LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGIMODUL BIOLOGI MOLEKULER

ISOLASI DNA

Disusun Oleh :

Octaviani Wiranda Putri(H1A013008)

Dosen pembimbing: Drs. Choirul Muslim, Ph.DFakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Bengkulu

2015BAB 1Pendahuluan

I. Latar BelakangSampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai materi genetik suatu organisme nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak langsung melalui analisis urutan protein dan RNA atau melalui analisis genetic. Kini menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu genome, yaitu total informasi genetic yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.

Teknologi rekombinan DNA yang menjadi pusat kegiatan dalam aktifitas Bioteknologi, merupakan suatu teknik yang menggabungkan suatu segmen DNA dengan DNA yang lain, telah menjadi pengetahuan yang memberikan banyak manfaat bagi kehidupan manusia, seperti dalam produksi vaksin dan hormone. Aktifitas utama dalam teknik rekombinan DNA, antara lain:

1. Memotong DNA pada tempat (site) yang spesifik dengan enzim restriksi nuclease. Dengan teknik ini, dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara individual.

2. Kloning DNA dengan menggunakan suatu vector atau teknik Polymerase Chains Reaction (PCR), yang memungkinkan suatu molekul DNA dapat dikopi untuk meghasilkan jutaan molekul identik.

3. Hibridisasi asam nukleat, teknik untuk menemukan urutan DNA atau RNA yang spesifik dengan tingkat akurasi yang tinggi berdasarkan kemampuannya mengikat urutan asam nukleat komplemennya

4. Pengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen DNA yang telah dipurifikasi. Bertujuan untuk mengidentifikasi gen dan memperkirakan urutan asam amino yang membentuk protein.

5. Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel dengan menggunakan teknik mircroarry asam nukleat.

II. Tujuan Umum

Mengisolasi DNA dari jaringan dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Tissue)

III. Tujuan Khusus

Mendapatkan molekul DNA murni dengan menghancurkan molekul-molekul lainnya.

Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan sample DNA diambil dari jaringan hati ayam

BAB 2

Landasan Teori

2.1 Deoxyribonucleic Acid (DNA)DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. (Klug & Cummings 1994: 315316; Raven & Johnson 2002: 94).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176178). Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)Ada tiga struktur DNA yang dikenal selama ini. Struktur-struktur DNA tersebut adalah sebagai berikut:1. Struktur primer

DNA tersusun dari monomer-monomer nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari satu basa nitrogen berupa senyawa purin atau pirimidin, satu gula pentose berupa 2 deoksi-D-ribosa dalam bentuk furanosa, dan satu molekul fosfat. Penulisan urutan basa dimulai dari kiri yaitu ujung 5 bebas (tidak terikat nukleotida lain) menuju ujung dengan gugus 3 hidroksil bebas atau dengan arah53 (Darnell, et al., dalam T. Milanda, 1994).

2. Struktur sekunder

Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan fungsinya sebagai pembawa informasi genetika adalah komposisi basa penyusun. Pada tahun 1949-1953, Edwin Chargaff menggunakan metode kromatografi untuk pemisahan dan analisis kuantitatif keempat basa DNA, yang diisolasi dari berbagai organisme. Kesimpulan yang diambil dari data yang terkumpul adalah sebagai berikut :

a. Komposisi basa DNA bervariasi antara spesies yang satu dengan spesies yang lain.

b. Sampel DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan pada spesies yang sama mempunyai komposisi basa yang sama.

c. Komposisi DNA pada suatu spesies tidak berubah oleh perubahan usia, keadaan nutrisi maupun perubahan lingkungan.

d. Hampir semua DNA yang diteliti mempunyai jumlah residu adenine yang sama dengan jumlah residu timin (A=T), dan jumlah residu guanin yang sama dengan jumlah residu sitosin (G=C) maka A+G = C+T, yang disebut aturan Charrgaff.

e. DNA yang diekstraksi dari spesies-spesies dengan hubungan kekerabatan yang dekat mempunyai komposisi basa yang hampir sama.

