A. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

B. Mulai Percobaan : Senin, 28 Oktober 2013

C. Selesai Percobaan : Senin, 28 Oktober 2013

D. Tujuan :

Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode

Biuret.

E. Dasar Teori :

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa selain polisakarida,

lipid dan polinukleotida yang merupakan penyusun utama makhluk hidup.

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang

merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan

satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein itu sendiri

mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitroge dan kadang kala sulfur serta

fosfor. Protein dirumuskan oleh Jons Jakob Berzelius pada tahun 1938.

Struktur protein ada 4 tingkatan yaitu :

1. Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis, dan urutan asam amino

dalam molekul protein (rentetan asam amino dalam suatu molekul

protein)

2. Struktur sekunder menunjukkan banyak sifat suatu protein, ditentukan

oleh orientasi molekul sebagai suatu keseluruhan, bentuk suatu molekul

protein (misalnya spiral) dan penataan ruang kerangkanya (ikatan

hidrogen antara gugus N-H, salah satu residu asam amino dengan gugus

karbonil C=O residu asam yang lain)

3. Struktur tersier menunjukkan keadaan kecenderungan polipeptida

membentuk lipatan tali gabungan (interaksi lebih lanjut seperti

terlipatnya kerangka untuk membentuk suatu bulatan)

4. Struktur kuartener menunjukkan derajat persekutuan unit-unit protein.

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu:

1. Protein sederhana yang merupakan protein yang hanya terdiri atas

molekul-molekul asam amino

2. Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan

gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas

karbohidrat, lipid atau asam nukleat.

Protein sederhana menurut bentuk molekulnya dibagi menjadi 2 kelompok,

yaitu:

1. Protein fiber. Molekul protein ini terdiri atas beberapa rantai polipeptida

yang memanjang dan dihubungkan satu sama lain oleh beberapa ikatan

silang hingga merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Protein

fiber tidak larut dalam pelarut-pelarut encer, baik larutan garam, asam,

basa ataupun alkohol. Berat molekulnya yang besar belum dapat

ditentukan dengan pati dan sukar dimurnikan. Kegunaan protein ini

hanya untuk membentuk struktur jaringan dan bahan, contohnya adalah

keratin pada rambut.

2. Protein globular. rotein globular pada umumnya berbentuk bulat atau

elips dan terdiri atas rantai polipeptida yang terlibat. Protein

globular/speroprotein berbentuk bola, protein ini larut dalam larutan

garam dan asam encer, juga lebih mudah berubah di bawah pengaruh

suhu, konsentrasi asam dan asam encer. Protein ini mudah terdenaturasi.

Banyak terdapat pada susu, telur dan daging.

Reaksi-reaksi kahas pada protein (uji kualitatif)

1. Reaksi Ninhidrin. Ninhidrin beraksi dengan asam amino bebas da

protein menghasilkan warna biru. Reaksi ini termasuk yang paling umum

dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya.

Reaksi ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui

adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein

oleh cairan tubuh.

2. Reaksi Biuret. Bila larutan protein dalam suasana basa kuat direaksikan

dengan larutan CuSO4 pekat, akan dihasilkan warna ungu. Warna yang

dihasilkan dari reaksi tersebut disebabkan oleh ikatan koordinasi antara

ion Cu2+ dengan pasangan elektron bebas dari N yang berasal dari

protein dan pasangan elektron bebas dari O molekul air. Reaksi ini tidak

berlaku untuk peptida.

3. Reaksi Uji Millon untuk Tirosin. Reagen Millon adalah larutan asam

nitrat yang mangandung raksa (I) nitrat dan raksa (II) nitrat. Bila reagn

millon dicampurkan dengan larutan yang mengandung protein akan

terbentuk endapan putih yang akan berubah merah bila dipanaskan.

4. Uji Penetralan Titik Isoelektrik. Titik isoelektrik adalah daereah pH

tertentu dimana protein mempunyai selisih muatan, sehingga tidak

bergerak dalam muatan listrik

Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan

dua mulekul urea. Ion Cu2+ dari preaksi Biuret dalam suasana basa akan berekasi

dengan polipeptida atau ikatan-ikatn peptida yang menyusun protein membentuk

senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua

buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau

dipeptida.

Isi dari pereaksi biuret adalah Kalium hidroksida (KOH), Tembaga (II) sulfat

(CuSO4), Kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6). Pembuatan reagen biuret:

Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat

(KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian

tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya

tambahkan aquades sampai garis tanda.

