lineamientos para la vigilancia epidemiológica de la rickettsiosis … · Tiene fundamento legal...

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Dirección General de Epidemiología Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez” lineamientos para la vigilancia epidemiológica de la rickettsiosis por laboratorio

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Dirección General de Epidemiología

Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”

lineamientos para la vigilancia epidemiológicade la rickettsiosis por laboratorio

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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA

DE LA RICKETTSIOSIS POR LABORATORIO

DGE-InDRE–RNLSP

2015

Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos

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PRIMERA EDICIÓN, 2015 RICKETTSIOSIS-RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE

CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS

PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LA RICKETTSIOSIS POR LABORATORIO”. VERSIÓN

NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN DE PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ

BÁEZ. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO

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SECRETARÍA DE SALUD

DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD

DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER

SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ

SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS

DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD

LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA

COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO

DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS

TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y

HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD

LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL

DR. NELLY AGUILERA ABURTO

TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO

LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL

DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN

DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL

DE ENFERMEDADES

DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD

DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA

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LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD

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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS

DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA

SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN

BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS

M. EN C. CARINA BERENICE BRITO LORÁN

JEFA DEL LABORATORIO DE LEPTOSPIROSIS

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GRUPO DE TRABAJO

M. EN C. CARINA BERENICE BRITO LORÁN

JEFA DEL LABORATORIO DE LEPTOSPIROSIS

QBP. ADRIANA GALICIA NICOLÁS

JEFA DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO

ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE

COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLÓGICA DE LA

RICKETTSIOSIS POR LABORATORIO

InDRE-DGE-SS

2015

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Contenido

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 9

ANTECEDENTES ........................................................................................................................... 10

MARCO LEGAL .............................................................................................................................. 13

DEFINICIONES OPERATIVAS .................................................................................................... 14

OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 15

Objetivo general .......................................................................................................................... 15

Objetivos Específicos ................................................................................................................. 15

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA LA VIGILANCIA DE

RICKETTSIOSIS ............................................................................................................................. 15

ORGANIZACIÓN DE LA RED ...................................................................................................... 15

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED ................................................................. 16

Funciones del laboratorio de nivel central .............................................................................. 16

Funciones de los laboratorios estatales (LESP) ..................................................................... 16

Funciones de los laboratorios a nivel local ............................................................................. 16

TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS ............................................................................. 16

ALGORITMO DIAGNÓSTICO ..................................................................................................... 19

ESTÁNDARES DE CALIDAD ....................................................................................................... 19

Criterios de aceptación .............................................................................................................. 19

Criterios de rechazo .................................................................................................................... 22

ESTÁNDARES DE SERVICIO ...................................................................................................... 23

Captura de datos y resultados ................................................................................................... 23

CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO .................................................... 28

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO ......................................................................................... 28

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ........................................................................................... 29

BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 29

Anexo I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ........................................................................................ 32

Anexo II: CARACTERÍSTICAS EQUIPOS COMERCIALES ..................................................... 41

Anexo III: PREPARACIÓN DE REACTIVOS ............................................................................. 42

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INTRODUCCIÓN

Se conoce como Rickettsiosis a un grupo de enfermedades causadas por bacterias

del género Rickettsia y que presentan entre sí similitudes desde el punto de vista

clínico, en México se presenta la enfermedad en prácticamente todo el país.

La Rickettsia son pequeños microorganismos intracelulares obligados con aspecto

de bacilos cortos, Gram negativos. Aunque puede infectar varios tipos de células

incluyendo macrófagos y músculo liso vascular los blancos primarios de infección

en huéspedes mamíferos son las células endoteliales que revisten los vasos

sanguíneos. Se multiplican en el citosol y ocasionalmente en el núcleo de las células

infectadas mediante fisión binaria en un período de 8 a 10 horas.

La Rickettsia es transmitida por vectores infectados, como lo pueden ser la

garrapata, la pulga o el piojo, el modo de infección es por picadura o por

contaminación de heridas localizadas en la piel o las mucosas con vectores

aplastados o sus heces.

No existe trasmisión directa de persona a persona.

Las Rickettsias de mayor importancia epidemiológicamente son:

Rickettsia rickettsii agente etiológico de la fiebre manchada de las Montañas

Rocosas transmitida por la garrapata, (principalmente Rhipicephalus

sanguineus) de la cual su principal reservorio es el perro.

Rickettsia prowasekii agente del tifus epidémico, su vector principal es el piojo

de cuerpo humano, la gente infectada puede presentar una reincidencia

conocida como enfermedad de Brill-Zinsser, se desconocen las causas, las

personas reincidentes pueden generar nuevos brotes

Rickettsia typhi, causante del tifus murino o endémico, los roedores son su

principal reservorio y los principales vectores son las pulgas de rata y gato.

El estándar de oro para el diagnóstico serológico es la Inmunofluorescencia

Indirecta, que es realizada en muestras pareadas para demostrar un incremento de

cuatro o más veces el título de anticuerpos. Debido a que los anticuerpos

comienzan a formarse de 7 a 10 días después del inicio de síntomas, un resultado

negativo antes de 7 días no descarta la infección por Rickettsia sp. Los anticuerpos

IgM usualmente comienzan a desarrollarse al mismo tiempo que los IgG y ambos

permanecen elevados por meses o a veces por años, aunque cabe mencionar que los

anticuerpos IgM son menos específicos. Para la fiebre manchada de las Montañas

Rocosas los anticuerpos IgM comienzan a disminuir después de 3 a 4 meses,

mientras que los anticuerpos IgG persisten de 6 a 8 meses.

Por otra parte una técnica que puede ser utilizada previa a los siete días es la

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de ácidos nucleicos

de la bacteria, de esta manera ambas técnicas se complementan para llevar a cabo

un diagnóstico oportuno dependiendo del tiempo en el que los pacientes acudan a

los servicios médicos.

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Particularmente México es un territorio que favorece la transmisión de

Rickettsiosis debido a sus condiciones geográficas, demográficas y

socioeconómicas, así como de marginación y pobreza, por lo tanto es de gran

importancia llevar a cabo la vigilancia epidemiológica correspondiente a dichas

enfermedades.

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de

laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han

permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de

resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de

recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia

epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de

decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de

laboratorio en muestras biológicas.

La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y

Referencia Epidemiológicos (InDRE) su órgano rector en el área de vigilancia

epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-

SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está conformada por 31

Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32 entidades federativas del

país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).

El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en

16 redes de vigilancia específica.

ANTECEDENTES DE LA RED DE LABORATORIOS DE RICKETTSIOSIS

El Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos Dr. Manuel Martínez

Báez tuvo su origen en el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales

(ISET). A pesar de que se señala a 1939 como año de inicio de los trabajos del ISET,

desde 1935 se había designado una comisión para elaborar un proyecto de creación

y organización del Instituto para constituir un centro de investigación y docencia

para el estudio de las enfermedades de importancia en salud pública prevalentes en

México, fundamentalmente las enfermedades infecciosas. El ISET se inauguró

oficialmente el 19 de marzo de 1939 por el Lic. Rubén Leñero en representación del

entonces Presidente de la República el General Lázaro Cárdenas.

Es curioso mencionar la coincidencia de la ubicación del Instituto en la calle que

lleva el nombre del Dr. Manuel Carpio, ya que el Dr. Carpio fue un destacado

médico veracruzano (1791-1860), editor del Periódico de la Primera Academia de

Medicina de México (1851) y notable poeta de su época.