Pada tahun 1953, James D. Watson dan Francis H.C. Crick berhasil menguraikan struktur sekunder DNA yang berbentuk heliks ganda melalui analisis pola difraksi sinar X dan membangun model strukturnya (Darnell, et al. dalamT. Milanda, 1994). Heliks ganda tersebut tersusun dari dua untai polinukleotida secara antiparalel (arah 53saling berlawanan), berputar kekanan dan melingkari suatu sumbu. Unit gula fosfat berada di luar molekul DNA dengan basa-basa komplementer yang berpasangan di dalam molekul. Ikatan hidrogen diantara pasangan basa memegangi kedua untai heliks ganda tersebut (Willbraham and Matta dalam T. Milanda, 1994). Kedua untai melingkar sedemikian rupa sehingga keduanya tidak dapat dipisahkan kembali bila putaran masing-masing untai dibuka. (a) struktur primer DNA

(b)struktur sekunder DNA

Jarak di antara kedua untai hanya memungkinkan pemasangan basa purin (lebih besar) dengan basa pirimidin (lebih kecil). Adenin berpasangan dengan timin membentuk dua ikatan hydrogen sedangkan guanine berpasangan dengan sitosin membentuk tiga ikatan hidrogen. Dua ikatan glikosidik yang mengikat pasangan basa pada cincin gula, tidak persis berhadapan. Akibatnya, jarak antara unit-unit gula fosfat yang berhadapan sepanjang heliks ganda tidak sama dan membentuk celah antara yang berbeda,yaitu celah mayor dan celah minor (Marks, et al., 1996 ;Robert K. Murray,et al., 2000).

3. Struktur tersier

Kebanyakan DNA virus dan DNA mitokondria merupakan molekul lingkar. Konformasi ini terjadi karena kedua untaai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diisolasi dari bakteri, virus dan mitokondria sering kali berbentuk superkoil, selain itu DNA dapat berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai yang bebas.DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah:1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup (Sadava dkk. 2004:220).2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).2.4 Komponen Sela. Membran plasmaTersusun atas molekul lemak (2 lapis; terdapat di bagian tengah membran) dan protein (luar: protein perifer (protein tepi) menyusun tepi luar dan dalam membran; selain itu ada protein yang menembus ke dalam 2 lapisan lemak (disebut protein integral) (Yuwono, 2006).Fungsi membran plasma: Melindungi isi sel (mempertahankan isi sel) ; Mengatur keluar masuknya molekul-molekul (bersifat semipermeabel / selektif permeabel; berarti hanya zat tertentu yang dapat melewati membran). Sebagai reseptor (penerima) rangsangan dari luar sel (bagian sel yang berfungsi sebagai reseptor adalah glikoprotein) berupa rangsang kimia, mis. hormon, racun, listrik, mekanik (Yuwono, 2006).

Gambar 1. Membran sel

b. Sitoplasma (plasma sel)Merupakan cairan yang berada dalam sel selain nukleoplasma (plasma inti). Cairannya disebut sitosol, padatan berupa organel-organel. Sitosol tersusun atas air, protein, asam amino, vitamin, nukleotida, asaam lemak, gula, dan ion - ion. (Sitosol mempunyai nama lain : matriks sitoplasma). Padatan sitoplasma terdiri dari organel-organel diantaranya ribosom, mitokondria, dan kompleks Golgi. Dan mempunyai sifat fisik berubah-ubah karena mengandung protein, dapat berupa fase sol (cair) dan fase gel (gelantin, padat) tergantung kondisi sel (Yuwono, 2006).Fungsi Sitoplasma: Tempat penyimpanan bahan-bahan kimia yang penting bagi metabolisme sel (enzim, gula, lemak, dan protein); Tempat terjadinya pembongkaran dan penyusunan zat melalui reaksi kimia (pembentukan energy,sintesis asam lemak, dan asam amino) (Yuwono, 2006).

