LTM DETEKSI PROTEIN

8/17/2019 LTM DETEKSI PROTEIN

1/16

DETEKSI PROTEIN

Nadya Saarah Amelinda (1406552824)

Teknik Kimia, Departemen Teknik Kimia, Unier!ita! "nd#ne!ia, Kamp$! Unier!ita! "nd#ne!ia,Dep#k 16424, "nd#ne!ia

ABSTRAK

%r#tein adalah p#limer dari a!am amin# dan mer$pakan makr#m#lek$l &ert m#lek$l tin''i$n'!i pr#tein !e*ara $m$m !e&a'ai !$m&er ener'y ketika ke&$t$han t$&$h terhadap ener'ytidak terpen$hi #leh karhidrat dan lemak!e&a'ai &ahan !tr$*t$ral, !e&a'ai en+im dan !e&a'aime!in yan' &ekera pada tin'kat m#le*$lar Terdapat d$a met#de yan' &i!a men'anali!i! pr#tein,yait$ !e*ara k$alitati- dan k$antitati-

Anali!i! !e*ara k$alitati- terdiri dari, anali!i! &erat m#lek$l (elektr#-#re!i! pr#tein), !tr$kt$r (kri!tal#'ra-i !inar ., !pektr#!k#pi N/, D!pektr#!k#pi), $r$tan a!am amin# (!ek$en!in'), $ia!am amin# (3ant#pr#tein, reak!i #pkin!*#le, reak!i natri$mnitr#pr$!ida, reak!i !aka'$*hi), $ipr#tein ($i &i$ret, $i ninhidrin, reak!i mill#n), met#de e!tern i#ttin', met#de %en'endapan%r#tein, anali!i! i#kimia dan i#-i!ika (met#de SDS %a'e, %7, DS)

Sementara met#de anali!i! k$antitati- terdiri dari anali!i! lan'!$n' (!pektr#m#metri lan'!$n'),pearnaan (met#de l#ry, met#de &$iret, $i A, $i rad-#rd), !pektr#!k#pi U99"S, titra!i(kehdahl, titra!i -#rm#l)

Kata Kunci : Protein, asam anmino, metode kualitatif, metode kuantitatif, amino acid analysis,CDS, X-Ray chrystallography, NMR Spectroscopy, uji komposisi secara umum, dengan sulfur,dengan nitrogen organic, P!C, SDS-Page, DSC, ninhidrin, sakaguchi, sulfur, Dia"o #hrlich, $cree-Rosenheim, %iuret, millon, &antoprotein, natrium ropusida, 'opkins cole, metode kjehdahl dan spektroskopi ()-)*S+

PENDAHULUAN

%r#tein &era!al dari kata pr#t#! yan' memiliki arti :yan' palin' $tama; dalam &aha!a y$nani%r#tein, yan' mer$pakan p#limer a!am amin#, adalah !alah !at$ &i#makr#m#lek$l &ertm#lek$l tin''i yan' memiliki peranan yan' pentin' &a'i makhl$k hid$p Tanpa memerhatikan-$n'!i ata$ eni! dari !em$&ernya, !el$r$h pr#tein di&$at dari d$a p$l$h a!am amin# yan' di!$!$ndari ran'kaian yan' &eraria!i Un!$r $tama peny$!$n pr#tei adalah (50


2/16

Gambar 1. Struktur ProteinSumber: www.sciencebiotech.net

ANALISIS DETEKSI PROTEIN

%r#tein tidaklah !ama antara yan' !at$ dan yan' lainnya %r#tein di&edakan &erda!arkan

tipe, $mlah, dan $'a !$!$nan a!am amin#nya %er&edaan yan' ada ini menye&a&kan per&edaan!tr$kt$r m#le*$lar, kand$n'an n$tri!i, dan !i-at -i!i#kimia Dalam men'anali!i! makanan,men'etah$i kadar t#tal, eni!, !tr$kt$r m#lek$l dan !i-at -$n'!i#nal dari pr#tein !an'atlah pentin'Unt$k men'anali!i! pr#tein pada &ahan makanan terdapat d$a met#de yan' &i!a di'$nakan, yait$!e*ara k$alitati- dan k$antitati-

1. METODE KUALITATIF Anali!i! pr#tein !e*ara k$alitati- memiliki t$$an $nt$k men'etah$i anali!i! !tr$kt$r, $i

k#mp#!i!i pr#tein, anali!i! &ik#mia &i#-i!ika, dan $i reak!i arna

1.1. ANALISIS BERAT MOLEKUL

Elektr!re"i" PrteinSeperti halnya den'an elektr#-#re!i! DNA, elektr#-#re!i! pr#tein mem$n'kinkan kita $nt$k

memi!ahkan pr#tein &erda!arkan $k$rannya dan memperlihatkan ha!ilnya Akan tetapi pr#tein

a$h le&ih &era'am dalam $k$ran dan !tr$kt$rnya, karena it$ tekniknya a$h le&ih r$mit %ada

da!arnya alat elektr#-#re!i! terdiri ata! 2 &a'ian $tama yait$ &a'ian ele*tri* tran!-#rmer yan'

men'$&ah ar$! A ke D dan &a'ian tanki elektr#-#re!i! yan' &eri!i -lat &ed, !la&, *#l$mn, dan

!elan' e&erapa -akt#r yan' mempen'ar$hi pemi!ahan k#mp#nen pada elektr#-#re!i! pr#tein B

1 Den!ita! m$atan m#lek$l C &er&eda diantara p media dan pl m#lek$l

2 %en'ar$h &$--er

p B akan mempen'ar$hi den!ita! m$atan pr#tein dan aki&atnya mempen'ar$hitin'kat dan arah per'erakannya

Kek$atan i#nik B mempen'ar$hi tin'kat pemi!ahan

K#mp#!i!i B &i!a &erinterak!i den'an pr#tein menye&a&kan per$&ahan dalam den!ita!m$atan !e&a'ai *#nt#h i#n rak dan 'lik#pr#tein

? ent$k dan $k$ran m#lek$l

4 /edia pend$k$n'

e!trik!i pada m#&ilita!

%en'ar$h di-$!i


3/16

Gambar 2. Grafk perkembangan per tahun dalam menganalisis struktur dengan x-raySumber: P!

ambar ". #asil di$raksi %ristal oleh penyinaran sinar xSumber: http:&&www.'ic.ac.uk&

lektr#end#!m#!i!

/ikr#heter#'enita! m#lek$ler !pe!ie!

1.#. ANALISIS STRUKTUR

A. $ircular Dic%ri"& S'ectr"c'( ) $D "'ektr"k'i/et#de ir*$lar Di*hr#i!m Spe*tr#!*#py (DS) ini di'$nakan $nt$k men'anali!i! !tr$kt$r

!ek$nder dan !tr$kt$r ter!ier Selain it$ -$n'!i DS ini $'a $nt$k men$n$kkan per&andin'ank#n-#rma!i dan menent$kan apakah interak!i pr#teinpr#tein ata$ pr#teinli'an men'$&ahk#n-#rma!i pr#tein %rin!ip dari met#de DS ini adalah men'$k$r per&edaan penyerapan le-thanded p#lari+ed li'ht ri'hthanded p#lari+ed li'ht Spektr$m!pektr$m D dari p$ntiranal-amen$n$kkan d$a a&!#r&an! ne'atie pada panan' 'el#m&an' 208 nm dan 220 nm, lempen'&eta men$$kkan !at$ p$n*ak ne'atie !ekitar 210216 nm Den'an mem&an'$n data&a!epr#tein &er!tr$kt$r !er$pa, melal$i anali!a *#mp$ter, dapat dipi!ahkan elemen dari ma!in'ma!in'!tr$kt$r Dipad$ den'an kek$atan t##l! &i#in-#rmatika !ehin''a &i!a diper#leh !tr$kt$r pr#teinyan' &er!an'k$tan, ala$p$n meman' tidak menela!kan !e*ara terperin*i hin''a leel at#m

!tr$kt$r pr#tein

B. *+Ra( $r("tall,ra'%( ) Kri"tal,ra!i Sinar *.ray

ry!t#ll#'raphymer$pakan !alah!at$ met#de yan'di'$nakan $nt$kmenent$kan!tr$kt$r ter!ier dari pr#tein .ray

