MAKALAH

BIOKIMIA PATI

Kelompok 2

NURSYAHLIDA

RAHMI EL HUSNA

RAHMI SITRA GUSTIYA

RICKY M ARNIS

VENI SOFIANI

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

PASCA SARJANA

UNIVERSITAS NEGERI PADANG

2014

Polisakarida adalah polimer hasil kondensasi monosakarida dan tersusun dari banyak molekul monosakarida yang berikatan satu sama lain, dengan melepaskan sebuah molekul air untuk setiap ikatan yang terbentuk. Senyawa ini mempunyai rumus umum (C6H10O5)n, dimana n adalah bilangan yang besar. Polisakarida terpenting sebagai sumber karbohidrat yang tersebar luas di alam dan banyak terdapat pada tanaman adalah pati. Pati penting dalam industri-industri pangan, tekstil, lem, kertas, permen, dan lain-lain.

A. Pengertian Pati

Pati atau amilum adalah karbohidrat kompleks yang tidak larut dalam air, berwujud bubuk putih, tawar dan tidak berbau. Pati merupakan bahan utama yang dihasilkan oleh tumbuhan untuk menyimpan kelebihan glukosa (sebagai produk fotosintesis) dalam jangka panjang. Hewan dan manusia juga menjadikan pati sebagai sumber energi yang penting.Pati tersusun dari dua macam karbohidrat, amilosa dan amilopektin, dalam komposisi yang berbeda-beda. Amilosa memberikan sifat keras (pera) sedangkan amilopektin menyebabkan sifat lengket. Amilosa memberikan warna ungu pekat pada tes iodin sedangkan amilopektin tidak bereaksi.

1. AmilosaAmilosa merupakan homogililikan D-glukosa dengan ikatan -(1,4) dari struktur cincin piranca, yang membentuk rantai lurus umumnya dikatakan sebagai linier dari pati. Meskipun sebenarnya amilase dihidrolisa dengan amilase pada beberapa jenis pati tidak diperoleh hasil hidrolisis yang sempurna (Bank, 1973), -amilase menghidrolisis amilosa menjadi unit-unit residu glukosa dengan memutus ikatan -(1,4) dari ujung non pereduksi rantai amilosa menghasilkan maltosa. Banyak satuan glukosa dalam setiap rantai tergantung pada sumbernya. Biasanya setiap rantai mengandung 850 atau lebih unit glukosa dan dari setiap rantai lurus tersebut terdapat satu titik cabang ikatan -(1,6) glikosida. Berat molekul amilosa beragam tergantung pada sumber dan metoda ekstraksi yang digunakan. Suatu karakteristik dari amilosa dalam suatu larutan adalah kecendrungan membentuk koil yang sangat panjang dan fleksibel yang selalu bergerak melingkar. Struktur ini mendasari terjadinya inte raksi iodamilosa membentuk warna biru (Rundle dan Foster,1944). Berikut adalah struktur primer dan sekunder (heliks dengan satu lilitan terdiri dari 6 glukosa) dari amilosa

Pembentukan kompleks pati iodin

Penapisan enzim -amilase dengan teknik pembentukan kompleks pati-iodin didasarkan pada penemuan aktivitas enzim -amilase dengan metoda Fuwa. Uji positif ditandai dengan terbentuknya daerah terang dengan latar biru/ ungu disekitar kultur (pada media pertumbuhan yang mengandung pati) setelah penambahan larutan KI/ I1. Warna biru/ ungu tersebut merupakan warna dari kompleks pati-iodin. Iodin dan pati akan saling berinteraksi, iodin tersebut terperangkap dalam struktur pati. Pada akhirnya terjadi komplek pati-iodin tersebut yang berwarna.

