i

LAPORAN PENELITIAN

PENELITIAN DASAR KEILMUAN(PDK)

VALIDASI METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) UNTUK

ANALISIS DNA CEMARAN BABI DARI PRODUK SOSIS SAPI

Tim Pengusul

Anang Rohwiyono, M.Ag. (Ketua) (0305057101)

Hanifah Rahmi, S.Si, M.Biomed (Anggota) (0326098603)

Etin Diah Permanasari, PhD. ( - )

Nomor Surat Kontrak Penelitian : 130/F.03.07/2019

Nilai Kontrak : Rp. 12.000.000

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

JAKARTA

2019

ii

iii

iv

v

ABSTRAK

Sosis merupakan salah satu produk olahan daging yang banyak dikonsumsi dan

tersedia di berbagai tempat baik pasar maupun supermarket. Sosis harus memenuhi

kriteria bahan agar dapat disertifikasi kehalalannya. Salah satu kriteria bahan untuk

sosis adalah tidak boleh bercampur dengan bahan haram yang berasal dari bahan

tambahan, bahan penolong, hingga fasilitas produksi. Bahan haram yang dilarang

antara lain cemaran babi, oleh karena itu perlu adanya deteksi terhadap gen DNA

babi. Metode yang digunakan untuk mendeteksi DNA babi adalah Polymerase

Chain Reaction (PCR). Metode ini terdiri atas beberapa langkah reaksi, yaitu

denaturasi, penempelan primer (annealing), amplifikasi, dan pemanjangan basa

nukleotida. Tahapan yang akan divalidasi yaitu perbedaan primer yang digunakan.

Primer yang digunakan adalah CytB dan SIMp. Validasi terhadap metode PCR

dibutuhkan agar diperoleh kondisi optimum dengan spesifisitas dan sensitivitas

terbaik yang dapat mendeterminasi cemaran gen babi. Analisis hasil PCR

menggunakan teknik elektroforesis agarosa dengan membandingkan pita DNA

yang terbentuk dari produk sosis dengan pita DNA Babi. CytB memiliki ukuran

basa nukleotida sebesar 359 bp sedangkan SIMp sebesar 398 bp.

1

DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN .............................................................................. ii

SURAT KONTRAK PENELITIAN................................................................. iii

ABSTRAK ....................................................................................................... iv

DAFTAR ISI .................................................................................................... 1

DAFTAR TABEL ........................................................................................... 2

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... 2

BAB 1. PENDAHULUAN ..............................................................................

1.1 Latar Belakang ..............................................................................

1.2 Rumusan Masalah .........................................................................

1.3 Tujuan Penelitian ...........................................................................

1.4 Urgensi Penelitian .........................................................................

BAB 2. KAJIAN PUSTAKA ...........................................................................

BAB 3. METODE PENELITIAN ....................................................................

3.1 Lokasi Kegiatan .............................................................................

3.2 Alat Penelitian ...............................................................................

3.3 Bahan Penelitian ............................................................................

3.4 Prosedur Penelitian .......................................................................

3.5 Analisis Data .................................................................................

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ..........................................................

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ...........................................................

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................

LAMPIRAN ....................................................................................................

1. Luaran ..................................................................................................

2. Biodata Ketua dan Anggota ...............................................................

3. Surat Pernyataan Ketua Pengusul .......................................................

3

3

3

4

4

5

7

7

7

7

7

8

9

13

14

15

15

16

21

2

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Jenis sampel sosis daging sapi ........................................................... 10

Tabel 2. Kadar dan kemurnian hasil isolasi DNA ........................................... 11

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Elektroforesis hasil amplifikasi gen CytB ...................................... 12

Gambar 2. Elektroforesis hasil amplifikasi gen SIMp ..................................... 13

3

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Kasus makanan mengandung bahan dari babi marak terjadi di Indonesia sejak tahun

1980-an sampai sekarang. Pada tahun 2009, beberapa jenis makanan olahan daging

seperti dendeng, abon, dan bakso terindikasi mengandung cemaran babi oleh

LPPOM MUI. Pencampuran produk olahan daging dengan daging babi bertujuan

untuk menurunkan harga produksi namun harga jual tetap tinggi, serta

meningkatkan cita rasa. Pencampuran ini tidak dibenarkan untuk dikonsumsi

masyarakat Indonesia yang sebagian besar merupakan muslim. Selain itu, untuk

memenuhi kriteria bahan yang akan disertifikasi halal, bahan makanan tidak boleh

berasal dan bebas dari kontaminasi bahan haram dan najis.

