PEMERIKSAAN KUALITAS PANGAN,

ISOLASI (BIAKAN) ANAEROB

DARI SAMPEL MAKANAN

(Makalah diselesaikan untuk Melengkapi Laporan Praktikum Mata Kuliah

Mikrobiologi Pangan, Semester III)

oleh:

Kelompok V

Kadek Dwi Antari (P07131013011)

Darmayanti (P07131013012)

Intan Dery (P07131013013)

Rendra Prastia (P07131013014)

Ni Luh Asri Asih (P07131013015)

Luh Gede Julian Hardiyanti Pertiwi (P07131013016)

Ni Wayan Riska Pratiwi (P07131013017)

Komang Dwi Pradnyani Laksmi (P07131013018)

Gede Aristana (P07131013019)

Debby Santika Gunawan (P07131013020)

KEMENTRIAN KESEHATAN RI

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

JURUSAN GIZI

DENPASAR

2014

A. Judul Praktikum

Pemeriksaan Kualitas Pangan, Isolasi (Biakan) Aerob dan Anaerob dari

Sampel Makanan.

B. Hari, Tanggal Praktikum

Senin, 13 Oktober 2014

C. Tujuan Praktikum

1. Mahasiswa dapat mengetahui ada atau tidaknya bakteri E.Coli dalam

makanan atau bahan pangan.

2. Mahasiswa mengetahui cara isolasi atau pembiakan aerob dan anaerob.

D. Dasar Teori

Isolasi mikroorganisme mengandung arti proses pengambilan mikroorganisme

dari lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di

laboratorium. Isolasi mikroba juga merupakan upaya pembiakkan suatu jenis

mikroba tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang

spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Setiap

mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang spesifik sehingga hal ini

dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untuk isolasi, identifikasi dan

konfirmasi.

Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau

menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s

Citratemedium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam

sitrat sebagai sumber karbon. Pada umumnya media yang digunakan untuk

membiakkan mikroba mengandung air, sumber energi (protein dan karbohidrat),

zat hara (sumber karbon,  nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta

faktor penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin).

Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan

melakukan aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis

mikroba tertentu. Setiap media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu

yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba tertentu tetapi menghambat

pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Sebagai contoh Media MCA ( Mac Conkey

Agar) mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram

Positif, sedangkan bakteri Gram Negatif tetap tumbuh.

Proses isolasi ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikrobia, uji

morfologi, fisiologi, dan serologi. Sedangkan pengujian sifat-sifat tersebut di alam

terbuka sangat mustahil untuk dilakukan. Prinsip kerja isolasi bakteri cukup

sederhana yakni dengan menginokulasikan sejumlah kecil bakteri pada suatu

medium tertentu yang dapat menyusung kehidupan bakteria. Sejumlah kecil

bakteri ini didapat dari bermacam-macam tempat tergantung dari tujuan inokulasi.

Dalam kajian mikrobiologi yang berhubungan dengan sumber bakteri adalah

mikrobia tanah, air, makanan dan udara. Pemahaman mengenai bakteri yang

diinokulasikan merupakan hal yang wajib. Inokulasi bakteri termasuk pula di

dalamnya adalah prinsip untuk membuat lingkungan medium menjadi semirip

mungkin dengan medium aslinya. Pemahaman ini meliputi:

Sifat dan jenis mikrobia yang akan diisolasi

Tempat hidup/atau asal mikrobia tersebut

Medium yang sesuai untuk pertumbuhan

Cara inkubasi mikrobia

Cara menanam mikrobia

Perlakuan yang tidak sesuai terhadap isolat mikrobia dapat mengakibatkan

perkembangan kultur mikrobia hasil isolasi terhambat. Sebagai contoh apabila

yang diisolasi adalah bakteri acidofil namun dikembangkan dalam medium yang

netral maka pertumbuhan bakteri tidak akan maksimal atau malah akan

mati.Teknik dalam menginokulasi bakteri memiliki beberapa variasi metode

misalnya metode goresan (streak plate), metode taburan (pour plate), dan metode

apusan (surface plate). Pemilihan teknik ini didasarkan pada tujuan

penelitian/percobaan.

