksimum terhadap semua patogen yang digunakan pada kedua media. Oleh karena itu , isolasi , karakterisasi dan studi metabolit sekunder actinomycetes dari sedimen bakau di Andaman dan Nicobar Pulau bisa menjadi jalur untuk penemuan antibiotik dari actinomycetes laut.

Kata kunci : Kepulauan Andaman , Actinomycetes , pretreatment , karakterisasi

PENDAHULUAN

Lingkungan laut adalah sumber yang sebagian besar belum dimanfaatkan untuk isolasi mikroorganisme baru dengan potensi untuk menghasilkan metabolit sekunder yang aktif, seperti mikroorganisme, actinomycetes, karena mereka dikenal untuk menghasilkan beragam senyawa kimia dengan berbagai aktivitas biologis (Bredholt et al., 2008). Permintaan untuk antibiotik baru terus tumbuh karena cepat muncul beberapa patogen resisten antibiotik yang mengancam kehidupan infeksi. Meskipun, kemajuan sedang dibuat dalam bidang sintesis kimia dan rekayasa biosintesis senyawa antibakteri, alam masih tetap merupakan sumber terkaya dan paling serbaguna untuk antibiotik baru (Kpehn dan Carter, 2005; Baltz, 2006; Pelaez, 2006).

Secara tradisional, actinomycetes telah diisolasi dari sumber-sumber terestrial meskipun, laporan pertama membentuk miselium actinomycetes dari sedimen laut yang muncul beberapa dekade lalu (Weyland, 1969). Baru-baru ini, actinomycetes telah diakui sebagai sumber agen antibiotik dan antikanker dengan struktur dan sifat biasa (Jensen et al., 2005).

Actinomycetes mewakili kelompok mikroba yang didistribusikan secara luas dalam ekosistem alam di seluruh dunia dan terutama penting bagi peran mereka di daur ulang (Srinivasan et al., 1991).

Literatur menunjukkan bahwa, sedimen laut Merupakan sumber yang baik untuk isolasi actinomycetes dengan potensi untuk menghasilkan produk baru yang berguna (Goodfellow dan Haynes, 1984). Namun, actinomycetes merupakan bagian dari komunitas mikroba laut asli dari sedimen sampel yang berasal dari habitat terestrial dan hanya dilakukan ke laut dalam bentuk spora (Weyland, 1981; Goodfellow dan Williams, 1983; Weyland dan Helmke, 1988; Takizawa dkk, 1993; Ravel dkk, 1998). Mikroorganisme yang ditemukan di lingkungan laut telah menarik banyak perhatian, karena produksi berbagai senyawa alami dan mekanisme khusus untuk adaptasi lingkungan ekstrim (Solingen et al., 2001).

Pengolahan awal termasuk pengayaan, media fisik dan selektif mungkin digunakan untuk mempelajari ekologi actinomycetes di alam habitat seperti tanah atau air sampel (Jensen et al., 2005). Karena sedimen laut merupakan lingkungan yang sangat berbeda dari yang berhubungan dengan tanah sampel, tidak jelas seberapa efektif pra-treatmen sedimen tersebut untuk pemulihan bioaktif actinomycetes. Sedimen laut adalah sumber daya yang belum dimanfaatkan dengan baik. Beberapa laporan dari Pantai Timur India, menunjukkan bahwa tanah adalah sumber utama Actinomycetes (Sivakumar et al, 2005.; Vijayakumar et al, 2007;.. Dhanasekaran et al, 2008; Vijayakumar et al., 2008). Sejalan dengan itu, Andaman dan Nicobar ekosistem laut Pulau sebagian besar belum diselidiki, dan dapat menyediakan sumber dari memproduksi mikroorganisme dan efisien senyawa antimikroba. Oleh karena itu, penelitian ini adalah dilakukan untuk mengisolasi actinomycetes bioaktif dari sedimen laut dari Kepulauan Andaman dan Nicobar oleh berbagai metode pra-treatment menggunakan media dan mengevaluasi potensi antibakteri dari isolate yang berbeda.

BAHAN DAN METODE

Daerah studi

Kepulauan Andaman dan Nicobar. Wilayah ini membentang di atas lahan seluas lebih dari 700 km dari utara ke selatan dengan 36 pulau berpenghuni. Setelah jangkauan bukit dari Burma (Myanmar) untuk Indonesia, pulau-pulau bergelombang ditutupi dengan hutan lebat.