c. Nukleus (Inti sel)Merupakan organel terbesar yang berada di dalam sel, terletak di tengah sel dan berbentuk bulat atau oval. Kromosom tersusun atas protein dan DNA (berfungsi untuk menyampaikan informasi genetik dan sintesis protein) serta RNA (berfungsi untuk sintesis protein saja) (Yuwono, 2006).Kandungan nukleus, terdiri atas: Membran nukleus merupakan membran luar dan dalam, dimana membran luar langsung berhubungan dengan RE, dan akhirnya ke membran sel. Nukleoplasma disebut juga matriks nucleus (tersusun atas air, protein, ion, enzim, dan asam inti) bersifat gel. Di dalamnya terdapat benang-benang kromatin (benang penyerap warna), pada saat proses mitosis maka benang kromatin itu tampak memendek dan disebut kromosom (tersusun atas protein dan DNA). Lalu DNA akan mentranskripsi diri (mengkopi diri) menjadi RNA yang dikeluarkan sitoplasma. Nukleolus disebut juga anak inti, terbentuk pada saat terjadi proses transkripsi (sintesis RNA) di dalam nukleus. Jadi, nukleolus bukan organel tetap, melainkan suatu tanda bahwa sel sedang melakukan transkripsi berhenti, maka nucleolus akan mengecil dan menghilang (Yuwono, 2006).

Gambar 2.NukleusFungsi nukleus: Pengendali seluruh kegiatan sel; pengatur pembelahan sel;

Pembawa informasi genetik (DNA) mewariskan sifat-sifat melalui pembelahan sel (Yuwono, 2006).

d. SentriolDapat dilihat ketika sel mengadakan pembelahan pada fase tertentu, dalam hidupnya sentriol memiliki silia/flagella dan hanya ditemui pada sel hewan. Dalam pembelahan sel itu sentriol terletak tegak lurus antar sesamanya dekat nukleus. Pada pembelahan mitosis sentriol terbagi menjadi 2, tiap-tiap bagian menunjukan kutub sel maka terbentuklah benang-benang spindle yang menghubungkan kedua kutub yang berfungsi menarik kromosom menuju kutub masing-masing (Yuwono, 2006).e. Retikulum Endoplasma

Gambar 3. Retikulum Endoplasma

Terletak memusat pada bagian dalam sitoplasma (endoplasma) maka disebut Retikulum Endoplasma (RE) yang hanya terdapat pada sel eukariotik.

Macam-macam Retikulum Endoplasma:

RE kasar terletak berhadapan dengan sitoplasma dan ditempeli ribosom (maka tampak berbintil-bintil). RE halus tidak mengandung ribosom (Yuwono, 2006).

Fungsi RE:

Menampung protein dihasilkan oleh ribosom (masuk ke dalam rongga RE) untuk disalurkan pada kompleks golgi dan berakhir pada sel (RE kasar); Mensintesis lemak dan kolesterol (RE Kasar dan Halus); Menetralkan racun (detoksifikasi) dari RE dalam sel-sel hati. Transportasi molekul-molekul dari bagian yang satu ke bagian yang lainnya (RE Kasar dan RE Halus) (Yuwono, 2006).

f. RibosomStruktur ini berbentuk bulat terdiri dari dua partikel besar dan kecil, ada yang melekat sepanjang RE dan ada pula yang soliter. Ribosom merupakan organ sel terkecil yang tersuspensi di dalam sel dan struktur ini hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron (Yuwono, 2006).

Gambar 4. RibosomFungsi ribosom: tempat sintesis protein (Yuwono, 2006).

g. Kompleks GolgiKompleks Golgi pada sel tumbuhan disebut diktiosom. Kompleks Golgi merupakan organel polimorfik, tersusun atas membrane berbentuk kantong pipih, berupa pembuluh, gelombang kecil, atau bentukan seperti mangkok (Yuwono, 2006).Cara kerja kompleks golgi:

RE menampung dan menyalurkan protein ke Golgi, Golgi mereaksikan protein itu dengan glioksilat sehingga terbentuk glikoprotein untuk dibawa ke luar sel. (maka golgi disebut juga sebagai organel sekretori) (Yuwono, 2006).