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En 1941 el Dr. Eliseo Ramírez fue designado director del ISET, sin embargo falleció

el 28 de diciembre del mismo año por lo cual se buscó al sucesor que en este caso

fue el Dr. Manuel Martínez Báez y posteriormente el Dr. Miguel E. Bustamante. En

aquel tiempo la organización interna del Instituto era por laboratorios, cada uno a

cargo de un importante investigador, así por ejemplo el Laboratorio de

Epidemiología y Bioestadística que estaba al frente el Dr. Miguel E. Bustamante; el

laboratorio de Bacteriología e Inmunología con el Dr. Alberto Ponce de León; el de

Protozoología con el Dr. Enrique Beltrán; en el laboratorio de Helmintología el Dr.

Luis Mazzotti; el de Entomología al Dr. Luis Vargas; el de Farmacología y Medicina

Experimental al Dr. Eliseo Ramírez; el de Química al Dr. Teófilo García Sancho; el

de Botánica a la Maestra en Ciencias Ester Luque; el de Anatomía Patológica al Dr.

Manuel Martínez Báez; en la Sección Clínica estaba el Dr. Samuel Morones; en el

Bioterio el Dr. Felipe Rulfo y en la Biblioteca, la Bibliotecaria Angelina Rohen. Poco

después, en 1941 se incorporó el Dr. José Zozaya en Terapéutica Experimental,

sustituyendo al Dr. Eliseo Ramírez y en laboratorios de nueva creación, el Dr.

Antonio González Ochoa en Micología y el Dr. Gerardo Varela en el Centro de

Salmonelas.

La mayor parte de este cuerpo brillante de investigadores prolongó sus actividades

por muchos años. Publicaron las más de sus investigaciones en la propia revista del

Instituto y formaron un número importante de nuevos investigadores que pronto

enriquecieron al propio ISET y a otros Institutos del país.

La actual organización departamental del InDRE tiene sus orígenes en propuestas

que datan de la década de los años sesenta y paulatinamente se han incrementado

en cuanto a su número y actividades que cada uno realiza, de acuerdo con los

cambios y necesidades del panorama de salud del país, así podemos decir que

prácticamente se encuentra en constante cambio . En 1978, se incorporó a la

organización del Instituto el Laboratorio de Investigaciones Inmunológicas que fue

fundado en el año de 1961 por el Dr. Mario Salazar Mallén.

El InDRE ha tenido a lo largo de su historia dos orientaciones diferentes: desde su

creación hasta 1985 fungió como hospital para enfermedades tropicales sujetas a

proyectos de investigación clínica y contó con médicos de gran reconocimiento

nacional e internacional. Esta actividad, a lo largo de los años, fue decayendo y la

retomaron paulatinamente otros institutos que se fueron creando en ese tiempo.

En 1985, se revisó el papel que el Instituto podía jugar en la nueva organización de

la Secretaría de Salud, decidiendo darle una nueva orientación con el propósito de

llenar algunas necesidades de los servicios epidemiológicos, particularmente como

infraestructura de los servicios de vigilancia de enfermedades transmisibles y para

apoyar los programas de vigilancia epidemiológica, es entonces como se dio

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prioridad al desarrollo y ejecución de técnicas eficientes para el diagnóstico y la

referencia, al fortalecimiento de redes nacionales de diagnóstico específico y a la

generación de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP). Bajo

estos nuevos criterios, en 1989, al cumplirse 50 años de su existencia, el Instituto

cambió su nombre por Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia

Epidemiológicos Doctor Manuel Martínez Báez (como un justo homenaje a uno de

los más ilustres fundadores del Instituto) e inició la incorporación de las redes de

diagnóstico de tuberculosis, paludismo y cáncer cérvicouterino, que funcionaban

de manera independiente, y se implementó la red de virus de inmunodeficiencia

humana (VIH) para bancos de sangre. A raíz de la última pandemia de cólera que

llegó a México en junio de 1991, el InDRE tuvo una actividad muy relevante y

organizó la habilitación de Laboratorios en todo el país para la identificación del

Vibrio cholerae.

El diagnóstico de Leptospirosis se comenzó a realizar en el año 1993, en el

“Departamento de Bacteriología y Micología” que estaba integrado por los

siguientes laboratorios: de Cólera y Bacterias Entéricas, el de Infecciones

Respiratorias Agudas, el de Brucela, y por el de Enfermedades de Transmisión

Sexual.

A lo largo de la historia la organización interna del InDRE ha variado en repetidas

ocasiones, algunas de ellas para apegarse a la legislación pero siempre con la

finalidad de buscar mejoras, así actualmente el InDRE cuenta con seis

departamentos que son el de Bacteriología, Biología Molecular, Enfermedades

Emergentes y Urgencias, Parasitología, Virología y Control de Muestras y Servicios.

Desde el 2008 el laboratorio de Leptospirosis pertenece al Departamento de

Bacteriología con la finalidad de hacer eficiente algunos procesos, modifica su

organización y queda integrado de la siguiente manera: Laboratorio de Cólera y

Enterobacterias, Laboratorio de Producción de Sueros, Laboratorio de Infecciones

Respiratorias Agudas Bacterianas, Laboratorio de Brucelosis, Laboratorio de

Bacteriología Molecular, Laboratorio de Leptospirosis, Laboratorio de Medios de

Cultivo, Laboratorio de Micología y Laboratorio de Micobacterias.

La pandemia de influenza AH1N1 ocurrida en el año 2009, vino a reforzar la

importancia de que el país cuente con una institución como el InDRE y de que este

se encuentre coordinando y al frente de la Red Nacional de Laboratorios de Salud

Pública. Así mismo el InDRE ha estrechado relaciones con los Centros de Control

de Enfermedades de los Estados Unidos de Norteamérica (CDC) que le han servido

a su vez como una referencia en pruebas inter-laboratorios y en el desarrollo de

nuevas metodologías de diagnóstico, hablando de diagnósticos que previamente no

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se realizaban y de pruebas que se van modernizando con el objetivo de mejorarlas y

simplificarlas.

En el año 2010 fue transferida al departamento de Bacteriología la técnica de

Inmunofluorescencia Indirecta para el diagnóstico de Rickettsiosis y con ella

también el propio diagnóstico, el cual era realizado anteriormente por el

Departamento de Virología. En la actualidad el diagnóstico de Rickettsiosis se

realiza en el laboratorio de Leptospirosis.

El InDRE es el órgano rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública,

con 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública, así a lo largo de los años el InDRE

ha crecido en cuanto a personal, capacidades y necesidades, razón por la cual se

construyó una nueva sede en Francisco de P. Miranda No.177, Col. Unidad Lomas

de Plateros, Del. Álvaro Obregón, C.P. 01480, México D.F., esta construcción ha

permitido contar con instalaciones amplias y sobre todo adecuadas a las

actividades de un centro de referencia tanto nacional como internacional.

MARCO LEGAL

Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF

05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.

Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y

141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.

Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial

de la Federación DOF: 12/12/2013.

Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación,

DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx

Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema

Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.

Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia

epidemiológica. (DOF: 19/02/2013)

Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010. Para la vigilancia

epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por

vector. (DOF: 01/06//2011)

Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección

Ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos-biológico-infecciosos-

Clasificación y especificaciones de manejo. (DOF: 17/02/2003)

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Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las

características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados

de los residuos peligrosos. (DOF: 23/06/2006).

Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y

funcionamiento de los laboratorios clínicos. (DOF: 27/03/2012).

Lineamientos para programas de evaluación externa del desempeño de la

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE- Secretaría de Salud,

2014.

Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud

Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014.

DEFINICIONES OPERATIVAS Caso sospechoso de Rickettsiosis: Toda persona que proceda de áreas donde

se identifiquen los vectores (piojos, pulgas o garrapatas), animales que los porten o

donde haya sido confirmada la ocurrencia de la enfermedad y que además presente

fiebre acompañada de cualquiera de los siguientes signos o síntomas: mialgias,

artralgias, escalofrío, dolor retrocular, astenia, adinamia, postración; en las

personas que puedan referirla se añadirá la presencia de cefalea.

Caso probable de Rickettsiosis: Todo caso sospechoso que adicionalmente

presente alguno de los siguientes: lesiones sospechosas de picadura, exantema

máculo-papular, petequias o sangrado a cualquier nivel, alteraciones respiratorias

(rinitis, rinorrea, faringitis, tos, dolor o ardor de garganta), alteraciones

neurológicas (fotofobia, convulsiones, alteraciones en el examen citoquímico de

LCR compatibles con infección bacteriana, incoordinación, alucinaciones, parálisis,

rigidez), alteraciones gastrointestinales (anorexia, nauseas, dolor abdominal tipo

cólico, diarrea, vómitos), alteraciones hepáticas (ictericia, aumento de las

bilirrubinas por encima del estándar y/o hipoalbuminemia, y/o elevación de las

transaminasas), alteraciones hematológicas; plaquetopenia <100,000/mm3,

bandemia absoluta >500/mm3, aumento de los tiempos de coagulación, anemia,

hiponatremia <135 mEq/L, elevación de DHL >350 UI/L y acidosis metabólica y/o

respiratoria.

Caso confirmado de Rickettsiosis: Todo caso probable en quien se confirme la

presencia de Rickettsia spp o valores significativos de títulos de anticuerpos contra

dicha bacteria mediante pruebas de laboratorio debidamente avaladas y

autorizadas por la autoridad competente.

Caso descartado. Todo caso probable que no sea confirmado mediante pruebas

de laboratorio debidamente avaladas por la autoridad competente.

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OBJETIVOS

Objetivo general

Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo diagnóstico de

Rickettsiosis y el manejo adecuado de la información generada por el laboratorio, a

través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la

Vigilancia Epidemiológica de la Rickettsiosis.

Objetivos Específicos

Realizar un diagnóstico de Rickettsiosis por laboratorio que sea oportuno y

confiable.

Mantener la vigilancia epidemiológica continua de la circulación de

Rickettsiosis en México.

Generar datos de utilidad para efectuar estudios epidemiológicos y el control

de brotes.

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA LA

VIGILANCIA DE RICKETTSIOSIS

El InDRE realiza el diagnóstico de Rickettsiosis mediante la técnica de

Inmunofluorescencia Indirecta y PCR en tiempo real, para lo cual se ha contado

con capacitación de los Centros de Control de Enfermedades de Estados Unidos de

Norteamérica, así como comparaciones inter-laboratorio, se encuentra en proceso

de recepción de paneles de evaluación provenientes de la misma instancia, sin

embargo aún no se ha realizado la transferencia de estas técnicas a los Laboratorios

Estatales de Salud Pública, ni se ha realizado la evaluación mediante paneles ni

control de calidad a los diferentes laboratorios que puedan contar con alguna

técnica de apoyo al diagnóstico de Rickettsiosis, por lo que hasta el momento no se

cuenta con una Red Nacional de Laboratorios en materia de este diagnóstico.

ORGANIZACIÓN DE LA RED No existe hasta el momento una Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública en

materia de apoyo al diagnóstico de Rickettsiosis por laboratorio.

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FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED

Funciones del laboratorio de nivel central

El Laboratorio de Rickettsiosis del InDRE, es el Laboratorio Nacional de

Referencia y es el órgano normativa para el diagnóstico por laboratorio, dentro de

las funciones que le competen se encuentran las siguientes:

Realizar el diagnóstico de Rickettsiosis mediante la técnica de PCR en

tiempo real o Inmunofluorescencia Indirecta según sea el caso.

Proporcionar asesoría y soporte a la Red Nacional de Laboratorios de Salud

Pública respecto al diagnóstico de Rickettsiosis.

Resguardar los antígenos de Rickettsia.

Analizar la información derivada del diagnóstico de Rickettsiosis.

Actualizar los lineamientos para el diagnóstico de Rickettsiosis de acuerdo al

análisis de datos pertinente.

Dar a conocer las actualizaciones que se realicen en los lineamientos para el

diagnóstico de Rickettsiosis por laboratorio

Funciones de los laboratorios estatales (LESP)

Conocer y aplicar los lineamientos del diagnóstico de Rickettsiosis por

laboratorio.

Difundir la información que el InDRE le haga llegar respecto al diagnóstico

de Rickettsiosis a todos los niveles implicados.

Certificar que las muestras enviadas al InDRE cumplan con los criterios de

aceptación establecidos en el presente lineamiento

Funciones de los laboratorios a nivel local

Recepción, identificación, resguardo y envío de muestras

Recibir capacitación y asesoría del Laboratorio Estatal de Salud Pública

correspondiente

Aplicar las recomendaciones del nivel estatal

Revisar que las muestras enviadas al LESP cumplan con los criterios de

aceptación establecidos en el presente lineamiento

TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS Para realizar la toma de muestra de sangre los pacientes deben de contar con un

ayuno mínimo de 8 horas, y deben de estar en un lugar iluminado, cómodo y de

preferencia sentada (o) si se trata de un paciente ambulatorio, en el caso de los

hospitalizados se efectúa con el paciente acostado. Hay que localizar una vena

periférica, y de preferencia en la cara anterior del brazo, si se trata de la vena

basílica, cefálica o mediana del antebrazo hay que colocar el torniquete en la

porción proximal del brazo. Desinfectar el área con un algodón humedecido con

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alcohol al 70% e introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la piel hasta

localizar el vaso sanguíneo elegido. Si la sangre no fluye espontáneamente presione

el tubo de ensaye hacia arriba. Al empezar a fluir la sangre hay que retirar el

torniquete y una vez que se haya obtenido la cantidad de sangre requerida (5 a 7

mL), retire la aguja y coloque una torunda con alcohol sobre el sitio de punción

ejerciendo presión para detener el sangrado. Para la obtención del suero hay que

utilizar un tubo sin anticoagulante (tubo Vacutainer con tapón rojo).

Para efectuar la separación de suero, una vez tomada la muestra dejar el tubo a

temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la retracción del coágulo,

separe el coágulo formado con un aplicador de madera estéril y en condiciones de

esterilidad, centrifugar de 2,500 a 3,000 rpm durante 10 min. Colocar el suero en

tubos estériles, de plástico con capacidad de 1.5 mL con tapón de rosca. Si la

muestra presenta indicios de contaminación debe de desecharse de inmediato

(realizar este paso en condiciones de esterilidad), rotular y sellar con papel

parafinado, si no se cuenta con la infraestructura para efectuar la separación del

suero se puede enviar el tubo en el que realizó la toma (principalmente aplicable a

laboratorios locales que envían muestras directamente al InDRE), almacenar a

temperatura de refrigeración 2-8 °C.