F. Alat Dan Bahan:

Tabung reaksi

Larutan standar protein

Larutan sampel protein

Spektrofotometer UV-VIS

Reagen biuret

G. Alur Percobaan

1. Pembuatan standar

2. Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

1 ml larutan standar protein

Dimasukkan dalam tabung reaksi I,II,III,IV,V dengan kadar protein

1 mg/ml

2 mg/ml

3 mg/ml

4 mg/ml

5 mg/ml

-+ 4 ml reagen biuret pada masing masing tabung reaksi

-Dikocok-Diinkubasikan 30 menit pada suhu

ruangan -Diukur absorbansinya pada λ optimum

dengan alat spektronik

hasil

1 ml aquades

- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi- + 4 ml reagen biuret - Dikocok- Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu

kamar- Diukur absorbansinya pada λ optimum

hasil

3. Penetapan absorbansi larutan sampel

1 ml sampel

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

+ 4 ml reagen biuret

Dikocok

Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar

Diukur absorbansinya pada λ optimum

hasil

H. Hasil Pengamatan

No. Prosedur kerja Hasil pengamatan Dugaan reaksi KesimpulanSebelum Sesudah

1. Pembuatan standar Larutan standar protein :Cair, jernih, tidak berwarna

Reagen biuret : Cair,jernih , biru (+++)

Larutan standar protein 1 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu(+)

Larutan standar protein 2 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (++)

Larutan standar protein 3 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (+++)

Larutan standar protein 4 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (++++)

Larutan standar protein 5 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (+++++)

Larutan basa Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghasilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang 520 nm.

Konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi panjang gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi maka semakin ungu warna larutannya.

Persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein :Y = 0,0503x – 0,0281

Konsentrasi rata-rata sampel: 0,8171 mg/mL

1 ml larutan standar protein

Dimasukkan dalam tabung reaksi I,II,III,IV,V dengan kadar protein

1 mg/ml

2 mg/ml

3 mg/ml

4 mg/ml

5 mg/ml

-+ 4 ml reagen biuret pada masing masing tabung reaksi

-Dikocok-Diinkubasikan 30 menit pada suhu

ruangan -Diukur absorbansinya pada λ

optimum dengan alat spektronik

hasil

2.Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

Aquades : jernih tak berwarnaReagen biuret : jernih biru (+++)

Blanko = biruMelalui excel, didapatkan persamaan Y = 0,0503x – 0,0281R2 = 0,936

Persamaan berdasarkan kurvaY = 0,0503x – 0,0281

Konsentrasi sampel1 = 1,03582 = 0,73763 = 0,6779Konsentrasi rata-rata sampel = 0,8171 mg/mL

1 ml aquades

hasil

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

+ 4 ml reagen biuret

Dikocok

Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar

Diukur absorbansinya pada λ optimum

3. Penetapan absorbansi larutan sampel Sampel : jernih tak berwarna Reagen biuret : jernih biru

1 ml sampel

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

+ 4 ml reagen biuret

Dikocok

Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar

Diukur absorbansinya pada λ optimum

hasil

I. Analisis Data

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein yang ada pada

sampel dengan menggunakan metode biuret. Dengan adanya ikatan peptida, ion

tembaga (II) pada reagen biuret membentuk senyawa kompleks berwarna ungu

dalam larutan alkali. Penentuan protein secara biuret didasarkan atas pengukuran

serapan cahaya (absorbansi) oleh oleh senyawa kompleks yang berwarna ungu

menggunakan prinsip spektrofotometri UV-VIS. Reaksi biuret dapat digunakan

untuk menentukan konsentrasi protein karena ikatan peptida muncul dengan

frekuensi yang sama per asam amino dalam peptida. Sesuai dengan hukum

Lambert-beer, konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada

panjang gelombang maksimum.

1. Pembuatan Standar

Pembuatan serta penetapan absorbansi larutan standard bertujuan untuk

membuat kurva standar dimana diperlukan larutan standar protein dengan

konsentrasi 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml dan 5 mg/ml.. Larutan standar

dibuat dari pengenceran larutan awal 10 mg/ml yang berupa larutan jernih tidak

berwarna. Pengenceran didasarkan pada persamaan:

M1 x V1 = M2 x V2

Labu ukur yang digunakan untuk pengenceran adalah labu ukur 20 ml.