*ry!tall#'raphypada da!arnyaadalah !e&$ah&ent$k mikr#!k#pyan' &ere!#l$!itin''i Sehin''amem$n'kinan$nt$k memi!$ali!a!ikan !tr$kt$r pr#tein !ampai tin'kat at#m erda!arkan 'am&ar 2 dapatterlihat &aha le&ih dari 85< !tr$kt$r pr#tein &i!a teridenti-ika!i den'an men''$nakan 3ray*ry!tall#'raphy ini

/en'apa men''$nakan !inar .E karena $nt$k melihat pr#tein !e*ara detai at#m, diperl$kan

radia!i elektr#ma'netik den'an panan' 'el#m&an' 0,1 nm ata$ den'an kata lain men''$nakan!inar 3 %rin!ip keranya adalah men'$k$r !$d$t dan inten!ita! dari Kri!tal terdi-rak!i yan' &i!amen'ha!ilkan 'am&ar ti'a dimen!i dari kepadatan ele*tr#n di dalam Kri!tal %ada mikr#!k#p*ahaya, !$&ek di!inari den'an *ahaya dan menye&a&kan radia!i yan' akan terdi-rak!i ke !e'alaarah #leh kri!tal al#k di-rak!i kem$dian akan dik$mp$lkan, dan den'an -#*$! dan per&e!arandari len!a mikr#!k#p akan mem&erikan 'am&ar yan' diper&e!ar dari #&ek al yan' diharapkanadalah &el#k terdi-rak!i dan di-#k$!kan den'an men''$nakan ma'net, nam$n hal it$ tidak

mem$n'kinkan !ehin''a har$! dilak$kan !e*aramatemati!

al pertama yan' har$! dilak$kan adalahmemper!iapkan !ampel m$rni yan' akan

di'#l#n'kan den'an &e&erapa kriteria Se&el$mper*#&aan dim$lai, !ampel yan' dipilih har$!dikri!talkan terle&ih dah$l$ (pr#!e! pen'kri!talanle&ih len'kap &i!a dilihat diB


4/16

Gambar (. %omponen )*+ SpectroscopySumber:

httpBFFi*a*$kF!ta--Fdaidla!#nF3tall#'F!$mmaryhtm ) Setelah Kri!tal telah ada, makaKri!tal ter!e&$t akan di$i den'an men''$nakan !inar 3 dan kem$dian men'$mp$lkan data 3ray(pa!tikan !imetri Kri!tal, parameter !el !at$an, #rienta!i Kri!tal, dan &ata! re!#l$!i) Semakinrendah !imetri, maka le&ih &anyak data yan' d$&$t$hkan Setelah data terk$p$l, maka akandipe*ahkan !#l$!i !tr$kt$r dan akhirnya mem&$at m#del &an'$nan pr#tein $nt$k m#del aal, darim#del aal ter!e&$t dilak$kan eal$a!i $nt$k menyemp$rnakan ha!il anali!i!

$. NMR S'ectr"c'( ) S'ektr"k'i NMR/et#de N/ Spe*tr#!*#py $nt$k menent$kan !tr$kt$r ter!ier pr#tein ia!anya, met#de ini

di'$nakan $nt$k men'anali!i! pr#tein yan'memiliki a!am amin# hidr#-#&ik yan' !$lit $nt$kdikri!talkan !ehin''a tidak dapat dianali!i!den'an met#de 3ray *ry!tall#'raphy N/di'$nakan $nt$k menent$kan !tr$kt$r darik#mp#nen alami dan !intetik yan' &ar$,kem$rnnian dari k#mp#nen, dan arah reak!ikimia !e&a'aimana h$&$n'an k#mp#nen dalamlaritan yan' dapat men'alami reak!i kimia

"nti pr#t#n (at#m hydr#'en) dan karn(karnn 1?) memp$nyai !i-at!i-at ma'net ila!$at$ !enyaa men'and$n' hydr#'en ata$karn diletakkan dalam &ida' ma'net yan' !an'at k$at dan diradia!i den'an radia!ielektr#ma'netik maka inti at#m hydr#'en dan karn dari !enyaa ter!e&$t akan menyerapener'y melal$i !$at$ pr#!e! ad!#rp!i yan' dikenal den'an re!#nan!i ma'neti* Unt$k pr#tein danpr#tein k#mplek! den'an &erat ma!!a m#lek$l !ekitar 25?0 kDa, k$alita! !pe*tra men$r$nden'an *epat mem&ata!i may#r A ketika &ekera den'an makr#m#lek$l &e!ar yan' &era!al darike*epatan relak!a!i tin''i !i'nal N/

1.-. UI URUTAN ASAM AMINO

Sekuen"in,Sek$en!in' pr#tein ata$ !ek$en!in' peptida adalah penent$an $r$tan a!am amin# pada !$at$

pr#tein ata$ peptida (#li'#peptida ma$p$n p#lipeptida) /et#de $nt$k !ek$en!in' pr#tein$m$mnya meli&atkan pem$t$!an ikatan yan' diik$ti den'an identi-ika!i a!am amin#

%ada met#de de'rada!i dman, re!id$ pada $$n'N ($$n' amin#) pr#tein dip#t#n' !at$ per !at$ den'an reak!i kimia Setelah !etiap pem#t#n'an, re!id$ a!am amin# yan' telah dip#t#n'ter!e&$t dapat diidenti-ika!i men''$nakan kr#mat#'ra-i %r#!ed$r ter!e&$t di$lan'i $nt$k !etiapre!id$ a!am amin# Kelemahan met#de ini adalah &aha p#lipeptida yan' di!ek$en!in' tidakdapat le&ih panan' dari 50C60 re!id$ (dapat di!ia!ati den'an mem#t#n'm#t#n' p#lipeptida&er$k$ran &e!ar menadi peptidapeptida &er$k$ran le&ih ke*il !e&el$m dilak$kan reak!i)

1./. UI ASAM AMINO

A. U0i *ant'rtein7ar$tan a!am nitrat pekat ditam&ahkan den'an hatihati ke dalam lar$tan pr#tein Setelah

di*amp$r teradi endapan p$tih yan' dapat &er$&ah menadi k$nin' apa&ila dipana!kan eak!iyan' teradi ialah nitra!i pada inti &en+ena yan' terdapat pada m#lek$l pr#tein eak!i ini p#!iti- $nt$k pr#tein yan' men'and$n' tir#!in, -enilalanin dan tript#-an%r#!ed$r dan #&!era!iB

G Ke dalam 2 ml lar$tan !ampel pada ta&$n' reak!i, tam&ahkan 2 tete! a!am nitrat pekatG ndapan p$tih akan ter&ent$k !ela'i dipana!kan di dalam air yan' !edan' dididihkan,

lar$tan akan &er$&ah menadi k$nin' ika p#!iti- terdapat tir#!in dan in''a ika p#!iti-

terdapat tript#pan

http://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htmhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_aminohttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Peptidahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Oligopeptida&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Polipeptidahttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Ikatan_kimiahttp://id.wikipedia.org/wiki/Ikatan_kimiahttp://en.wikipedia.org/wiki/edman_degradationhttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_aminohttp://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografihttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_aminohttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Peptidahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Oligopeptida&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Polipeptidahttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Ikatan_kimiahttp://en.wikipedia.org/wiki/edman_degradationhttp://id.wikipedia.org/wiki/Proteinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_aminohttp://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografihttp://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htm


5/16

B. U0i Reak"i H'kin"+$le

7ar$tan pr#tein yan' men'and$n' tript#-an dapat direak!ikan den'an pereak!i #pkin!#le

yan' men'and$n' a!am 'li#k!ilat %ereak!i ini di&$at dari a!am #k!alat den'an !er&$k

ma'ne!i$m dalam air

Setelah di*amp$r den'an pereak!i #pkin!#le, a!am !$l-at dit$an'kan perlahanlahan

!ehin''a mem&ent$k lapi!an di &aah lar$tan pr#tein e&erapa !aat kem$dian akan teradi

*in*in $n'$ pada &ata! antara ked$a lapi!an ter!e&$t

%r#!ed$r dan #&!era!iB

G Tam&ahkan 1 ml rea'en #pkin!#le ke dalam 1 ml lar$tan !ampel pada ta&$n' reak!i,kem$dian ad$k hin''a rata

G /irin'kan ta&$n' reak!i dan tam&ahkan 1 ml 2S>4 pekat meleati dindin' dalam ta&$n'!e*ara perlahan hin''a mem&ent$k 2 lapi!an