Para plasma hay que utilizar un tubo con citratos de preferencia o EDTA (tubo

Vacutainer de tapón azul o lila), una vez tomada la muestra hay que homogenizar

por inversión y colocar en una gradilla, rotular, sellar y almacenar a temperatura de

refrigeración 2-8 °C.

Cuando el paciente haya fallecido se puede realizar una biopsia post-mortem, esta

debe de ser de un tamaño aproximado de 3 x 3 x 1 cm y hay que colocarla en un

recipiente de plástico con boca ancha y tapa de rosca que contenga solución salina,

el volumen de debe de ser 10 veces el volumen de la muestra de tejido, hay que

rotularla, sellarla y almacenarla a temperatura de refrigeración 2-8 °C.

La toma del líquido cefalorraquídeo debe de ser efectuada por personal capacitado

y con experiencia, debe de efectuar bajo condiciones asepsia y antisepsia. Los

pacientes deben estar inmóviles, sentados o descansando de lado, con la espalda

arqueada hacia adelante de modo que la cabeza toque las rodillas durante el

procedimiento (posición fetal). Desinfectar la piel a lo largo de la línea entre las dos

crestas ilíacas, con alcohol al 70%, para limpiar la superficie y remover los detritos

y la grasa posteriormente aplicar la tintura de yodo o yodo povidona y deje secar.

Introduzca la aguja y cuando está adentro, obtenga las gotas de líquido

cefalorraquídeo en un volumen promedio de 3 a 4 mL, si es posible en tubos

estériles con tapón de rosca. Marque la muestra con la identificación del paciente y

la fecha y hora de la recolección de la muestra, cabe mencionar que no es la

muestra ideal, sin embargo se procesa en casos de no existir posibilidad de tomar

cualquier otra muestra al paciente.

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Una vez que se ha obtenido el LCR, este debe ser transportado al laboratorio para

ser examinado tan pronto como sea posible (de preferencia dentro de la primera

hora de haberse obtenido); almacenar a temperatura de refrigeración 2-8 °C.

Evitar calentamiento o enfriamiento excesivo de la muestra ya que pueden dejar de

ser útil y habrá que tomarla y enviarla de nuevo.

Transportar los tubos colocados en una gradilla que se encuentre dentro de una

hielera, estos deben de estar en posición vertical cubiertos por una gasa o apósito

grueso para evitar su movimiento, y sobre la gasa se deben de colocar geles

refrigerantes fríos para mantener la temperatura interior de la hielera entre 2 a 8

°C.

El transporte de las biopsias debe de efectuarse en frascos perfectamente sellados y

en una hielera que contenga geles refrigerantes para mantener la temperatura

interior entre 2 a 8 °C y evitar que los frascos se vuelquen.

La muestra debe ser enviada junto con el formato único de envío de muestras del

InDRE. Este debe de venir lleno incluyendo la fecha de inicio de los síntomas, fecha

de la toma de muestra, si se trata de la primera o segunda muestra, si el paciente ha

recibido algún tratamiento y en caso positivo incluir el nombre del fármaco, dosis

así como fecha de inicio y terminación, anexar también documento que incluya los

datos de identificación del paciente, unidad notificante, información de la muestra,

estadio de la enfermedad, antecedentes patológicos, datos epidemiológicos que

incluya contacto con animales y actividades al aire libre, cuadro clínico y exámenes

paraclínicos.

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ALGORITMO DIAGNÓSTICO

Figura 1. Algoritmo diagnóstico de Rickettsiosis

ESTÁNDARES DE CALIDAD

Criterios de aceptación

Las muestras deben de ser tomadas en aquellos individuos que presentan signos y

síntomas compatibles con el cuadro clínico de Rickettsiosis así como alteraciones

en los exámenes paraclínicos:

Síntomas generales

Adinamia

Artralgias

Astenia

Cefalea

Dolor retrocular

Escalofrío

Fiebre

Mialgias

Postración

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Gastrointestinal

Diarrea

Dolor abdominal

Náusea

Vómito

Respiratorios

Dolor o ardor de garganta

Faringitis

Rinitis

Rinorrea

Tos

Hemorragias y alteraciones hematológicas

Hemorragia ocular

Petequias

Púrpura y/o sangrado

Sangrado a cualquier nivel

Sistema Nervioso Central

Alteraciones del citoquímico del LCR compatibles con infección bacteriana

Alucinaciones

Convulsiones

Delirio

Fotofobia

Incoordinación

Insomnio

Parálisis

Rigidez

Tremor

Exantema y piel

Exantema máculo-papular

Eritematoso

Lesiones oculares

Conjuntivitis

Parálisis ocular

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Exámenes paraclínicos

alteraciones hepáticas: ictericia, aumento de las concentraciones de

bilirrubinas por arriba del límite normal superior hipoalbuminemia, y

elevación de las transaminasas

alteraciones hematológicas: plaquetopenia <100,000/mm3, bandemia

absoluta >500/mm3, aumento de los tiempos de coagulación, anemia

alteraciones electrolíticas y enzimáticas: hiponatremia (Na+ sérico <135

mEq/L), elevación de LDH 350 UI/L y acidosis metabólica y/o respiratoria.

Es importante tomar en cuenta, si el paciente proviene de zonas endémicas donde

haya sido confirmada la enfermedad, así como también el contar con el

antecedente de contacto y/o picaduras de piojos, pulgas, garrapatas o de animales

que puedan portar a los mismos; perros, ratas, ganado u otros mamíferos

silvestres, además de actividades al aire libre que expongan al contacto con el

vector como en los caso de los campamentos, excursiones, caza, pesca, actividades

ocupacionales, etc.

Es de vital importancia que también se envíen la historia clínica especificando la

fecha de inicio de los síntomas así como la de toma de la muestra, indicando si se

trata de la primera o segunda muestra y si el paciente ha recibido algún

tratamiento, incluyendo el nombre, la dosis y fecha de inicio y terminación.

Los sueros para la búsqueda de anticuerpos mediante la técnica de

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) deben de ser obtenidos de los pacientes que

tengan de siete o más días de haber iniciado con los signos y síntomas

característicos. Para el caso de muestras para la realización de la técnica de PCR los

pacientes deben tener de 6 o menos días de evolución. Cabe mencionar que en caso

de muestras valiosas; como son el caso de las defunciones, o cuando no sea posible

tomar una muestra adecuada se pueden realizar las pruebas de laboratorio a pesar

de que no se cumpla con ciertos criterios de aceptación, sin embargo se debe

considerar la posibilidad que, debido a no ser la muestra óptima, puede obtenerse

resultados falsos negativos por lo que se deben interpretar con cautela, de

preferencia se debe poner en contacto con el laboratorio de Rickettsiosis localizado

en el InDRE para informar el envío de estas muestras sospechosas.