Apabila ingin mendapatkan kultur murni suatu mikrobia yang digunakan

adalah metode streak plate, karena hasil akhir metode ini adalah berupa kumpulan

sel-sel yang semakin jarang pada ujung streak sehingga dapat diambil bakteri pada

jumlah seluler (satu sel). Selain itu bakteri yang didapat seharusnya merupakan

bakteri yang memang ingin dibiakkan di kultur tersebut dengan kata lain bukan

bakteri kontaminan, sebab yang diambil/dicuplik adalah koloni bakteri yang

berada di atass treak yang dibuat dan bukan di luars treak. Kelebihan metode ini

adalah dapat segera diketahui adanya kontaminasi. Sedangkan kekurangannya

metode ini sulit dilakukan dan hanya dapat digunakan untuk menumbuhkan

bakteri aerob saja.

Metode kedua adalah pour plate. Metode ini dilakukan dengan

menginokulasikan sejumlah bakteri ke dasar cawan baru kemudian medium agar

cair dimasukkan dan dibiarkan memadat. Metode ini cocok digunakan apabila kita

ingin menguji apakah suatu koloni bakteri merupakan bakteri yang aerobik,

anaerob fakultatif, ataukah anaerob obligat. Pengujian ini dapat terjadi karena

hasil akhir metode pour plate adalah berupa pertumbuhan bakteri pada dasar

medium, tengah medium, dan pada permukaan medium. Bakteri yang terdapat

pada dasar medium mungkin adalah bakteri anaerob obligat, sedangkan bakteri

yang tumbuh pada bagian tengah medium adalah bakteri anaerob fakultatif, dan

bakteri yang tumbuh pada permukaan adalah bakteri aerob walaupun perlu

pengkajian lebih lanjut mengenai hal ini. Kekurangan metode ini adalah sulit

menentukan kontaminan dan kerapatan mikrobia karena jarak antar koloni terlalu

rapat.

Metode yang ketiga adalah surface plate. Metode ini cocok digunakan apabila

ingin mengetahui bentuk koloni alami dari suatu bakteri. Kelebihan teknik ini

adalah mudah dilakukan dan mudah menghitung kerapatan mikrobia.

Kekurangannya sulit mengetahui kontaminasi, untuk mengetahuinya perlu

perlakuan kontrol.

Bakteri anaerob adalah jenis bakteri yang hanya mampu hidup pada kondisi

tidak ada oksigen. Bakteri akan mati bila terkena oksigen karena oksigen menjadi

toksik bagi bakteri ini. Habitat dari bakteri anaerob berada di dalam saluran

pencernaan (Escherichia coli) atau di bawah permukaan tanah (Paracoccus).

Respirasi anaerob yang umum dipelajari terjadi pada Escherichia coli yang

mampu melakukan respirasi ketika ada nitrat atau fumarat sebagai akseptor

elektron. Hal itu terjadi karena oksigen menghambat (represi) sintesis nitrat

reduktase atau fumarat reduktase. Jika E. coli menyintesis nitrat reduktase, nitrat

reduktase akan menghambat sintesis fumarat reduktase. Jadi ada hierarki sitokrom

pada respirasi E.coli yaitu dari sitokrom bo ke sitokrom bd (respirasi aerob) ke

nitrat reduktase dan fumarat reduktase (respirasi anaerob).

Bakteri aerob adalah bakteri yang membutuhkan oksigen untuk hidupnya. Bila

tidak ada oksigen, maka bakteri akan mati. Bakteri aerob menggunakan glukosa

atau zat organik lainnya (misalnya etanol) untuk dioksidasi menjadi CO2 (karbon

dioksida), H2O (air), dan sejumlah energi. Yang termasuk bakteri aerob antara lain

Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrobacter, Methanomonas (pengoksidasi metan),

Hydrogenomonas, Thiobacillus thiooxidans, Acetobacter, dan Nocardia

asteroides (penyebab penyakit paru-paru).

E. Cara Kerja

1. Uji Perkiraan (Presumtive Test)

Media yang digunakan adalah media Lactosa broth, didalamnya diisi

dengan tabung durham. Diinkubasi selama 2x24 jam. Tabung durham

berfungsi sebagai penunjuk jika dalam sampel terdapat bakteri maka akan

menimbulkan gas. Jika pada praktikum ditemukan adanya gas maka

diduga adanya coliform.

