LAPORAN PRAKTIK KERJA INDUSTRI

DI PT EQUILAB INTERNATIONAL CILANDAK JAKARTA

oleh

Nurlatifah

NIS 09.55.06533

KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA

Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri

Sekolah Menengah Kejuruan SMAK

Bogor

2013

LAPORAN PRAKTIK KERJA INDUSTRI

DI PT EQUILAB INTERNATIONAL CILANDAK JAKARTA

Sebagai Syarat untuk Mengikuti Ujian Akhir SMK Sekolah Menengah Analis

Kimia Bogor Tahun Ajaran 2012/2013

oleh

Nurlatifah NIS. 09.55.06533

KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA

Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri

Sekolah Menengah Kejuruan SMAK

Bogor

2013

LEMBAR PERSETUJUAN DAN PENGESAHAN

Disetujui dan disahkan oleh :

Disetujui oleh :

Yan Tirta Indra Kurniawan, S.SI

NIP 2009 06 00859

Pembimbing I,

Iwan Dwi Santoso S.Si

NIP 2004 09 13362

Pembimbing II,

Ir. Tin Kartini M.Si

NIP 19640316 199403 2 003

Pembimbing III,

Disahkan oleh,

Dra. Hadiati Agustine

NIP 19570817 198103 2 002

Kepala Sekolah Menengah Kejuruan SMAK Bogor

i

KATA PENGANTAR

Laporan Praktik Kerja Industri (Prakerin) di PT Equilab International ini

disusun sebagai laporan atau tugas akhir hasil pengalaman prakerin selama tiga-

setengah bulan yang dimulai pada tanggal 11 November 2012 hingga 27 Januari

2013. Laporan ini merupakan persyaratan bagi siswa/siswi kelas XIII untuk

mengikuti Ujian Akhir di Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor Tahun Ajaran

2012/2013.

Laporan ini diberi judul, Validasi Metode Analisis Senyawa Pyrazinamide

dalam Plasma Darah secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang secara garis

besar berisi Pendahuluan , Tinjauan Umum PT Equilab International, Kegiatan di

Laboratorium, Tinjauan Pustaka, Metode Analisis, Hasil dan Pembahasan, serta

Simpulan dan Saran. Adapun isi materi laporan ini lebih menekankan kepada

Validase Metode.

Puji syukur Penyusun panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas

rahmat dan karunia-Nya, Penyusun dapat menyelesaikan laporan prakerin ini

tepat pada waktunya. Penyusunan laporan ini juga terwujud berkat adanya

bimbingan, dorongan, serta bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,

Penyusun ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Dra. Hadiati Agustine selaku Kepala Sekolah Menengah Analis Kimia

Bogor beserta seluruh Staf Pendidik dan Kependidikan yang telah

memberikan bimbingan selama menjalani pendidikan di Sekolah.

2. Yan Tirta Indra Kurniawan, S.Si selaku Manajer Teknis PT Equilab

International sekaligus Pembimbing I Institusi yang telah membantu

dalam hal pengarahan dan memberikan kesempatan kepada Penyusun

untuk meaksanakan prakerin.

3. Bapak Iwan Dwi Santoso S.Si selaku Pembimbing II Institusi yang telah

membantu dalam hal pengarahan dan memberikan kesempatan kepada

Penyusun untuk melaksanakan prakerin.

4. Amilia Sari Ghani, S.Si, selaku Wakil Kepala Bidang Hubungan

Kerjasama Industri yang menjadi penyambung antara Penyusun dengan

PT Equilab Inernational.

5. Tin Kartini selaku Pembimbing Prakerin dari sekolah yang telah

membimbing Penyusun baik dalam kegiatan prakerin maupun dalam

penyusunan laporan ini.

ii

6. Ganjar Bayu Aji S.Si dan Kak Irawati Luthfy selaku Analis PT Equilab

International sekaligus Pembimbing yang telah membantu memberikan

pengarahan pada Penyusun selama melaksanakan prakerin.

7. Lucia Rat Handayani, S.Si; Teh Siti Halimah, Teh Euis Dewi Kurnia, Kak

Amalia Sabila, Kak Laras Wirahmawati, Kak Sri Wahyuni, Ka Ismi

Sakinah, Kak Gilang Aria Bintang, Mas Rahmad Dian, serta seluruh staf

PT Equilab International yang tidak dapat Penyusun sebutkan satu

persatu, yang telah memberikan dukungan dan masukan selama

prakerin.

8. Orangtua tercinta Dr. Arwan Sugiharo dan R. Dedeh Widiarsih, serta

segenap keluarga tercinta yang telah memberikan dukungan baik moril

maupun materiil kepada Penyusun secara tulus tiada henti.

9. Huda Yeni Rachmalia., rekan satu perjuangan Penyusun selama Prakerin

di PT Equilab International.

10. Sahabat-sahabat tercinta Ahmadi Apri Fathoni, Azaria Dian Mayangsari,

Gandes Fatiya Rahmah, Khisma Arum Firdaus, Zakia Maulida, Ilva

Mawasri Tartiwi, Saraswati Regina Putri, Rachmanda Febriati G., dan

rekan-rekan seperjuangan di Wisma Jihan yang maaf tak bisa disebutkan

satu persatu atas jasanya yang senantiasa mengiringi dalam setiap

langkah Penyusun di saat suka maupun duka.

11. Rekan-rekan angkatan seperjuangan tercinta Fosgena Survivor

Angkatan 55, Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor.

12. Serta semua pihak yang telah membantu pelaksanaan praktikum hingga

penyusunan laporan, yang tidak dapat Penyusun sebutkan satu persatu.

Tak ada satu pun gading yang tak retak, begitu pula manusia tidak ada

satupun yang sempurna. Oleh karena itu, Penyusun embuka diri untuk kritik dan

masukan yang dapat membantu penyempurnaan laporan ini sehingga dapat

dijadikan masukkan untuk perbaikan di masa yang akan datang.

Semoga laporan ini bermanfaat bagi pembaca pada umumnya dan

rekan-rekan sebidang keahlian, khususnya siswa/siswi Sekolah Menengah

Analis Kimia Bogor.

Bogor, Maret 2013

Penyusun

iii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................ i

DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii

DAFTAR TABEL ............................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... ix

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

A. Latar Belakang ....................................................................................... 1

B. Tujuan .................................................................................................... 2

C. Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Praktik Kerja Industri ............................ 3

D. Pembuatan Laporan ............................................................................... 3

BAB II INSTITUSI PRAKERIN ............................................................................ 5

A. Latar Belakang ....................................................................................... 5

B. Visi dan Misi ........................................................................................... 6

1. Visi ......................................................................................................... 6

2. Misi ........................................................................................................ 6

C. Standar Kerja ......................................................................................... 6

D. Ruang Lingkup Penelitian ...................................................................... 7

E. Metode Penelitian dan Peralatan ........................................................... 8

F. Tim Peneliti ............................................................................................ 8

G. Organisasi .............................................................................................. 8

BAB III KEGIATAN DI LABORATORIUM ........................................................... 9

A. Tinjauan Pustaka ................................................................................... 9

1. Obat ....................................................................................................... 9

2. Tuberkulosis......................................................................................... 12

a. Klasifikasi Penyakit TBC .................................................................. 14

b. Penularan ........................................................................................ 14

c. Diagnosis Penyakit TBC ................................................................... 15

d. Komplikasi Penyakit TBC ................................................................. 16

iv

3. Pyrazinamide ....................................................................................... 17

a. Farmakologi ..................................................................................... 18

e. Indikasi ............................................................................................. 18

f. Kontra-Indikasi ................................................................................. 18

g. Efek Samping ................................................................................... 19

h. Interaksi Obat ................................................................................... 19

4. Methyl prednisolone ............................................................................. 19

5. Plasma Darah ...................................................................................... 20

6. Validasi Metode ................................................................................... 22

a. Selektivitas ....................................................................................... 23

b. Akurasi ............................................................................................. 24

c. Presisi .............................................................................................. 24

d. Perolehan Kembali (Recovery)......................................................... 24

e. Kurva Kalibrasi Standar.................................................................... 25

f. Stabilitas .......................................................................................... 26

7. Teori Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .......................................... 28

a. Mekanisme Pemisahan .................................................................... 29

b. Instrumentasi KCKT ......................................................................... 33

B. Metode Analisis .................................................................................... 42

1. Dasar ................................................................................................... 42

2. Alat dan Bahan .................................................................................... 43

a. Alat .................................................................................................. 43

b. Bahan .............................................................................................. 44

3. Cara Kerja ............................................................................................ 44

a. Pembuatan Standar Pyrazinamide 500 g/mL .............................. 44

b. Pembuatan Internal Standar Methyl prednisolone 150 g/mL ....... 45

c. Persiapan Larutan Uji (Plasma Darah) ............................................. 45

v

d. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Pengawasan Mutu (Quality Control)

........................................................................................................ 46

e. Pengerjaan Analisis ......................................................................... 46

f. Kondisi Lingkungan .......................................................................... 47

g. Kondisi KCKT ................................................................................... 48

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 49

A. Kurva Kalibrasi Standar (Standard Calibration Curve) .......................... 49

1. Kurva Kalibrasi (Calibration Curve) ...................................................... 49

2. Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control Samples) ......................... 50

a. Linearitas ......................................................................................... 50

b. Batas Terendah Kuantifikasi (Lower Limit of Quantification/LLOQ) .. 51

B. Presisi (Precision) ................................................................................ 52

1. Pengujian Presisi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Precision Within-

Day Variation) ...................................................................................... 52

2. Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda (Inter-Assay Precision Day-

to-Day Variation) .................................................................................. 53

C. Akurasi (Accuracy) ............................................................................... 53

1. Pengujian Akurasi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Accuracy Within-

Day Variation) ...................................................................................... 53

2. Pengujian Akurasi pada Hari yang Berbeda (Intra-Assay Accuracy Day-

to-Day Variation) .................................................................................. 54

D. Selektifitas (Selectivity) ........................................................................ 55

1. Selektifitas Analit (Selectivity of Analyte) .............................................. 55

2. Selektifitas Internal Standar (Selectivity of Internal Standard) .............. 56

E. Perolehan Kembali (Recovery) ............................................................ 57

F. Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) .............................................. 58