Reaksi tersebut merupakan reaksi yang bersifat spesifik terhadap pati. Dengan demikian, uji tersebut dapat digunakan sebagai analisis pati dalam sampel baik kualitatif maupun kuantitatif. Keberadaan -amilase akan mendegradasi pati menjadi glukosa, sehingga warna biru/ungu yang terbentuk semakin hilang (muncul di daerah terang). Aktivitas -amilase dapat diperiksa dengan hilangnya warna biru/ungu (muncul di daerah terang) pada medium pertumbuhan setelah penambahan iodin.2. Amilopektin

Amilopektin seperti amilosa juga mempunyai ikatan -(1,4) pada rantai lurusnya, serta ikatan -(1,6) pada titik percabangannya. Ikatan percabangan tersebut berjumlah sekiar 4 5 % da ri seluruh lkatan yang ada pada amilopektin (Hodge dan Osman, 1976 ; Fennema, 1976). Biasanya amilopektin mengandung 1000 atau lebih unit molekul glukosa untuk setiap rantai. Berat molekul amilopektin glukosa untuk setiap rantai. Berat molekul amilopektin bervariasi tergantung pada sumbernya. Amilopektin pada pati umbi-umbian mengandung sejumlah kecil ester fosfat yang terikat pada atom karbon ke 6 dari cincin glukosa (G reenwood dan Munro, 1976).

Amylose models. Amylose can be depicted as either a straight chain or helix.

Amilopektin dan amilosa mempunyai sifat fisik yang berbeda. Amilosa lebih mudah larut dalam air dibandingkan amilopektin. Bila amilosa direaksikan dengan larutan iod akan membentuk warna biru tua, sedangkan amilopektin akan membentuk warna merah. Dalam produk makanan amilopektin bersifat merangsang terjadinya proses mekar (puffing) dimana produk makan yang berasal dari pati yang kandungan amilopektinnya tinggi akan bersifat ringan, porus, garing dan renyah. Kebalikannya pati dengan kandungan amilosa tinggi, cenderung menghasilkan produk yang keras, pejal, karena proses mekarnya terjadi secara terbatas. Kadar amilosa dan amilopektin pada pati dapat dilihat pada table berikut ini

Granula PatiPati dalam jaringan tanaman mempunyai bentuk granula (butiran) yang berbeda-beda. Penampakan mikroskopik dari granula pati seperti bentuk, ukuran, keseragaman, letak hilum bersifat khas untuk setiap jenis pati, oleh karena itu dapat digunakan untuk identifikasi dan demikian juga dengan sifat birefringen dari masing- masing pati berbeda.

Bentuk butiran pati secara fisik berupa semikristalin yang terdiri dari unit kristal dan unit amorf (Bank dan Greenwood, 1975). Unit kristal lebih tahan terhadap perlakuan asam kuat dan enzim. Bagian amorf dapat menyerap air dingin sampai 30% tanpa merusak struktur pati secara keseluruhan (Hodge dan Osman, 1976). Sampai saat ini diduga bahwa amilopektin merupakan komponen yang bertanggung jawab terhadap sifat-sifat kristal dari granula pati (Bank, 1973).

Pemeriksaan dengan polirizing microscope memperlihatkan bahwa pati dengan amilopektin tinggi tetap memperlihatkan pola birefringen-nya seperti pati normal, sementara pati dengan kandungan amilosa yang tidak tinggi dan tidak memperlihatkan pola seperti dari normal (Baker dan Whelan, 1950).

Menurut Kulp (1975) pati yang berasal dari biji-bijian tertentu hanya mengandung amilopektin saja yang dikenal dengan istilah waxy atau lilin. Spesies yang penting adalah sorgum lilin, jagung lilin dan berat lilin.B. Sumber-Sumber Pati