G 7etakkan ta&$n' reak!i ke dalam air yan' !edan' dididihkan !elama 2 menit

G in*in $n'$ kemerahan akan m$n*$l pada per&ata!an antara 2 lapi!an den'an al&$mindan ka!ein Hika ter&ent$k 'elatin maka ha!ilnya ne'ati-

$. U0i Reak"i Natriu&nitr'ru"ia%ada a!am amin# !i!tein, !elain memiliki '$'$! C>>, N 2, dan '$'$! , $'a terdapat

'$'$! CS &e&a!, yait$ '$'$! !$l-idril Apa&ila '$'$! ini &ereak!i den'an natri$m nitr#pr$!idadalam amm#nia &erle&ih maka akan men'ha!ilkan k#mplek! yan' &erarna merah e&erapapr#tein yan' mem&erikan ha!il ne'atie ketika di$i men''$nakan $i natri$m r#p$!ida ini ternyata

akan menadi p#riti apa&ila dipna!akan !ampai men'alami k#a'$la!i ata$ denat$ra!i Denat$ra!iadalah pr#!e! yan' men'$&ah !tr$kt$r m#lek$l tanpa mem$t$!kan ikatan k#alen al inimen$n$kkkan &aha pada pr#!e! men'ha!ilkan '$'$! CS &e&a!

D. U0i Reak"i Saka,uc%i

Ui Saka'$*hi adalah $i kimia yan' di'$nakan $nt$k mendetek!i a!am amin# ar'inin Ar'ininmemiliki kel#mp#kpr#pil (? metil) den'an '$'$! '$anidin di $$n'nya I$'$! '$anidinmer$pakan at#m yan' men'ikat N2 den'an ikatan t$n''al dan men'ikat N den'an ikatan'anda I$'$! '$anidin akan &ereak!i dalam $i !aka'$*hi Dalam k#ndi!i &a!a, alpha napht#lakan &ereak!i den'an '$'$! '$anidin dalam ar'inin yan' telah ter#k!ida!i !#di$m hip#kl#rit,men'ha!ilkan !enyaa &erarna merah Apa&ila pr#tein yan' di$i den'an te! !aka'$*himen$n$kkan per$&ahan arna merah &erarti dalam pr#tein ter!e&$t terdapat ar'inin

Ba%an an 'ereak"i:G Na> 10


6/16

Gambar ,. +eaksi pada metode ninhidrinSumber: www.kriminal.org

G S#di$m hip#kl#rit (Nal>)G Alpha napht#l (1< dalam alk#h#l)G 7ar$tan !ampel

Lan,ka% ker0a:G /a!$kkan 2 ml &ahan yan' akan di$i ke dalam ta&$n' reak!iG Tam&ahkan &e&erapa tete! Na>G Tam&ahkan d$a tete! alpha napht#l

G Tam&ahkan 5 tete! !#di$m hip#*l#ritG Amati per$&ahan arna yan' teradi$atatan: S#di$m hip#kl#rit dapat di'anti den'an a'en pen'#k!ida!i lain !eperti lar$tan &r#min(&e&erapa tete! &r#min dalam 100 ml air)

1.2. UI PROTEIN

A. U0i Nin%irinNinhidrin adalah !alah !at$ rea'en yan'

memiliki -$n'!i $nt$k mendetek!i a!am ami n# danmenetapkan k#n!entra!inya dalam lar$tan Sem$a

a!am amin# al-a &ereak!i den'an ninhidrinmem&ent$k aldehid den'an !at$ at#m le&ihrendah dan melepa!kan N? dan >2 Selain it$ $'a ter&ent$k k#mplek! &erara &ir$ yan'diperkirakan di!e&a&kan #leh 2 m#lek$l ninhidrinyan' &ereak!i den'an N? !etelah a!am amin#ter!e&$t di#k!ida!i alhal yan' perl$ dilak$kanpada met#de ini antara lainB

• /enyediakan ta&$n reak!i yan' dii!i den'an al&$min, ka!ein, 'elatin, dan 'i!!in (!ampel)

• /enam&ahkan 5 teter pereak!i ninhidrin

• /emana!kan den'an air hin''a mendidih

%ada per*#&aan tadi, al&$min, 'elatin, dan -enilanin mem&ent$k arna &ir$F$n'$ karena

&ereak!i den'an ninhidrin menandakan adanya a!am amin# Selain pr#tein, ha!il p#!iti- $'di&erikan #leh pept#n, a!am amin#, dan amin primer lainnya

B. U0i Sul!ur Den'an men''$nakan met#de ini maka akan diketah$i a!am amin# yan' men'and$n' !$l-$r

Hika lar$tan pr#tein didihkan den'an *amp$ran lar$tan K> ata$ Na> dan %&a!etat, maka akanter&ent$k endapan &erarna hitam apa&ila terdapat a!am amin# yan' men'and$n' !$l-$r #nt#hpr#tein yan' men'and$n' !$l-$r adalah !i!tein dan meti#nin 7ar$ta &a!a k$at mem$t$! ikatan!$l-$r pada a!am amin#, mem&ent$k K2S yan' akan &ereak!i den'an %&a!etat mem&ent$k %&S,!enyaa yan' &erarna hitam Nam$n, meti#nin tidak p#!iti- den'an met#de $i ini ke*$ali apa&ilalar$tan pr#tein ter!e&$t terle&ih dah$l$ dipana!kan den'an a!am mineral

$. U0i Biuret7ar$tan pr#tein di&$at alkali! den'an Na> kem$dian ditam&ahkan lar$tan $S>4 en*er Ui

ini $nt$k men$n$kkan adanya !enyaa!enyaa yan' men'and$n' '$'$! amida a!am yan'&erada &er!ama '$'$! amida yan' lain Ui ini mem&erikan reak!i p#!iti- yait$ ditandai den'antim&$lnya arna merah i#let ata$ &ir$ i#let


7/16

Iam&ar 6 a!il terhadap pereak!i &i$ret adalah p#!iti-

D. U0i Reak"i MillnUi /ill#n di'$nakan $nt$k men'identi-ika!i pr#tein yan' men'and$n' tir#!in dalam !$at$

!ampel yan' ditandai den'an ter&ent$knya k#mplek! &erarnamerah pada !ampel pr#tein Tir#!inmer$pakan a!am amin# yan' men'and$n''$'$! -en#l pada rantai !ampin'nya ('$'$! nya)I$'$! -en#l pada tir#!in ini akan ternitra!i mem&ent$k 'aram merk$ri den'an pereak!i mill#nyan'akan mem&ent$k k#mplek! &erarna merah (%#ediadi 200=)

%ereak!i /ill#n adalah lar$tan merk$r# dan merk$ri nitrat dalam a!am nitrat Apa&ila pereak!iini ditam&ahkan pada lar$tan pr#tein, akan men'ha!ilkan endapan p$tih yan' dapat &er$&ahmenadi merah #leh pemana!an %ada da!arnya reak!i ini p#!iti- $nt$k -en#l-en#l, karenater&ent$knya !enyaa merk$ri den'an '$'$! hidr#k!i-enil yan' &erarna Tetapi kh$!$! $nt$kpr#te#!# dan pept#n !e*ara lan'!$n' akan men'ha!ilkan lar$tan yan'&erarna merah ndapanyan' ter&ent$k &er$pa 'aram k#mplek! dari tir#!in yan' ternitra!iHika lar$tan pr#tein yan' akandianali!i! ada dalam !$a!ana &a!a, maka terle&ih dah$l$ har$!dinetrali!a!i den'an a!am (&$kanl) Hika tidak, i#n merk$ri dari pereak!i akan men'endap !e&a'ai '(>)2 "#n l dapat&ereak!i den'an a!am nitrat men'ha!ilkan radikal kl#r yan' dapat mer$!ak k#mplek! &erarna

%r#!ed$r dan #&!era!iBG Ke dalam 2 ml lar$tan !ampel pada ta&$n' reak!i, tam&ahkan ? tete! rea'en /ill#nG Ad$k merata dan pana!kan lan'!$n' di ata! api ke*ilG Hika !ampel p#!iti-, maka akan ter&ent$k endapan p$tih den'an al&$min dan ka!ein, dan

lam&at la$n akan &er$&ah arna menadi merah &ata

1.3 4e"tern Blttin,

estern lot () mer$pakan !$at$ teknik $nt$k menandai !$at$ pr#tein pada mem&rannitr#!el$l#!a, nil#n, ata$ mem&ran tran!-er lain !etelah pr#tein ter!e&$t terpi!ahkan melal$ielektr#-#re!i! %r#tein ter!e&$t kem$dian dapat didetek!i melal$i met#de a$t#radi#'ra-i, pela&elanden'an !enyaa!enyaa -l$#re!en, pela&elan den'an 125", pela&elan den'an antidi terikatpr#tein, lektin ata$ 'en pen'ikat !pe!i-ik lainnya (Att##d et al+, 2006)

erda!arkan pen'ertian ter!e&$t, dilak$kan melal$i &e&erapa tahap, yait$ B1 Tahap lektr#-#re!i!