Koleksi sedimen bakau

Sebanyak empat sampel sedimen mangrove yang berbeda yang dikumpulkan dari Teluk Benggala Coast (Lat. 11 ° 38 '46 N; Panjang. 92 ° 40 '71 E) dan Andaman Sea Coast (Lat.11 ° 35'47. Panjang. 92 ° 45'79) dari Selatan Pulau Andaman, India. Sampel dikumpulkan dalam wadah plastik steril di lapangan dan segera dipindahkan ke laboratorium dan disimpan untuk studi lebih lanjut.

Isolasi actinomycetes dari sedimen

Sampel sedimen kering adalah tanah aseptic dengan Pestle dan Mortar , dicampur secara merata dan lulus melalui 2 mm saringan filter untuk menghilangkan kerikil dan puing-puing . Sampel disimpan pada suhu 55 ° C selama 5 menit , 55 ° C selama 60 min , 70 ° C selama 15 menit dan 100 ° C selama 1 jam dalam gelas terpisah wadah untuk pra - pengolahan ( Hayakawa dan Nonomura , 1987; Hayakawa et al , 1991; . Seong et al , 2001) . . kemudian , 10 seri pengenceran kali lipat dari sampel sedimen yang dibuat menggunakan steril 50 % air laut ( Kim et al . , 1994) . Sekitar 0,1 mL sampel serial diencerkan tersebar atas media agar-agar Kuster ini ( Balagurunathan dan Subramanian , 1992 ) g / L : gliserol 10 , kasein 0.3 , KNO3 3 , K2HPO4 2 , NaCl 2 , MgSO4 0,05 , CaCO3 · 0,02 , FeSO4 0,01 , agar 16 , pH 7 ± 0,1 dan 50 % air laut , ( Difco Chemicals ) . Pati kasein media agar ( Wellington dan Cross, 1983) g / L : 10 pati , kasein bubuk 1 , agar-agar 15; air laut 50 % dan pH 7,2 ± 0,2 dan Actinomycetes isolasi agar menengah g / L : sodium caseinate 2 , L - asparagin 0.10 , natrium propionat 4 , di - kalium fosfat 0,5 , magnesium sulfat 0,1 , besi sulfat 0,001 , agar 15 ; air laut 50 % dan pH 8,1 ± 0,2 . Semua tiga media agar yang dilengkapi dengan 80 mg / mL dan cycloheximide 75 ug / mL asam nalidiksat ( HIMEDIA , Mumbai ) untuk meminimalkan pertumbuhan bakteri dan jamur lainnya. Plat diinkubasi pada 28 ± 2 ° C selama 28 hari. Setelah 5 hari, yang actinomycetes koloni yang tumbuh pada cawan Petri yang dihitung secara berkala. Semua morfologis koloni actinomycete berbeda adalah sub-kultur di ekstrak ragi malt extract agar menengah (ISP No 2) g / L: ekstrak ragi 4, ekstrak malt 10, dekstrosa 4, 50% laut air, agar-agar 20, pH 7,3 (Shirling, 1966) oleh Teknik streak plate. Setelah pertumbuhan muncul, koloni actinomycetes dipertahankan di ISP No 2 agar miring untuk penyelidikan lebih lanjut.

Skrining untuk aktivitas antibakteri

Semua actinomycetes terisolasi dan diuji aktivitas antibakteri mereka terhadap beberapa bakteri yaitu B. subtilis, S. typhi, S. aureus dan K. pneumoniae. Itu aktivitas antibakteri dilakukan oleh Metode plat lintas beruntun (Lemos et al., 1985), streak tunggal dari actinomycetes dibuat pada agar Kuster dan dimodifikasi media nutrien agar [g / L: glukosa 5, pepton 5, daging sapi mengekstrak 3, NaCl 5, 15 dan agar pH 7 ± 0,1] dan diinkubasi pada 28 ± 2 ° C selama 3 sampai 4 hari (Kim et al., 1994). Setelah mengamati pita yang baik seperti pertumbuhan actinomycetes, bakteri patogen yang melesat di sudut kanan ke streak asli actinomycetes dan diinkubasi pada 28 ± 2 ° C. Zona inhibisi (mm) diukur setelah 24 dan 48 jam. Piring kontrol juga dipertahankan tanpa inokulasi actinomycetes / bakteri untuk menilai normal pertumbuhan bakteri patogen dan actinomycetes.