2. Uji Penegasan (Confirmation Test)

Tabung LB yang positif dilanjutkan dengan penanaman ke media Brilian

Green Lactose Bile Broth (BGLB). Inkubasi pada suhu 350 C, 2 x 24 jam

3. Uji Pelengkap (Complete Test)

Dilanjutkan dengan penanaman ke media Eosin Methylen Blue Agar

(EMBA). Diinkubasi pada suhu 370 C selama 18-24 jam. Kemudian

mengamati ada atau tidaknya kilap logam

F. Hasil Pengamatan

Gambar Keterangan

Amplop anaerob sebagai

biakan anaerob

Sampel makanan yang

tidak mengandung E.Coli

(non fecal coli)

Sampel makanan yang

mengandung E.Coli (fecal

coli) yang ditandai dengan

adanya warna kilap logam

hijau pada biakan EMBA

Anaerobic jars. Untuk

menempatkan banyak

sampel.

Tabung Lactosa broth

yang didalamnya terdapat

tabung Durham sebagai

tempat untuk meletakkan

sampel makanan.

Sampel makanan yang

mengandung E.Coli akan

terdapat gelembung dalam

tabung durham.

Sampel makanan pada

tabung durham yang tidak

mengandung E.Coli

Sampel makanan pada

tabung durham yang

memiliki gelembung

menandakan adanya

E.Coli

Kotak anaerob. Untuk

menenmpatkan satu

sampai dua sampel.

G. Pembahasan

Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran

pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri

patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri

indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi

indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif

dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih

murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh

bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi,

coliform adalah indikator kualitas bahan pangan. Makin sedikit kandungan

coliform artinya, kualitas bahan pangan semakin baik.

Penyakit infeksi masih merupakan penyakit yang paling banyak diderita oleh

penduduk di negara berkembang, termasuk Indonesia. Penyakit infeksi

disebabkan oleh mikroba patogen dan bersifat dinamis. Di negara-negara

berkembang penyakit infeksi masih merupakan penyebab utama tingginya angka

kesakitan (morbiditas) dan angka kematian (mortalitas). Salah satu penyebab

terjadinya penyakit infeksi adalah bakteri oportunistik. Bakteri oportunistik

merupakan bakteri yang hanya menyebabkan penyakit pada orang yang

mengalami penekanan imun yang lemah. Escherichia coli adalah salah satu contoh

bakteri oportunistik. Escherichia coli merupakan bakteri enteric yang terdapat

dalam usus dan biasanya ditemukan dalam jumlah kecil sebagai flora normal

dalam saluran pernafasan dan alat kelamin. Bakteri ini dikenal sebagai bakteri

oportunis yang dapat menyebabkan infeksi primer pada usus sekitar 5% - 10%,

infeksi nosokomial di rumah sakit dan juga infeksi saluran kencing pada wanita

90%. E. coli tergolong bakteri Gram Negatif, berbentuk batang yang tidak

membentuk spora, tidak tahan asam dan ukurannya 2−3 x 0,6 μm. Bakteri ini

dapat ditemukan pada berbagai infeksi pada hewan dan merupakan agen primer

atau sekunder dari infeksi tersebut. Faktor virulensi E. Coli dipengaruhi oleh

ketahanannya terhadap pagositosis, kemampuan perlekatan terhadap epitel sel

pernafasan dan ketahanannya terhadap daya bunuh oleh serum. E. coli yang

patogen ini mempunyai struktur dinding sel yang disebut “pili”, yang tidak

ditemukan pada serotype yang tidak pathogen.

Terdapatnya bakteri coliform dalam bahan pangan dapat menjadi indikasi

kemungkinan besar adanya organisme patogen. Bakteri coliform dibedakan

menjadi 2 tipe, yaitu fecal coliform dan non-fecal coliform. E. Coli adalah bagian

dari fecal coliform. Keberadaan E. Coli dalam makanan dapat menjadi indikator

adanya pencemaran makanan oleh tinja. E. Coli digunakan sebagai indikator

pemeriksaan kualitas bakteriologis secara universal dalam analisis dengan alasan :

1) E. Coli secara normal hanya ditemukan di saluran pencernaan manusia

(sebagai flora normal) atau hewan mamalia, atau bahan yang telah

terkontaminasi dengan tinja manusia atau hewan jarang sekali ditemukan

dalam makanan dengan kualitas kebersihan yang tinggi.

