METODE ANALISIS PROTEINKELOMPOK 4GITA YUNASTRIE WOWORRAMDAN GUNGUN SSUSI RUSDIANISABILA AINUN HAFSAH

METODE ANALISIS PROTEIN DAN ASAM AMINOa. Analisa Kualitatif1. Reaksi Xantoprotein2. Reaksi Hopkins-Cole3. Reaksi Millon4. salting out5. Reaksi Natriumnitroprusida6. Metode Biuret (klasik)7. Pengendapan dgn logam8.Tes Koagulasi9. Pengendapan dengan asam organik b. Analisa Kuantitatif1. Metode Kjeldahl (klasik)2. Metode Titrasi Formol3. Metode Ninhidrinc.Metode lainPenetapan Kadar Protein dengan Metode FeCl3Penetapan Kadar Protein dengan Metode LowryPenetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford

A. ANALISA KUALITATIF

Analisis kualitatif adalah identifikasi dengan menunjukan ada tidaknya protein tanpa melihat jumlah atau kadar protein

RESIDU ASAM AMINO YANG POSITIF TERHADAP REAKSI XANTOPROTEIN YAITU RESIDU TIROSIN, FENILALANIN, DAN TRIPTOFAN. PROTEIN YANG MENGANDUNG RESIDU ASAM AMINO DENGAN RADIKAL FENIL DALAM STRUKTUR KIMIANYA (PROTEIN YANG MENGANDUNG ASAM AMINO FENILALANIN ATAU TIROSIN) JIKA DITAMBAHKAN DENGAN ASAM NITRAT PEKAT AKAN GUMPALAN PUTIH. PADA PEMANASAN, GUMPALAN PUTIH AKAN BERUBAH MENJADI KUNING DAN AKHIRNYA MENJADI JINGGA JIKA DITAMBAHKAN LARUTAN BASATes Xantoprotein

1. REAKSI XANTOPROTEIN

Untuk mengidentifikasi protein secara umumPereaksi xantoprotein :

Endapan Putih

Tes MillonPereaksi millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil protein.

Tes Hopkins - ColeSalah satu uji asam amino yaitu dengan uji hopkins-cole. Pereaksi yang digunakan dalam uji ini mengandung asam glioksilat, uji hopkins-cole spesifik pada protein yang mengandung triptofan, sehingga hasil positifnya akan terbentuk cincin ungu.

Tes Salting OutSalting out adalah peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih besar dibanding zat utama, akan menyebabkan penurunan kelarutan zat utama atau terbentuknya endapan karena ada reaksi kimia.Pengendapan pada salting out terjadi karena proses persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air

6. METODE BIURET

Prinsip : senyawa yang berisi dua atau lebih ikatan peptida akan memberikan warna biru ungu yang karakteristik bila direaksikan dengan larutan kupri sulfat dalam suasana basa.

REAKSI H O HHOOCNC C NH2 + CuSO4 + NaOH R H R R H H R 2HNCCNCCOOH H O H Cu + Na2SO4 + H2O H OHOOCNCCNH2 R H H R (senyawa kompleks ungu)

KELEBIHANLebih murah daripada metoda Kjeldahl, cepat (dapat selesai dalam < 30 menit), paling sederhanaDeviasi warna jarang terjadi dibanding dengan metoda Lowry, absorpsi UV, atau turbidimetriSenyawa yang dapat mengganggu analisis hanya sedikit sekali

KEKURANGANKurang sensitif bila dibandingkan dengan metoda Lowry; perlu minimal 2 4 mg protein untuk analisaAbsorbansi dapat berasal dari pigmen empedu, bila pigmen tersebut ada di dalam sampelGaram amonium dengan konsentrasi tinggi dapat mengganggu reaksiWarna yang dihasilkan bervariasi dengan perbedaan jenis protein. Misal : gelatin menghasilkan warna pinkish-purple

7. METODE PENGENDAPAN DENGAN LOGAMPrinsip :Larutan albumin membentuk endapan dan berwarna keruh setelah direaksikan dengan HgCl2 dan (CH3COO)2Pb.

Prinsip :Pada asam amino sistein terdapat SH bebas (gugus sulfidril) bila bereaksi dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih menghasilkan kompleks berwarna merah.

8. REAKSI NATRIUM NITROPRUSIDA

9.PENGENDAPAN DENGAN ASAMSebagian besar protein dapat diendapkan dengan penambahan asam-asam organik (seperti asam pikrat, asam trikloroasetat dan asam sulfonat) yang membentuk garam proteinat yang tidak larut.