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Criterios de rechazo

Se rechazan muestras cuando se presenten las siguientes características:

tubo o envase roto

volumen menor a 400 µL en caso de Líquido Cefalorraquídeo

volumen menor a 1 mL en caso de sangre total

volumen menor a 300 µL en caso de sueros o plasma

muestra contaminada

muestra contenida en tubos o recipientes de vidrio

muestra de contactos asintomáticos

muestra de sangre total para el diagnóstico por la técnica de PCR que hayan

sido tomadas después de 6 días de empezados con los signos y síntomas.

muestra de sangre total que no contenga como anticoagulantes citratos o

EDTA

muestra de sangre total para la técnica de PCR que no cuente con

sintomatología aguda: exantema, alteraciones en neurológicas o hemorrágicas

muestras de sueros para diagnóstico por la técnica de IFI que hayan sido

tomadas antes de 7 días de haber iniciado con los signos y síntomas

característicos

muestra derramada

muestra hemolizada

muestra lipémica

muestras conservadas a temperatura ambiente

muestra que no coincida los datos con los de su correspondiente

documentación

muestra de pacientes que no presenten sintomatología característica del

cuadro clínico de Rickettsiosis

muestra que no cuente con la fecha de inicio de síntomas

muestra sin etiqueta o rotulo de identificación

muestra sin fecha de toma

sin datos completos en el Formato Único de Envío de Muestras del InDRE o

Historia Clínica

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ESTÁNDARES DE SERVICIO

El estándar de servicio para el diagnóstico por laboratorio de Rickettsiosis es de 5

días.

Captura de datos y resultados

La captura de los resultados se realiza en el programa INFO-LAB Ver 3.0 dentro de

la base de datos “RICK”.

1. Se selecciona la opción “laboratorio” y después “ver muestras recibidas”.

2. Se abrirá una nueva ventana donde se debe elegir en “Laboratorio” la opción

“RIK”, en “Año” el año en curso, en “Tipo de búsqueda” la opción “Número” y

finalmente seleccionar “Aceptar”.

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3. Se abrirá una ventana donde se despliegan todas las muestras que se han

recibido en el año seleccionado para el diagnóstico de Rickettsiosis, las que se

encuentran en “Status” “Asignado” corresponden a las que no se les ha

registrado un resultado, se debe colocar el cursor sobre alguna de ellas y

posteriormente oprimir la tecla “Enter”, se abrirá entonces una ventana que

contiene toda la información correspondiente a la muestra, se debe

corroborar que todo este correcto, de lo contrario se debe corregir mediante

una solicitud al área de Recepción de Muestras.

4. Cuando se ha comprobado que los datos de las muestras son correctos se

cierran esas ventanas oprimiendo la tecla “Escape” hasta regresar a la ventana

inicial (así se cierran todas las ventanas siempre que se desee) y ahí se

selecciona la opción “Laboratorio” y después “Proceso”.

5. Después se abre una nueva ventana y se deben seleccionar en “Laboratorio” la

opción “RIK”, en “año” el año en curso, en “Status” la opción “Recepción” y

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finalmente “Aceptar”, se abrirá una ventana con todas las muestras que han

sido capturadas para el diagnóstico de Rickettsiosis y que están pendientes de

resultado, se coloca el cursor en alguna o varias de ellas y luego se oprime la

tecla “Enter”, estás muestras pasarán así a otra ventana, la de “Actualización”,

donde se pueden capturar los resultados correspondientes.

6. Se cierra la ventana anterior y se abre una nueva, se deben seleccionar en

“Laboratorio” la opción “RIK”, en “año” el año en curso, en “Status” la opción

“Actualización” y finalmente “Aceptar”.

7. Se coloca el cursor sobre la muestra que se vaya a capturar y se oprime la tecla

“Enter”, aparecerá una pantalla como la que se muestra a continuación (si el

resultado es el mismo para varias muestras consecutivas se puede capturar

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por bloque, de lo contrario por única muestra, eso se elige en la opción

“Desde” y “Hasta”) y se oprime la opción “Aceptar”.

8. Se abrirá una nueva ventana donde se debe elegir en “Diagnóstico inicial” la

opción “RIK, Rickettsiosis”, posteriormente en “Técnica” la opción “IFI” o

“PCR” según sea el caso, luego se elige el resultado correspondiente

“Negativo”, “Positivo” o “Indeterminado”(en caso de resultado positivo en IFI

además se agrega el valor de “Dilución” para la especie correspondiente) en la

casilla de observaciones se incluye la que corresponda al resultado emitido y

finalmente en la parte inferior de la ventana “Diagnóstico de lab” se vuelve a

capturar solo el resultado final (positivo, negativo o indeterminado), se

oprime la tecla “Enter” y aparecerá una ventana que pregunta “¿Desea salvar

los cambios realizados?”, en caso de ser correctos los datos se selecciona la

opción “Si”, de lo contrario la opción “No” y se vuelve a capturar.

9. Una vez que se ha capturado de manera correcta toda la información se

procede a realizar la impresión de los resultados, en la ventana principal se

elige la opción de “Laboratorio” y posteriormente la de “Impresiones”, se

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abrirá una nueva ventana en donde se debe elegir en la barra de herramientas

la opción “RIK”, luego la opción del “Año” que corresponda y finalmente el

“Status” que igualmente corresponda a la muestra que se desea imprimir

(usualmente se elige la opción de “No impreso”) y se oprime la tecla

“Aceptar”, de ahí se desplegará una nueva pantalla con las muestras

disponibles para impresión, se debe colocar el cursor en alguna de ellas y

posteriormente oprimir la tecla “Enter”, se abrirá una ventana donde se deben

introducir los números de las muestras que se desean imprimir y finalmente

se elige la opción de “Aceptar”, una vez impreso se vuelve a revisar que toda la

información sea correcta, de ser así, los resultados se firman y se entregan al

área de recepción de muestras para su envío o entrega, de lo contrario se

solicita la corrección de los datos erróneos al área de recepción de muestras.

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10. El envío de resultados cuando se trata de muestras enviadas por los LESP se

realiza por correo electrónico diariamente a la una de la tarde, posteriormente se

envían por mensajería, el día puede variar, sin embargo el envío a cada LESP se

realiza por lo menos una vez a la semana. Los resultados de muestras que llegan

de manera particular se pueden enviar por fax, o por correo electrónico también,

si dejan los datos correspondientes o por mensajería si se deja alguna guía

pagada, de lo contrario se deben recoger directamente en el InDRE.

CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO

Para que un Laboratorio Estatal de Salud Pública se integre a la Red de Diagnóstico

de Rickettsiosis debe de contar con la infraestructura indispensable, dispositivos

médicos, reactivos e insumos indicados por el InDRE, además de contar con

personal profesional que tenga la capacitación en servicio en el InDRE, este

personal será designado por el LESP para la realización del diagnóstico y debe

contar con una antigüedad mayor a los 6 meses al momento de iniciar el

diagnóstico.

Una vez que el laboratorio cumpla con los requisitos antes mencionados se debe de

notificar el inicio del diagnóstico por vía oficial al InDRE y entonces ya se puede

comenzar a realizar el diagnóstico, de manera inmediata se evaluará su desempeño

mediante el control de calidad y paneles de evaluación externa.

En caso de que su desempeño sea deficiente; menor al 80%, el personal deberá

capacitarse de nuevo en las instalaciones del InDRE, en caso de que el desempeño

sea consecutivamente sobresaliente durante un período de tiempo ya definido se

liberará el diagnóstico al laboratorio correspondiente, quedando abierta la

posibilidad de que el InDRE solicite muestras para referencia.

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO

Se mantiene un banco de muestras positivas y negativas, las muestras negativas

solo se conservan tres meses debido a que la cantidad de estas es grande, por otra

parte la cantidad de muestras positivas de este diagnóstico es baja, todas son

conservadas y almacenadas por un año como mínimo.