1. Beras Bagian terbesar beras didominasi oleh pati (sekitar 80-85%). Beras juga mengandung protein, vitamin (terutama pada bagian aleuron), mineral, danair. Pati beras dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu amilosa pati dengan struktur tidak bercabang dan amilopektin dengan struktur bercabang. Perbandingan komposisi kedua golongan pati ini sangat menentukan warna (transparan atau tidak) dan tekstur nasi (lengket, lunak, keras, atau pera). Ketan hampir sepenuhnya didominasi oleh amilopektin sehingga sangat lekat, sementara beras pera memiliki kandungan amilosa melebihi 20% yang membuat butiran nasinya terpencar-pencar (tidak berlekatan) dan keras. Karbohidrat merupakan penyusun utama beras dan sebagian besar dari karbohidrat ini adalah pati. Sedang karbohidat lain seperti pentosa dan selulosa, hemiselulosa dan gula hanya terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit. Oleh karena itu pati merupakan fraksi terbesar dalam beras, maka sifat fisikokimia pati mempunyai peranan penting dalam penentuan sifat fisikokimia beras. Berdasarkan kandungan amilosanya, beras dibagi menjadi empat golongan, yaitu ketan (2-9 persen), beras beramilosa rendah (9-20 persen), beras beramilosa sedang (20-25 persen) dan beras beramilosa tinggi (25-33 persen). Secara umum, beras memiliki bentuk polygonal bulat dengan ukuran bulat 3-8 mikron, dan suhu gelatinisasi 68-78oC.Beras ketan dan beras biasa (non ketan) berbeda kandungan amylosa dan amylopektinnya. Amylosa berantai lurus dengan ikatan 1-4 alfa-glikosidik, sedangkan amylopektin berantai cabang dengan ikatan 1-4 alfa dan 1-6 beta glikosidik pada percabangannya dengan panjang rantai 20 26 satuan glukosa. Ketan (atau beras ketan), berwarna putih, tidak transparan, seluruh atau hampir seluruh patinya merupakan amilopektin. Perbandingan antara amilosa dan amilopektin ini dijadikan dasar atau merupakan factor tunggal dalam menentukan mutu rasa dan tekstur nasi. Kandungan amilosa tersebut berkorelasi positif dengan tingkat kelemahan, kelengketan, warna dan kilap. Semakin tinggi kadar amilosa volume nasi yang diperoleh makin besar tanpa kecenderungan mengempes, hal ini dikarenakan amilosa mempunyai kemampuan retrogadasi yang lebih besar. Beras dengan kandungan amilosa tinggi menghasilkan nasi pera dan kering, sebaliknya beras dengan kandungan amilosa rendah menghasilkan nasi yang lengket dan lunak. Semakin tinggi kandungan atau kadar amylose yang terkandung, maka akan semakin berkurang keenakan rasanya karena semakin tinggi kadar amylose yang terkandung, maka struktur nasi yang diperoleh akan semakin keras dan mempunyai struktur pisah-pisah.2. Jagung Jagung (Zea mays) merupakan salah satu serealia yang strategis dan bernilai ekonomis serta mempunyai peluang untuk dikembangkan karena kedudukannya sebagai sumber utama karbohidrat dan protein setelah beras. Selain sebagai sumber karbohidrat, jagung juga merupakan sumber protein yangpenting dalam menu masyarakat Indonesia. Kandungan gizi utama jagung adalah pati (72-73%), dengan perbandingan amilosa dan amilopektin 25-30% : 70-75%, namun pada jagung pulut (waxy maize) 0-7% : 93-100%. Kadar gula sederhana jagung (glukosa, fruktosa, dan sukrosa) berkisar antara 1-3%. Kandungan karbohidrat dapat mencapai 80% dari seluruh bahan kering biji. Karbohidrat dalam bentuk pati umumnya berupa campuran amilosa dan amilopektin. Pada jagung ketan, sebagian besar atau seluruh patinya merupakan amilopektin. Perbedaan ini tidak banyak berpengaruh pada kandungan gizi, tetapi lebih berarti dalam pengolahan sebagai bahan pangan. Biji jagung mengandung pati 54,1-71,7%, sedangkan kandungan gulanya 2,6-12,0%. Karbohidrat pada jagung sebagian besar merupakan komponen pati, sedangkan komponen lainnya adalah pentosan, serat kasar, dekstrin, sukrosa, dan gula pereduksi.

3. Gandum Gandum (Triticum spp.) adalah sejenis tanaman yang kaya akan karbohidrat. andum biasanya digunakan untuk memproduksi tepung terigu, pakan ternak, ataupun difermentasi untuk menghasilkan alkohol. Biji gandum terdiri atas: 83%endosperma, 14.5% bran dan aleurone layer, 2.5% germ. Tepung terigu adalah tepung/bubuk halus yang berasal dari biji gandum,dan digunakan sebagai bahan dasar pembuat kue, mi dan roti.Tepung terigu mengandung banyak zat pati, yaitu karbohidrat kompleks yang tidak larut dalam air. Tepung terigu juga mengandung protein dalam bentuk gluten, yang berperan dalam menentukan kekenyalan makanan yang terbuat dari bahan terigu. Tepung terigu mengandung banyak zat pati, yaitu karbohidrat kompleks yang tidak larut dalam air. Tepung terigu jugamengandung protein dalam bentuk gluten, yang berperan dalam menentukan kekenyalan makanan yang terbuat dari bahan terigu. Pati gandum berbentuk datar, bulat, dan elips. Ukuran granula patinya berkisar 2-35 mikron dan suhu gelatinisasinya 58-64oC.