B. ANALISA KUANTITATIF

Analisis yang menentukan jumlah atau kadar protein

1. METODE TITRASI FORMOLMetode analisis cara penentuan protein dengan cara titrasi formol untuk menghidrolisis protein dalam sampel

Gelatin Enzim Proteolitik

1.METODE TITRASI FORMOL REAGEN BASALarutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Titrasi dengan Asam, Misalnya dgn HClDengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.Titrasi blanko ( NaOH yang tanpa protein dgn perlakuan yg sama)Reagen yang digunakan bisa juga asam dan titrannya basa

CARA KERJA METODE TITRASI FORMOL DENGAN REAGEN ASAM1.Dipipet 10 mL Larutan Protein Ditambahkan 20 mL aquadest dan 0.4 mL Asam-oksalat jenuh2. tetes Indikator PP3.Dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai larutan berwarna merah muda4.Ditambah 2 mL Formalin sampai larutan berwarna merah muda6.Dititrasi kembali dengan larutan NaOH 0,1 N sampai larutan berwarna merah muda.Catat volume pemakaian

RUMUS METODE TITRASI FORMOL DENGAN REAGEN ASAM%Protein = (V titrasi V blanko) x N NaOH x Ar N x 100%gram sampel x V sampel

2. METODE NINHIDRIN

Larutan Protein ditambahkan Nynhidrin, kemudian panaskan. Contoh: 3mL protein + Nynhidrin Biasanya berwarna biruLarutan bkanko ; Nynhidrin yang dipanaskanUkur absorbansi Larutan protein terhadap blanko dengan spektroskopi UV-Vis

Kadar Protein = A x Faktor koreksi x pengenceran

C.METODE LAIN

Penetapan Kadar Protein dengan Metode FeCl3Penetapan Kadar Protein dengan Metode LowryPenetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE FECL3Protein dapat diendapkan dengan asam tannat.Kompleks asam tannat/proteindapat bereaksi dengan ion Ferri membentuk kompleks stabil berwarna merah.Sebelumnya, kelebihan asam tannat harus dihilangkan dengan pencucian menggunakan larutan NaCl fisiologisMetode ini bisa memiliki batas deteksinya hingga 5 ug/mL, dan recovery 98-103%.

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE FECL31. Reagen:Larutan NaCl 1.5 MAsam Tannat 1 mM; dibuat dengan melarutkan 1.7 g asam tannat dalam akuades (yang mengandung 1 g asam benzoat) hingga 1 L.Larutan FeCl3 10 mM; dibuat dengan melarutkan 1.625 g dalam pelarut air-trietanolamin (1:1) hingga 1 L.

2. Larutan Standard:Buat seri kadar larutan standard BSA (Bovine Saline Albumin) 0.1 - 1.0 mg/mL dengan pengenceran dari larutan stok.

3. Larutan blanko : 2 mL air + 0.5 mL FeCl3

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE FECL3Prosedur:Ambil 0.5 mL larutan (sampel protein/standard), masukkan ke dalam tabung sentrifuse. Tambahkan 0.5 mL larutan NaCl 1.5 M dan 0.5 mL asam tannat 1 mM, vortex. Setelah 5 menit, lakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm.Dekantir supernatan, tuntaskan dengan membalikkan tabung pada kertas saring.Tambahkan 5 mL larutan NaCl pada endapan, vortex, sentrifugasi, dan buang supernatan untuk memcuci endapan.Tambahkan 2 mL air dan 0.5 mL reagen FeCl3 pada endapan, vortex. Setelah 5 menit, ukur absorbansinya pada 510 nm terhadap blanko (2 mL air + 0.5 mL FeCl3).

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE FECL3

0.5 mL larutan sampel+ 0.5 mL larutan NaCl 1.5 M & + 0.5 mL asam tannat 1 mMDiamkan 5menitsentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm,endapan+ 2 mL air dan 0.5 mL reagen FeCl3Setelah 5 menit, ukur absorbansinya pada 510 nm terhadap blanko

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE LOWRYUntuk analis tryptophan dan tyrosineMetode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret.kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuretdalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I)Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteukompleks phosphomolybdotungstate menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis CuKekuatan warna biru menunjukan banyaknya protein

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORDUntuk ; Tyrosine, Tryptophan, Phenylalanine Arginine, Histidine dan LeucineMetode Bradford didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG)Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (maks 465 nm)dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (maks 595 nm)Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD1. Coomassie Blue G250; sebanyak 100 mg Coomassie Blue G250 dilarutkan dalam 50 mL etanol 95%. Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 mL asam fosfat 85%, diencerkan hingga 1 L dengan akuades. Reagen kemudian disaring dengan kertas Whatman No. 1 sebelum disimpan pada suhu kamar. Reagen ini stabil untuk beberapa minggu, meskipun akan terjadi sedikit pengendapan.

PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD2. Buat seri kadar larutan standard BSA (Bovine Saline Albumin) 0.1 - 1.0 mg/mL dengan pengenceran dari larutan stok.Ambil 100 L larutan (sampel/standard), masukkan ke tabung. Tambahkan 5 mL reagen, homogenkan. Hindari terjadinya gelembung (busa), Ukur absorbansi pada 595 nm terhadap blanko (larutan PBS).

DAPUShttp://id.swewe.net/word_show.htm/?34768_2&Alat_pengukur_cahaya_untuk_pemotretan, 21-10-14, 13.28