G. Stabilitas (Stability) ............................................................................... 59

1. Stabilitas Larutan Standar (Stability of The Standard Solution) ............ 59

a. Pada Suhu Kamar ............................................................................ 59

vi

b. Pada Kondisi Penyimpanan ............................................................. 61

2. Stabilitas Sampel dalam Plasma (Stability of The Plasma Samples) .... 63

a. Pada Suhu Ruang ............................................................................ 63

b. Pada Kondisi Penyimpanan ............................................................. 65

c. Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan (Influences of Freeze

and Thaw Cycle) .............................................................................. 66

d. Stabilitas Pasca Preparasi (Post Preparative Stability) ..................... 68

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................. 75

A. Simpulan .............................................................................................. 75

B. Saran ................................................................................................... 75

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 76

LAMPIRAN ........................................................................................................ 79

vii

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Komposisi Plasma dan Fungsi Utamanya ............................................ 20

Tabel 2 Tabel Pembuatan Kurva Kalibrasi ........................................................ 46

Tabel 3 Komposisi Gradien ............................................................................... 48

Tabel 4 Kurva Kalibrasi Standar ....................................................................... 50

Tabel 5 Batas Terendah Kuantifikasi/LLOQ ...................................................... 51

Tabel 6 Pengujian Presisi Pada Hari yang Sama .............................................. 52

Tabel 7 Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda .......................................... 53

Tabel 8 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Sama ............................................. 54

Tabel 9 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Berbeda......................................... 54

Tabel 10 Pengujian Selektifitas Analit (Pyrazinamide) ....................................... 56

Tabel 11Pengujian Selektifitas Internal Standar (Methyl prednisolone) ............. 57

Tabel 12 Pengujian Recovery............................................................................ 58

Tabel 13 Pengujian Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) ............................ 59

Tabel 14 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Suhu Ruang ........................ 60

Tabel 15 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Suhu Ruang .............. 61

Tabel 16 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Kondisi Penyimpanan ......... 62

Tabel 17 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Kondisi Penyimpanan 63

Tabel 18 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Suhu Ruang 64

Tabel 19 PengujianStabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Suhu Ruang .... 64

Tabel 20 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Kondisi

Penyimpanan ....................................................................................... 65

Tabel 21 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Kondisi

Penyimpanan ....................................................................................... 66

Tabel 22 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap

Sampel Konsentrasi Rendah ................................................................ 67

Tabel 23 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap

Sampel Konsentrasi Tinggi .................................................................. 67

Tabel 24 Pengujian Stabilitas Sampel Pasca Preparasi .................................... 68

Tabel 25 Rangkuman Hasil Validasi Metode Analisis Pyrazinamide .................. 70

viii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Paru-paru Penderita TBC Melalui Sinar X ........................................ 12

Gambar 2 Bakteri Mycobacterium tuberculosis ................................................ 13

Gambar 3 Penyebaran Bakteri TBC ................................................................. 15

Gambar 4 Gambar Struktur Pyrazinamide ........................................................ 17

Gambar 5 Struktur Senyawa Methyl prednisolone ............................................ 19

Gambar 6 Instrumentasi KCKT ........................................................................ 33

Gambar 7 Bagan Pompa Reciprocating ........................................................... 34

Gambar 8 Bagan Pompa Sistem Pergantian .................................................... 35

Gambar 9 Bagan Pompa Tekanan Udara ........................................................ 36

Gambar 10 Linearitas Kurva Kalibrasi ............................................................... 51

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Struktur Organisasi PT Equilab International ............................... 79

Lampiran 2 Instrumentasi HPLC (Waters Alliance e2695) ............................. 80

Lampiran 3 Pembuatan Reagen/Pereaksi ..................................................... 81

Lampiran 4 Prosedur Proses Analisis Data di KCKT...................................... 82

Lampiran 5 Prosedur Pemakaian pH-meter ................................................... 83

Lampiran 6 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko (Interday 1) .......... 84

Lampiran 7 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko+Internal Standar

(Interday 1) ................................................................................. 85

Lampiran 8 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 1 (Interday 1) ...... 86

Lampiran 9 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 2 (Interday 1) ...... 87

Lampiran 10 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 3 (Interday 1) ...... 88

Lampiran 11 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 4 (Interday 1) ...... 89

Lampiran 12 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 5 (Interday 1) ...... 90

Lampiran 13 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 6 (Interday 1) ...... 91

Lampiran 14 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control)

Konsentrasi Rendah (Interday 1) ................................................ 92

Lampiran 15 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control)

Konsentrasi Sedang (Interday 1) ................................................. 93

Lampiran 16 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control)

Konsentrasi Tinggi (Interday 1) ................................................... 94

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Dewasa ini, pembangunan di sektor industri semakin meningkat,

maka tidak dapat dipungkiri bahwa sekolah-sekolah kejuruan, khususnya

Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor harus mampu menghadapi tuntutan

dan tantangan yang senantiasa muncul dalam era-globalisasi seperti

belakangan ini. Mengingat tuntutan dan tantangan masyarakat industri di

tahun-tahun mendatang akan semakin meningkat dan bersifat padat

pengetahuan dan keterampilan, maka Pengembangan Pendidikan Menengah

Kejuruan khususnya rumpun Kimia Analis harus difokuskan kepada kualitas

lulusan. Hal ini sesuai dengan Pasal 15 Undang-undang Sisdiknas No. 20

Tahun 2003, yang menyebutkan bahwa Sekolah Menengah Kejuruan

merupakan pendidikan menengah yang mempersiapkan peserta didik

terutama untuk bekerja dalam bidang tertentu. Berkaitan dengan itu, maka

pola pengembangan yang digunakan dalam pembinaan sistem pendidikan

menjadi sangat penting.

Seorang analis kimia yang terampil tidak cukup hanya dibekali ilmu

kimia terapan dan praktikum-praktikum di sekolah. Melainkan perlu

pengalaman langsung di dunia industri. Hal ini disebabkan, banyaknya hal-

hal baru diluar teori yang diberikan di sekolah yang hanya akan didapatkan

dengan terjun langsung ke dunia industri.

Sesuai dengan tujuan dari program pendidikan di Sekolah Menengah

Analis Kimia Bogor (SMAKBo) yaitu menyiapkan lulusan untuk menjadi

tenaga kerja tingkat menengah dalam bidang teknisi pengelola laboratorium,

pengatur dan pelaksana analisis kimia, serta melanjutkan ke jenjang yang

kebih tinggi. Maka diperlukaan adanya kemitraan antara sekolah dengan

dunia industri yang akan membantu kekurangan sekolah melalui Praktik Kerja

Industri (Prakerin).

Pelaksanaan prakerin dibantu sepenuhnya oleh balai atau lembaga

pemerintah dan perusahaan-perusahaan industri yang berhubungan dengan

kimia dan atau mikrobiologi. Materi prakerin dititikberatkan pada latihan

2

analisis kimia yang merupakan analisis sehari-hari dan bukannya penelitian

seperti halnya pada program diploma atau sarjana. Pelaksanaan prakerin

dititikberatkan pada pemantapan metode analisis, program pengendalian

mutu, dan pengetahuan tentang komoditas yang dianalisis.

Saat pelaksanaan Praktik Kerja Industri (Prakerin) siswa dapat

melihat, mempelajari, dan mempraktikkan prosedur dan peralatan modern

yang tidak mungkin dilakukan di sekolah. Selain praktik laboratorium, siswa

juga berkesempatan untuk berkenalan dengan lingkungan kerja yang

sesungguhnya, sehingga dapat beradaptasi dengan baik dengan lingkungan

kerja yang akan dihadapi pada masa mendatang. Praktik kerja industri ini pun

dapat menambah pengalaman kerja, menambah wawasan secara berdikari

dibawah bimbingan yang terarah dan terpantau, baik oleh sekolah maupun

oleh institusi tempat dilaksanakannya prakerin. Sehingga bila lulus nanti akan

menjadi seorang analis kimia yang terampil, kreatif,produktif, dan bermoral.

Kesempatan para siswa SMAKBo dalam Praktik Kerja Industri

(Prakerin) ini tentunya telah menjadi suatu keuntungan yang sangat baik bagi

para pelaku industri pemula. Lebih jauh lagi dalam bidang kimia analisis yang

mendominasi perkembangan zaman, dan berdampak pada kemajuan

nasional. Individu yang terampil merupakan aset yang sangat penting untuk

kemajuan suatu negara. Selain itu, kegiatan Praktik Kerja Industri (Prakerin)

ini juga merupakan suatu syarat kelulusan untuk semua siswa kelas XIII

Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBo) yang dilakukan baik di

Instansi Pemerintah, BUMN, BUMD, Lembaga-lembaga Penelitian, serta

perusahaan yang memiliki Laboratoriun Kimia Analisis maupun Laboratorium

Mikrobiologi.

B. Tujuan

Tujuan pelaksanaan Praktik Kerja Industri (Prakerin) khususnya yang

berlangsung mulai 12 November 2012 hingga 1 Maret 2013 adalah sebagai

berikut:

1. Meningkatkan kemampuan dan memantapkan keterampilan siswa

sebagai bekal kerja yang sesuai dengan Program Studi Kimia Analisis.

2. Menumbuhkembangkan dan memantapkan sikap profesional siswa

dalam rangka memasuki Lapangan Kerja.

3

3. Meningkatkan wawasan siswa pada aspek-aspek yang potensial dalam

dunia kerja, antara lain : Struktur, Organisasi, Disiplin, Lingkungan

Kerja, dan Sistem Kerja.

4. Menigkatkan pengetahuan siswa dalam hal penggunaan Instrumen

Kimia Analisis yang lebih modern, dibandingkan dengan fasilitas yang

ada di sekolah.

5. Memperoleh masukan dan umpan balik, guna memperbaiki serta

mengembangkan pendidikan di Sekolah Menengah Analis Kimia.

6. Memperkenalkan Fungsi dan Tugas seorang Analis Kimia kepada

Lembaga-lembaga Penelitian dan Perusahaan Industri di tempat

pelaksanaan prakerin.