2) E. Coli mudah diperiksa di laboratorium dan sensitivitasnya tinggi jika

pemeriksaan dilakukan dengan benar.

3) Bila dalam bahan pangan tersebut ditemukan E. Coli, maka bahan pangan

tersebut dianggap berbahaya bagi penggunaan domestik.

4) Ada kemungkinan bakteri enterik patogen yang lain dapat ditemukan

bersama-sama dengan E. Coli dalam bahan pangan tersebut.

Penting untuk kita mengetahui adanya bakteri coliform atau tidak, yaitu

bila terjadi perubahan warna jadi kuning/orange dan terdapat gas pada tabung

durham maka pada sampel tersebut terdapat bakteri golongan coliform. Bila

belum mengalami perubahan warna maka bahan pangan dieramkan lagi 48 jam,

jika dalam 48 jam tidak ada perubahan warna maka bahan pangan tersebut tidak

mengandung bakteri coliform. Untuk mengetahui jumlah sel bakteri golongan

coliform yang terdapat dalam sampel bahan pangan, dilakukan metoda Jumlah

Perkiraan Terdekat atau Most Probable Number, untuk menentukan apakah bahan

pangan yang digunakan masih sesuai peruntukannya sebagai bahan pangan atau

tidak. Terdapat tiga tahap pengujian yang dilakukan yaitu :

1) Uji Praduga

Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan

pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung

berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS

(Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef extract (3

gr),peptone (5 gr),lactos e (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya.

Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth

Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari

LBDS yaitu 5 gr.

Tanda positif pada tabel hasil pengamatan menunjukkan adanya bakteri

coliform dalam sample bahan pangan yang diuji. Indikator yang digunakan

dalam melakukan pengamatan ini adalah dengan melihat perubahan warna

yaitu menjadi kuning, ada gelembung dalam tabung durham dan gas pada

tabung reaksi, hal ini terjadi karena mikroba (bakteri Coliform) yang

tumbuh mampu memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas.

Gelembung gas menunjukan adanya metabolisme pada bakteri tersebut.

Tanda negatif (-) pada tabel menunjukkan tidak terdapatnya gelembung

dalam tabung durham dan gas pada tabung reaksi, hal ini menunjukkan

tidak terdapat aktivitas mikroba (bakteri Coliform) dalam tabung kultur.

Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan

gas) tiap serinya setelah diinkubasi. Untuk inkubasi 24 jam.

2) Uji Penguat

Pada uji ini digunakan medium EMB yang komposisinya terdiri dari

Pepton 10 gram, 5 gram lactose, 2 gram HPOK, 13.5 gram agar, 0.4 gram eosin

Y, 0.065 Methylene blue. EMB(Eosin-Methylen Blue) merupakan media selektif

untuk isolasi dan diferensial bakteri enterik, karena kandungan eosin akan

menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan Methylen Blue

sebagai indikator fermentasi laktosa dan sukrosa yang ditunjukkan oleh adanya

perubahan warna hasil dari isolasi pada media EMB tampak adanya koloni

berbentuk bulat, sirkuler dan halus berwarna hijau metalic sheen. Fermentasi

laktosa dan sukrosa membentuk koloni berwarna gelap. Presipitat gelap ini

mungkin MB-eosionate yang dipresipitasi sebagai akibat pH rendah yang berada

di sekitar koloni yang memfermentasi laktosa atau sukrosa. Tidak terjadi warna

hijau metalik menunjukan tidak ditemukannya E.coli. Untuk lebih meyakinkan

adanya keberadaan E.coli pada sampel tersebut maka perlulah dilakukan uji

selanjutnya yaitu uji penyempurna.

3) Uji Penyempurna

Uji ini dilakukan untuk memperkuat dugaan bahwa pada sampel terdapat

bakteri E.coli. Pada uji ini dilakukan dua pengujian yaitu dengan menggunakan

LB dan tabung durham sedangkan yang kedua dengan menanam bakteri tersebut

pada NA agar miring sehingga setelah inkubasi selama 24 jam dapat diamati di

bawah mikroskop dengan terlebih dahulu melakukan pewarnaan gram. LB

digunakan untuk menguji kembali terbentuknya gas pada tabung durham sebagai

hasil fermentasi lactose oleh E.coli dan berdasarkan hasil percobaan pada tabung

reaksi terbentuk gelembung gas.