El objetivo de mantener un banco de sueros es el de contar con un resguardo de

controles secundarios positivos y negativos que pueden ser utilizados para el

diagnóstico o evaluación, validación y verificación de las pruebas diagnósticas.

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Cuadro 1. Cronograma de actividades para el diagnóstico de Rickettsiosis ACTIVIDAD ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC

Propagación

de células

Vero E6

xxx xxx xxx xxx

Diagnóstico

de

Rickettsiosis

xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx

Trámites para

envío de

Rickettsia por

parte de los

CDC

xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx

Producción y

evaluación de

antígeno de

Rickettsia

para IFI, PCR

y resguardo

xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx

Gestión para

realizar

pruebas inter-

laboratorio

de

diagnóstico

de

Rickettsiosis

xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx

BIBLIOGRAFÍA 1. Centers for Disease Control and Prevention [Internet]. Atlanta, EU: Centers for

Disease Control and Prevention; 04 Noviembre 2010 [actualizado 04 Noviembre

de 2010; acceso 9 de mayo de 2013]. Rocky Mountain spotted fever (RMSF):

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http://www.cdc.gov/rmsf/symptoms/index.html.

2. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta GA, EU. Diagnostic.

Rickettsiology Workshop. 27 de mayo de 2011.

3. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades: Centro Nacional para

las Enfermedades Infecciosas y Organización Mundial de la Salud [Internet].

Atlanta, Georgia USA; fecha de publicación 2004 [fecha de actualización no

disponible; acceso junio 2013].

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4. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Sensibilidad a los

Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública

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http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s16330s/s16330s.pdf.

5. Clements M, Dumler J, Fiset P, and et al. Serodiagnosis of Rocky Mountain

spotted fever: comparison of IgM and IgG enzyme-linked Immunosorbent

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6. Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Aviso epidemiológico

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México: CONAVE; 15 de Noviembre de 2012 [consulta 8 de mayo de 2013].

http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/vigilanciaepidem/aviso_rickettsios

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7. Dantas F. Rocky Mountain spotted fever. Lancet Infect Disease. 2007; 7:724-

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8. Kato C, Chung I, Robinson L, et al Assessment of real-time PCR assay for

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9. Manual Estandarizado para la Vigilancia Epidemiológica de las Enfermedades

Transmitidas por Vectores de la Dirección General de Epidemiológica. 2012.

10. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012 para la vigilancia epidemiológica.

11. Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010 para la Vigilancia

Epidemiología, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector.

12. Walker David H. Rocky Mountain Spotted Fever and Other Rickettsioses. En:

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367.

13. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical

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14. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement/Vol. 60;

2011.

15. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of

Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.

16. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical

Laboratories–5th ed. CDC-NIH; 2009.

17. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk

management standard. Brussels: CEN; 2011.

18. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual–3rd ed. Geneva:

WHO Press; 2004.

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ANEXOS

Página 32 de 42

Anexo I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Inmunofluorescencia indirecta

Recepción de la muestra

Se reciben las muestras en el laboratorio de Rickettsiosis.

Registro de la muestra

Se asigna un número consecutivo a la muestra y se registran los datos del

paciente.

Sensibilización de antígenos en los portaobjetos recubiertos con teflón blanco.

Se permite que el vial del antígeno inactivo a sensibilizar se descongele, o cuando

sea el caso se hidrata con agua grado biología molecular conforme a las

especificaciones impresas en cada vial, después se introduce un capilar de vidrio en

el antígeno y se coloca en los pozos de portaobjetos cubiertos de teflón un volumen

de 2 a 3 mL, se dejan secar y se colocan dentro de un desecador durante 2 horas,

pasado este tiempo se sumergen en acetona al 100% durante 15 a 20 minutos. Los

portaobjetos con el antígeno ya seco y fijado se colocan en cajas para portaobjetos,

las cuales se guardan dentro de una bolsa de plástico con cierre hermético,

finalmente se conservan a una temperatura de -70 °C hasta su uso. Una vez

descongelado o hidratado, el antígeno debe utilizarse en su totalidad y no volverse

a congelarse ni refrigerarse.

Preparación de la muestra

Las muestras se ordenan, de igual forma se ordenan las placas de reacción para

asignación y rastreo de cada una de las muestras, así como los controles en los

diferentes pozos de la microplaca.

Para evidenciar la presencia de anticuerpos de la clase IgG en una primera

muestra, se prepara una dilución 1:64 de la muestra de la siguiente manera: 150 µL

de diluyente PBS-Albumina y se agregan 10 µL del suero de la muestra, obteniendo

una dilución inicial de 1:16 posteriormente efectuar diluciones seriadas 1:32 y 1:64

en los pozos de la microplaca, para finalmente colocar la dilución 1:64 de la

muestra en los portaobjetos con los antígenos fijados correspondientes. Por cada

corrida se incluyen controles positivos y negativos, en el caso de los controles

positivos se deberá probar la dilución óptima.

En caso de presentarse un cruce entre dos o más especies de Rickettsia durante la

lectura de la reacción, se procede a realizar diluciones seriadas de la muestra hasta

encontrar aquella dilución en la que sólo presente reacción positiva una especie,

ese será el título de corte y la especie que se informe como positiva.

Para evidenciar la presencia de anticuerpos de la clase IgG en una segunda muestra

se prepara una dilución inicial de 1:16 de la siguiente manera: a 150 µL de PBS-

albúmina, se le agrega 10 µL del suero de la muestra, se realizan las diluciones

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seriadas, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 en los pozos de la microplaca, para posteriormente

colocar la dilución 1:256 de la muestra en los portaobjetos con los antígenos fijados

correspondientes. Nota: solo se solicita la segunda muestra cuando la primera no

presentó títulos de anticuerpos.

En caso de presentarse un cruce entre dos o más especies de Rickettsia durante la

lectura de la reacción, se procede a realizar diluciones seriadas como se describió

para el caso de las primeras muestras.

Para muestras de seguimiento realizar diluciones seriadas, se puede comenzar con

las más cercanas al título de la última muestra.

Ensayo de la muestra

Se adicionan 15µL de las diferentes diluciones, previamente preparadas, en el pozo

del portaobjetos correspondiente a cada una de las especies de Rickettsias y/o

Ehrlichia dependiendo de la solicitud que haya realizado el LESP o el médico

tratante. La dilución seleccionada para realizar el ensayo de determinación de

inmunoglobulinas tipo IgG en primera muestra es 1:64 y para la segunda muestra

1:256. Se incuba en baño húmedo a 37 °C durante 30 minutos. Se lavan con

solución de PBS 1X (con una pizeta) cada uno de los portaobjetos, se colocan en

una rejilla y esta se introduce en una caja de tinción donde se realizarán 3 lavados

en PBS. Se vacía PBS en la caja hasta que cubra completamente lo pozos, se deja

agitando lentamente 5 minutos a temperatura ambiente con ayuda de un agitador

magnético, se desecha el líquido y se repite el paso otras dos veces, después de

finalizar el último enjuague se dejan secar completamente a temperatura ambiente

dentro de un desecador.