7. Melatih siswa agar dapat menerapkan pengetahuan dalam dunia kerja ,

baik teori maupun praktik yang telah diberikan di sekolah.

8. Menumbuhkan pengetahuan dalam analisis berbagai material di dunia

industri.

9. Memberikan peluang untuk penempatan lulusan dan kerja sama.

C. Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Praktik Kerja Industri

Prakerin dilaksanakan di unit atau bagian dalam Perusahaan Industri

atau Lembaga Penelitian, terutama yang mendukung terhadap kegiatan atau

pendidikan Kimia Analisis. Adapun tempat Prakerin yang dipilih oleh

Penyusun adalah PT. Equilab International yang berlokasi di Jalan RS.

Fatmawati Persil 33 Cilandak-Jakarta Selatan dengan waktu pelaksanaan

mulai 12 November 2012 sampai 1 Maret 2013.

D. Pembuatan Laporan

Pada akhir kegiatan Praktik Kerja Industri, siswa/siswi diwajibkan

membuat laporan yang nanti akan diujikan sebagai syarat kelulusan siswa.

Adapun tujuan pembuatan laporan ini yaitu :

1. Mengembangkan kemampuan siswa dalam mengumpulkan data dan

meningkatkan kemampuan berfikir terutama dalam mengevaluasi data.

2. Memantapkan dalam penerapan pelajaran bagi siswa dari sekolah ke

tempat prakerin.

4

3. Sebagai bahan ujian lisan dan pertanggungjawaban kepada sekolah

atas prakerin yang telah dilakukan.

4. Menambah koleksi pustaka di perpustakaan sekolah sehingga dapat

menambah ilmu bagi para pembaca.

5

BAB II

INSTITUSI PRAKERIN

A. Latar Belakang

PT Equilab International adalah suatu perusahaan independen di

Indonesia yang bergerak dalam bidang penelitian, khususnya dalam Uji

Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE) dan Uji Klinilk. Dalam rangka upaya

pemerintah Indonesia menyediakan obat yang bermutu baik dengan harga

relatif murah bagi masyarakat, Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM)

meminta produsen obat di Indonesia untuk juga membuktikan kualitas obat

salinan (copy) ekivalen dengan obat inovator melalui uji BA/BE disamping

standar-standar lain yang selama ini telah berlaku. Pembuktian melalui uji

BABE memiliki dampak yang sangat positif bagi masyarakat, pemerintah, dan

institusi farmasi karena :

1. Dapat meningkatkan keyakinan masyarakat bahwa obat yang

diproduksi di Indonesia mempunyai mutu yang baik disamping

harganya yang lebih kompetitif.

2. Memacu industri farmasi di Indonesia untuk terus memperbaiki kualitas

produknya.

3. Mendukung industri farmasi di Indonesia untuk dapat memasarkan

produknya di luar negeri.

Selain uji BA/BE, PT Equilab International juga memberikan jasa

untuk penelitian uji klinik dengan tujuan untuk menguji efektivitas dan

keamanan suatu obat/pengobatan pada sekelompok manusia sehat/penderita

dalam jumlah tertentu agar hasilnya dapat ditetrapkan pada penderita lain di

kemudian hari secara rutin.

6

B. Visi dan Misi

1. Visi

Menjadi perusahaan penyedia jasa penelitian terkemuka di

regional dan global, khususnya di bidang Bioavailabilitas/Bioekivalensi

(BA/BE) dan Uji Klinik dengan keunggulan bersaing yang memenuhi

standar internasional.

2. Misi

Adapun misi dari PT Equilab International diantaranya :

Mengembangkan dan melaksanakan penelitian yang

berkualitas tinggi.

Mengembangkan kemitraan berkelanjutan dengan pelanggan.

Menerapkan ilmu pengetahuan dan eknologi tepat guna, serta

menjunjung tinggi etika penelitian dengan mengutamakan

keselamatan subjek penelitian.

Beradaptasi aktif dalam mewujudkan standar obat bermutu.

Meningkatkan kemampuan sumber daya manusia dan sistem

secara berkelanjutan.

C. Standar Kerja

Dalam melakukan pengujian klinis pada subjek manusia, PT Equilab

International menggunakan standar Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB) yang

merupakan standar ICH-Good Practice yang telah diadopsi oleh pemerintah

Indonesia pada tahun 2001 dan WHO Annex 9 : Additional Guidance for

Organizations Performing In-Vitro Bioequivalence Studies. Standar Mutu dan

Kompetensi Laboratorium yang digunakan oleh PT Equilab International

adalah ISO/IEC 17025:2005 dan untuk operasional sistem manajemen untuk

kegiatan pengujian PT Equilab International memenuhi prinsip-prinsip

manajemen mutu dalam ISO 9001:2000 yaitu dalam melaksanakan

peningkatan berkesinambungan dan penentuan sasaran mutu yang

ditetapkan dalam kaji ulang manajemen. Lembaga yang mengakreditasi PT

Equilab International sesuai dengan sistem ISO/IEC 17025:2005 adalah

7

Komite Akreditasi Nasional sebagai lembaga akreditasi yang sesuai dengan

ISO/IEC 17011.

D. Ruang Lingkup Penelitian

PT Equilab International memfokuskan penelitian pada studi :

1. BA/BE yang mencakup :

Pengembangan dan validasi metode pengukuran kadar obat dalam

cairan biologis.

Penyusunan protokol penelitian.

Persiapan dan pengajuan permohonan perizinan (ethical clearance)

ke Komisi Etik.

Pemeriksaan kesehatan dan screening sukarelawan.

Pengambilan sampel sukarelawan.

Analisis sampel.

Pengolahan data dan analisa statistik.

Penyusunan laporan.

Dokumentasi.

2. Uji Klinik yang mencakup :

Penyusunan protokol.

Permohonan acuan etik (ethical reference) ke Komisi Etik.

Seleksi peneliti dan tempat penelitian.

Penelitian.

Screening data awal.

Pengukuran parameter-parameter pemeriksaan kesehatan di

laboratorium.

Pengumpulan data.

Pengolahan data dan analisis statistik.

Publikasi.

Dokumentasi.

3. Uji Farmasetik/Pharmaceutical Test yang mencakup :

Uji Disolusi Terbanding.

Uji Kadar.

Uji Farmasi lainnya.

8

E. Metode Penelitian dan Peralatan

Metode analisis yang digunakan dalam penelitian BA/BE harus

divalidasi terlebih dahulu yang menyangkut Spesififitas, Sensitivitas,

Linearitas, Presese, dan Reprodusibilitas dengan cara-cara yang sesuai

dengan ketentuan ISO/IEC 17025:2005 dan Validasi Metode untuk

Bioanalisis.

Laboratorium Equilab dalam analisis sampel menggunakan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High Performance Liquid Chromatography,

HPLC) dengan sistem deteksi : Ultra-Violet (UV), Detektor Photo Dioda Array

(Photodiode Array Detector), dan Fluoresensi (Fluorescence) ; Kromatografi

Cair Spektroskopi Massa (Liquid Chromatography Mass Spectrometer, LC

MS/MS) tandem, serta Kromatografi Cair Kinerja Ultra (Ultra Performance

Liquid Chromatography, UPLC MS/MS) tandem.

F. Tim Peneliti

PT Equilab International didukung oleh tenaga-tenaga peneliti yang

telah berpengalaman bertahun-tahun bekerja dengan HPLC-

UV/Fluorescence, LC MS/MS, UPLC MS/MS dan juga telah berpengalaman

melakukan uji BA/BE dan uji klinik. Kualifikasi para peneliti ini ialah Dokter,

Paramedis, Ahli Farmasi, Ahli Kimia, Ahli Statistik, dan Ahli Farmakologi.

G. Organisasi

Laboratorium PT Equilab International merupakan suatu kesatuan

yang secara legal dapat dipertanggungjawabkan. Laboratorium PT Equilab

International bertanggungjawab untuk melakukan pengujian sesuai

persyaratan standar ISO/IEC 17025:2005 dan untuk memuaskan kebutuhan

pelanggan, pihak yang berwenang atau organisasi yang memberikan

pengkuan, sesuai dengan yang tercantum pada Prosedur Tata Laksana

Organisasi. Sistem manajemen PT Equilab International mencakup pekerjaan

yang dilakukan dalam Fasilitas Laboratorium yang permanen. Untuk Bagan

Struktur Organisasi PT Equilab International terdaat di Lampiran 1.

9

BAB III

KEGIATAN DI LABORATORIUM

A. Tinjauan Pustaka

1. Obat

Obat dapat didefinisikan sebagai suatu zat yang dimaksudkan

untuk dipakai dalam diagnosis, mengurangi rasa sakit, mengobati atau

mencegah penyakit pada manusia atau hewan. Obat dapat berasal dari

alam, diperoleh dari sumber mineral, tumbuh-tumbuhan, dan hewan, atau

dapat dihasilkan dari sintesis kimia organik atau biosintesis. Bahan obat

dicampurkan dengan unsur-unsur farmasetik yang tidak aktif secara

fisiologi dalam pembuatan bermacam-macam bentuk sediaan yang

dipakai sekarang (Anonimus, 2012).

Berdasarkan sumbernya, obat digolongkan menjadi tiga, yaitu :

Obat alamiah, yaitu obat yang terdapat di alam seperti

pada tanaman, hewan, dan mineral.

Obat semisintetik, yaitu obat hasil sintesis yang bahan

dasarnya berasal dari bahan obat yang terdapat di alam.

Obat sintetik murni, yaitu obat yang bahan dasarnya tidak

berkhasiat, setelah disintesis akan didapatkan senyawa

dengan khasiat farmakologis tertentu.

Berdasarkan Permenkes, obat yang dipasarkan digolongkan

berdasarkan khasiatnya, yaitu :

Obat Narkotika.

Obat Keras.

Obat Bebas Terbatas.

Obat Bebas.

10

Berdasarkan penamaannya, obat dibedakan menjadi dua, yaitu :

Obat Generik, merupakan nama resmi obat yang

dikeluarkan oleh WHO.