Konsentrasi

awal (M1)

Volume yang

diencerkan (V1)

Konsentrasi hasil

pengenceran (M2)

Volume hasil

pengenceran (V2)

10 mg/ml 10 ml 5 mg/ml 20 ml

5 mg/ml 16 ml 4 mg/ml 20 ml

4 mg/ml 15 ml 3 mg/ml 20 ml

3 mg/ml 13,3 ml 2 mg/ml 20 ml

2 mg/ml 10 ml 1 mg/ml 20 ml

Hasil pengenceran berupa larutan tidak berwarna.

Sebanyak 5 tabung reaksi diisi masing-masing 1 mL larutan standar

protein dengan kadar 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, dan 5 mg/ml. Setelah

itu ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam masing-masing tabung. Reagen

biuret ini berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein.

Reagen ini mengandung NaOH dan CuSO4. Secara teori pada penambahan reagen

biuret akan menghasilkan warna ungu dimana warna ungu dihasilkan dari reaksi

antara reagen biuret dengan protein yang menghasilkan suatu senyawa kompleks.

Warna dari larutan protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi. Semakin besar

konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat warna yang terbentuk, dan

begitu juga sebaliknya. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:

Hasil penambahan tabung dengan reagen biuret:

Tabung 1 (1 mg/ml): ungu

Tabung 2 (2 mg/ml): ungu (+)

Tabung 3 (3 mg/ml): ungu (++)

Tabung 4 (4 mg/ml): ungu (+++)

Tabung 5 (5 mg/ml): ungu (++++)

Setelah penambahan biuret, larutan dikocok dan diinkubasikan pada suhu 37oC

selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau sempurna.

Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC, kemudian

diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang berisi air.

Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil reaksi

larutan protein dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi masing-masing

larutan pada masing-masing larutan pada panjang gelombang 520 nm dengan alat

spektrofotometri UV-VIS.

Tabel hasil absorbansi masing-masing larutan standart:

konsentrasi (mg/ml) absorbansi0,000 0,0001,000 0,0092,000 0,0343,000 0,1244,000 0,1975,000 0,221

Kurva standar

Kurva ini menunjukkan bahwa hasil percobaan sesuai dengan teori bahwa

konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang

maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin ungu warna

larutan, hal ini mengakibatkan cahaya yang diserap lebih tinggi yang

menyebabkan nilai absorbansinya lebih tinggi. Dan didapatkan persamaan y =

0,0503x – 0,0281, dengan nilai regresi kelinearan = 0,936. Seharusnya didapatkan

0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.0000.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

f(x) = 0.0502571428571429 x − 0.0281428571428572R² = 0.935959537598483

KURVA STANDART BIURET

absorbansi

kons

entr

asi (

mg/

ml)

hasil regresi 0,99 untuk mendapatkan hasil absorbansi yang maksimal. Hal ini

akan dibahas dalam diskusi.

2. Penetapan absorbansi larutan blanko

Penetapan absorbansi larutan blanko berfungsi sebagai faktor pengurang

dari absorbansi standar dan sampel karena standar dan sampel tidak murni namun

hasil dari pengenceran yang ditambah aquades. Tabung reaksi diisi 1 ml aquades,

kemudian ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam tabung. Reagen biuret ini

berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Aquades

tidak mengandung protein jadi warna larutan menjadi seperti reagen biuret, yaitu

biru muda. Lalu diinkubasikan pada suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk

warna ungu yang stabil atau sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air,

suhunya diukur sampai 37oC, kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke

dalam gelas kimia yang berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk

mempertajam warna dari hasil reaksi larutan dengan reagen biuret. Kemudian

diukur absorbansi aquades pada panjang gelombang 520 nm dengan alat

spektrofotometri UV-VIS. Hasil absorbansi ini sebagai faktor pengurang dari

absorbansi standar dan sampel karena standar dan sampel tidak murni namun hasil

dari pengenceran yang ditambah aquades.

3. Penetapan absorbansi larutan sampel

Penetapan hasil absorbansi ini digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel.

Tabung reaksi diisi 1 ml sampel, kemudian ditambahkan 4 ml reagen biuret ke

dalam tabung. Warnanya menjadi biru. Reagen biuret ini berfungsi untuk

mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Lalu diinkubasikan pada

suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau

sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC,

kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang

berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari

hasil reaksi larutan dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi aquades

pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-VIS.

Perlakuan ini diulangi tiga kali. Hasil absorbansi yang didapat: 0,024, 0,009, dan

0,006. Dengan menggunakan persamaan linear yang didapat dari kurva standar

protein y = 0,0503x – 0,0281. Didapatkan konsentrasi sampel berturut-turut

1,0358; 0,7376; dan 0,6779. Konsntrasi rata-rata pada sampel = 0,8171 mg/ml.