Una vez secos se adicionan 15µL de anticuerpo anti IgG humano conjugado con

isotiocianato de fluoresceína (FITC) (el cual fue previamente titulado para conocer

la dilución óptima de uso y diluido con PBS-albúmina) en cada uno de los pozos de

los portaobjetos, se incuban en baño húmedo a 37 °C durante 30 minutos, se lavan

con solución de PBS 1X con una pizeta cada uno de los portaobjetos, se colocan en

una rejilla para que se realicen 2 lavados de 5 minutos con PBS empleando un

agitador magnético lentamente, al finalizar el segundo lavado no se desecha el PBS

y se agregan 2 mL de negro de eriocromo al 1.65% como colorante de contraste, se

dejan agitando durante 5 minutos y se desecha la solución, se lava nuevamente con

PBS 1X por 5 minutos, se dejan secar a temperatura ambiente dentro de un

desecador hasta que no se observen rastros de humedad en los pozos, después se

adicionan en cada uno de los pozos de los portaobjetos una gota de líquido de

montaje y se coloca un cubreobjetos.

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Lectura microscópica

Observar al microscopio de fluorescencia con objetivo 40X y registrar la lectura.

Las reacciones positivas exhiben fluorescencia citoplasmática color verde-manzana

brillante distribuida homogéneamente a lo largo y ancho de todo el pozo. Para las

muestras positivas en dos o más especies de Rickettsias incluyendo Ehrlichia, se

procede a repetir el ensayo aumentando las diluciones seriadas, hasta obtener

reacción positiva exclusivamente en una especie de Rickettsia y/o Ehrlichia.

Las reacciones negativas son aquellas que:

No exhiben fluorescencia

Presentan fluorescencia menos intensa respecto al control positivo (opaca)

Presentan color verde extracelularmente indicativo de precipitación de reactivos

Presentan fluorescencia que no es homogénea a lo largo de la preparación y que

tiende a acumularse en la periferia

Informe de resultados

Las lecturas se registran en bitácoras (los títulos obtenidos de las diferentes

especies analizadas o negativo a todas).

Se transfieren los resultados al sistema INFOLAB, en las muestras positivas se

informa como positiva la especie de Rickettsia que presente el título más alto y el

resto como negativa o cuando sea el caso negativo a todas las especies,

posteriormente se imprimen y envían al área de recepción de muestras.

Interpretación de resultados

En la primera muestra un título de ≥1:64 en cualquier especie es indicativo de

exposición a, o infección por, el antígeno.

En la primera muestra que no se encuentre título de anticuerpos ≥1:64 se informa

como indeterminado y se solicita una segunda muestra.

En una segunda muestra (tomadas de 2 a 6 semanas de diferencia) un aumento de

cuatro o más veces el título de la primera muestra es indicativo de infección o

exposición al antígeno.

Una segunda muestra (cuando la primera fue indeterminada) títulos menores a

1:64 se informan como negativa.

PCR tiempo real

Recepción de la muestra

Se reciben las muestras en el laboratorio de bacteriología molecular, las cuales son

entregadas por el laboratorio de Rickettsiosis junto con un formato de solicitud de

PCR donde se integran los datos de las mismas; número InDRE, diagnóstico

solicitado, tipo de muestra, etc.

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Muestras útiles para el diagnóstico

*Sangre total con citratos de preferencia, o con EDTA si no cuenta con el anterior,

enviar un tubo en red fría, con un volumen entre 3 a 4 mL y como mínimo 1 mL.

*LCR, enviar en un contenedor adecuado, con un volumen mínimo indispensable

de 400 L y a temperatura de refrigeración 2 a 8 °C.

*Biopsias; hígado, cerebro, pulmón, bazo, riñón, ganglio o petequias en piel, enviar

en contenedor adecuado con solución salina fisiológica y a temperatura de

refrigeración 2 a 8 °C.

Registro de la muestra

Se asigna un número consecutivo interno del área de bacteriología molecular a la

muestra y se registran los datos de la misma.

Preparación y extracción de muestras

Se realiza con estuches comerciales de la compañía QIAGEN para sangre y tejidos

Muestra de sangre

Homogenizar suavemente la sangre

Pequeñas cantidades de muestras se pueden ajustar a 200 µL con agua o buffer AE.

Para obtener el paquete de células blancas (buffy coat) poner 1 mL de sangre en 2

tubos de 1.5 mL y centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente,

retirar el plasma de la superficie y tomar cuidadosamente la fracción intermedia, si

no se distingue tomar 200 µL de la sangre de la superficie de cada tubo y

depositarlos en un tubo limpio (en total serán 400 µL de muestra)

Un tiempo largo de incubación a 56 °C no afecta el rendimiento o calidad del DNA

Centrifugar a máxima velocidad no afecta el rendimiento del DNA

Incubar la columna con el buffer de elución por 5 minutos a temperatura ambiente

incrementa el rendimiento de DNA

Para concentrar la muestra es recomendable eluir hasta en 50 µL de buffer AE o

agua

Protocolo

1. Adicionar 40 µL de proteinasa K a un tubo de 1.5 mL, posteriormente

adicionar los 400 µL de muestra; paquete blanco o sangre de la superficie

2. Agregar 400 µL de Buffer AL y agitar en un vórtex

3. Incubar 15 min a 56 °C

4. Adicionar 400 µL de etanol y agitar en un vórtex hasta homogenizar

5. Transferir la mezcla a una columna y centrifugar a 14000 rpm por 1 min.

Descartar el filtrado y transferir la columna a otro tubo colector; repetir este

pasó 2 veces

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6. Adicionar 500 µL de buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm por 1 min,

descartar el filtrado y cambiar de tubo colector

7. Adicionar 500 µL de buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm por 3 min,

descartar el filtrado y cambiar de tubo colector

8. Centrifugar nuevamente a 14000 rpm por 1 min

9. Transferir la columna a un tubo de 1.5 mL y adicionar 35 µL de buffer AE e

incubar por 5 min a temperatura ambiente, posteriormente centrifugar a

8000 rpm por 1 min

10. Adicionar nuevamente 35 µL de buffer AE y centrifugar a 8000 rpm por 1 min

11. Conservar el DNA eluído a 4 °C o -20 °C hasta su uso

Muestra de Líquido Cefalorraquídeo

Homogenizar suavemente el LCR contenido en el tubo, se toman 200 L y se

colocan en un vial de 1.5 mililitros. A estos 200 µL se les realiza la extracción

conforme el estuche comercial QIAamp DNA Blood Mini kit.

Al final adicionar 25 µL de buffer AE o agua grado biología molecular en la

columna, se incuba 5 minutos, se centrifuga y se repite este paso, para tener un

volumen final de 50 µL.

Muestra: biopsia

Evitar congelar y descongelar las muestras

Retirar dentro de un gabinete de seguridad la envoltura de los contenedores de las

muestras

Desinfectarlos y cambiar de guantes las veces que sea necesario

Cortar 50 mg del tejido que se va a trabajar a (si es bazo no usar más de10 mg).

Tomar la parte del tejido que se vea necrosada o afectada

La disgregación o maceración del tejido puede ser

con Bisturí

con mortero y con un poco de arena estéril

con Nitrógeno

Se sugiere macerar directamente en un tubo tipo Eppendorf con ayuda de un

aplicador de madera y arena estériles, 50 mg ocupan aproximadamente la mitad de

la marca de 0.1 en el tubo de 1.5 mL, como se muestra en la imagen.

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El cerebro se puede trabajar inmediatamente después de macerar, dejando

solamente 20 minutos para la digestión, después se procede tal como lo indica el

manual de QIAGEN.