Gambar 5. Badan GolgiFungsi Badan Golgi :

Menambah glioksilat pada protein; Sebagai organel sekretori; Mensintesis (membentuk) glikopida; Membentuk dinding sel tumbuhan; Membentuk lisosom (Yuwono, 2006).

h. LisosomLisosom berasal dari (lyso = pencernaan; soma = tubuh) merupakan membran yang berbentuk kantong kecil yg berisi enzim hidrolitik (hidrolase) disebut lisozim, yang berfungsi untuk pencernaan intra sel (mencerna zat yang masuk ke dalam sel) (Yuwono, 2006).1. Pembentukan LisosomEnzim Lisosom / protein yg diproduksi oleh ribosom masuk ke RE enzim dimasukkan ke dalam membran dikeluarkan ke sitoplasma menjadi lisosom; Selain itu ada yg enzim dimasukkan ke Golgi dibungkus membran dilepaskan di dalam sitoplasma.2. Proses pencernaan oleh lisosom:Contoh: sel menelan benda asing berupa bakteri secara fagositosis bakteri dimasukkan ke dalam vakuola didatangi lisosom membran lisosom & membran vakuola bersinggungan membran bersatu enzim dari lisosom masuk ke vakuola mencerna bakteri (Yuwono, 2006).

Gambar 6. Lisosom

Enzim lisosom tidak aktif mencerna jika membran lisosom pecah, jika membran pecah maka enzim lisosom akan keluar dari membran & mencerna sel itu sendiri (Yuwono, 2006).

i. Badan Mikro

Terdiri atas :1. Peroksisom (dikandung banyak pada sel2 yang banyak melakukan respirasi. Contoh: Sel hati, ginjal, otot mengandung enzim katalase, menguraikan hidrogen peroksida (bersifat racun) (H2O2) menjadi oksigen & air. Dan berperan dalam metabolisme lemak & fotorespirasi.2. Glioksisom hanya terdapat pada sel tumbuhan terutama pada jaringan yg mengandung lemak, seperti biji-bijian berlemak, menghasilkan enzim katalase dan oksidase yg berperan dalam proses metabolisme lemak, mengubah lemak menjadi gula. Dihasilkan energi yang diperlukan untuk perkecambahan biji (Yuwono, 2006).

Gambar 7. Peroksisom

j. MitokondriaMerupakan penghasil energi (ATP) (The power hous) karena berfungsi untuk respirasi. Secara umum mitokondria berbentuk butiran/benang dan bersifat plastis (mudah berubah). Mitokondria berkembang biak dengan membelah diri dari mitokondria sebelumnya (pembelahan pada bakteri) (Yuwono, 2006).Dalam Mitokondria memiliki 2 membran: Membran luar & dalam. Membran luar mirip dengan membran plasma. Pada membran dalam terjadi pelekukan ke arah dalam membentuk krista (membuat permukaan membran semakin luas sehingga proses respirasi menjadi semakin efektif) terjadi dalam membran dalam mitokondria dan matriks (tersusun atas air, protein, enzim respirasi, garam, DNA dan ion-ion) (Yuwono, 2006).

Gambar 8. Mitokondria

Reaksi Respirasi yang terjadi :

reaksi dekarboksilasi oksidatif; daur Krebs; transfer elektron.

k. Mikortubulus dan MikrofilamenTerdiri ada beberapa bagian: Mikrotubulus: pada gelendong sel; berupa benang2 spindel yg menghubungkan 2 kutub sel pada waktu pembelahan (gerakan kromosom dari daerah equator ke kutub masing2 dikendalikan oleh mikrotubulus.) Selain itu berguna pula untuk penyusun sentriol, flagela, & silia. Secara umum dapat disimpulkan berguna pada pergerakan sel. Mikrofilamen: merupakan benang2 halus, tipis, & memanjang. Mempunyai 2 protein yaitu aktin dan miosin banyak terdapat pada sel2 otot & membentuk rangka dalam pada sel.

Contoh: menyebabkan kontraksi pada sel2 otot; tetapi apabila aktin dan miosin saling menjauh maka akan terjadi relaksasi; Amoeba: berperan dalam pembentukan pseudopoda, gerakan sel, gerakan sitoplasma, pembelahan sel yaitu terbelahnya sel menjadi 2 sel anak karena ditarik mikrofilamen yg menghubungkan membrane (Yuwono, 2006).

Gambar 9. Mikortubulus dan Mikrofilamen2.3 Isolasi DNAIsolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002:115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia, hewan maupun pada tumbuhan. Isolasi DNA pada hewan salah satunya dalah dengan menggunakan hepar ayam. DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti seperti pada sampel hepar ayam. Teknik utama dari isolasi DNA adalah:

1. Penghancuran membran sel dengan Cell Lysis Solution (CLS)

2. Penghancuran membran inti dengan Nuclei Lysis Solution (NLS)

3. Pengendapan protein dengan Protein Precipitation Solution (PPS)

4. Pencucian DNA dengan isopropanol dan alkohol 70%

Metode-metode isolasi DNA :

1. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatenya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004).