Keberadaan komponen bahan makanan yang mengandung babi dalam bahan dan

produk pangan dapat diidentifikasi melalui lemak, protein maupun DNA (Fibriana

F et al. 2010). Identifikasi DNA untuk mendeteksi adanya kandungan daging babi

pada produk pangan telah banyak dilakukan. Tanabe et al. (2007) menggunakan

teknik PCR untuk mendeteksi DNA babi dari sampel daging segar dan daging

olahan (sosis, salami, bakso, bacon, steak, dan gyoza). Hasil penelitian

menunjukkan bahwa teknik PCR mempunyai sensitivitas tinggi untuk mendeteksi

gen sitokrom-b babi (porcine cytochrome b gene). Singh et al. (2007) menggunakan

teknik PCR untuk mengidentifikasi jenis organisme pada daging mentah dan

matang berdasarkan famili gen aktin.

Sosis sebagai salah satu bahan makanan daging perlu mendapatkan sertifikat halal

agar dapat dikonsumsi masyarakat muslim. Deteksi cemaran gen babi pada produk

sosis perlu dilakukan dengan menggunakan teknik PCR, sehingga validasi tahapan

reaksi PCR dapat memberikan spesifisitas dan sensitivitas terhadap hasil analisis

DNA Babi.

1.2 Perumusan Masalah

Validasi terhadap metode PCR untuk analisis kontaminasi DNA babi pada

bahan makanan sosis di sekitar Jakarta Timur belum dilakukan. Validasi ini

4

dibutuhkan agar diperoleh kondisi optimum dengan spesifisitas dan sensitivitas

terbaik yang dapat mendeterminasi cemaran gen babi.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengembangan metode deteksi DNA pada

sosis serta untuk mengetahui apakah produk sosis di sekitar Jakarta Timur ada yang

mengandung daging babi.

1.4 Urgensi Penelitian

Kemampuan untuk melakukan deteksi kandungan babi merupakan keharusan

bagi pelayanan sampel di laboratorium halal suatu instansi. Lembaga pusat kajian

halal di UHAMKA (PKHU), perlu melakukan validasi metode PCR untuk

mendapatkan kondisi optimum dalam menganalisis DNA babi dari salah satu

produk olahan daging yaitu sosis.

5

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Produk Sosis Sapi

Sosis merupakan produk olahan yang dibuat dari bahan dasar berupa daging

(sapi atau ayam) yang digiling. Pada prinsipnya semua jenis daging dapat dibuat

sosis bila dicampur dengan sejumlah lemak. Daging merupakan sumber protein

yang bertindak sebagai pengemulsi dalam sosis. Kekenyalan dari sosis dipengaruhi

oleh oleh kadar air sosis, bahan pengikat sosis yaitu susu skim bubuk dan bahan

pembentuk yaitu susu skim bubuk dan tepung tapioka.

Sosis merupakan produk emulsi yang membutuhkan pH tinggi (diatas pH

isoelektrik). Nilai pH sosis ditentukan oleh pH daging yang dipakai dalam

pembuatan sosis dan kondisi daging yang pre-rigor (Suparno, 1998). Menurut

Forrest et al (1975), adonan sosis merupakan emulsi minyak dalam air (oil in water)

yang terbentuk dalam suatu fase koloid dengan protein daging yang bertindak

sebagai emulsifier sehingga protein air dalam adonan sosis akan membuat matriks

yang menyelubungi butiran lemak dan membentuk emulsi yang stabil.

Pengujian cemaran daging babi pada sosis dari berbagai tempat di Indonesia

telah banyak dilakukan. Hal ini merupakan imbas dari adanya laporan mengenai

pencampuran daging babi dengan alasan harga produksi yang lebih murah.