%ada tahap pertama, pr#tein yan' diin'inkan dipi!ahkan dari !ampel !e*ara elektr#-#re!i!lektr#-#re!i! mer$pakan pemi!ahan pr#tein &erda!arkan $k$ran m#lek$l dalam !$at$te'an'an li!trik tertent$ Dalam elektr#-#re!i!, &ia!anya !ampel yan' men'and$n' pr#tein&ia!anya di*amp$r den'an SDS SDS mer$pakan !$at$ deter'en yan' memiliki m$atan

ne'ati- /$atan ne'ati- SDS ter!e&$t men''an''$ ke!ta&ilan pr#tein, !ehin''a pr#teinmen'alami denat$ra!i "nterak!i i#nik, em&atan di!$l-ida, ikatan hidr#'en yan'menye&a&kan !$at$ pr#tein men'alami -#ldin' $nt$k mena'a ke!ta&ilannya menadi


8/16

ter'an''$ aki&at adanya SDS S$at$ pr#tein m$ltimer $'a akan ter$rai menadi m#n#mer peny$!$nnya Aki&atnya, pr#teinpr#tein yan' ada dalam !ampel mem&ent$k !$at$ rantaip#lipeptida l$r$! Semakin &e!ar &erat m#lek$l !$at$ pr#tein, maka rantai p#lipeptidater!e&$t !emakin panan' Sampel den'an pr#tein rantai p#lipeptida l$r$! ter!e&$tdima!$kkan dalam !$at$ mem&ran p#liakrilamid yan' dialiri ar$! li!trik %r#tein yan' telah&erm$atan ne'ati- akan &er'erak dari k$t$& ne'ati- men$$ k$t$& p#!iti- 7a$ per'erakanpr#tein dalam mem&ran p#liakrilamid ter!e&$t &er&eda&eda ter'ant$n' pada daya ham&at

antara pr#tein dan mem&ran %r#tein yan' &er$k$ran le&ih &e!ar akan memiliki dayaham&at le&ih &e!ar !ehin''a per'erakannya menadi le&ih lam&at di&andin'kan den'anper'erakan pr#tein yan' &er$k$ran le&ih ke*il Setelah dialiri ar$! li!trik !elama &e&erapaakt$, ma!in'ma!in' pr#tein akan terpi!ah &erda!arkan $k$ran m#lek$lnya %r#tein yan'le&ih ke*il ata$ memiliki &erat m#lek$l rendah akan &er'erak le&ih a$h di&andin' pr#teinyan' le&ih &e!ar Dalam 'el p#liakrilamid ter!e&$t akan ter&ent$k pitapita yan' mer$pakanpr#teinpr#tein yan' telah terpi!ah &erda!arkan &erat m#lek$l (Iam&ar 2) (K##lman dan#ehm, 2005)

2 Tahap lektr#tran!-er Tahap ked$a dalam yait$ pemindahan pr#tein dari 'el p#liakrilamid men$$ 'eltran!-er Tahap pemindahan ter!e&$t men''$nakan ar$! li!trik !e&a'ai -akt#r pend#r#n'tran!-er pr#tein >leh karena it$, pr#!e! pemindahan ter!e&$t di!e&$t $'a elektr#tran!-erlektr#tran!-er dapat dilak$kan den'an d$a met#de, yait$ (#lla' et al+, 1@@6)Ba l#ttin' !emikerin'l#ttin' !emikerin' men''$nakan kerta! !arin' yan' telah di&a!ahi

den'an &$--er tran!-er Kerta! !arin' ter!e&$t diletakkan di antara 'el p#liakrilamid dan'el tran!-er Tran!-er !eperti ini dapat dilak$kan !elama 10?0 menit den'an ar$! l!triktertent$

& l#ttin' &a!ahl#ttin' &a!ah tidak men''$nakan kerta! !arin' diantara 'elp#liakrilamid dan 'el tran!-er, tetapi ked$a 'el ter!e&$t diimpitkan dan direndam dalam&$--er tran!-er Tran!-er den'an &l#ttin' &a!ah dapat dilak$kan 45 menit hin''a 1malam /et#de &l#ttin' &a!ah le&ih $m$m di'$nakan karena -lek!i&ilita! met#de

ter!e&$t yan' le&ih &aik

? Tahap Detek!iTahap keti'a mer$pakan detek!i pr#tein yan' telah dipindahkan ke mem&ran tran!-erDetek!i pr#tein ter!e&$t meman-aatkan interak!i antara anti'en dan antidi yan' &er!i-at!pe!i-ik 9aria!i met#demet#de ter!e&$t ter$tama terletak pada pen''$naan antidiprimer dan !ek$nder, !erta pen''$naan m#lek$l penanda erda!arkan pen''$naanantidi primer dan antidi !ek$nder, ada d$a met#de detek!i, yait$B met#de lan'!$n'dan met#de tidak lan'!$n' /et#de lan'!$n' men''$nakan antidi primer yan' telahterk#n$'a!i den'an m#lek$l marker /et#de tidak lan'!$n' men''$nakan antidi primer dan antidi !ek$nder Antidi primer &er-$n!i men'ikat pr#tein tar'et, !edan'kanantidi !ek$nder &er-$n'!i men'ikat antidi primer dan terk#n$'a!i den'an m#lek$l

penanda /#lek$l penanda yan' di'$nakan $'a &eraria!i /#lek$l penanda yan' $m$mdi'$nakan diantaranya adalah en+im alkalin -#!-ata!e (A%), en+im h#r!edi!h per#k!ida!e(%), imm$n#'#ld, dan125" /a!in'ma!in' m#lek$l penanda ter!e&$t memiliki kele&ihandan kek$ran'an /#lek$l penanda imm$n#'#ld memiliki !en!iti-ita! palin' tin''i, yait$imm$n#'#ld (125 p') %, A% dan 125" memiliki !en!itiita! relati- rendah yait$ 1020 p',1050 p', dan 50100 p' (#lla' et al+, 1@@6)

1.5 ANALISIS BIOKIMIA DAN BIOFISIKAUnt$k men'anali!i! !i-at &i#kimia dan &i#-i!ika pada pr#tein dapat ditina$ dari &erat

m#lek$l yan' men''$nakan %7 dan SDS%a'e, !erta S$h$ Denat$ra!i yan' men''$nakan/et#de DS


9/16

Gambar . %omponen P/0Sumber: www.pharmacia.com

Gambar . *etode SS-gelSumber:

A. FPL$ 6Fast protein Lipid Chromatography 7%rin!ip kr#mat#ra-i adalah di!tri&$!i ata$

parti!i m#lek$l den'an memi!ahkan antara d$a-a!e yan' di!e&$t -a!e 'erak dan -a!e diamSe*ara kh$!$!, %7 ata$ a!t %r#tein 7ipidhr#mat#'raphy memilik prin!ip yait$memi!ahkan m#lek$l #r'ani* &er$k$ran ke*il

yan' lar$t dalam pelar$t #r'ani*Fn#n p#lar %7ini dapat memi!ahkan pr#tein &erda!arkan !i-atphy!i#*hemi*al mereka, *#nt#hnya &eratm#lek$l, $k$ran, !i-at hidr#-#&ik, pert$karankati#n dan ani#n, dan lainlain %7 dan %7k$ran' le&ih hampir !ama, nam$n %7 memilikitekanan #pera!i yan' le&ih rendah dan &ia!anyadi'$nakan dalam !kala ind$!tri %7 inidilak$kan pada tahap akhir i!#la!i den'anmen''$nakan alat !eperti Iam&ar 5 Diperl$kantekanan tin''i $nt$k mem&$at aliran el$en yan'&aik melal$i 'el pada k#l#m yan' &er$k$ran ke*il