Obat Paten, merupakan obat produksi suatu perusahaan

dengan nama khas yang dilindungi hukum, yang disebut

merek dagang (trade mark)

Obat memiliki peranan penting dalam bidang kesehatan, tetapi di

Indonesia beberapa harga obat terutama obat paten relatif mahal untuk

masyarakat menengah ke bawah. Sehingga, saat ini banyak produsen

obat yang telah membuat obat generik yang mengandung zat aktif,

bentuk, sediaan, kekuatan, indikasi, efektivitas, cara dan dosis yang sama

dengan obat patennya. Untuk membuktikan kualitas obat tersebut, Badan

Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) selaku regulator di Indonesia

mewajibkan kepada produsen obat tersebut untuk melakukan studi

Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE).

Bioavailabilitas adalah persentase dan kecepatan zat aktif dalam

suatu produk obat yang tersedia dalam sirkulasi sistemik yang berbentuk

utuh/aktif setelah pemberian produk obat tersebut diukur kadarnya dalam

darah terhadap waktu atau ekskresinya dalam urin. Sedangkan studi

Bioekivalensi adalah studi perbandingan Bioavailabilitas antara dua

formulasi obat (Obat Generik dan Obat Paten) yang memiliki zat aktif

sama. Sampel darah diperoleh dari subjek sehat (subjek yang telah

diperiksa kondisi kesehatannya terlebih dahulu) pada studi BA/BE,

kemudan dipisahkan plasmanya untuk dianalisis kadarnya dengan

menggunakan metode analisis yang sudah tervalidasi (Anonimus, 2004).

Pada tahun 1960-an diketahui bahwa produk obat yang

kandungan zat berkhasiatnya sama atau setara, memberikan efek

terapetik yang berbeda. Terbukti dua produk obat yang secara kimia

setara (pada penilaian in vitro) dapat memberikan perbedaan jumlah

kadar obat yang dicapai dalam plasma darah (penilaian in vivo). Hal ini

disebabkan perbedaan jumlah zat yang tersedia untuk memberikan efek

terapetik.

Syarat terpenting suatu produk obat adalah zat aktifnya dapat

mencapai bagian tubuh tempat obat itu diharapkan bekerja, serta dalam

jumlah yang cukup untuk memberikan respon farmakologis. Syarat ini

11

disebut ketersediaan obat secara biologis atau bioavailabilitas (Biological

Availability).

Ketersediaan biologis (Biological Availability) adalah jumlah

relatif obat atau zat aktif suatu produk obat yang diabsorpsi, serta

kecepatan obat itu masuk ke dalam peredaran darah sistemik. Obat

dinyatakan tersedia (available) jika setelah diabsorpsi obat tersebut

tersedia untuk bekerja pada jaringan yang dituju dan memberikan efek

farmakologis setelah berikatan dengan reseptor di jaringan tersebut.

Ketersediaan farmasetik (Pharmaceutical Availaibity) adalah ukuran untuk

bagian obat yang in vitro dilepaskan dari bentuk sediaannya dan siap

diabsorpsi. Dengan kata lain, kecepatan larut obat yang tersedia in vitro.

Dari penelitian pharmaceutical availability sediaan tablet

diketahui bahwa setelah ditelan tablet akan pecah (terdisintegrasi) di

dalam lambung menjadi granul-granul kecil. Stelah granul pecah, zat aktif

terlepas dan melarut (terdisolusi) di dalam cairan lambung atau usus.

Setelah melarut, obat tersedia untuk diabsorpsi. Peristiwa ini disebut fase

ketersediaan farmasetik. Berdasarkan uraian tersebut jelas bahwa obat

yang diberikan dalam bentuk larutan mencapai ketersediaan farmasetik

lebih cepat dibandingkan sediaan tablet, karena tidak mengalami tahap

disintegrasi.

Pharmaceutical availability ditentukan secara in vitro di

laboratoium dengan mengukur kecepatan melarut zat aktif dalam waktu

tertentu (dissolution rate). Pengukuran ini menggunakan metode dan alat

yang ditetapkan oleh United States Pharmacopeia/USP untuk meniru

seakurat mungkin keadaan alami di dalam saluran cerna. Akan tetapi,

cara penelitian yang praktis ini jarang memberikan hasil yang berkorelasi

dengan kadar obat dalam plasma in vivo, sehingga perlu dilanjutkan

dengan pengukuran bioavailabilitas obat.

Bioavailabilitas diukur secara in vivo dengan menentukan kadar

obat dalam plasma setelah tercapai keadaan tunak (steady state). Pada

keadaan ini, terjadi kesetimbangan antara kadar obat di semua jaringan

tubuh dan kadar obat di plasma relatif konstan karena jumlah obat yang

diabsorpsi dan dieliminasi adalah sama. Umumnya terdapat korelasi

yang baik antara kadar obat dalam plasma dan efek terpetik obat.

12

Bioavailabilitas obat sangat tergantung pada dua faktor, yaitu

faktor obat dan faktor pengguna obat. Terdapat kemungkinan obat yang

sama diberikan pada orang yang sama, dalam keadaan berbeda,

memberikan kurva dosis-respon yang berbeda. Faktor-faktor yang

mempengaruhi diantaranya :

1) Faktor Obat :

Kelarutan obat.

Ukuran partikel.

Bentuk fisik obat.

Dosage form

Teknik formulasi

2) Faktor Pengguna :

Umur, berat badan, luas permukaan tubuh.

Waktu dan cara obat diberikan.

Kecepatan pengosongan lambung.

Gangguan hepar dan ginjal.

Interaksi obat lain.

Di dalam tubuh manusia, Pyrazinamide terserap ke dalam aliran

darah. Kemudian plasma darah yang merupakan bagian cairan dalam

darah yang mengandung Pyrazinamide dianalisis sesuai metode yang

digunakan yaitu menggunakan instrumen HPLC-UV. Metode tersebut

harus divalidasi terlebih dahulu. Hal ini penting untuk menentukan

kualitas obat generik yang akan dibandingkan terhadap obat paten atau

inovator.

2. Tuberkulosis

Gambar 1 Paru-paru Penderita TBC Melalui Sinar X

13

Penyakit tuberkulosis ini paling sering menyerang paru-paru

walaupun pada sepertiga kasus menyerang organ tubuh lain dan

ditularkan orang ke orang. Penyakit ini juga salah satu penyakit tertua

yang diketahui menyerang manusia. Jika diterapi dengan benar,

tuberkulosis yang disebabkan oleh kompleks Mycobacterium tuberculosis,

yang peka terhadap obat, praktis dapat disembuhkan. Tanpa terapi

tuberkulosis akan mengakibatkan kematian dalam lima tahun pertama

pada lebih dari setengah kasus (Anonimus, 2013).

Pada tahun 1992 WHO telah mencanangkan tuberkulosis

sebagai Global Emergency. Laporan WHO tahun 2004 menyatakan

bahwa terdapat 8,8 juta kasus baru tuberkulosis. Pada tahun 2002,

sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi kuman tuberkulosis dan

menurut regional WHO jumlah terbesar kasus ini terjadi di Asia Tenggara

yaitu 33% dari seluruh kasus di dunia.

Indonesia berada dalam peringkat ketiga terburuk di dunia untuk

jumlah penderita TB. Setiap tahun muncul 500 ribu kasus baru dan lebih

dari 140 ribu lainnya meninggal. Seratus tahun yang lalu, satu dari lima

kematian di Amerika Serikat disebabkan oleh tuberkulosis.

Pengobatan tuberkulosis berlangsung cukup lama yaitu

setidaknya 6 bulan pengobatan dan selanjutnya dievaluasi oleh dokter

apakah perlu dilanjutkan atau berhenti, karena pengobatan yang cukup

lama seringkali membuat pasien putus berobat atau menjalankan

pengobatan secara tidak teratur, kedua hal ini ini fatal akibatnya yaitu

pengobatan tidak berhasil dan kuman menjadi kebal disebut MDR (Multi

Drugs Resistance), kasus ini memerlukan biaya berlipat dan lebih sulit

dalam pengobatannya sehingga diharapkan pasien disiplin dalam berobat

setiap waktu demi pengentasan tuberkulosis di Indonesia

Gambar 2 Bakteri Mycobacterium tuberculosis

14

a. Klasifikasi Penyakit TBC

Penyakit TBC diklasifikasikan atas 5 jenis, yaitu :

Tuberkulosis paru terkonfirmasi secara bakteriologis dan

histologis

Tuberkulosis paru tidak terkonfirmasi secara bakteriologis

dan histologis

Tuberkulosis pada sistem saraf

Tuberkulosis pada organ-organ lainnya

Tuberkulosis millier

b. Penularan

Penularan penyakit ini karena kontak dengan dahak atau

menghirup titik-titik air dari bersin atau batuk dari orang yang

terinfeksi kuman tuberkulosis, anak anak sering mendapatkan

penularan dari orang dewasa di sekitar rumah maupun saat berada

di fasilitas umum seperti kendaraan umum, rumah sakit dan dari

lingkungan sekitar rumah. Bakteri ini dapat menyebar melalui

pembuluh darah atau kelenjar getah bening. Oleh sebab itu, infeksi

TBC dapat menginfeksi hampir seluruh organ tubuh seperti: paru-

paru, otak, ginjal, saluran pencernaan, tulang, kelenjar getah

bening, dan lain-lain, meskipun demikian organ tubuh yang paling

sering terkena yaitu paru-paru.

Saat Mikobakterium tuberkulosa berhasil menginfeksi paru-

paru, maka dengan segera akan tumbuh koloni bakteri yang

berbentuk globular (bulat). Biasanya melalui serangkaian reaksi

imunologis bakteri TBC ini akan berusaha dihambat melalui

pembentukan dinding di sekeliling bakteri itu oleh sel-sel paru.

Mekanisme pembentukan dinding itu membuat jaringan di

sekitarnya menjadi jaringan parut dan bakteri TBC akan menjadi

dormant (istirahat). Bentuk-bentuk dormant inilah yang sebenarnya

terlihat sebagai tuberkel pada pemeriksaan foto rontgen.