Penelitian yang telah dilakukan oleh Priyanka V (2017), bahwa adanya kontaminasi

gen babi pada sosis yang diperoleh dari pasar di Yogyakarta. Penelitian lain yang

dilakukan oleh Harisah S (2017), melaporkan bahwa tidak ditemukan cemaran babi

pada sosis yang diperoleh dari Pasar Parung.

2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di bidang analisis produk

halal. Salah satunya ialah Polymerase Chain Reaction atau yang lebih dikenal

dengan PCR merupakan suatu teknik untuk mengamplifikasi atau menggandakan

suatu segmen dari DNA (Garibyan, 2013). Menurut National Laboratory of Enteric

Pathogensm Bureau of Microbiology, Laboratory Center for Disease Control

(1991) menyatakan bahwa PCR dapat secara langsung memproduksi lebih dari satu

juta copy dari DNA spesifik ataupun RNA sekuens dalam tiga proses sederhana.

6

Proses yang pertama diinisiasi dengan denaturasi DNA duplex ganda untuk

memisahkan dua untai yang saling berkomplemen. Proses yang kedua ditandai

dengan penempelan primer kepada masing-masing untai DNA yang sudah terpisah

tersebut. Proses yang terakhir merupakan proses sintesis DNA yang dibantu dengan

kerja enzim DNA Polymerase. Siklus tersebut akan berlangsung berulang-ulang.

Reaksi PCR menggunakan dua primer yang komplemen dan terhibridisasi dengan

untai yang berlawanan dari ujung 5’ ke ujung 3’. Apabila template dari reaksi PCR

adalah RNA sekuens, cDNA harus dibentuk terlebih dahulu dengan bantuan enzim

DNA transkripsi balik.

Roadmap Penelitian

Penelitian

terdahulu (2019)

Penelitian yang akan

dilakukan (2020)

Penelitian tindak

lanjut (2021)

Tahap

Hilir

(tahap

lanjut)

Tahap

Pengem

bangan

Tahap

inisisasi

Pengembangan metode analisis cemaran

bahan haram seperti babi pada tingkat

molekuler dengan teknologi terkini

dengan hasil yang relatif singkat

menggunakan Real-Time PCR

Validasi metode analisis cemaran bahan haram

seperti babi dengan sampel produk sosis sapi pada

tingkat molekuler. Teknik yang digunakan PCR

konvensional

Pengembangan metode analisis cemaran bahan

haram seperti babi dari produk olahan daging

lainnya pada tingkat molekuler dengan

menggunakan PCR

7

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Lokasi Kegiatan

Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Hewan dan Bioteknologi Fakultas

Farmasi UHAMKA.

3.2 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain adalah timbangan analitik,

perangkat gelas, mikropipet, mikrotube, tip, vorteks, mesin PCR, perangkat

elektroforesis, sentrifus, homogenizer, dan freezer.

3.3 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain adalah berbagai produk

olahan daging sebagai sampel, phosphate buffer saline(PBS), DNA isolation kit,

dapar TAE, agarosa, GelRed, primer basa nukleotida, marker DNA dan reaction

mix PCR kit.

3.4 Prosedur Penelitian

Pengumpulan Produk Sosis Sapi

Sampel diperoleh dari pasar tradisional dan supermarket di wilayah Jakarta

Timur. Pengambilan sampel dilakukan dengan teknik Cluster Random Sampling

yaitu pengambilan sampel secara acak berdasarkan area tertentu (Taherdoost H

2016). Jumlah sampel keseluruhan yang diambil dari populasi sebanyak 11 sampel

dengan merk yang berbeda dari Pasar Perumnas Klender, Pasar Jaya Klender, Pasar

Jaya Pondok Kelapa, dan Pasar Kramat Jati.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Homogenat sampel diresuspensi dengan PBS sebanyak 200 μL. Suspensi

jaringan ditambahkan 400 μL bufer lisis dan divortex selama 15 detik. Suspensi sel

dipipet ke dalam tube filter, kemudian tube filter yang berisi suspensi sel disentrifus

pada kecepatan 8000 xg selama 15 detik. Cairan yang tertampung pada tube koleksi

dibuang. Sebanyak 100 μL RNAse I ditambahkan ke dalam tube filter, kemudian

tube filter diinkubasi selama 15 menit pada suhu 18 derajat Celcius(Roche 2011).