2. Metode CTAB

Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differential of solubility). Disamping diperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi.3. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%.

BAB 3

Metodologi Penelitian3.1 Alat

a. Micropipet 0,5-10 ul, 10-100 ul, 100-1000 ul.

b. Tip biru.

c. Tip kuning.

d. Tip putih.

e. Vortex.

f. Microcentrifugator.

g. Timbangan analitik.

h. Inkubator.

i. Kulkas.

j. Alarm/stopwatch.

3.2 Bahan

a. Genomic DNA mini kit (tissue) GT100, yang terdiri dari:

- GT buffer.

- GBT buffer.

- W1 buffer.

- Proteinase K.

- GD column.

- 2 ml collection tube.

- Micropestle.

b. Etanol absolut.

c. Microtube 1,5 mL.

d. Aquabidest.

e. Jaringan otak/hepar @ 30 mg

f. Aluminum foil.

3.3. Cara Kerja

Ada empat (4) tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel:

a. Menghancurkan jaringan secara mekanik dengan micropestle.

b. Melisiskan sel secara kimiawi dengan GT buffer.

c. Mempresipitasikan protein dengan proteinase K dan GBT buffer (mengandung garam

chaotropic guanidine hidroklorida, SELALU GUNAKAN APD SELAMA

BEKERJA), kemudian (opsional) memurnikan DNA dari RNA dengan RNase A (10

mg/mL).

d. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh

Urutan cara kerja:

1. Potong 20 mg jaringan dan masukkan dalam microtube.

2. Masukkan micropestle dalam microtube dan hancurkan jaringan hingga menjadi

bubur.

3. Tambahkan 200 ul GT buffer ke microtube dan lanjutkan proses penghancuran

dengan micropestle.

4. Tambahkan 20 ul proteinase K dan kocok dengan kuat. Inkubasi selama 30 menit

pada suhu 60oC (selama inkubasi, bolak-balik tabung setiap 5 menit).

5. Tambahkan 200 ul GBT buffer dan kocok kuat selama 5 detik.

6. Inkubasi pada suhu 60oC selama minimal 20 menit hingga lisat jernih (selama

inkubasi, bolak-balik tabung setiap 5 menit).

7. Panaskan elution buffer (100 ul per sampel) pada suhu 60oC.

8. Tambahkan 200 ul etanol absolut pada lisat kemudian kocok dengan kuat selama 10

detik.

9. Pasang GD column pada 2 ml collection tube.

10. Transfer campuran ke GD column.

11. Sentrifugasi pada 14-16.000 g (13.500 rpm) selama 2 menit.

12. Buang collection tube lalu transfer GD column ke collection tube baru.

13. Tambahkan 400 ul W1 buffer ke GD column lalu sentrifugasi pada 14-16.000 g (13.500 rpm) selama 1 menit.

14. Buang cairan hasil penyaringan lalu pasang kembali GD column pada collection tube.

15. Sentrifugasi pada 14-16.000 g (13.500) selama 3 menit.

16. Transfer GD column ke microtube baru.

17. Tambahkan 100 ml elution buffer yang telah dipanaskan ke bagian tengah matriks

kolom.

18. Diamkan selama 5 menit.

19. Sentrifugasi pada 14-16.000 g (13.500 rpm) selama 1 menit.

20. Masukkan kembali cairan hasil penyaringan ke bagian tengah matriks kolom.

21. Ulangi sentrifugasi pada 14-16.000 g (13.500 rpm) selama 1 menit.

22. Simpan DNA pada suhu -20 oC.

BAB 4

Hasil Dan Pembahasan

4.1 Hasil

Pada gambar terlihat supernatant pada bagian atas dan pelet pada bagian bawahnya. Kemudian supernatant dipisahkan ke tabung microcentrifuge steril lainnya dan dicampurkan dengan 200 l ethanol absolut. Ethanol disini berfungsi mengendapkan DNA karena muatannya negatif. Lalu campuran tersebut dikocok selama 10 detik. Setelah itu diletakkan pada GD column dalam 2 ml Collection tube. Seperti pada gambar 4.2 (a) dibawah ini.