Pada sebagian orang dengan sistem imun yang baik,

bentuk ini akan tetap dormant sepanjang hidupnya. Sedangkan

pada orang-orang dengan sistem kekebalan tubuh yang kurang,

15

bakteri ini akan mengalami perkembangbiakan sehingga tuberkel

bertambah banyak. Tuberkel yang banyak ini membentuk sebuah

ruang di dalam paru-paru. Ruang inilah yang nantinya menjadi

sumber produksi sputum (dahak). Seseorang yang telah

memproduksi sputum dapat diperkirakan sedang mengalami

pertumbuhan tuberkel berlebih dan positif terinfeksi TBC.

Dalam memerangi penyebaran Tuberkulosis terutama pada

anak anak yang masih rentan daya tahan tubuhnya maka,

pemerintah Indonesia telah memasukkan Imunisasi Tuberkulosis

pada anak anak yang disebut sebagai Imunisasi BCG sebagai salah

satu program prioritas imunisasi wajib nasional beserta dengan 4

jenis imunisasi wajib lainnya yaitu hepatitis B, Polio, DPT dan

campak.

c. Diagnosis Penyakit TBC

Diagnosa tuberkulosis dapat ditegakkan berdasarkan

gejala klinis, pemeriksaan jasmani, pemeriksaan bakteriologi ,

radiologi dan pemeriksaan penunjang lainnya.

Gambar 3 Penyebaran Bakteri TBC

16

Gejala klinis tuberkulosis dapat dibagi menjadi 2 golongan,

yaitu :

Gejala lokal

Apabila organ yang terkena adalah paru-paru, maka

gejala lokal ialah gejala respiratori atau gejala gejala yang erat

hubungannya dengan organ pernapasan (sedang gejala lokal

lain akan sesuai dengan organ yang terlibat).

Gejala respiratori ialah batuk lebih dari 2 minggu,

batuk bercampur darah. Dapat pula nyeri dada dan sesak

napas. Gejala respiratori sangat bervariasi, dari mulai tidak

ada gejala sampai gejala yang cukup berat tergantung dari

luas lesi. Sehingga terkadang pasien baru mengetahui dirinya

terdiagnosis Tuberkulosis saat medical check up.

Gejala sistemik

Gejala sistemik merupakan akibat atau lanjutan dari

gejala respiratori. Contoh gejala sistemik antara lain demam,

badan lemah yang disebut sebagai malaise, keringat malam,

anoreksia dan berat badan menurun menjadi semakin kurus

(Anonimus, 2011).

d. Komplikasi Penyakit TBC

Beberapa komplikasi yang sering ditemukan pada pasien

TBC atau TB antara lain sebagai berikut :

Kerusakan Tulang dan Sendi

Nyeri tulang punggung dan kerusakan sendi bisa

terjadi ketika infeksi kuman TB menyebar dari paru-paru ke

jaringan tulang. Dalam banyak kasus, tulang iga juga bisa

terinfeksi dan memicu nyeri di bagian tersebut.

Kerusakan Otak

Kuman TB yang menyebar hingga ke otak bisa

menyebabkan meningitis atau peradangan pada selaput otak.

Radang tersebut memicu pembengkakan pada membran

17

yang menyelimuti otak dan seringkali berakibat fatal atau

mematikan.

Kerusakan Hati dan Ginjal

Hati dan ginjal membantu menyaring pengotor yang

ada adi aliran darah. Fungsi ini akan mengalami kegagalan

apabila kedua organ tersebut terinfeksi oleh kuman TB.

Kerusakan Jantung

Jaringan di sekitar jantung juga bisa terinfeksi oleh

kuman TB. Akibatnya bisa terjadi cardiac tamponade, atau

peradangan dan penumpukan cairan yang membuat jantung

jadi tidak efektif dalam memompa darah dan akibatnya bisa

sangat fatal.

Gangguan Mata

Ciri-ciri mata yang sudah terinfeksi TB adalah

berwarna kemerahan, mengalami iritasi dan membengkak di

retina atau bagian lain.

Resistensi Kuman

Pengobatan dalam jangka panjang seringkali

membuat pasien tidak disiplin, bahkan ada yang putus obat

karena merasa bosan. Pengobatan yang tidak tuntas atau

tidak disiplin membuat kuman menjadi resisten atau kebal,

sehingga harus diganti dengan obat lain yang lebih kuat

dengan efek samping yang tentunya lebih berat (Pramudiarja,

2012).

3. Pyrazinamide

Memiliki nama lain yaitu Pyrazinecarboxamide; Pyrazinoic acid

amide; Pyrazine carboxylamide dan nama IUPAC : Pyrazine-2-

carboxamide dengan rumus molekul C5H5N3O. Memiliki bobot molekul

Gambar 4 Gambar Struktur Pyrazinamide

18

123,11 dengan kadar C sebesar 48,78%, H sebesar 4,09%, N sebesar

34,13%, dan O sebesar 13,00 %. Merupakan senyawa yang mulai

menyublim pada suhu 600C dan mempunyai titik didih pada 1890-1910C.

Memiliki kelarutan dalam air (15 mg/mL), metanol (13,8 mg/mL), etanol

(5,7 mg/mL), 2-propanol (3,8 mg/mL), dietil eter (1,0 mg/mL), kloroform

(7,4 mg/mL), dan iso-oktana (0,01 mg/mL).

a. Farmakologi

Pyrazinamide merupakan obat antituberkulosis yang

digunakan sebagai terapi kombinasi dengan antituberkulosis (TBC)

lainnya. Pyrazinamide aktif dalam suasana asam terhadap

mikobakterium. Pyrazinamide bersifat bakterisid terutama pada

basil tuberkulosis intraselular (Radhi, 2012).

Pada pemberian oral Pyrazinamide mudah diserap dan

tersebar luas ke seluruh jaringan tubuh. Kadar puncak dalam

serum tercapai dalam waktu kurang lebih 2 jam dan waktu paruh

antara 10 16 jam. Pyrazinamide mengalami hidrolisis dan

hidroksilasi menjadi asam hidroksi pirazinoat yang merupakan

metabolit utamanya dan diekskresi melalui filtrasi glomerulus.

e. Indikasi

Indikasi Pyrazinamide adalah untuk pengobatan

tuberkulosis yang diberikan bersama antituberkulosis lainnya (terapi

kombinasi).

f. Kontra-Indikasi

Penderita yang hipersensitif atau alergi terhadap

Pyrazinamide.

Penderita dengan gangguan fungsi hati atau gangguan fungsi

ginjal.

Hiperurisemia dan atau gout / asam urat.

Hipoglikemia (kadar gula darah rendah).

Penderita Diabetes.

Wanita hamil.

19

g. Efek Samping

Efek samping berupa artralgia, anoreksia, nausea, disuria,

malaise, demam, porfiria, hepatomegali splenomegali, jaundice,

kerusakan sel hati, fatal hemolysis, sideroblastik anemia, tukak

lambung, trombositopenia, rash, hepatotoksisitas, gout, intoleransi

saluran pencernaan, ulkus peptikum yang bertambah parah,

dysuria, urtikaria, pruritus, akne, fotosensitivitas, dan interstitial

nefritis.

h. Interaksi Obat

Probenesid dapat menghambat pengeluaran Pyrazinamide

melalui ginjal (Anonimus, 2011).

4. Methyl prednisolone

Merupakan padatan kristal yang berbobot molekul sebesar

374,47. Memiliki rumus molekul C22H30O5 dengan kadar C sebesar

70,56%, H sebesar 8,07%, dan O sebesar 21,36%. Kristal ini tidak larut

dalam air, larut dalam metanol, sedikit larut dalam aseton dan kloroform,

serta sangat sedikit larut dalam eter.

Pada metode analisis pyrazinamide dalam plasma darah

manusia menggunakan HPLC-UV, methyl prednisolone digunakan

sebagai standar internal. Standar internal yaitu penambahan zat lain yang

tidak sama dengan sampel atau standar akan tetapi mempunyai sifat

fisikokimia yang mirip dengan sampel dan bertujuan untuk mengurangi

variasi konsentrasi standar dan sampel akibat faktor-faktor yang

mempengaruhi kepekaan dan respon detektor seperti fluktuasi listrik,

Gambar 5 Struktur Senyawa Methyl prednisolone

20

temperatur kolom dan detektor, variasi injeksi dan sebagainya (Gritter,

1991).

5. Plasma Darah

Plasma darah merupakan bagian cair darah. Sekitar 90% plasma

terdiri dari air, 7-8% protein dan disamping itu plasma mengandung

karbohidrat, lipid, asam amino, dan garam anorganik terutama NaCl

(Mutschler, 1991). Komposisi plasma dan fungsi utamanya dapat dilihat

pada Tabel 1.

Tabel 1 Komposisi Plasma dan Fungsi Utamanya

Kandungan Fungsi Utama

Air Pelarut bagi zat-zat lain

Garam (Natrium, Kalium,

Kalsium, Magnesium, Klorida,

Bikarbonat)

Penyeimbang tekanan osmosis,

mempertahankan pH, meregulasi

permeabilitas membran

Protein (Albumin, Fibrinogen,

Imunoglobulin)

Pembekuan darah, pertahanan

tubuh (antibodi)

Plasma berguna dalam pengaturan tekanan osmosis darah

sehingga dengan sendirinya jumlahnya dalam tubuh akan diatur, misalnya

dengan proses ekskresi. Plasma juga bertugas membawa sari-sari

makanan, sisa metabolisme, hasil sekresi dan beberapa gas (Mutschler,

1991).

Plasma darah dapat dipisahkan di dalam sebuah tabung berisi

darah segar yang telah dibubuhi zat anti-koagulan, yang kemudian

diputar sentrifugal sampai sel darah merah jatuh ke dasar tabung, sel

darah putih akan berada di atasnya dan membentuk lapisan buffy coat,

plasma darah berada di atas lapisan tersebut dengan kepadatan sekitar

1025 kg/m3 atau 1.025 kg/l. Serum darah adalah plasma tanpa

fibrinogen, sel dan faktor koagulasi lainnya. Fibrinogen menempati 4%

alokasi protein dalam plasma dan merupakan faktor penting dalam proses

pembekuan darah.