8

Larutan bufer pencuci I ditambahkan ke dalam tube sebanyak 500 μL dan

disentrifuse pada kecepatan 8000 xg selama 15 detik. Cairan yang mengalir ke

dalam tube koleksi dibuang. Larutan bufer pencuci II ditambahkan ke dalam tube

sebanyak 500 μL dan disentrifuse pada kecepatan 13000 xg selama 2 menit. Cairan

yang mengalir ke dalam tube koleksi dibuang. Larutan bufer elusi ditambahkan

sebanyak 100 μL dan disentrifuse pada kecepatan 8000 xg selama 1 menit. Tabung

mikro mengandung DNA, lalu aliquot menjadi 4 bagian. Sampel DNA dapat

disimpan dalam lemari pendingin suhu -80 ᴼC(Roche 2011).

3.5 Analisis Data

Elektroforesis Agarosa

Sebanyak 0.9 g agarosa ditimbang untuk dilarutkan dalam bufer TAE

sebanyak 60 mL. Larutan tersebut dipanaskan dengan microwave selama 4 menit

suhu medium hingga agarosa larut sempurna. Larutan agarosa ditambahkan etidium

bromida jika suhu larutan sudah hangat sekitar 60ᴼC. Larutan agar dituang ke dalam

cetakan elektroforesis dan dibiarkan agar mengeras. Aplikasi sampel dan marker ke

dalam sumur agar, kemudian jalankan elektroforesis pada 100 volt selama 30 menit

(FKUI 2001).

Analisis PCR

Analisis DNA dengan PCR menggunakan 2×Taq Plus PCR Mix (With Dye)

(Tiangen). Reaksi PCR melibatkan bufer PCR, MgCl2, dNTP, Taq DNA

Polimerase, serta primer.

PCR cycle :

1. Denaturasi

1 cycle 94⁰C 2 menit

2. PCR amplifikasi

30 cycle 94⁰C 30 menit

55⁰C 30 menit

72⁰C 30 menit

3. Ekstensi Akhir

1 cycle 72⁰C 30 menit

9

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengumpulan Sampel

Sampel sosis diperoleh dari 4 pasar yang berbeda yaitu, Pasar Perumnas

Klender, Pasar Jaya Klender, Pasar Jaya Pondok Kelapa, dan Pasar Kramat Jati.

Jumlah sampel yang diperoleh yaitu sebanyak 11 (Tabel 1), lebih sedikit

dibandingkan dengan jumlah yang diajukan pada proposal. Hal ini dikarenakan

jenis produk yang dijual di pasar yang disebutkan memiliki merk yang sama. Selain

itu, jumlah sampel dibatasi mengingat semakin banyak jumlah sampel yang

digunakan maka semakin besar pula reagen atau kit yang dibutuhkan, hal ini

berpengaruh pada pendanaan dan waktu yang diperoleh.

Tabel 1. Jenis sampel sosis daging sapi.

No Inisial Nama

Sosis

Label Halal No.Sertifikat

1 SHJ Ada 00010048090508

2 SBB Ada 00010060390212

3 SHS Ada 01011216461018

4 SBS Ada 01011025460607

5 SBG Ada 00010050740609

6 SDB Ada 00010041970906

7 SKS Ada 00010040730606

8 SEF Ada 00010025330603

9 SCS Ada 00010011101099

10 SFH Ada 00010003180698

11 SVS Ada 00010040730606

4.2 Isolasi DNA

Hasil isolasi DNA dari sosis sapi berupa nilai konsentrasi dan kemurnian

yang terdapat pada Tabel 2. Isolasi menggunakan 2 kit yaitu TIANamp Genomic

DNA Kit dan Wizard Genomic DNA Purification Kit.