J. Diskusi

Nilai regresi kelinearan yang didapat dari hasil percobaan = 0,936.

Seharusnya didapatkan hasil regresi 0,99 untuk mendapatkan hasil absorbansi

yang maksimal. Hasil ini dikarenakan kekurangtelitian kami dalam melakukan

pengenceran larutan standar, kurang teliti dalam mengambil volume larutan yang

tidak tepat. Selain itu juga dapat dikarenakan proses inkubasi yang dilakukan

belum maksimal dan warna belum mengembang.

K. Kesimpulan

Dari hasil percobaan dapat kami simpulkan sebagai berikut :

Konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang

gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin

ungu warna larutan, hal ini mengakibatkan cahaya yang diserap lebih tinggi

yang menyebabkan nilai absorbansinya lebih tinggi.

Hasil absorbansi larutan blanko digunakan sebagai faktor pengurang dari

absorbansi standar dan sampel.

Persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein y = 0,0503x –

0,0281.

Konsentrasi rata-rata sampel = 0,8171 mg/ml.

L. Daftar Pustaka

Fesenden, J Ralp, dan Joan S. Fessenden. 2006. Kimia Organik Jilid 2.

Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Erlangga.

Lehninger, Albert L. 1992. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy

Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga.

Tim. 2013. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya : Universitas Negeri

Surabaya.

M. Jawaban Pertanyaan

1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva

standar tersebut tentukan kadar protein sampel!

Tabel

konsentrasi (mg/ml) absorbansi0,000 0,0001,000 0,0092,000 0,0343,000 0,1244,000 0,1975,000 0,221

Kurva standar

0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.0000.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

f(x) = 0.0502571428571429 x − 0.0281428571428572R² = 0.935959537598483

KURVA STANDART BIURET

absorbansi

kons

entr

asi (

mg/

ml)

2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi Biuret?

Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang tercampur

dengan peptida?

Peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret, hal ini

dibuktikan dengan terbentuknya larutan berwarna ungu jika peptida

direaksikan dengan reagen biuret. Cara penentuan kadarnya juga seperti cara

penentuan kadar protein seperti yang dilakukan pada analisis diatas yaitu

dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-VIS. Karena ikatan peptida

dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu yang dapat dibaca oleh

alat tersebut.

LAMPIRAN PERHITUNGAN

Untuk 5 mg/ml

M 1V 1=M2 V 2

10 ×V 1=5× 20

10 V 1=100

V 1=10 ml

Untuk 4 mg/ml

M 1V 1=M2 V 2

5 ×V 1=4 × 20

5 V 1=80

V 1=16 ml

Untuk 3 mg/ml

M 1V 1=M2 V 2

4 ×V 1=3 × 20

4 V 1=60

V 1=15 ml

Untuk 2 mg/ml

M 1V 1=M2 V 2

3 ×V 1=2× 20

3 V 1=40

V 1=13,3 ml

Untuk 1 mg/ml

M 1V 1=M2 V 2

2 ×V 1=1×20

2 V 1=20

V 1=10 ml

Lampiran tabel konsentrasi terhadap absorbansi

0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.0000.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

f(x) = 0.0502571428571429 x − 0.0281428571428572R² = 0.935959537598483

KURVA STANDART BIURET

absorbansi

kons

entr

asi (

mg/

ml)

konsentrasi (mg/ml) absorbansi0,000 0,0001,000 0,0092,000 0,0343,000 0,1244,000 0,1975,000 0,221

Konsentrasi pada sampel:

Sampel 1

y = 0,0503x – 0,0281

0,024 = 0,0503x – 0,0281

0,0521 = 0,0503x

X = 1,0358

Sampel 2

y = 0,0503x – 0,0281

0,009 = 0,0503x – 0,0281

0,0371 = 0,0503x

X = 0,7376

Sampel 3

y = 0,0503x – 0,0281

0,006 = 0,0503x – 0,0281

0,0341 = 0,0503x

X = 0,6779

Jadi konsentrasi sampel rata-rata,

konsentrasi rata−rata=1,0358+0,7376+0,67793

=0,8171mg /ml

LAMPIRAN FOTO

Alat yang digunakan

Proses pengenceran

1 – 5 ppmLarutan yang digunakan

Penambahan BiuretProses Inkubasi