21

Di dalam plasma, obat berinteraksi dengan protein plasma,

jaringan atau makromolekul lain seperti melanin dan DNA membentuk

suatu kompleks obat-makromolekul, kompleks ini sering disebut ikatan

obat protein. Ikatan obat protein dapat berupa proses reversibel dan

irreversibel. Namun, sebagian besar obat berikatan atau membentuk

kompleks dengan protein dengan proses reversibel (Leon & Andrew,

1988). Ikatan obat protein yang reversibel ini menunjukan bahwa obat

mengikat protein dengan ikatan kimia yang lebih lemah dibandingkan

pada proses irreversibel, seperti ikatan hidrogen atau gaya Van der

Waals.

Komponen utama protein plasma yang bertanggung jawab

terhadap ikatan obat adalah albumin. Obat-obat asam lemah seperti

salisilat, fenilbutazon, dan penisilina terikat kuat dengan albumin. Namun,

kekuatan ikatan obat dengan albumin berbeda untuk masing-masing

obat. Protein lain seperti globulin yang dapat berikatan dengan obat-obat

hanya merupakan bagian terkecil dari keseluruhan ikatan protein plasma.

Dalam proses analisis, obat tersebut harus dipisahkan dari ikatan

proteinnya. Hal ini dikarenakan protein dapat mengganggu proses

analisis dan merusak kolom HPLC, sehingga usia kolom menjadi pendek.

Pemisahan protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan protein.

Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi

dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan

penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum

digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent. Protein

dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat

sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul,

atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein

memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya

protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan.

Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH

dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif

sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan

protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga

potein dapat mengendap (Farida, 2012).

22

Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam

dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga

molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein

mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifat lain yang

berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada

mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen.

Penggunaan pelarut organik seperti methanol dan asetonitril

sebagai zat pengendap protein sangat umum digunakan terutama yang

melibatkan metode analisis HPLC. Pengendapan ini berkaitan dengan pI

protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan

semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka

kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti

metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan

menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan

tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi

elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan

menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari

permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga

menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan

protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan.

Penggunaan methanol dan asetonitril mempunyai suatu keuntungan

karena kompabilitasnya dengan berbagai eluen yang digunakan dalam

metode HPLC.

6. Validasi Metode

Validasi metode adalah konfirmasi bahwa suatu metode dapat

memenuhi persyaratan tujuan penggunaannya, yaitu melakukan uji untuk

metode kerja yang bersangkutan dan mengumpulkan bukti atau hasilnya.

Validasi metode merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan penggunaannya. Validasi

metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa

metode analisis tersebut sudah sesuai peruntukannya. Metode analisis

yang sensitif dan selektif untuk evaluasi kuantitatif obat-obatan dan

merupakan suatu hal yang penting untuk keberhasilan pelaksanaan studi

23

praklinis, biofarmasetik, dan farmakologi klinis. Validasi metode

bioanalisis mencakup semua prosedur yang membuktikan bahwa suatu

metode khusus yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif pada analit

dalam suatu matriks biologis seperti darah, plasma, serum, atau urin,

dapat dipercaya dan memiliki ketertiruan (reproducible) untuk tujuan

penggunaannya (Anonimus, 2001).

Analisis obat-obatan dan metabolitnya dalam suatu matriks

biologis dilakukan dengan menggunakan suatu standar (reference

standard) dan menggunakan sampel kontrol (Quality Control). Kemurnian

dari standar pembanding yang digunakan untuk menyiapkan sampel yang

akan diberikan sejumlah standar (spiked sample) dapat mempengaruhi

data studi. Karena alasan inilah, standar pembanding analisis otentik

yang diketahui identitas dan kemurniannya harus digunakan untuk

menyiapkan larutan dengan konsentrasi tertentu.

Menurut pedoman USFDA (United States Food and Drug

Administration), Validasi Metode merupakan suatu prosedur yang

menunjukkan fakta yang digunakan untuk pengukuran analit secara

kuantitatif dalam matriks cairan biologis seperti : darah, plasma, serum,

atau urin yang dapat dipercaya dan reprodusibel. Parameter dasar untuk

Validasi Metode Bioanalisis meliputi Akurasi, Presisi, Selektivitas,

Sensitivitas, Reproduktivitas, dan Stabilitas. Pengukuran untuk masing-

masing analit dalam matriks biologi harus divalidasi. Selain itu, stabilitas

analit dalam sampel yang diberikan sejumlah standar juga harus

ditentukan. Metode yang disusun dan dikembangkan untuk metode

bioanalisis meliputi penentuan Selektivitas (Selectivity), Akurasi

(Accuracy), Presisi (Precision), Perolehan Kembali (Recovery), Kurva

Kalibrasi (Calibration Curve), Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect),

Limit Kuantitasi (Limit of Quantification), dan Stabilitas (Stability) Standar,

Internal Standar, dan Analit dalam sampel (plasma blanko) yang telah

diberi sejumlah standar (Spiked Sample) (Anonimus, 2001).

a. Selektivitas

Selektivitas adalah kemampuan dari suatu metode analisis

untuk membedakan dan menghitung jumlah analit terhadap

keberadaan komponen lain di dalam sampel. Untuk uji selektivitas,

24

analisis sampel blanko pada matriks biologis yang sesuai (plasma,

urin, atau matriks lainnya) harus diperoleh dari minimal enam

sumber. Setiap sampel blanko harus diuji gangguannya, dan

selektivitas harus dipastikan pada batas terendah dari kuantifikasi

(Lower Limit Of Quantification/LLOQ).

b. Akurasi

Ketepatan (akurasi) metode analisis menggambarkan

kedekatan hasil uji yang diperoleh dari metode yang digunakan,

dengan nilai sebenarnya. Akurasi ditentukan dengan mengulang

analisis sampel yang mengandung analit yang telah diketahui

jumlahnya. Akurasi harus diukur dengan menggunakan minimal

lima penetapan per konsentrasi. Penggunaan minimum tiga variasi

konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang ditentukan juga

dianjurkan. Nilai yang terukur harus berada dalam rentang 15,00

% dari nilai sebenarnya kecuali untuk LLOQ, yang seharusnya tidak

menyimpang dari rentang 20 %.

c. Presisi

Presisi suatu metode analisis menggambarkan kedekatan

pengukuran individu dari suatu analit ketika prosedur diterapkan

berulang kali ke beberapa alikuot dari satu volume matriks biologis

yang homogen. Presisi harus diukur menggunakan minimal lima

penentuan setiap konsentrasi. Penggunaan minimum tiga variasi

konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang ditentukan juga

dianjurkan. Presisi ditentukan pada setiap tingkat konsentrasi, yaitu

tidak boleh melebihi 15,00 % dari koefisien variasi (CV).

d. Perolehan Kembali (Recovery)

Menurut USFDA, Perolehan kembali (Recovery) suatu

analit dalam suatu pengujian adalah respon detektor yang diperoleh

dari sejumlah analit yang ditambahkan dan diekstrak dari matriks

biologis, dibandingkan dengan respon detektor yang diperoleh

untuk konsentrasi sebenarnya dari suatu standar yang murni.

25

Perolehan kembali berkenaan dengan efisiensi ekstraksi metode

analisis dalam batas-batas variabilitas. Perolehan kembali analit

tidak harus 100%, tetapi jangkauan perolehan kembali dari analit

dan standar harus konsisten, tepat, dan terulang. Pengujian

perolehan kembali (recovery) harus dilakukan dengan

membandingkan hasil analisis untuk sampel terekstraksi pada tiga

konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dengan standar yang tidak

diekstrak yang mewakili 100 % perolehan kembali.

e. Kurva Kalibrasi Standar

Suatu Kurva Kalibrasi (Standar) adalah hubungan antara

respon instrumen dan konsentrasi analit yang telah diketahui.

Suatu Kurva Kalibrasi harus dibuat untuk setiap analit dalam

sampel. Sejumlah standar yang cukup harus digunakan untuk

menentukan hubungan antara konsentrasi dan respon. Kurva

alibrasi harus disiapkan dalam matriks biologis yang sama seperti

sampel dalam studi yang dilakukan dengan melakukan sejumlah

standar (spike) pada matriks dengan konsentrasi analit yang

diketahui.

Jumlah standar yang digunakan dalam membuat Kurva

Kalibrasi akan menjadi fungsi dari hubungan antara rentang niali

analisis yang diantisipasi dan sifat dari analit. Konsentrasi standar

harus dipilih berdasarkan rentang konsentrasi yang diharapkan

pada studi tertentu. Kurva kalibrasi harus terdiri dari sampel blanko

(matriks sampel yang diproses tanpa Internal Standar) dan enam

sampai delapan sampel bukan nol yang mencakup rentang yang

diharapkan, termasuk batas bawah kuantifikasi.

1) Linearitas

Linearitas adalah kemampuan metode memperoleh

hasil uji yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit

dalam suatu rentang yang ditetapkan. Linearitas suatu

metode dapat diperoleh dengan menggambarkan secara

grafik hasil uji sebagai fungsi dari konsentrasi analit.

26

Linearitas biasanya ditetapkan dengan menghitung garis

regresi dari hasil uji terhadap konsentrasi analit.

2) Batas Terendah Kuantifikasi/Lower Limit of Quantification

(LLOQ)

Menurut pedoman validasi metode bioanalisis dari

USFDA untuk industri, LLOQ yaitu konsentrasi terkecil dari

suatu analit dalam suatu kurva kalibrasi yang dapat

dikuantitasi dengan tingkat kepercayaan yang tinggi dan dapat

diterima sebagai batas kuantitasi jika memenuhi kondisi

sebagai berikut :

Respon analit pada LLOQ harus paling sedikit 5 kali

respon blanko.

Area analit (respon) harus dapat diidentifikasi, diskrit, dan

terulang dengan presisi 20 % dan akurasi 80-120%.

Model yang digunakan untuk menggambarkan

hubungan antara respon dan konsentrasi haruslah model

yang paling sederhana. Pemilihan bobot dan penggunaan

persamaan regresi yang kompleks harus dapat ditepatkan.