Den'an met#de %7 pemi!ahan pr#tein dim$n'kinkan karena k#mp#nen yan' &er&eda dari*amp$ran yan' memiliki a-inita! yan' &er&eda a!e 'erak dapat &eri!i lar$tan &erair, ata$ %uffer yan' meleati padat &erp#ri (-a!e diam) dikema! ke dalam 'ela! !ilinder

B. SDS+PA8ESDS%a'e adalah !alah !at$ met#de anali!i! pr#tein ($nt$k

men'etah$i &erat m#lek$l) yan' &anyak di'$nakan dalam &i#kimia,-#ren!i*, 'enetika, &i#l#'i m#lek$ler, dan &i#tekn#l#'i $nt$kmemi!ahkan pr#tein !e!$ai den'an ele*tr#ph#re!i! m#&ility yan'dimilikinya SDS ata$ S#di$m Dedcyl Sulfat mer$pakan deter'en

yan' dapat meme*ah m#lek$l hidr#-#&ik tetapi $'a memilikim$atan ne'atie S$at$ rantai p#lipeptida dapat &erikatan den'anSDS (!e!$ai ma!!a m#lek$l) /$atan ne'atie SDS akanmen'han*$rkan !e&a'ian &e!ar !tr$kt$r k#mplek! pr#tein, dan!e*ara k$at tertarik ke an#da &ila ditempatkan pada !$at$ medanelektrik

Unt$k melak$kan met#de ini ada &e&erapa lan'kah yan' har$!dila$kan, yait$B

• Separatin' 'el B mem&$at 'el den'an &ahan&ahan yan' ada dan ditar$h dalam plate

• Sta*kin' 'el B men*ap$r !el$r$h lar$tan dan dit$an' ke !eparatin' 'el yan' meadat

Setelah padat, melepa!kan !i!ir dan merapikan !$m$r yan' ter&ent$k• %repara!i 'el B !ampel yan' dien*erkan ditam&ah S (1B1) dan dipana!kan 1000

!elama 5 menit

• $nnin' 'el B plate 'el dima!$kkan ke *ham&er elektr#-#re!i! dan dit$an' r$nnin'

&$--er hin''a terendam, dan mem$lai r$nnin'

• %earnaan B merendam 'el den'an !tainin' dan men*$*i den'an aJ$ade!

$. DS$ 6Differential Scanning Calorimetri)DS (Differential Scanning Caloreimetri ) adalah !$at$ teknik anali!a termal yan' men'$k$r

ener'y yan' di!erap #leh !ampel !e&a'ai -$n'!i akt$ ata$ !$h$ %en'$k$ran ini mem&erikanin-#rma!i tentan' per$&ahan -i!ik dan kimia yan' meli&atkan pr#!e! end#termik ma$p$n

ek!#termik alhal yan' dapat diketah$i dari pen''$naan DS adalah tran!i!i 'a!, titik leleh dandidih, akt$ dan !$h$ kri!tali!a!i, ener'y -$!i dan reak!i, !$h$ de'rada!i, ener'y kinetik, dan lainlain


10/16

Gambar . %omponen %'eldahlSumber: www.escience.ca

DS menaarkan &er&a'ai aplika!i dalam men*ari -akt#r &erperan dalam !ta&ilita! pr#tein/aka dari it$, hal ini mem$n'kinkan $nt$k menent$kan k#ndi!i yan' palin' ideal $nt$kmen!ta&ilkan -#rm$la!i *air pr#tein Dalam DS !t$di, !$h$ pada titik mak!im$m p k$ra (Tm)meakili !ta&ilita! makr#m#lek$l Ada &e&erapa lap#ran tentan' pen''$naan !ampel pr#tein,yan' dipana!kan $nt$k eal$a!i reer!i&ilita! termal de'rada!i pr#tein

#. METODE KUANTITATIF/et#de K$antitati- terdiri dari anali!i! lan'!$n' (!pektr#m#metri lan'!$n'), pearnaan (met#del#ry, met#de &$iret, $i A, $i rad-#rd), !pektr#!k#pi U99"S, titra!i (kehdahl, titra!i -#rm#l)

#.1 UI TITRASI

A. METODE KELDAHL/et#de Keldahl dikem&an'kan pada than 188? #leh pem&$at &$r &ernaman H#hann Keldahl

an' ditent$kan pada met#de ini adalah kand$n'an nitr#'en yan' terdapat pada !ampel /et#de

ini ter&a'i menadi ? *ara, yait$ Disgestion, Neutrali"ation, .itrationa Di!'e!ti#n

Sampel makanan yan' dianali!i!dipana!kan di dalam a!am !$l-at pekat(!e&a'ai #k!idat#r yan' dapatmendi'e!ti !ampel) !ehin''a akanteradi peme*ahan enadi $n!$re$n!$rnya Serin'kali $'a ditam&ahkannatri$m !$l-at anhidrat $nt$kmemper*epat ter*apainya titik didih dankatali! !eperi !eleni$m $nt$k

memper*epat reak!i S$h$ de!tr$k!i ini&erki!ar antara ?=0410# di!'e!timen'$&ah nitr#'en pada !ampelmenadi amm#nia, !ementara it$ $n!$re#r'ani* lain &er$&ah menadi >2 dan 2> %r#!e! de!tr$k!i !$dah !ele!ai apa&ila lar$tanmenadi ernih ata$ tidak &erarna la'i eak!i yan' teradi adalahB

9. Ne$trali+ati#n


11/16

7ar$tan yan' telah didi'e!ti kem$dia ditam&ahkan Na> !ampai alkali! dan dipana!kan!ehin''a amm#ni$m !$l-at dipe*ah menadi amm#nia Amm#nia yan' telah &e&a!!elan$tnya akan &erikatan #leh lar$tan a!am !tandar 7ar$tan a!am !tandar yan'di'$nakan adalah a!am rat 2< dalam $mlah yna' &erle&ihan endahnya ph lar$tan dila&$ penerima men'$&ah 'a! amm#nia menadi i#n amm#ni$m !erta men'$&ah a!amrat menadi i#n rat De!tila!i diakhiri &ila !em$a amm#nia !$dah terde!tila!i !emp$rnaden'an ditandai de!tilat tidak &ereak!i &a!a eak!i yan' teradi adalahB

* Titrati#nKand$n'an nitr#'en kem$dia die!tima!i den'an titra!i i#n amm#ni$m rat yan' ter&ent$kdan men''$nakan indi*at#r yan' !e!$ai $nt$k menent$kan titik akhir titra!i, ditandaiden'an per$&ahan arna lar$tan dari k$nin' menadi #ran'e Kadar air i#n hydr#'en yan'di&$t$hkan $nt$k men*apai titik akhir !etara den'an kadar nitr#'en dalam !ampelmakanan eak!i yan' teradi adalahB

%er!amaan yan' di'$nakan $nt$k menent$kan kadar nitr#'en dalam m' !ampel den'anmen''$nakan a!am kl#rida adalahB

Setelah kadar nitr#'en ditent$kan, maka dik#ner!ikan menadi kadar pr#tein den'an-akt#r k#ner!i yan' !e!$aiB

Kele&ihan yan' dimiliki met#de Keldahl antara lainB

•

/et#de ini di'$naka !e*ara l$a! di !el$r$h d$nia• Si-atnya $nier!al, pre!i!i tin''i, dan repr#d$!i&ilita! &aik mem&$at met#de ini &anyak

$nt$k penetapan kadar pr#tein

Kek$ran'an dari met#de Keldah adalahB

• Tidak mem&erikan pen'$k$ran pr#tein yan' !e!$n''$hnya (yan' dihit$n' adalah

nitr#'en)

• %en''$naan a!am !$l-at pada !$h$ tin''i &i!a &er&ahaya

• akt$ yan' di&$t$hkan *$k$p lama

B. Mete Titra"i Fr&l7ar$tan pr#tein dinetralkan den'an &a!a (Na>) lal$ ditam&ahkan -#rmalin akan mem&ent$k

dimethil#l Den'an ter&ent$knya dimethil#l ini &erarti '$'$! amin#nya !$dah terikat dan tidak akanmempen'ar$hi reak!i antara a!am den'an &a!a Na> !ehin''a akhir titra!i dapat diakhiriden'an tepat "ndikat#r yan' di'$nakan adalah pp, %ada akhir titra!i &ila tepat teradi per$&ahanarna menadi merah m$da yan' tidak hilan' dalam ?0 detik