4. Singkong Umbi akar singkong banyak mengandung glukosa dan dapat dimakan mentah. Dari umbi ini dapat pula dibuat tepung tapioka. Tapioka adalah pati yang diperoleh dari hasil ekstrak ubi kayu, dimana pati itu terdiri dari dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas. Fraksi terlarut disebut amilosa dan yang tidak larut disebut amilopektin. Tepung tapioca mengandung 17 % amilosa dan 83 % amilopektin. Perbandingan amilosa dan amilopektin mempengaruhi sifat kelarutan dan derajat gelatinisasi pati. Semakin kecil kandungan amilosa atau semakin tinggi kandungan amilopektinnya, maka pati cenderung menyerap air lebih banyak (Tjokroadikusumo, 1986). Gelatinisasi suhu berkisar antara 58,8oC-70oC. Pati yang kandungan amilopektinnya tinggi akan membentuk gel yang tidak kaku, sedangkan pati yang kandungan amilopektinnya rendah akan membentuk gel yang kaku. Pati jagung berbentuk bulat dengan ukuran granula patinya berkisar 5-25 mikron.5. Kentang Kentang (Solanum Tuberosum) merupakan umbi dari bagian batang tanaman. Kentang merupakan tanaman berbentuk semak/herba. Secara kimia, umbi kentang banyak mengandung air. Pati yang dihasilkan memiliki sifat yang berbeda-beda tergantung dari jenis patinya. Kentang memiliki bentuk bulat telur pada granulanya, berukuran 15-100 mikron, dan suhu gelatinisasinya 58-66oC.

6. SaguPati sagu merupakan hasil ekstraksi empulur pohon sagu (Metroxylon sp) yang sudah tua (berumur 8-16) tahun. Komponen terbesar yang terkandung dalam sagu adalah pati. Pati sagu tersusun atas dua fraksi penting yaitu amilosa yang merupakan fraksi linier dan amilopektin yang merupakan fraksi cabang. Kandungan amilopektin pati sagu adalah 73% 3. Pati sagu memiliki karakteristik yaitu memiliki ukuran granula rata-rata 30, kadar amilosa 27% 3, suhu gelatinisasi pati 700C, entalpy gelatinisasi 15-17 J/g, dan termasuk tipe C pada pola X-ray difraction. Sifat pati sagu berbeda dengan pati gandum.

C. Biokonversi pati menjadi glukosa menjadi menjadi alkohol

Amilosa dihidrolis dengan alfa amilase

Amilopektin dihidrolisis dengan alfa amilase

Glukosa diglikolisis menjadi asam piruvatAsam piruvat dirubah menjadi etanol

D. Enzim yang terlibat pada proses biokonversi pati menjadi glukosa dan alkohol Tahap reaksiEnzim yang digunakan

Hidrolisis pati menjadi glukosa-amilase

Gikolisis (10 tahap)

Tahap 1

Tahap 2

Tahap 3

Tahap 4

Tahap 5

Tahap 6

Tahap 7

Tahap 8

Tahap 9

Tahap 10Glukokinase

Fosfoglukoisomerase

Fosfofruktokinase

Aldolase

Triosafosfat isomerase

Gliseraldehid 3-P dehidrogenase

Fosfogliserat kinase

Fosfogliserat mutase

Enolase

Piruvat kinase

Fermentasi alkohol

Piruvat menjadi asetadehid

Asetaldehid menjadi etanolPiruvat dekarboksilase

Alkohol dehidrogenase

Alfa-amilase

(bahasa Inggris:alpha-amylase, 1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase, pancreatic alpha-amylase, -amilase, PA) adalah salah satuenzimyang berperan dalam proses degradasipati, sejenismakromolekulkarbohidrat.Struktur molekuler dari enzim ini adalah -1,4-glukanohidrolase.Bersama dengan enzim pendegradasi pati lain,pululanase, -amilase termasuk ke dalam golongan enzim kelas 13 glikosil hidrolase (E.C.3.2.1.1).Alpha-amilase ini memiliki beberapa sisi aktif yang dapat mengikat 4 hingga 10 molekul substrat sekaligus. Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil (Reddy et al., 2003).