Protocolo

1. Disgregar de 25 a 50 mg del tejido directamente en el tubo (adicionar un poco

de arena estéril) con 80 µL o menos de la solución de su transporte o agua

grado biología molecular.

2. Adicionar 100 µL de solución buffer ATL y 20 µL de proteinasa K, agitar en un

agitador tipo vórtex.

3. Incubar a 56 °C de 1 a 2 h, si es posible agitar en un vórtex ocasionalmente.

4. Adicionar 200 µL de Buffer AL y agitar en un agitador tipo vórtex el tiempo

suficiente hasta obtener una suspensión homogénea, posteriormente incubar

durante 15 min a 70 °C.

5. Centrifugar a 14000 rpm por 30 segundos para separar el tejido no digerido,

pasar el sobrenadante a un tubo limpio.

6. Adicionar 200 µL de etanol y agitar en un vórtex hasta homogenizar.

7. Transferir la mezcla a la columna y centrifugar a 8000 rpm por un minuto, si

no pasa todo el volumen aumentar la velocidad. Descartar el filtrado y

transferir a otro tubo colector.

8. Adicionar 500 µL de solución buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm por un

minuto, descartar el filtrado y transferir a otro tubo colector.

9. Adicionar 500 µL de solución buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm durante

3 minutos, descartar el filtrado y transferir a otro tubo colector.

10. Centrifugar nuevamente a 14000 rpm por un minuto, descartar el filtrado.

11. Transferir la columna a un tubo de 1.5 mL y adicionar 50 µL de buffer AE e

incubar por 5 minutos a temperatura ambiente, después centrifugar a 8000

rpm durante un minuto.

12. Adicionar de nuevo 50 µL de solución buffer AE y centrifugar a 8000 rpm

durante un minuto.

13. Conservar el ADN eluído a 4 °C o a -20 °C hasta su utilización.

MARC

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Desarrollo de la PCR en tiempo real

Reactivo crítico

Estuche para PCR (illustra PuRE Taq Ready-to-go PCR Beads) GE Healthcare,

como alternative se puede usar el estuche Taqman Gene Expression Master Mix

Applied Biosystems.

Iniciadores y sonda de Rickettsia spp

CS-F5’ TCG CAA ATG TTC ACG GTA CTT T 3’

CS-R5’ TCG TGC ATT TCT TTC CAT TGT G 3’

CS-P5’ -6-FAM-TGC AAT AGC AAG AAC CGT AGG CTG GAT G-BHQ-1-3’

74pb Detección del gen citrato sintetasa como blanco para grupo Rickettsia. Región

altamente conservada, secuencias completamente homólogas para estos iniciadores

y sonda.

Iniciadores y sonda de ARNsa P

RNaseP-F CCA AGT GTG AGG GCT GAA AAG

RNaseP-R TGT TGT GGC TGA TGA ACT ATA AAA GG

RNaseP-P FAM-CC CCA GTC TCT GTC AGC ACT CCC TTC-BHQ1

1. Preparar la mezcla de reacción, existen dos opciones (a y b): Reactivos:

Taqman Gene Expression Master Mix Applied Bio systems. Preparar en un tubo la

siguiente mezcla y posteriormente adicionar 20 µL de ésta a cada pozo

Reactivo Vol. por Reacción

(µL)

X No.

Muestras Vol. total (µL)

Gene Expression 12.5

RNAsePF 10 pmol/µL 1

RNAsePR 10 pmol/µL 1

RNAsePP 10 pmol/µL 0.5

Mgcl2 25 mM 2.5

*H2O 2.5

Reactivo Vol. por reacción (µL) X No.

Muestras Vol. total (µL)

Gene Expression 12.5

CSF 10 pmol/µL 1

CSR 10 pmol/µL 1

CSP 10 pmol/µL 2

Mgcl2 25Mm 2.5

*H2O 1.0

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*Vol. muestra: 5 µL

Si el volumen de la muestra varia se deberá ajustar la cantidad de agua.

a) Reactivos: Illustra™ puReTaq Ready-To-GoTM PCR Beads GE Healthcare.

Preparar en un tubo la siguiente mezcla y posteriormente adicionar 20 µL de

ésta a cada pozo que contiene la perla de reactivos.

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*Vol. muestra: 5 µL

Si el volumen de la muestra varia se deberá ajustar la cantidad de agua.

2. Llevar a cabo el siguiente programa en el Equipo 7500 Fast de Applied

Biosystems.

3. Una vez concluido el desarrollo, se obtienen los resultados. La presencia de una

curva sigmoides bien definida donde se distingan claramente las tres fases de la

reacción de PCR y presente un Ct ≤41 significa presencia de DNA.

4. Una amplificación con Ct mayor a 41 se considera un resultado indeterminado,

lo que indica un bajo rendimiento de DNA que puede ser un falso negativo.

5. La presencia de una línea horizontal sin aparente curva significa la ausencia de

DNA en ese producto.

Reactivo Vol. por reacción

(µL)

X No.

Muestras Vol. total (µL)

CSF 10 pmol/µL 1

CSR 10 pmol/µL 1

CSP* 10 pmol/µL 2

MgCl2 25 mM 2.5

*H2O 13.5

Reactivo Vol. por reacción

(µL)

X No.

Muestras Vol. total (µL)

RNAsePF 10 pmol/µL 1

RNAsePR 10 pmol/µL 1

RNAsePP 10 pmol/µL 0.5

Mgcl2 25 mM 2.5

*H2O 15

50 °C 95 °C 95 °C 60 °C

2 min 5 min 20 segundos 40 segundos

50 ciclos

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Anexo II: CARACTERÍSTICAS EQUIPOS COMERCIALES

microscopio binocular para fluorescencia, con objetivo de 40x, iluminación

halógena 6V/30W

baño de agua de 37 °C

equipo 7500 Fast de Applied Bio systems

calentador en bloque (thermoblock)

gabinete de bioseguridad clase II tipo A2

agitador tipo vórtex

agitador magnético

cabinas para PCR

centrífuga para microplacas

microcentrífuga

centrífuga refrigerada

micropipeta

ultracongeladores

refrigerador

congelador

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Anexo III: PREPARACIÓN DE REACTIVOS

PBS

Se utiliza PBS 10X comercial o se puede preparar de la siguiente manera:

Reactivo Cantidad

Fosfato dibasico de sodio 17gramos

Fosfato monobasico de potasio 4 gramos

Cloruro de sodio 85 gramos

Se mezclan los diferentes reactivos hasta su completa disolucion en agua destilada,

se ajusta el pH entre 7.2 a 7.4 con hidroxido de sodio o acido clorhidrico, se afora a

1000 mL en un matraz aforado, finalmente se filtra en una unidad de filtracion de

0.22 µM.

Diluyente de muestra

Preparación del diluyente de las muestras

Reactivo Cantidad

Albumina serica bovina 2.5 gramos

Timerosal 0.25 gramos

PBS 1X 250 mL

Suero de conejo descomplementado 2.5 mL

Se disuelve el timerosal en el PBS, se agrega la albumina hasta disolverse, se

incorpora el suero de conejo previamente descomplemntado a 56 °C durante 30

minutos y finalmente se filtra con una unidad de filtracion de 0.22 µM. Conserve en

refrigeracion hasta su uso y utilicese en condiciones de esterilidad.