Kondisi berikut harus dipenuhi dalam mengembangkan

sebuah Kurva Kalibrasi :

20% deviasi dari nominal konsentrasi LLOQ.

15% standar deviasi selain dari nominal konsentrasi

LLOQ.

Setidaknya empat dari enam standar bukan nol harus

memenuhi kriteria di atas, termasuk LLOQ dan Kurva

Kalibrasi Standar pada konsentrasi tertinggi.

f. Stabilitas

Stabilitas obat dalam suatu cairan biologis adalah fungsi

dari kondisi penyimpanan, sifat-sifat kimia obat, dan matriks.

Prosedur stabilitas harus mengevaluasi stabilitas analit selama

pengumpulan dan penanganan sampel, setelah penyimpanan

jangka panjang (beku pada suhu penyimpanan yang digunakan)

dan jangka pendek (suhu kamar, 20-28 C), dan setelah melalui

27

siklus pembekuan dan pencairan, kemudian proses stabilitas harus

mengevaluasi stabilitas analit selama pengumpulan dan

penanganan sampel. Ketentuan yang digunakan dalam pengujian

stabilitas harus mencerminkan situasi yang harus dihadapi selama

penanganan sampel sebenarnya dan pada analisis sampel.

Prosedur juga harus mencakup pengujian stabilitas analit

dalam larutan stok. Semua penentuan stabilitas harus

menggunakan seperangkat sampel yang disiapkan dari larutan stok

yang baru dibuat dalam matriks biologi yang bebas dari analit dan

pengotor. Larutan stok analit untuk pengujian stabilitas harus

disiapkan dalam suatu pelarut yang sesuai pada konsentrasi yang

telah diketahui.

Stabilitas juga dibagi menjadi 5 bagian, yaitu :

1) Stabilitas Pencairan dan Pembekuan (Freeze and Thaw

Stability)

Stabilitas analit harus ditentukan setelah tiga siklus

pembekuan dan pencairan. Setidaknya tiga alikuot pada tiap

konsentrasi (Rendah dan Tinggi) harus disimpan pada suhu

penyimpanan yang digunakan slama 24 jam dan dicairkan

tanpa bantuan pada suhu kamar. Ketika benar-benar cair,

sampel harus dibekukan kembali selama 12 sampai 24 jam

pada kondisi yang sama. Siklus pencairan dan pembekuan

harus diulang dua kali lagi, lalu dianalisis pada siklus ketiga.

Jika analit tidak stabil pada suhu penyimpanan yang

digunakan, sampel stabilitas harus dibekukan pada -200C

selama tiga siklus pembekuan dan pencairan atau

disesuaikan dengan kestabilan zat tersebut.

2) Stabilitas Suhu Jangka Pendek

Tiga alikuot dari tiap konsentrasi (Rendah dan Tinggi)

harus dicairkan pada suhu kamar dan disimpan pada suhu

tersebut selama 4-24 jam (berdasarkan durasi yang

diharapkan dimana sampel akan dipertahankan pada suhu

kamar dalam studi yang dituju) dan dianalisa.

28

3) Stabilitas Jangka Panjang

Waktu penyimpanan dalam pengujian stabilitas

jangka panjang harus melebihi waktu antara tanggal

pengambilan sampel pertama dan tanggal analisis sampel

berakhir. Stabilitas jangka panjang harus ditentukan dengan

menyimpan setidaknya tiga alikuot dari masing-masing

konsentrasi rendah dan tinggi pada kondisi yang sama

dengan sampel studi. Volume sampel harus cukup untuk

analisis pada tiga waktu berbeda. Konsentrasi dari semua

saampel stabilitas harus dibandingkan dengan rata-rata nilai

penghitungan kembali untuk standar pada konsentrasi yang

sesuai dari hari pertama pengujian Stabiitas Jangka Panjang.

4) Stabilitas Larutan Stok

Stabilitas larutan stok obat dan internal standar harus

diuji pada suhu ruang setidaknya 6 jam. Jika larutan stok

didinginkan atau dibekukan untuk periode yang berpautan,

stabilitas harus didokumentasikan. Setelah menyelesaikan

waktu penyimpanan yang dikehendaki, stabilitas harus diuji

dengan membandingkan respon instrumen dengan larutan

yang baru dibuat tersebut.

5) Stabilitas Pasca Preparasi

Stabilitas Pasca Preparasi diukur untuk

mengantisipasi stabilitas sampel selama proses injeksi di auto

sampler. Stabilitas pasca preparasi ditentukan dengan

melakukan pengujian kontrol sampel rendah, sedang, dan

tinggi selama periode waktu tertentu yang dibutuhkan oleh

satu batch analisis.

7. Teori Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi secara bahasa berasal dari kata chroma dan

graphein yang berarti menulis warna. Menurut IUPAC nomenclature,

chromatography is physical method of separation in which the

components to be separated are distributed between two phases, one of

which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase)

move in definite direction.

29

Metode analisis kimia secara umum haruslah memiliki sifat

selektifitas yang baik dan spesifik. Penghilangan gangguan terhadap

analat merupakan hal yang penting dalam analisis. Sampai pertengahan

abad XX, pemisahan dalam analisis dilakukan secara pengendapan,

distilasi, dan ekstraksi. Saat ini pemisahan dalam kegiatan analisis

umumnya dilakukan secara kromatografi.

Penerapan analisis secara kromatografi telah berkembang pesat

dalam kurun waktu lima puluh tahun terakhir untuk dapat menentukan

sifat-sifat senyawa dalam campuran kompleks. Peranan yang sangat

berarti dari kromatografi ditunjukkan misalnya dengan hadiah Nobel pada

tahun 1952 kepada A.J.P Martin dan R.L.M. Synge, dan sekitar 12 Nobel

antara tahun 1937 hingga 1972 yang seluruhnya diberikan atas jasa

pengembangan bidang kromatografi.

Kromatografi menerapkan prinsip tingkat lanjut dari proses

ekstraksi. Ekstraksi adalah suatu metode untuk memisahkan suatu

komponen dalam suatu cairan atau padatan dengan cairan lain yang tidak

saling bercampur, sehingga komponen tersebut berpindah ke dalam

cairan kedua. Pemisahan dapat terjadi karena adanya perbedaan

kecepatan gerak suatu komponen senyawa dengan senyawa lainnya

akibat perbedaan sifat yang dimiliki masing-masing senyawa terhadap

fasa diam maupun fasa gerak yang ada dalam sistem kromatografi (Day

dan Underwood, 1988).

Prinsip KCKT yaitu, dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan

melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam fase gerak

melalui penyuntikan atau injeksi. Di daam kolom terjadi pemisahan

komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi

antara molekul yang terlarut dalam fase gerak terhadap fase diam maka

terjadilah pemisahan. Komponen yang lemah interaksinya dengan fase

diam akan keluar terlebih dahulu dari kolom. Setiap komponen campuran

yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor, kemudian akan

direkam dalam bentuk kromatogram.

a. Mekanisme Pemisahan

Mekanisme pemisahan dominan yang terjadi dalam sistem

KCKT ditentukan oleh jenis kolom yang digunakan. Terdapat

30

kemungkinan terjadi lebih dari satu proses pemisahan dalam satu

kolom. Dibandingkan dengan kromatografi gas, KCKT memiliki

mekanisme pemisahan lebih banyak, terdapat kemudahan untuk

mengubah secara radikal sifat kimia dan kekuatan elusi dari fase

gerak, fase penunjang dengan ukuran partikel 3, 5 atau 10 m

memiliki ukuran pori 50 -150 , dapat diikatkan dengan lapisan

sangat tipis bersifat polar atau nonpolar. Mekanisme pemisahan

yang mungkin adalah adsorpsi, partisi, penukar ion dan

kromatografi ekslusi.

1) Adsorpsi

Kromatografi adsorpsi, sering juga dinyatakan

sebagai kromatografi padat-cair atau kromatografi fase

normal. Istilah fase normal menunjukkan digunakannya fase

diam polar dengan fase gerak nonpolar. Sebagai fase diam

digunakan adsorben berpori yang pada sisi-sisinya memiliki

gugusan hidroksil baik yang bebas atau berikatan. Gugusan

tersebut akan menjadi sisi aktif yang menyebabkan interaksi

di permukaan terhadap molekul terlarut dalam fase gerak.

Fase gerak yang digunakan berupa pelarut nonpolar,

misalnya heksan yang dimodifikasi polaritasnya dengan

mencampurkan sejumlah kecil pelarut polar seperti 2-

propanol, diklorometana atau metil tersierbutil eter. Saat

sampel dimasukan ke dalam kolom, molekul dengan gugus

fungsi yang bersifat polar akan tertarik oleh sisi aktif fase

diam, kemudian digantikan oleh molekul polar dari fase gerak,

selanjutnya diadsorp kembali oleh sisi aktif selanjutnya hingga

keluar dari kolom. Molekul yang lebih polar akan diadsorp

lebih kuat dibandingkan molekul yang kurang polar sehingga

terelusi lebih lama.

2) Fase Terikat

Kromatografi fase terikat dapat digunakan untuk

sistem kromatografi fase normal atau fase terbalik. Pada

sistem fase terbalik, fase diam yang digunakan bersifat

31

nonpolar sedangkan fase gerak polar digunakan untuk

mengelusi komponen dalam kolom.

Sistem fase terbalik pada awalnya berupa fase

penunjang yang disalut dengan lapisan tipis fase diam, terikat

secara fisika. Hal ini akan menyebabkan fase diam akan

mudah terbawa oleh aliran fase gerak dan sangat rentan oleh

proses hidrolisis. Sistem ini kemudian dikembangkan dengan

mengikatkan secara kimia gugus tertentu pada permukaan

fase penunjang. Senyawa yang paling umum digunakan

sebagai fase diam adalah oktadekilsilan (octadecylsilane,

ODS), merupakan senyawa hidrokarbon, berupa cairan. Fase

diam ini biasanya diikatkan pada fase penunjang silika dengan

membentuk ikatan silileter atau ikatan siloksan.

Sistem fase normal diperoleh dengan mengikatkan

gugus nitril, nitro atau amino pada ujung fase penunjang.