Amilase telah banyak dilaporkan bahwa dapat diproduksi oleh mikroorganisme. Walaupun begitu, amilase juga dapat ditemukan pada jaringan hewan dan tumbuhan. Dua kelompok utama enzim amilase yang telah diidentifikasi di dalam mikroorganisme, yaitu -amilase dan Glukoamilase (Pandey, 2000).Hidrolisis amilosa oleh -amilase terjadi melalui dua tahap. Tahap pertama adalah degradasi amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa yang terjadi secara acak, sangat cepat dan diikuti dengan penurunan viskositas. Tahap kedua merupakan proses degradasi yang relatif lebih lambat yaitu pembentukan glukosa dan maltosa sebagai hasil akhir, dimulai dari ujung pereduksi secara teratur (Winarno ,1983). Kerja - amilase pada molekul amilopektin akan menghasilkan glukosa dan oligosakarida (Winarno, 1983).Penggunaan -amilase dalam proses hidrolisa pati sering juga disebut likuifikasi, karena adanya penurunan viskositas dengan cepat, dan kecepatannya dapat bervariasi untuk berbagai substrat. Enzim -amilase dapat diisolasi dari berbagai sumber mikroorganisme seperti Aspergilus oryzae, Aspergilus niger, Bacillus substilis, Endomycopsis fibuligira, dan sebagainya. Khusus -amilase dari Bacillus substilis, merupakan sumber terpenting dalam proses likuifikasi di industri, karena -amilase dari mikroorganisme ini mampu bereaksi pada temperatur yang tinggi diatas temperatur gelatinisasi dari granula pati.Dalam hidrolisa pati, -amilase menghasilkan dekstrin yang merupakan substrat untuk tahap selanjutnya, yaitu bagi enzim glukoamilase sehingga dengan mudah enzim ini mengkatalisis hidrolisa untuk menghasilkan glukosa. Karakterisasi Enzim1. Pengaruh suhu dan waktuPengaruh suhu pada reaksi enzimatik merupakan suatu fenomena yang kompleks, dimana pada umumnya semakin tinggi suhu, laju reaksi kimia baik yang dikatalisis maupun tidak dikatalisis oleh enzim akan semakin meningkat. Sampai batas tertentu kenaikan suhu akan mempercepat reaksi enzimatik, Tetapi pada suhu yang lebih tinggi protein enzim akan terdenaturasi sehingga aktivitasnya menurun. (Winarno,1983).Suhu optimum merupakan suhu dimana enzim menunjukkan aktivitas yang optimum. Meningkatnya aktivitas enzim sampai suhu optimum tertentu, disebabkan oleh bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk berinteraksi.2. Pengaruh pHPada umumnya enzim bersifat amfolitik, yang berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam dan basanya terutama pada gugus terminal karboksil dan gugus terminal amino. Perubahan pH lingkungan dapat menyebabkan perubahan aktivitas enzim (Winarno, 1983)Enzim memiliki pH optimum tertentu yaitu pH dimana enzim mempunyai aktivitas maksimum. pH optimum pada tahap gelatinisasi dan liquifikasi menggunakan enzim -amilase adalah 5,3 - 6,5 (Chaplin, 2004).

3. Pengaruh konsentrasi substratPenambahan konsentrasi substrat hingga level tertentu dapat menurunkan laju reaksi. Hal ini terjadi karena substrat akhirnya menjadi inhibitor pada enzim, dimana begitu banyaknya substrat menyebabkan terjadinya persaingan antar substrat untuk menempati sisi aktif enzim. Sehingga tidak ada substrat yang dapat menempatinya dan reaksi tidak terjadi atau dapat terjadi namun membutuhkan waktu yang lama(Husnil, 2009).E. Sumber enzim untuk biokonversi pati