Isolasi DNA dilakukan secara duplo dan diukur serapannya pada panjang

gelombang 260 nm serta 280 nm. Serapan yang diperoleh dari λ 260 nm digunakan

untuk menghitung kadar DNA sedangkan rasio serapan pada λ 260 nm dan λ 280

nm digunakan untuk mengukur kemurnian dari hasil isolasi. Rasio OD-260nm/OD-

280nm sebesar 1.8 atau lebih tinggi menunjukkan tingkat kemurnian yang baik

ditandai dengan rendahnya tingkat kontaminan protein dalam larutan sampel DNA.

10

Tabel 2. Kadar dan kemurnian hasil isolasi DNA.

No Inisial

Sosis

TIANamp Genomic DNA Kit Wizard Genomic DNA

Purification Kit

Kadar

Rerata

(ug/mL)

Kemurnian

Rerata

Kadar

Rerata

(ug/mL)

Kemurnian

Rerata

1 SHJ 2150 1.85 2250 1.80

2 SBB 2300 1.90 2400 1.81

3 SHS 2500 1.80 2500 1.81

4 SBS 2200 1.85 2600 1.80

5 SBG 2300 1.90 2550 1.83

6 SDB 2400 1.83 2350 1.83

7 SKS 2300 1.85 2200 1.85

8 SEF 2200 1.87 2400 1.83

9 SCS 2400 1.90 2700 1.85

10 SFH 2250 1.87 2750 1.83

11 SVS 2450 1.87 2500 1.85

Kedua kit yang digunakan memiliki kelebihan dan kekurangan masing-

masing, TIANamp Genomic DNA Kit yang menggunakan sistem kolom

memberikan tingkat kemurnian pada hasil yang lebih baik dibandingkan dengan

Wizard Genomic DNA Purification Kit. Namun, estimasi waktu dan alat pelengkap

yang dibutuhkan untuk isolasi DNA lebih efisien menggunakan Wizard Genomic

DNA Purification Kit daripada TIANamp Genomic DNA Kit. Oleh karena itu,

peneliti dapat memilih kit yang sesuai dengan kebutuhan dan tujuan dari penelitian.

4.3 PCR

Primer yang digunakan adalah CytB dan SIMp. Kedua pasangan primer ini

diperoleh dari artikel penelitian yang dilakukan oleh Ishak N & Muthalib SA, 2018.

Primer Forward CytB :

5’-CCATCCAACATCTCAGCATGAAA-3’

Primer Reverse CytB :

5’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’

Primer Forward SIMp :

5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGA- 3'

Primer Forward SIMp :

5' -GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3'

11

DNA hasil isolasi ditambahkan dengan reagen PCR dan pasangan primer

CytB dan SIMp. Selanjutnya produk PCR dilakukan analisis kualitatif dengan

elektroforesis agarosa.

4.4 Elektroforesis Agarosa

Semua sampel menunjukkan terdapat gen CytB mitokondria yaitu gen yang

dimiliki oleh vertebrata. Sapi termasuk hewan vertebrata, selain sapi, babi juga

termasuk hewan vertebrata. Pada penelitian ini, tahapan yang dilakukan yaitu

amplifikasi gen CytB. Hasil PCR dari 11 sampel sosis, kontrol negatif (daging sapi),

dan kontrol positif (daging babi) yang menggunakan primer CytB dianalisis dengan

elektroforesis. Seluruh sampel mengandung gen CytB dengan ukuran 359 bp

(Gambar 1).

Gambar 1. Elektroforesis hasil amplifikasi gen CytB.

(Keterangan : M = Marker DNA 1Kb, 1-11 = sampel sosis, 12 = Daging Sapi, 13 = Daging

Babi)

Hasil amplifikasi dari 13 sampel termasuk kontrol positif dan kontrol

negatif dengan menggunakan primer spesifik porcine SIMp dapat dilihat pada

Gambar 2. Visualisasi pita yang ditunjukkan terdapat 9 sampel yang positif

mengandung gen SIMp, hampir semua sampel sosis mengandung gen SIMp.