Dilanjutkan dengan cara kerja nomor 12 sampai nomor 13 didapatkan hasil seperti pada gambar 6.2 (b). Lalu dipisahkan antara larutan yang terdapat pada 2 ml Collection tube tersebut . Kemudian GD columnnya diletakkan ke 2 ml Collection tube yang baru dan ditambahkan dengan 400 l W1 Buffer. Langkah ini dilakukan berulang kali dengan penambahan yang berbeda yaitu ditambah 600l Wash Buffer ke GD columnnya dan setelah itu dipisahkan lagi dengan 2 ml Collection tube seperti pada gambar 4.3 dibawah ini.

Pada gambar diatas terlihat hasil penyaringannya berwarna coklat. Itu merupakan DNA yang akan diamati. Agar pengamatannya lebih jelas ditambahkan 100 l Elution Buffer, kemudian di centrifuge lagi lagi dengan 13.500 rpm selama 1 menit. Sehingga didapatkan hasil seperti pada gambar 4.4 dibawah ini.

.Pada gambar diatas terlihat larutan putih. Larutan ini didapatkan dari penambahan 100 l Elution Buffer kemudian di cetrifuge dengan 13.500 rpm selama 1 menit. Elution Buffer ini digunakan untuk menurunkan DNA yang awalnya berada pada GD column seperti pada gambar 4.3 ke 2 ml Collection tube yang baru. Pada larutan hasil inilah terdapat DNA sel hepar ayam yang akan diamati.4.2 Pembahasan

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti grinding dengan menggunakan micropestle. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer non osmotik. Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus.

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase K. Molekul DNA diarahkan agar melekat pada GD Coloumn dengan teknik DNA Binding. Sebelumnya DNA diendapkan dengan menggunakan ethanol. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan wash Buffer. Untuk melepaskan DNA dari GD Coloumn digunakan elution Buffer. Pada analisa ini, cairan bening menyerupai serabut-serabut benang pada saat di bawa ke daerah yang lebih terang yang merupakan DNA.

BAB 5

KesimpulanIsolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Isolasi DNA merupakan cara yang digunakan untuk identifikasi DNA yang kemudian dapat digunakan untuk diagnosis suatu penyakit infeksi yang disebabkan virus atau bakteri. Mendeteksi mutasi gen, penyakit herediter, menentukan jenis kelamin prenatal atau sebagai alat bantu dalam bidang kedokteran kehakiman.Daftar PustakaAlbert, B,et al. 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka

Utama.Anggie. 2011. Published online 4 April 2011. Manfaat Isolasi DNA. Accessed 18 April 2014 .Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction. 2nd edition. USA :

Thomson.Brooks, Cole, Fauziah, L. 2010. Published online 5 January 2010. Isolasi DNA. Accessed 18 April 2014. Campbell, N.A., L.G. Mitchell and J.B. Reece. 2004. Biology: Concept and Connections.

The Benjamin/Cummings Pub. Co., Inc. Dorland, Newman. 2002. Kamus Kedokteran Dorland. Edisi 29, Jakarta: EGC.Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri.

Bandung : KPP Bioteknologi Bandung. Jusuf, M. 2001. Genetika 1 Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta : Sagung Seto.

Mader,S.S.1993. Biology. Publishers: Lowa .

Sadava, D. 2004. Life: The Science of Biology. 5th edition. Sinauer Associates, Inc.Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Yogyakarta : UGM Press.

Wilson,keith and john walker. 2010. Principles and Techniques of Biochemistry and molecular Biology. New York: Cambridge University Press.Lampiran

Gambar 4.1 supernatant dan pelet yang belum dipisahkan (a) dan supernatant dan pelet yang sudah dipisahkan (b).

(a)

(b)

Gambar 4.2 campuran diletakkan pada GD column dalam 2 ml Collection tube (a) dan hasil setelah dicentrifuge (b)

(a)

(b)

Gambar 4.3 GD Column yang sudah dipisahkan dengan 2 ml Collection tube hasil cetrifuge pada cara kerja nomor 17.

Gambar 4.4 hasil akhir dari praktikum