Skrining Sekunder A107 : Persiapan antibiotik kaldu fermentasi Strain A107 dikultur pada agar miring pada suhu 28 ° C selama 2 minggu, spora matang diinokulasi dalam fermentasi kaldu yang mengandung 100 mL ( Dextrose 2 g , kedelai makan 2 g , pati terlarut 0,5 g , 0,5 g pepton , minuman keras curam jagung 0,25 g , ( NH4 ) 2 SO4 0,25 g , MgSO4 · 7H2O 0,25 g , K2HPO4 0,002 g , 0.4 g NaCl , CaCO3 0,2 g , air laut 50 % ) dan diinkubasi pada 30 ° C pada rotary shaker pada 200 rpm selama 216 jam .

Fermentasi kaldu disentrifugasi pada 10.000 rpm pada 4 ° C selama 20 menit Supernatan disaring menggunakan 0,45 pM spora ukuran filter membran ( Millipore ) filter adalah dikumpulkan sebagai sampel antibiotik ( Ruan , 1977) . untuk menentukan spektrum antibakteri , bakteri pathogen dikultur pada medium kaldu nutrisi pada 37 ° C selama 24 jam , yang budaya ditukar pada Muller media agar Hindan .

Tiga sumur ( 6 mm diameter ) disiapkan di setiap pelat agar seeded dan setiap sumur diisi dengan 100 Ul antibiotik kaldu fermentasi regangan A107 . pelat diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 sampai 48 jam . Diameter zona inhibisi diukur Karakteristik antibakteri aktif tinggi actinomycetes (A107)

Budaya geser dari Streptomycetes aktif tinggi adalah disiapkan pada medium agar Kuster dan diinkubasi pada suhu 28 ° C dengan menggunakan slide rongga. Pengamatan berkala mengenai morfologi spora , pengaturan dan struktur miselium dicatat dengan menggunakan Nikon Mikroskop dalam 100 x zoom .

Karakteristik budaya A107 ( pertumbuhan, pewarnaan dari udara dan substrat miselia , pembentukan pigmen larut) diuji dalam enam media yang berbeda termasuk , ekstrak ragi ekstrak malt agar ( ISP - 2 ) , oat agar makan ( ISP - 3 ) , Anorganik garam pati agar ( ISP - 4 ) , gliserol asparagin agar ( ISP - 5 ) , tyrosin agar ( ISP - 7 ) dan medium

agar Kuster itu ( KU ) menurut prosedur ISP . uji biokimia termasuk IM -Vic , produksi H2S , reduksi nitrat , urease , katalase , pati gelatin dan kasein hidrolisis , hemolisis dan TSI juga dilakukan sebagai direkomendasikan oleh ISP . Sifat seperti Chemotaxanomical seperti , analisis sel gula dinding ( Lechevalier et al . , 1970) dan dinding sel analisis asam amino ( Becker et al . , 1965) dianalisis . Pemanfaatan sumber karbon seperti pati , dekstrosa , fruktosa , maltosa , dan manitol dan sumber nitrogen yaitu D - alanin , L - arginin , dan Ltyrosine diuji dalam medium agar Kuster itu .

HASIL DAN PEMBAHASAN

Empat perawatan pra-panas yang berbeda yang digunakan untuk isolasi maksimum actinomycetes. Dari tanah yang dirawat di 70 ° C selama 15 menit menghasilkan maksimal 22 CFU dari actinomycetes per gram sedimen pada pengenceran 10-6 [Gambar 2 (a)], sedangkan perawatan lain seperti pada 100 ° C selama 60 menit hanya menghasilkan 4 CFU/10-6, pada 55 ° C selama 5 menit memberikan 12 CFU/10-6 dan pada 55 ° C selama 60 menit memberikan 15 CFU/10-6. Akibatnya, dua perlakuan tidak mengizinkan koloni bakteri dan jamur untuk tumbuh, sedangkan kemudian perawatan memungkinkan pertumbuhan bakteri dan jamur koloni sebagai 8 dan 6 CFU/10-6 dan 6 dan 7 adalah CFU/10-6 dicatat dalam sedimen dirawat di 55 ° C selama 5 menit dan 55 ° C selama 60 menit masing-masing (Gambar 1).