#.# METODE SPEKTROSKOPI U+IS/et#de !pektr#!k#pi ini meman-aatkan kemamp$an pr#tein $nt$k menyerap ata$

menye&arkan *ahaya pada rentan' U9i!i&le pada !etr$m elektr#ma'netik Sem$a !erapank$ra kali&ra!i ! kadar pr#tein di!iapkan men''$nakan !er lar$tan pr#tein yan' telah diketah$ikadarnya Serapan lar$tan yan' dianali!i! kem$dian di$k$r pada panan' 'el#m&an' yan' !ama

dan kadar pr#tein ditent$kan dari k$ra kali&ra!i %er&edaan $tama dari pen'$ian ini adalah'$'$! -$n'!i yan' &erperan $nt$k a&!#r&! ata$ pem&ia!an elektr#ma'netik

a /et#de i$ret


12/16

7ar$tan pr#tein ditam&ahkan den'an rea'en &i$ret, di*amp$r dan kem$dian dihan'atkanpada !$h$ ?=# !elama k$ran' le&ih 10 menit Kem$dian didin'inkan dan ek!tin!i di&a*apada 'el#m&an' den'an panan' 540 nm arna i#let akan ter&ent$k &ila i#n *$pri&erinterak!i den'an ikatan peptide dalam !$a!an &a!aKe$nt$n'an dari teknik ini adalah tidak adanya 'an''$an dari !enyaa yan' menyerappada panan' 'el#m&an' yan' le&ih renda Teknik ini k$ran' !en!itie pada eni! pr#tein

& %en'$k$ran lan'!$n' pada 280 nmTript#-an dan tir#!in men'a&!#r&! *ahaya pada 280 nm Sehin''a panan' 'el#m&an'ter!e&$t dapat di'$nakan $nt$k menent$kan kadarnya Ke$nt$n'an dari met#de ini adalah!an'at !ederhana $nt$k dilak$kan karena tidak mem&$t$hkan rea'en tertent$ Nam$nkek$ran'annya adalah a!am n$kleat $'a men'a&!#r&!i pada panan' 'el#m&an' 280 nm

* /et#de 7#ry%ada met#de ini, pr#tein &ereak!i den'an rea'en #lini#*altea$ mem&ent$k !enyaak#mplek! &erarna eak!i ini men'ha!ilkan arna ke&ir$an yan' &i!a di&a*a antara 500=50 nm %em&ent$kan arna ter!e&$t di!e&a&kan karena reak!i alkaline *#pper den'anpr#tein !e&a'aimana $i &i$ret #leh tir#!in dan tript#-an yan' terdapat pada pr#tein /etedini $m$nya di'$nakan pada anali!i! &i#kimia, dan &er!i-at le&ih !en!itie $nt$k pr#teinden'an k#n!entra!i rendah di&andin'kan met#de &i$ret

Se*ara $m$m ke$nt$n'an dari teknik ini adalah teknik ini mer$pakan teknik yan' *epatdan !ederhan !erta !en!itie pada pr#tein me!kip$n k#n!entra!inya rendah Nam$n teknikini $'a memiliki ker$'ian yait$ terlal$ !en!iti-nya alat !ehin''a !ampel har$! !an'at en*er dan tidak leh men'and$n' k#ntaminan !ehin''a har$! meleati &e&erapa pr#!e!prepara!i Kelemahan lainnya adalah !erapan ter'ant$n' pada eni! pr#tein

#.- METODE LAN8SUN8S'ektr!t&etri lan,"un, 'aa #;< n&

/et#de !pektr#!k#pi ini meman-aatkan kemamp$an pr#tein $nt$k menyerap ata$

menye&arkan *ahaya pada rentan' U9i!i&le pada !etr$m elektr#ma'netik Sem$a !erapank$ra kali&ra!i ! kadar pr#tein di!iapkan men''$nakan !er lar$tan pr#tein yan' telah diketah$ikadarnya Serapan lar$tan yan' dianali!i! kem$dian di$k$r pada panan' 'el#m&an' yan' !amadan kadar pr#tein ditent$kan dari k$ra kali&ra!i %er&edaan $tama dari pen'$ian ini adalah'$'$! -$n'!i yan' &erperan $nt$k a&!#r&! ata$ pem&ia!an elektr#ma'netik Tript#-an dan tir#!inmen'a&!#r&! *ahaya pada 280 nm Sehin''a panan' 'el#m&an' ter!e&$t dapat di'$nakan$nt$k menent$kan kadarnya Ke$nt$n'an dari met#de ini adalah !an'at !ederhana $nt$kdilak$kan karena tidak mem&$t$hkan rea'en tertent$ Nam$n kek$ran'annya adalah a!amn$kleat $'a men'a&!#r&!i pada panan' 'el#m&an' 280 nm

#./ METODE PE4ARNAAN

A. Mete L=r(%ada met#de ini, pr#tein &ereak!i den'an rea'en #lini#*altea$ mem&ent$k !enyaa

k#mplek! &erarna eak!i ini men'ha!ilkan arna ke&ir$an yan' &i!a di&a*a antara 500=50nm %em&ent$kan arna ter!e&$t di!e&a&kan karena reak!i alkaline *#pper den'an pr#tein!e&a'aimana $i &i$ret #leh tir#!in dan tript#-an yan' terdapat pada pr#tein /et#de ini $m$nyadi'$nakan pada anali!i! &i#kimia, dan &er!i-at le&ih !en!itie $nt$k pr#tein den'an k#n!entra!irendah di&andin'kan met#de &i$ret Se*ara $m$m ke$nt$n'an dari teknik ini adalah teknik inimer$pakan teknik yan' *epat dan !ederhana !erta !en!itie pada pr#tein me!kip$nk#n!entra!inya rendah Nam$n teknik ini $'a memiliki ker$'ian yait$ terlal$ !en!iti-nya alat!ehin''a !ampel har$! !an'at en*er dan tidak leh men'and$n' k#ntaminan !ehin''a har$!meleati &e&erapa pr#!e! prepara!i Kelemahan lainnya adalah !erapan ter'ant$n' pada eni!

pr#tein

B. Mete Biuret


13/16

7ar$tan pr#tein ditam&ahkan den'an rea'en &i$ret, di*amp$r dan kem$dian dihan'atkanpada !$h$ ?=# !elama k$ran' le&ih 10 menit Kem$dian didin'inkan dan ek!tin!i di&a*a pada'el#m&an' den'an panan' 540 nm arna i#let akan ter&ent$k &ila i#n *$pri &erinterak!iden'an ikatan peptide dalam !$a!an &a!a Ke$nt$n'an dari teknik ini adalah tidak adanya'an''$an dari !enyaa yan' menyerap pada panan' 'el#m&an' yan' le&ih renda Teknik inik$ran' !en!itie pada eni! pr#tein%r#!ed$r B

• %em&$atan rea'en i$ret B 7ar$tkan 150 m' tem&a'a ("") !$l-at ($S>4 52>) dan kali$m

natri$m tartrat (KNa44>6 42>) dalam 50 ml aJ$ade! dalam la&$ takar 100 mlKem$dian tam&ahkan ?0 ml natri$m hidr#k!ida 10< !am&il dik#*#kk#*#k, !elan$tnyatam&ahkan aJ$ade! !ampai 'ari! tanda

• %em&$atan lar$tan ind$k in !er$m al&$min (SA)B Ditim&an' 500 m' in !er$m al&$min

dilar$tkan dalam aJ$ade! !ampai 10,0 ml !ehin''a kadar lar$tan ind$k 5,0< (7i)

• %enetapan kadar (/et#de i$ret) B

o %em&$atan k$ra &ak$ B Dalam k$et dima!$kkan lar$tan ind$k, rea'en i$ret dan

aJ$ade! mi!al den'an k#mp#!i!i !e&a'ai &erik$tB Setelah tepat 10 menit !erapan di&a*apada L 550 nm terhadap &lank# yan' terdiri dari 800 M7 rea'en i$ret dan 200 M7 aJ$ade!