Enzim banyak digunakan dalam industri karena enzim merupakan biokatalisator, yang artinya, enzim dapat meningkatkan kecepatan reaksi kimia (Marks, 2000). Enzim juga merupakan produk yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Salah satu jenis enzim yang banyak dimanfaatkan dalam industri adalah amilase. Amilase banyak digunakan dalam berbagai keperluan, khusunya dalam industri pangan dan tekstil. Amilase digunakan dalam industri gula cair, pembuatan pati termodifikasi, tekstil. Amilase terdapat pada tanaman, jaringan mamalia dan tersebar luas pada berbagai mikroorganisme seperti bakteri dan jamur / kapang akan tetapi memproduksi enzim dengan menggunakan mikroorganisme dari jamur lebih menguntungkan dibandingkan dari sumber lainnya karena dapat menghasilkan enzim dengan cepat dan biaya produksinya lebih murah serta isolasi enzimnya pun relatif lebih mudah. Selain itu jamur mempunyai kelebihan diantaranya -amilase yang dihasilkan dari jamur lebih stabil jika dibandingkan dengan -amilase yang dihasilkan dari bakteri sehingga lebih menguntungkan jika digunakan untuk kepentingan industri. Jamur / kapang yang mampu menghasilkan alpha amilase diantaranya adalah Aspergillus oryzae.

Produksi Enzim alpha Amylase dari Bakteri Aspergillus Oryzae1. Pembuatan Media Produksi EnzimMedium produksi: kulit buah kakao, dedak padi, tepung beras, larutan mineral terdiri dari NaNO3 20 g/L air, KH2PO4 3 g/L air, MgSO4 0,5 g/L air, KCl 0,5 g/L air. CaCl2.2H2O 0,2 g/L air, FeSO4.7H2O 0,01 g/L air. semua bahan dimasukkan dalam Erlenmeyer volume 1000 ml, ditambahkan aquadest dan diaduk hingga homogen, lalu dipanaskan sesuai dengan variable A. Komposisi media dapat dilihat pada Tabel 3.Tabel 3. Komposisi Media FermentasiKulit Buah KakaoDedakLarutan Mineral

23 % (5 gr)9 % (2 gr)68 % (15 ml)

2. Percobaan penambahan larutan mineralLarutan mineral dimasukkan dalam Erlenmeyer yang berisi media fermentasi. Variasi percobaan larutan mineral adalah:

a. 5 gram kulit kakao + 2 gram dedak padi + 25 ml air mineral

b. 5 gram kulit kakao + 2 gram dedak padi + 20 ml air mineral

c. 5 gram kulit kakao + 2 gram dedak padi + 15 ml air mineral

d. 5 gram kulit kakao + 2 gram dedak padi + 10 ml air mineral

3. Penyiapan Suspensi SporaSuspensi spora disiapkan dengan menambahakan aquadest ke dalam media agar miring dan permukaan agar yang telah ditumbuhi spora jamur kemudian digosok secara perlahn dengan menggunakan jarum ose steril. Jumlah spora dihitung dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop (pembesaran 40 X 10). Pada penyiapan spora ini dilakukan variasi perlakuanpenambahan aquadest steril pada tabung reaksi yang berisi spora kapang. Variasi percobaan adalah:

a. satu tabung reaksi berisi spora Aspergillus oryzae + 5 ml aquadest steril.

b. Satu tabung reaksi berisi spora Aspergillus oryzae + 4 ml aquadest steril

c. Satu tabung reaksi berisi spora Aspergillus oryzae + 3 ml aquadest steril

4. Produksi EnzimLarutan spora kemudian diinokulasi pada medium produksi sebanyak 1 ml dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 96 jam (4X24 jam), kemudian kultur dihentikan. Selama fermentasi media berlangsung, dilakukan perhitungan berat kering kultur setiap 24 jam.

5. Isolasi EnzimPemanenan enzim dalam media fermentasi dilakukan dengan menghentikan proses fermentasi dengan menambahkan larutan twin 80 0,1% (b/v) ke dalam media. Selanjutnya dikocok selama 15 menit dengan kecepatan 130 rpm, kemudian di saring. Filtrat enzim hasil saringan disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Filtrat yang mengandung enzim dimasukkan dalam botol tertutup dan disimpan dalam refrigerator pada suhu (-20)-(-40)oC.6. Uji Aktivitas EnzimPengujian aktivitas enzim amilase dilakukan pada filtrate kultur jamur Aspergillus oryzae