Namun, tidak dapat dikatakan sampel sosis tersebut mengandung babi karena pita

M 1 2 3 4 5 6 7

M 8 9 10 11 12 13 13

359 bp

bp

359 bp

bp

12

gen SIMp juga terdapat pada daging sapi yang digunakan sebagai kontrol negatif.

Berdasarkan hasil tersebut, dapat dinyatakan bahwa gen SIMp bukanlah gen

spesifik sebagai penanda keberadaan campuran daging babi pada sampel daging

ataupun produk makanan olahan daging.

Gambar 2. Elektroforesis hasil amplifikasi gen SIMp.

(Keterangan : M = Marker DNA 1Kb, 1-11 = sampel sosis, 12 = Daging Sapi, 13-

Daging Babi)

Menurut Ishak N & Muthalib SA (2018), primer SIMp merupakan primer

spesifik yang digunakan untuk mengidentifikasi kontaminasi DNA Babi dengan

cepat. Namun, pada penelitian ini primer tersebut belum dapat digunakan untuk

mendeteksi DNA kontaminasi Babi dari produk daging olahan. Oleh karena itu,

teknik PCR-RFLP merupakan teknik kualitatif yang tepat untuk mendeteksi

cemaran DNA Babi dari sumber daging sebagai sampel. Teknik ini dapat

membantu membedakan sumber sampel dari Daging Sapi atau Babi.

M 1 2 3 4 5 6 7

398 bp

bp

M 8 9 10 11 12 13

398 bp

bp

13

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

Sebelas sampel sosis yang diperoleh dari pasar di daerah Jakarta Timur

mengandung gen CytB mitokondria yang merupakan gen universal vertebrata.

Sembilan sampel sosis serta kontrol baik positif dan negatif memberikan hasil

positif terhadap gen spesifik porcine yaitu SIMp. Primer SIMp belum dapat

digunakan untuk mengidenifikasi gen Babi dengan teknik PCR.

5.2 Saran

Penelitian selanjutnya perlu dilakukan analisis kualitatif dengan teknik PCR-

RFLP serta analisis kuantitatif menggunakan metode Real Time PCR.

14

DAFTAR PUSTAKA

Fibriana F, Widianti T, Retnoningsih A. 2010. “Deteksi Kandungan Daging Babi

Pada Bakso yang Dijajakan di Pusat Kota Salatiga Menggunakan Teknik

Polymerase Chain Reaction”. Biosaintifika 2(1): 10-17.

FKUI, Bagian Biokimia. 2001. “Biokimia: Eksperimen Laboratorium.”

Forrest, J. C., E. D. Aberle, H. B. Hendrick, M. D. Judge and R. A. Merkel. 1975.

“Principles of Meat Science”. W. H. Freeman and Co., San Fransisco.

Ishak N dan Mutalib SA. 2018. “Extraction and detection of animal

deoxyribonucleic acid (DNA) species on lipsticks using Polymerase Chain

Reaction (PCR) assay”. International Journal of ChemTech Research 11(6):

250-254.

Singh Y, MN Brahmbhatt, CD Bhong, S Jain & CG Joshi. 2007. “Detection of meat

species by polymerase chain reaction of actin gene family”. Haryana Vet.

41:25-27.

Suparno. 1998. Ilmu dan Teknologi Daging. UGM Press, Yogyakarta.

Taherdoost H. 2016.”Sampling Methods in Research Methodology; How to Choose

a Sampling Technique for Research”. International Journal of Academic

Research in Management (IJARM) 5(2): 18-27.

Tanabe S, Miyauchi E, Muneshie A & Mio K. 2007. “PCR method of detecting

pork in foods for verifying allergen labeling and for identifying hidden pork

ingredients in processed foods”. Biosci. Biotechnol.Biochem. 71(7):1663-

1667.

15

Lampiran 1. Luaran Artikel

16

Lampiran 2. Biodata Ketua dan Anggota

Ketua

17

18

Anggota 1

19

20

Anggota 2

21

Lampiran 2.

SURAT PERNYATAAN KETUA PENGUSUL