Adapun alat-alat yang digunakan dalam pemeriksaan kualitas pangan, isolasi

(biakan) aerob dan anaerob dari sampel makanan adalah :

Anaerobic jar adalah suatu alat yang digunakan untuk menciptakan

suasana anaerob buatan (suasana tanpa oksigen) dimana kondisi ini

dibutuhkan untuk perkembangan bakteri anaerob, cara untuk menciptakan

kondisi Anaerobic jar agar anaerob ada dua cara yaitu mengosongkan

udara dengan vakum atau dengan menggunakan gas generating kit.

Anaerobic jar bekerja dengan reaksi kimia yang menghasilkan gas

hidrogen. Dengan menggunakan paladium sebagai katalis, gas hidrogen

akan bereaksi dengan oksigen bebas di udara yang dihasilkan oleh air yang

bereaksi dengan gas generating kit. Reaksi ini mengambil oksigen dari

lingkungan yang tertutup. Kemudian jar diinkubasi pada suhu yang

hangat ± 37OC. Anaerobic jar dalam menciptakan suasana anaerob

menggunakan katalis yang disebut dengan gas generating kit, dimana gas

generating kit adalah suatu bahan yang terdiri dari 3 kristal aktif, ketiga

kristal tersebut adalah Sodium borohydride, Asam sitrat, dan Sodium

bicarbonat, dimana bila ketiga kristal tersebut di reaksikan dengan air

(H2O) akan menghasilkan gas Hidrogen (H) dan Oksigen (O2).

Tabung Durham merupakan alat yang digunakan di

dunia mikrobiologi untuk mendeteksi produksi gas yang dihasilkan dari

mikroorganisme. Alat ini berukuran sangat kecil, ditempatkan pada tabung

reaksi yang telah berisi cairan pertumbuhan mikroorganisme dan zat

indikator yang dapat menandai terjadinya perubahan warna karena adanya

perubahan derajat keasaman dan gas yang dihasilkan. Produksi gas

dicirikan dengan terdapatnya gas di ujung tabung durham setelah

mikroorganisme diinokulasi dan diinkubasi. Penggunaan tabung durham

ini biasa dilakukan pada pengujian biokimia dalam identifikasi bakteri.

Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam

sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).

Gas Generating Kit berfungsi sebagai penyerap oksigen yang ada. Di

dalam gas generating kit terdapat seperti kapsul, yang disebut indikator.

Apabila indikator tersebut berubah warna menjadi ungu, berarti

menunjukkan kondisinya telah anaerob.

H. Kesimpulan

Jadi dari hasil pembahasan yang kami lakukan, kami dapat

menyimpulkan bahwa :

1. Coliform digunakan sebagai indikator pencemaran makanan yang terdiri

atas Fecal coli (Escherichia coli) dan non fecal coli (Enterobacter,

Klebsiella,Citrobacter)

2. Dalam makanan dan minuman tidak boleh ditemukan adanya E.Coli

3. Tahapan dalam isolasi atau pembiakan aerob dan anaerob yaitu Presumtive

test (uji perkiraan), Confirmation Test (Uji Penegasan), Complete test (Uji

Pelengkap).

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2013. Laporan Mikrobiologi, Pengenalan Alat. Tersedia pada

http://pharmacy-mikrobiologi.blogspot.com/2013/10/laporan-

mikrobiologi-pengenalan-alat.html. Diakses pada: 14 Oktober 2014.

Dwi. 2013. Isolasi Bakteri. Tersedia pada:

http://dwierwin.blogspot.com/p/isolasi-bakteri.html. Diakses pada: 14

Oktober 2014.

Murni, Dewi. 2014. Isolasi dan Identifikasi Escherichia. Tersedia pada :

http://veterinarydewi.blogspot.com/2014/01/isolasi-dan-identifikasi-

escherichia.html. Diakses pada : 14 Oktober 2014.

Nugraha. 2012. Isolasi Bakteri Anaerob. Tersedia pada:

http://gaulnugraha.wordpress.com/2012/07/23/isolasi-bakteri-anaerob/.

Diakses pada : 14 Oktober 2014.

Umhir. 2012. Bakteri Coliform. Tersedia pada:

http://jumhirmaeng.wordpress.com/2012/02/21/bakteri-coliform/. Diakses

pada : 14 Oktober 2014.