Oleh karena itu memiliki yang dilaporkan, ketika sedimen mangrove adalah dibudidayakan tanpa pra-perlakuan, jumlah yang tidak diinginkan koloni bakteri dan jamur yang tumbuh, [Gambar 2 (b)] sedangkan tanah yang dikeringkan, mereka menurun pada budaya piring. Juga, penelitian ini melaporkan dominasi kontaminasi bakteri dan jamur lainnya menghambat kolonisasi actinomycetes. sebelumnya, jenis metode pra-pengobatan untuk isolasi actinomycetes juga telah disarankan oleh beberapa peneliti (Hayakawa dan Nonomura, 1987; Hayakawa et al, 1991;. Jensen et al, 1991;. Kim et al, 1994;. Seong et al., 2001). Selanjutnya, agen antimikroba yaitu cycloheximide (80 mg / mL) dan asam idixic nal (75 mg / mL) yang ditambah dalam tiga media kultur yang berbeda yaitu Agar Kuster itu, pati kasein agar dan actinomycetes isolat agar ion. Dalam kami ELAJAR, sebagai muc h sebagai 42 actinomycetes morfologis berbeda isolate diisolasi dari sedimen mangrove. bila dibandingkan dengan pati kasein agar, agar Kuster itu ditemukan untuk menjadi support yang baik adalah Olat ion marine actinomycetes. koloni maksimum actinomycetes (22 CFU/10-6) ditemukan pada agar Kuster ini diikuti oleh actinomycetes isolasi agar (12 CFU/10-6) dan pati kasein agar (8 CFU/10-6). Dengan demikian, saat ini

Gambar 1: Berbagai perawatan sebelum isolasi actinomycetes dari sedimen bakau

Gambar 2: Isolasi actinomycetes dari bakau sedimen (a) Pretreatment pada 70 ° C selama 15 menit dan (b) tanpa pretreatment.

laporan studi, suhu pada 70 ° C selama 15 menit adalah metode perawatan yang cocok untuk mengisolasi lebih

actinomycetes koloni dari sedimen laut, pada Kuster yang medium agar dengan suplementasi cycloheximide (80 mg / mL) dan asam nalidiksat (75 mg / mL). Karakteristik fenotipik antagonis terpilih actinomycetes (A107) Karakterisasi morfologi A107, sebuah spektrum yang luas isolat antagonis dikembangkan abu-abu gelap ke putih berwarna spora massa. Namun, ketegangan A107 mengembangkan kopi berwarna coklat substrat miselium. Selanjutnya strain A107 dikembangkan spiral alam spora rantai dalam miselium udara (Tabel 1). Rincian karakteristik morfologi dan

biokimia, pemanfaatan karbon dan nitrogen sumber, dan chemotaxanomicals milik isolat uji diberikan pada Tabel 1. Sivakumar et al., (2005) melaporkan bahwa karakter dapat digunakan sebagai penanda dimana suatu strain individu dapat

diakui. Khususnya, chemotaxonomy memainkan peran penting dalam identifikasi actinomycetes tingkat generic. Dalam studi ini, isolat uji mengandung mesodiaminopimelic asam dan tidak ada gula yang ditemukan dalam dinding sel mereka. Isolat bisa memanfaatkan semua karbon sumber dan sumber nitrogen (Tabel 1). saat ini Penyelidikan menyimpulkan bahwa fisiologis karakteristik actinomycetes

bervariasi tergantung pada nutrisi yang tersedia dalam media dan fisik kondisi. Setelah pertumbuhan isolat pada berbagai media, agar Kuster yang diamati untuk menjadi media terbaik untuk pertumbuhan maksimal. Selanjutnya, warna diffusible pigmen dan udara dan substrat miselium diproduksi oleh A107 isolat bervariasi dengan media yang berbeda. Pridham dan Tresner (1974) melaporkan bahwa warna miselium aerial

dianggap karakter penting bagi pengelompokan dan identifikasi actinomycetes. Dalam penelitian ini, A107, potensi antibakteri yang tinggi Senyawa memproduksi actinomycete dikultur pada enam media kultur yang berbeda. Strain A107 diproduksi pucat merah muda pigmen diffusible berwarna pada medium agar Kuster ini (Tabel 2). Dengan demikian, penyelidikan ini telah preclassified sebagai produsen potensial tinggi berdasarkan koloni morfologi dan karakteristik fenotipik actinomycetes (Tabel 1). Dengan demikian, dapat disimpulkan pada dasar penelitian ini dan sebelumnya bahwa gizi komposisi medium sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfologi organisme.