o %er!iapan !ampel B Am&il !e$mlah tertent$ !ampel pr#tein yan' terlar$t mi!al al&$min,endapkan dah$l$ den'an penam&ahan am#ni$m !$l-at kri!tal ($mlahnya ter'ant$n' dari eni! pr#teinnya, kala$ perl$ !ampai mendekati keen$han am#ni$m !$l-at dalam lar$tan)%i!ahkan pr#tein yan' men'endap den'an !entri-$! 11000 rpm !elama 10 menit,pi!ahkan !$pernatannya %re!ipitat yan' mer$pakan pr#teinnya kem$dian dilar$tkankem&ali den'an dapar a!am a!etat p 5 mi!al !ampai 10,0 ml Am&il !e$mlah M7 lar$tanter!e&$t !e*ara k$antitati- kem$dian tam&ahkan rea'en i$ret dan ika perl$ tam&ahden'an dapar a!etat p 5 $nt$k pen'$k$ran k$antitati- Setelah 10 menit dari penam&ahanrea'en i$ret, &a*a a&!#r&an!inya pada panan' 'el#m&an' 550 nm terhadap &lank#yan' &eri!i rea'en i$ret dan dapar a!etat p 5 %erhatikan adanya -akt#r pen'en*erandan a&!#r&an !ampel !edapat m$n'kin har$! ma!$k dalam ki!aran a&!#r&an k$ra &ak$

$. U0i B$A%ada $i A (icinchoninic $cid/, $ mem&ent$k k#mplek! $n'$ 'elap den'an A, yan'

mem$n'kinkan pr#tein ditent$kan dalam ki!aran 0,0005 C 2 m'Fm7 Ui ini !erin' di!e&$t O$i%ier*eP !e!$ai den'an pr#d$!en kit rea'en "#n k$pri &erk##rdina!i den'an 4 ikatan peptida, yan'mered$k!inya menadi i#n k$pr# dan mem$n'kinkan ia mem&ent$k k#mplek! den'an A yan'menyerap !ekitar 540 nm, men'ha!ilkan men'ha!ilkan arna Ui pr#tein den'an Amenin'katkan kepekaan $i &i$ret den'an -akt#r !ekitar 100, dan mem&erikan man-aat pentin'k#mpati&ilita! den'an !ampel yan' men'and$n' !ampai 5< !$r-aktan al ini di*apai den'ankela!i a!am &i!ink#ninat (%icinchoninic acid ) den'an i#n tem&a'a yan' di&ent$k #leh reak!i &i$retal ini menin'katkan !en!itiita! karena AFk#mplek! tem&a'a lar$t air menyerap a$h le&ih

k$at daripada peptidaFk#mplek! tem&a'a

D. U0i Bra!rUi rad-#rd adalah !$at$ $i $nt$k men'$k$r k#n!entra!i pr#tein t#tal den'an !e*ara

k#l#rimetri dalam !$at$ lar$tan Dalam $i rad-#rd meli&atkan pearna ##ma!!ie rilliant l$e() yan' &erikatan den'an pr#tein dalam !$at$ lar$tan yan' &er!i-at a!am !ehin''amem&erikan arna (ke&ir$an) Karena men'ha!ilkan arna, !ehin''a !e*ara k#l#rimetri dapatdi$k$r a&!#r&an!inya den'an men''$nakan !pektr#-#t#metri (7am&ert3eer) pada panan''el#m&an' 46535@5 nm (*ahaya tampak)

/aterial B%ereak!i (ea'ent)

%ereak!i yan' di'$nakan di&$at den'an melar$tkan 100 m' ##ma!!ie l$e I250 dalam 50 mlethan#l @5


14/16

1 dan di!impan dalam t#l am&er ('elap) di !$h$ r$an' %ereak!i ini !ta&il hin''a &e&erapamin''$, nam$n ika ter&ent$k endapan ketika penyimpanan, maka har$! di-ilter la'i !aat hendakdi'$nakanStandar %r#tein#ine Q'l#&$lin den'an k#n!entra!i 1 m'Fml (ata$ 100 M'Fml $nt$k mi*r#a!!ay) di'$nakan!e&a'ai lar$tan !t#k (di!impan &ek$ pada !$h$ 20#) K#n!entra!i pr#tein lar$tan !tandard har$!di$k$r !e&el$m di'$nakan den'an men'$k$r a&!#r&an!inya pada 280 nm A&!#r&an!i lar$tan

#ine Q'l#&$lin 1m'Fml pada *$et 1 *m adalah 1?5 Hika yan' di'$nakan adalah #ine Ser$m Al&$min (SA) ata$ >al&$min, maka a&!#r&an!inya ma!in'ma!in' adalah 066 dan 0=5Standard A!!ay

G %ipet 100 Ml !ample yan' men'and$n' kirakira 10 C 100 M' pr#tein Hika perkiraank#n!entra!i pr#teinnya tidak diketah$i, maka &i!a di&$at &e&erapa !eri pen'en*eran (1,1B10, 1B100, 1B1000, d!t) Siapkan !e*ara d$pl#

G Unt$k k$ra kali&ra!i, &$atlah !eri lar$tan !tandard 100, 200, 400, 600, 800 dan 1000M'Fml 7al$ pipet ma!in'ma!in' 100 Ml ke dalam ta&$n' Siapkan &lank# den'an aJ$ade!t100 Ml

G Tam&ahkan 5 ml pereak!i rad-#rd ke dalam ma!in'ma!in' ta&$n' !ample dan !tandard,*amp$r den'an memlak&alik ta&$n' ata$ di#rte3 !e*ara perlahan indariter&ent$knya &$!a karena akan men'$ran'i repr#d$*i&ilitynya "nk$&a!i !elama 2 !ampai60 menit

G Uk$r a&!#r&an!i !ample dan !tandard pada panan' 'el#m&an' 5@5 nm atatanBG Standard 100 M' akan mem&erikan a&!#r&an!i !ekitar 04G K$ra !tandardnya tidak linear, dan pre!i!i a&!#r&an!inya &eraria!i &er'ant$n' pada

lamanya ink$&a!i Hadi k$ra kali&ra!i har$! di&$at $nt$k !etiap a!!ay/i*r#a!!ay

G %ipet 100 Ml !ample yan' men'and$n' kirakira 1 C 10 M' pr#tein ke dalam ta&$n'ppend#r- 15 ml Hika perkiraan k#n!entra!i pr#teinnya tidak diketah$i, maka &i!a di&$at&e&erapa !eri pen'en*eran (1, 1B10, 1B100, 1B1000, d!t) Siapkan !e*ara d$pl#

G Unt$k k$ra kali&ra!i, &$atlah !eri lar$tan !tandard 10, 20, 40, 60, 80 dan 100 M'F ml 7al$pipet ma!in'ma!in' 100 Ml ke dalam ta&$n' Siapkan &lank# den'an aJ$ade!t 100 Ml

G Tam&ahkan 1 ml pereak!i rad-#rd ke dalam ma!in'ma!in' ta&$n', *amp$r den'anmemlak&alik ta&$n' ata$ di#rte3 !e*ara perlahan indari ter&ent$knya &$!a karenaakan men'$ran'i repr#d$*i&ilitynya "nk$&a!i !elama 2 !ampai 60 menit

> Uk$r a&!#r&an!i !ample dan !tandard pada panan' 'el#m&an' 5@5 nm Nilai a&!#r&an!i$nt$k !ampel yan' men'and$n' 10 M' Q'l#&$lin adalah 045

KESIMPULAN%r#tein mer$pakan makr#m#lek$l &ert m#lek$l tin''i Terdapat d$a met#de yan' &i!a

men'anali!i! pr#tein, yait$ !e*ara k$alitati- dan k$antitati- Se*ara k$alitati- dapat dianali!i!!tr$kt$r, $i k#mp#!i!i pr#tein, anali!i! &ik#mia &i#-i!ika, dan $i reak!i arna