Diagram Alir Produksi Enzim alpha Amylase dari Bakteri Aspergillus OryzaeAspergillus oryzaeAspergillus oryzae termasuk kapang / jamur dari genus Aspergillus. Aspergillus oryzae bersifat kosmopolit artinya dapat ditemukan pada aneka substrat terutama pada makanan fermentasi serta pada lingkungan industri. Aspergillus oryzae digunakan dalam fermentasi tahap pertama dalam pembuatan kecap dan tauco.Aspergillus oryzae memerlukan nutrient untuk pertumbuhannya. Nutrient berupa unsur-unsur atau senyawa kimia, dari lingkungan digunakan sel sebagai konstituen kimia penyusun sel. Secara umum, nutrient yang diperlukan dalam bentuk karbon, nitrogen, sulfur, kalium, magnesium, natrium, kalsium, nutrient mikro (besi, mangan, zinc, kobalt, molybdenum) dan vitamin. Aspergillus oryzae dapat tumbuh dengan baik pada suhu 35-37oC dan pada selang pH 2 - 8,5.

F. Informasi Enzim -Amylase pada database GenBank, PDB, dan CAZy

Telah dijelaskan sebelumnya bahwa enzim yang terlibat dalam proses biokonversi amilum menjadi glukosa dan fruktosa adalah enzim -Amylase. Informasi enzim -Amylase tersebut pada database GenBank, PDB, dan CAZy adalah

1. Informasi enzim inulinase pada data base GenBank

Berikut adalah langkah-langkah dalam pencarian informasi enzim inulase pada data base GenBank :

a. Membuat kata kunci genbank di situs google. Kemudian, klik GenBank atau klik website www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

b. Kemudian, setelah memasuki website www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, pada isian nucleotide pilih protein.

c. Pada isian search ketik kata alpha amylase. Lalu, baru klik search.

d. Kemudian, pada website tersebut akan muncul 252.220 jenis penghasil enzim -amylase.

e. Dimana, pada makalah kelompok kami, kami memilih jenis -amylase [Aspergillus Oryzae]. Karena terlalu banyak, kita spesifikkan dengan mengetik nama organismenya. Sehingga muncul 115, kemudian kita pilih -amylase Aspergillus Oryzae.

f. Lalu, pada website akan tampil informasi-informasi mengenai enzim yang dihasilkan oleh Aspergillus Oryzae. Beberapa informasi penting di dapatkan adalah bahwa Aspergillus Oryzae ini tergolong ke dalam jenis bakteri. Dan juga kita dapatkan informasi bahwa residu asam amino yang terdapat pada enzim -amylase yang dihasilkan oleh Aspergillus Oryzae adalah sebanyak 499 aa protein.

g. Untuk melihat residu asam amino yang terdapat dalam bakteri Aspergillus Oryzae dapat dilihat dibagian bawah situs atau bisa juga dengan mengklik FASTA maka akan terlihat residu asam aminonya.

h. Untuk melihat informasi yang lebih pada bakteri Aspergillus Oryzae, kita klik EC number 3.2.1.1

i. Kemudian, akan muncul tampilan seperti gambar dibawah ini.

Dimana jika ingin mendapatkan informasi tambahan dari enzim dapat mengklik BRENDA / EC2PDB / ExplorEnz , dll sesuai yang ada pada bagian Cross-references.

j. Tetapi, kami memilih bagian EC2PDB maka akan muncul tampilan seperti dibawah ini :

Informasi yang bisa didapatkan dari tampilan gambar tersebut adalah :

Enzim -amylase termasuk :

Enzim hydrolase EC 3.-.-.-

Glycosylases EC 3.2.-.-

Glycosidase EC 3.2.1.-

-amylase EC 3.2.1.1

Table 1. The members of the -amylase family (clan GH-H).