Keuntungan dari fase terikat dibandingkan sistem adsorpsi

adalah kemungkinan dilakukannya elusi gradien. Elusi

biasanya dilakukan menggunakan pelarut yang relatif

nonpolar seperti tetrahidrofuran (THF), dietileter, kloroform

dan heksana.

3) Penukar Ion

Kromatografi penukan ion memanfaatkan perbedaan

tingkat afinitas ion-ion dalam larutan terhadap kumpulan ion

bermuatan yang terdapat pada kolom. Gugus fungsi alami

yang menjadi sisi aktif penukar ion adalah amonium kuartener

(-N+R3) untuk anion dan asam sulfonat (-SO3H) untuk kation.

Sebagai penunjang sisi aktif digunakan penukar ion yang

berasal senyawa berikatan silang dari polistiren, polidekstran,

dan silika.

Selanjutnya dikembangkan sistem penukar ion

menggunakan partikel yang lebih kecil. Lapisan tipis lateks

dijadikan sebagai penukar ion. Media penukar ion seperti ini

kemudian disebut sebagai resin penukar ion. Hasil dari

pengembangan ini adalah peningkatan terhadap kemampuan

32

pemisahan, kecepatan, efisiensi dan selektifitas. Sifat dari

resin dapat diatur dengan melakukan modifikasi terhadap

derajat ikatan silang, ukuran dan gugus fungsi penukar

ionnya.

4) Ekslusi

Kromatografi ekslusi dikenal juga dengan sebutan

kromatografi gel, filtrasi gel atau permeasi gel. Mekanisme

pemisahan terjadi berdasarkan pemilihan ukuran partikel

molekul. Molekul akan terdifusi dalam pori dengan ukuran

tertentu. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori akan masuk

dan mengalami pemisahan berdasarkan ukurannya.

Material yang digunakan dalam kromatografi ekslusi

pada awalnya adalah dekstran, kopolimer dari

stirenadivinilbenzena. Keterbatasan terjadi karena mudah

mengembang dan tidak tahan terhadap tekanan tinggi (hanya

sampai 300 psi). Dekstran hanya dapat digunakan untuk

larutan yang tidak mengandung air, disebabkan adanya

molekul air akan menyebabkan molekul yang akan dipisahkan

tidak dapat memasuki sistem kromatografi ekslusi. Untuk

sampel yang mengandung air dapat digunakan kopolimer 2-

dihidroksietilmetaakrilat, karena bersifat hidrofil.

Material yang lebih baik dibuat berbahan dasar silika

berpori dengan ukuran pori yang dapat diatur dengan kisaran

4 250 m. Dapat digunakan pada tekanan 3000 hingga

8000 psi, tahan hingga pH 10, kecepatan alir bisa ditinggikan,

dan yang paling menguntungkan adalah dapat digunakan

untuk memisahkan molekul yang larut dalam air atau dalam

pelarut organik.

33

b. Instrumentasi KCKT

Kecepatan alir yang cukup diperlukan dalam setiap sistem

kromatografi kolom. Untuk merealisasikan keadaan ini dalam

sistem KCKT yang menggunakan ukuran diameter partikel 2 10

m, penggunaan pompa tekanan tinggi mutlak diperlukan.

Keadaan inilah yang menyebabkan instrumen KCKT, menjadi lebih

kompleks dan tentunya lebih mahal dari sistem kromatografi yang

lainnya. Berikut digambarkan skema dari sebuah instrumen KCKT.

1) Tampungan Fasa Gerak

Peralatan KCKT mutakhir dilengkapi dengan satu

atau beberapa tampungan berbahan gelas atau stainless steel

dengan ukuran mulai 200 sampai 1000 mL. Peralatan

degasser disertakan untuk menghilangkan gas terlarut berupa

oksigen atau nitrogen yang akan mempengaruhi dengan

membentuk gelembung pada kolom dan detektor. Degasser

dapat berupa pompa vakum, sistem destilasi, peralatan

pemanas dan pengaduk atau sistem pengusiran

menggunakan gas mulia.

Pemisahan yang menggunakan satu jenis pelarut

dalam keadaan konstan dinamakan elusi isokratik. Seringkali

efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan elusi gradien.

Berbeda dengan sistem isokratik, pada elusi gradien terdapat

Gambar 6 Instrumentasi KCKT

34

2 atau 3 sistem pelarut yang berbeda, yang akan mengalami

perubahan komposisi dalam urutan deret berdasarkan waktu.

2) Sistem Pemompaan

Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam

sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan :

Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi

Keluaran yang bebas denyut

Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 mL/menit

Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan relatif

yang baik (kesalahan < 0,5%)

Tahan terhadap korosi

Terdapat tiga jenis pompa yang sering digunakan

dalam sistem KCKT, yaitu :

a) Pompa Reciprocating

Pompa reciprocating adalah jenis pompa yang

paling banyak digunakan. Sekitar 90% peralatan

komersial menggunakan pompa jenis ini. Pada pompa

jenis ini, larutan dipompakan dengan gerakan maju

mundur piston yang digerakkan oleh motor penggerak.

Terdapat dua buah bola yang berperan sebagai katup

pembuka dan penutup, yang mengontrol keluar

masuknya solven dalam tabung pompa.

Gambar 7 Bagan Pompa Reciprocating

35

Kelemahan pompa adalah masih dihasilkannya

denyut yang harus diredam dengan pengaturan baseline

pada kromatogram. Kelebihan pompa jenis ini adalah

volum internalnya kecil (35 400 L), tekanan hingga

10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan

elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari

tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.

b) Pompa Sistem penggantian (displacement pump)

Sistem penggantian menggunakan sebuah

wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan

yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang

bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan

bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah

kapasitas pompa terbatas hanya 250 mL dan cukup sulit

saat solven harus mengalami penggantian.

c) Pompa Tekanan Udara (Pneumatic Pump)

Bentuk paling sederhana sebuah pompa tekanan

udara merupakan wadah yang ditekan oleh gas

bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut

merupakan kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya

terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran

terbatas hanya sekitar 5000 psi, dipengaruhi oleh tekanan

balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan

untuk sistem elusi gradien.

Gambar 8 Bagan Pompa Sistem Pergantian

36

3) Injeksi Sampel

Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari

sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat menyebabkan

pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan

kapasitas. Sebagai akibatnya, volum injeksi harus dibatasi

hingga kisaran maksimum 500 L.

Terdapat beberapa metode yang digunakan untuk

menginjeksikan sampel ke dalam kolom yang dapat dibagi

menjadi, injeksi menggunakan syringe (syiringe injection),

injeksi aliran terhenti (stopped flow injection) dan injeksi

menggunakan katup (valve injection).

a) Injeksi menggunakan katup

Merupakan metode injeksi yang paling diterima

dan umum digunakan pada saat ini. Pemasukan sampel

ke dalam aliran fase gerak berlangsung dengan cepat,

aliran fase gerak tidak perlu dihentikan, mudah

digunakan, dapat disesuaikan untuk injeksi otomatis,

dapat digunakan pada tekanan hingga 6000 psi. Katup

enam jalur digunakan berpasangan dengan loop sampel.

Pada saat posisi pengambilan (charge), katup

terpisah dari jalur aliran fase gerak, tidak terjadi tekanan

Gambar 9 Bagan Pompa Tekanan Udara

37

sehingga loop dapat diisi dengan sampel. Dengan

memutar rotor pada posisi injeksi (inject), loop yang telah

diisi dengan sampel akan berhubungan dengan aliran

fase gerak dari kolom, sehingga sampel akan terbawa ke

dalam kolom.

Katup injeksi yang dipasarkan oleh Valco dan

Rheodine, memiliki loop untuk sampel diluar rotor

sehingga dapat dengan mudah diganti sesuai dengan

volum injeksi yang diinginkan.

b) Injeksi menggunakan syringe

Merupakan metode awal yang digunakan untuk

memasukan sampel ke dalam kolom. Diadaptasi dari

proses injeksi sampel dalam kromatografi gas. Sampel

diinjeksikan melalui sebuah penyegel septum.

c) Injeksi pada kolom (on column injection)

Metode injeksi ini disebut juga metode injeksi

aliran terhenti (stopped flow injection). Menggunakan

metode ini, pompa dimatikan, kemudian katup injeksi

dibuka, sampel diinjeksikan pada injector yang tidak

memiliki septum, pompa dinyalakan lagi, aliran fase gerak

kembali seperti pada pengaturan awal. Sistem ini tidak

menyebabkan kerugian dalam hal akurasi. Hanya saja,

keterulangan waktu retensi akan sulit untuk memberikan

hasil yang memuaskan.

4) Kolom KCKT

Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung

stainless steel, walaupun untuk tekanan di bawah 600 psi

kolom kaca dapat digunakan.

Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang

kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika

diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain.

38

Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5

10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000

plat/meternya.

Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan

memproduksi kolom dengan kecepatan dan kinerja tinggi.

Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm

dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom

memiliki jumlah plat hingga 100.000 hanya dengan panjang 3

sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan

sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah

solven minimum menjadi pertimbangan penting karena

mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi

(chromatography grade).

Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair

yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous particle).

Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak

berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter

30 hingga 40 m. Lapisan tipis berpori silika, alumina, atau

resin sintetis divinil benzen polystirena dengan melapiskan

penukar ion pada permukaannya.

Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel

berpori dengan diameter partikel 3 10 m terbuat dari silika,

alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin

penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film

berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika

terhadap permukaannya.

5) Detektor

Detektor ideal pada sistem KCKT memenuhi

persyaratan berikut:

Memiliki sensitivitas yang memadai. Kisaran umum

sensitivitas berkisar dari 10-8 hingga 10-15 gram zat terlarut

per pembacaan.

Stabil dan memiliki keterulangan yang baik.

Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi.

39

Waktu respon yang singkat.

Kemudahan pada penggunaan.

Memiliki volum internal yang kecil untuk mengurangi

pelebaran puncak.

Berikut merupakan beberapa jenis detektor dapat

digunakan pada sistem KCKT :

a) Detektor Absorban

Detektor Absorban Untuk meminimalkan

pelebaran puncak, detektor dirancang dalam vo