Unt$k men'$i !e*ara !tr$kt$r dapat di'$nakan ain# a*id analy!i! $nt$k menanali!i!!tr$kt$r primer, met#de DS $nt$k men'anali!i! !tr$kt$r !ek$nder, !erta .ray hry!all#'raphydan N/ Spe*tr#!*#py $nt$k men'anali!i! !tr$kt$r ter!ier dari pr#tein Unt$k men'$i k#mp#!i!ipr#tein dapat dilak$kan den'an $i !e*ara $m$m, $i nitr#'en #r'anik yan' &erprin!ip pada $i7a!!ai'ne, dan $'a $i !$l-$r yan' &erprin!ip pada $i !i!tin dan !i!tein Unt$k men'anali!i!!ampel akan !i-at pr#tein !e*ara &i#kimia dan &i#-i!ika di'$nakan %7 yan' memiliki prin!ipmemi!ahkan m#lek$l #r'ani* &er$k$ran ke*il yan' lar$t dalam pelar$t #r'ani*Fn#n p#lar, SDS%a'e yan' memiliki prin!ip memi!ahkan pr#tein !e!$ai den'an ele*tr#ph#re!i! m#&ility yan'dimilikinya, dan DS yan' memiliki prin!ip anali!a termal yan' men'$k$r ener'y yan' di!erap#leh !ampel !e&a'ai -$n'!i akt$ ata$ !$h$ 7% dan SDS%a'e $nt$k men'etah$i &eratm#lek$l dan DS* $nt$k men'etah$i denat$ra!i !$h$ Unt$k $i reak!i arna terdapat &anyak $iyan' dilak$kan yait$ ninhidrin (!ampel ninhidrin, mem&ent$k arna &ir$F$n'$ menandakan

adanya pept#n, a!am amin#, dll), !aka'$*hi (na-t#lFnatri$mhip#&r#mit !ampel, mem&ent$karna merah menandakan adanya '$'$! '$anidine), !$l-$r (!ampel K>FNa> %& a!etat,men'ha!ilkan arna hitam menandakan adanya !$l-$r), Dia+# hrli*h (!ampel N4>,


15/16

&erarna merah mendakan hi!tidin dan #ranye menandakan tir#!in), A*ree#!enheim (!ampel l, men'ha!ilkan *in*in $n'$ menandakan adanya -#rmaldehid), &i$ret (!ampel Na> R$2S>4, &erarna &ir$ t$a p#!iti- pada p#lipeptida), mill#n (!ampel mill#n dan dipana!kan,menha!ilka endapan p$tih lal$ merah maka p#!iti- pada '$'$! hidr#k!-enil), 3ant#pr#tein (!ampel N>? dipana!kan dan dititra!i den'an Na>, akan men'ha!ilkan endapan p$tih lal$ #ranyemenandakan adanya '$'$! a!am amin# &erinti &en+ene), natri$m r#p$!ida (!ampel natri$mr#p$!ida pada amm#nia, men'ha!ilkan arna merah p#riti- pada '$'$! !$l-idril), #pkin! *#le

(!ampel rea'en #pkin!*#le dan 2S>4, mem$n*$lkan *in*in i#let menandakan adanyatript#-an)

/et#de K$antitati- terdiri dari met#de anali!i! lan'!$n' (!pektr#m#metri lan'!$n'),pearnaan (met#de l#ry, met#de &$iret, $i A, $i rad-#rd), Keldahl (men'hit$n' kadar nitr#'en melal$i ? tahap, di!'e!ti, netrali!a!i, dan titra!i), titra!i -#rm#ldan /et#de Spekt#!k#piU99"S (den'an met#de lan'!$n' 280 nm, met#de &i$ret, dan met#de 7#ry) Ked$a met#deter!e&$t memiliki kele&ihan dan kelemahan ma!in'ma!in'

REFERENSI

A*hmad, N$rdin 2011 Reaksi $nalisa Protein S$ra&aya (#nline) httpBFF!kp$naira*idFrep#!it#ryFI$r$"nd#ne!iaFeak!iAnali!a%r#teN$rdinA*hmad5=pd- A**e!!edB 1 /ei 2016

An#nim 2011 (ji $sam $mino (#nline) http!BFF!*ri&d*#mFd#*F@1=26062F7ap /ill#nDan#pkin!#le A**e!!edB 1 /ei 2016

An#nim S$matera UtaraB Unier!ita! S$matera Utara (#nline) httpBFFrep#!it#ry$!$a*idF&it!treamFhandleF12?456=8@F?8246Fhapter3-#rd Unier!ity %re!!

#lla', D/, /D #+y*ki, SH del!tein 1@@6 Protein Method iley7i!!, "n*

hen, H 2010 Protein X-Ray Crystallography #nline Aaila&le atB WhttpBFFk!tateed$F&m&Fla&!F*Ftea*hin'F&i#*h5@0F&i#*h5@0=.raypd- R A**e!!ed 1 /ei 2016

irman!yah,, /aardi, A, iandi, /U, N$'raha, D, N$rdian!yah, A, 200= Mudah dan $ktif elajar iologi e#k and$n'B %T Setia %$rna "ne! Aaila&le atB I##'le ##k!httpBFF#k!'##'le*#m A**e!!ed 1 /ei 2016

Kah, K 201? Chem 223!, iophysical and ioanalitical !a%oratory #nline Aaila&le atBWhttpBFFe&*hem$*!&ed$FXkal$F*hem1127F R A**e!!ed 1 /ei 2016

Kindt, TH, AI#ld!&y, A >!rne, H K$&y 200= 4u%y *mmunology Ne #rkB reeman,K##lman, H dan K #ehm 2005 Color $tlas of iochemistry, Second edition,re1ised and enlarged Thieme

/*D#nanald, 1@== Methods of protein $nalysisi and )ariation in Protein Results Aaila&lethr#$'hB N#rth Dak#ta State Unier!ityWhttpBFFli&nd!$n#daked$Frep#!it#ryF&it!treamFhandleF10?65F4===F-arm?40501pd-E!eJ$en*eV1R A**e!!ed 1 /ei 2016

N" (nd) National Center for iotechnology *nformation #nline Aaila&le atBWhttpBFFn*&inlmnih'#F R A**e!!ed 2 /ei 2016

http://www.k-state.edu/bmb/labs/jc/teaching/bioch590/bioch590-7-Xray.pdfhttp://www.k-state.edu/bmb/labs/jc/teaching/bioch590/bioch590-7-Xray.pdfhttp://booksgoogle.com/http://web.chem.ucsb.edu/~kalju/chem112L/http://www.lib.ndsu.nodak.edu/repository/bitstream/handle/10365/4777/farm_34_05_01.pdf?sequence=1http://www.lib.ndsu.nodak.edu/repository/bitstream/handle/10365/4777/farm_34_05_01.pdf?sequence=1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.k-state.edu/bmb/labs/jc/teaching/bioch590/bioch590-7-Xray.pdfhttp://www.k-state.edu/bmb/labs/jc/teaching/bioch590/bioch590-7-Xray.pdfhttp://booksgoogle.com/http://web.chem.ucsb.edu/~kalju/chem112L/http://www.lib.ndsu.nodak.edu/repository/bitstream/handle/10365/4777/farm_34_05_01.pdf?sequence=1http://www.lib.ndsu.nodak.edu/repository/bitstream/handle/10365/4777/farm_34_05_01.pdf?sequence=1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


16/16

N$rar-a, hyranti 201? %>T"N (Ui /ill#n, Ui #pkin!#le, Ui Ninhdrin,Ui eleran', Ui.ant#pr#teat, Ui i$ret ) #'#r (#nline) httpBFFa*ademiaed$F 6162151F$ipr#teiniA**e!!edB 2 /ei 2016

%elt#n, H T, /*lean, 7 2000 Re1ie56 Spectroscopic Methods fo $nalysisi of Protein

Secondary Structrue >nline Aaila&le thr#$'hB i#*hemi!try Unier!ity #- i!*#n!inmadi!#n WhttpBFF&i#*hemi!*ed$F&i-Fin!tr$mentpd-!Fpelt#n2000pd- R A**e!!ed 2 /ei2016

%er!in', D, Ten#er, 2004 Diagnostic Molecular Micro%iology6 Prinsiples and $pplication, AS/, a!hin't#n D, p ?@22@@

$!tam, epy ardi 2011 $nalisa Protein dengan Metode radford (#nline) httpBFF!*ien*e&i#te*hnetFanali!apr#teinden'anmet#de&rad-#rdF A**e!!edB 2 /ei 2016

Sattaya!ai, N 2012 Protein Purrification, Chemical iology, prof+ Deni" #kinci 7#d+/ #nline Aaila&le thr#$'hB "nte*h H#$rnal! e&!ite WhttpBFF*dninte*h#pen*#mFpd-!mF28=65pd- RA**e!!ed 2 /ei 2016

i#, /S #lektroforesis+ #nline Aaila&le atB WhttpBFFd#nl#ad-ait&a*idF-ilenyaFand#$t

LTM DETEKSI PROTEIN

Documents

Transcript of LTM DETEKSI PROTEIN