Enzyme classEnzymeECGH

Hydrolases-Amylase3.2.1.113

Oligo-1,6-glucosidase3.2.1.1013

-Glucosidase3.2.1.2013

Pullulanase3.2.1.4113

Amylopullulanase3.2.1.1/4113

Cyclomaltodextrinase3.2.1.5413

Maltotetraohydrolase3.2.1.6013

Isoamylase3.2.1.6813

Dextran glucosidase3.2.1.7013

Trehalose-6-phosphate hydrolase3.2.1.9313

Maltohexaohydrolase3.2.1.9813

Maltotriohydrolase3.2.1.11613

Maltogenic -amylase3.2.1.13313

Maltogenic amylase3.2.1.13313

Neopullulanase3.2.1.13513

Maltooligosyltrehalose hydrolase3.2.1.14113

Maltopentaohydrolase3.2.1.-13

Sucrose hydrolase3.2.1.-13

TransferasesAmylosucrase2.4.1.413

Glucansucrase2.4.1.570

Sucrose phosphorylase2.4.1.713

Glucan branching enzyme2.4.1.1813

Cyclodextrin glucanotransferase2.4.1.1913

4--Glucanotransferase (Amylomaltase)2.4.1.2513, 77

Glucan debranching enzyme2.4.1.25/3.2.1.3313

Alternansucrase2.4.1.14070

Maltosyltransferase2.4.1.-13

IsomerasesIsomaltulose synthase5.4.99.1113

Maltooligosyltrehalose synthase5.4.99.1513

Trehalose synthase5.4.99.1613

HATsarBAT protein---13

4F2hc antigen---13

a HATs means the heteromeric amino acid transporter proteins. Adapted from JANECEK (2009).

G. Mekanisme kerja enzim

-Amilase (EC 3.2.1.1) merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan -1,4 gliosidik pada pati dan glikogen dengan produk akhir berupa dekstrin dan oligosakarida. -Amilase merupakan enzim amilolitik yang berfungsi untuk mempercepat laju reaksi degradasi bagian linear pati. Enzim -Amilase bekerja dengan mekanisme katalitik yang disebut - retaining double displacement yaitu mekanisme yang melibatkan dua residu katalitik pada sisi aktif. Residu katalitik tersebut beruapa residu asam glutamate (Glu230) sebagai katalis asam serta residu asam aspartat (Asp206) sebgai nukleofil. Reaksi ini berlangsung dalam tahapan berupa substrat terikat pada sisi aktif,lalu asam glutamate mendonorkan sebuah proton pada oksigen dari ikatan glikosidik sehingga terbentuk oksokarbonium pada keadaan transisi yang diikuti dengan pembentukan kovalen intermediet, molekul glukosa yang terprotonasi meninggalkan sisi aktif pada saat molekul air atau glukosa baru berpindah ke sisi aktif, ion oksokarbonium terbentuk kembali kemudian residu asam glutamate menerima satu hydrogen dari molekul glukosa baru dan menggantikan ikatan oksokarbonium.

Alfa-amilase pada umumnya aktif bekerja pada kisaran suhu 250C hingga 950C. Penambahan ion kalsium dan klorida dapat meningkatkan aktivitas kerja dan menjaga kestabilan enzim ini. Alfa-amilase akan memotong ikatan glikosidik -1,4 pada molekul pati (karbohidrat) sehingga terbentuk molekul-molekul karbohidrat yang lebih pendek. Hasil dari pemotongan enzim ini antara lain maltosa, maltotriosa, dan glukosa.

DAFTAR PUSTAKA

http://www.publish.csiro.au/paper/PP9800035.htmhttp://en.wikipedia.org/wiki/Pyruvate_decarboxylasehttp://aem.asm.org/cgi/content/full/65/2/523http://www.interscience.wiley.com/journal/110547829/abstracthttp://www.en.wikipedia.com/pyruvate decarboxylase

Janecek, Stefan.Amylolytic Enzymes-Fokus On The Alpha-Amylases From Archaea And Plants.2009. Department of Biotechnology, University of SS. Cyril and Methodius

Kimmerer, Thomas W., Alcohol Dehydrogenase and Pyruvate Decarboxylase Activity in Leaves and Roots of Eastern Cottonwood (Populus deltoides Bartr.) and Soybean (Glycine max L.) (1987). Plant Physiol 4:121-1213).

Neale, Alan. D., Scopes, Robert. K., Wettenhall, Richard E. H., Hoogenraad, Nicholas J. (1986). Pyruvate Decarboxylase of Zymomonas mobilis: Isolation, Properties, and Genetic Expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 169:1024-1028

Old.analytical.chem.itb.ac.id/.../Citra_Resdia_10505082_Makalah_.doc(primer)

Nova Biotechnologica 9-1 (2009)