Aktivitas antibakteri isolat

Para actinomycetes adalah produsen antibiotik penting, membuat perempat dari semua produk farmasi yang dikenal; para Streptomycetes terutama produktif (Waksman, 1961; Lachevalier, 1989; Locci, 1989; Saadown dan Gharaibeh, 2003). Dalam penelitian ini, dari 42 actinomycetes dari sedimen mangrove Andaman dan Nikobar, 22 (58,4%) isolat telah antibakteri aktivitas terhadap bakteri patogen. Semua 42 isolat menunjukkan aktivitas antibakteri dengan setidaknya satu bakteri uji

pada kedua dimodifikasi agar nutrien dan media agar Kuster itu. Terutama, strain A101, A102, A107, A116, A121, A125, A130, F101, F102, F104, F106, De101 dan De102 memiliki aktivitas tertinggi terhadap semua bakteri patogen diuji pada kedua agar nutrien diubah dan Agar Kuster itu. Strain A105, A108, A128 dan De103 menunjukkan aktivitas yang lebih terhadap bakteri diuji pada Kuster ini agar dari dimodifikasi agar nutrien. strain actinomycete seperti A108, A128 dan F105 menghambat satu bakteri masing-masing [S. aureus (10 mm), K. pneumoniae (18 mm) dan K. pneumoniae (15 mm) masing-masing] pada dimodifikasi nutrisi agar, sedangkan pada agar Kuster itu strain A108 dan A128 diproduksi maksimum sampai sedang zona hambat terhadap semua bakteri yang diuji kecuali K. pneumoniae, dan strain F105 menghambat pertumbuhan semua empat bakteri patogen di media yang sama. Selain itu, semua strain actinomycete memiliki aktivitas antibakteri yang luar biasa terhadap S. aureus bila ditanam pada medium agar Kuster.

Pada dimodifikasi agar nutrisi, strain A107 diproduksi maksimum (37 mm) zona inhibisi terhadap S. aureus, sedangkan pada agar Kuster, baik strain A121 dan A125 zona maksimum yang dihasilkan dari penghambatan terhadap S. aureus (38 mm) dan K. pneumonia (38 mm) masing-masing. Menariknya, pada bakteri lainnya juga menunjukkan terlihat aktivitas antibakteri terhadap semua bakteri yang diuji pada kedua media. Relatif, semua isolat yang dihasilkan maksimum zona inhibisi ketika mereka dibudidayakan Kuster ini medium agar dari dimodifikasi agar nutrien (Tabel 3). A107 ditemukan bakteri patogen yang sangat menghambat pada kedua media, maka, budaya dipilih untuk identifikasi. Dengan demikian, telah melaporkan bahwa, ada kedua variasi kuantitatif dan kualitatif dalam antibiotik yang diproduksi oleh genera yang berbeda dan spesies. Substrat dan habitat sangat mempengaruhi produksi antibiotik oleh isolat

actinomycete. Aktivitas metabolik sekunder dari A107 menunjukkan tertinggi aktivitas antibakteri terhadap S. aureus (45 mm) dan K. pneumoniae (48 mm) diberikan pada Gambar 3. Sejalan dengan itu, Streptomyces spp. Diisolasi dari spons laut Callyspongia diffusa, Mycale mytilorum, Tedania anhelans dan Dysidea fragilis (Dharmaraj dan Sumantha, 2009). Dari awal skrining, 94 budaya Streptomyces diperoleh dan dari ini 58 budaya dipamerkan antagonisme terhadap bakteri, 36 strain terhadap jamur dan 27 strain dipamerkan aktivitas spektrum yang luas terhadap kedua. Sejenis pekerjaan juga telah dilaporkan oleh Remya dan Vijayakumar (2008), dari tanah laut Kerala, Pantai Barat India.

Padahal, hasil penelitian ini memberikan jelas gambaran tentang pentingnya metode pra-treatment untuk isolasi actinomycetes dan mengungkapkan kelautan actinomycetes dari sedimen mangrove Andaman dan Kepulauan Nicobar menjadi sumber potensial antibiotik baru. Studi keragaman actinomycetes keinginan kunjungan rutin ke stasiun sampling, isolasi dari substrat yang berbeda dikumpulkan dari habitat dan penggunaan yang berbeda media kultur. Upaya tersebut perlu terus baik dalam area yang sama serta dari tempat-tempat yang berdekatan selama berbagai kondisi iklim seperti layar lebih isolat untuk terapi.