LAPORAN PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)

ii

LAPORAN

PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM B-GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM

LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK (ANNONA MURICATA. L)

Tim Pengusul

Fitri Yuniarti, M.Si. (0318068504)

Wahyu Hidayati, S.Si., M. Biomed (0308108202)

PROGRAM STUDI S1-FARMASI

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

TAHUN 2020

LEMBAR PENGESAHAN

PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)

Judul Penelitian

Isolasi dan Uji Aktivitas Enzim B-Galaktosidase Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi

Buah Sirsak (Annona Muricata L.)

Jenis Penelitian : PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)

Ketua Peneliti : Fitri Yuniarti, M. Si Link Profil simakip : http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/690

Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978

Fakultas : Fakultas Farmasi dan Sains

Anggota Peneliti : Wahyu Hidayati, S.Si., M. Biomed

Link Profil simakip : http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/1008 Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978

Anggota Peneliti :-

Link Profil simakip :- Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978

Waktu Penelitian : 6 Bulan

Luaran Penelitian :

Luaran Wajib : Jurnal Kimia Sains Dan Aplikasi-Jurnal Nasional Terakreditasi Sinta 2

Status Luaran Wajib : In Review

Luaran Tambahan : Prosiding Seminar Nasional

Status Luaran Tambahan: Submitted

Mengetahui, Jakarta, 5 Mei 2020

Ketua Program Studi Ketua Peneliti

Kori Yati, M.Farm., Apt Fitri Yuniarti, M.Si

NIDN. 0324067802 NIDN.0318068504

Menyetujui,

Dekan Fakultas Farmasi dan Sains Ketua Lemlitbang UHAMKA

Dr. Hadi Sunaryo, M.Si., Apt Prof. Dr. Suswandari, M.Pd

NIDN.0325067201 NIDN. 0020116601

http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/690





vii

ABSTRAK Bakteri asam laktat memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang

berguna untuk penderita intoleransi laktosa. Salah satu sumber penghasil bakteri asam laktat

adalah buah sirsak (Annona Muricata L) dengan kandungan glukosa yang cukup tinggi yang

berguna untuk pertumbuhan bakteri asam laktat, terutama pada proses fermentasi buah sirsak.

Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak yang

memiliki aktivitas enzim β-galaktosidase. Produksi enzim β-galaktosidase menggunakan metode

sonikasi. Uji aktivitas enzim dilakukan dengan melihat kemampuan enzim β- Galaktosidase

dalam menguraikan laktosa menjadi monosakarida. Penelitian ini di awali dengan isolasi BAL

dari fermentasi buah sirsak, kemudian dilakukan karakterisasi Bakteri Asam Laktat secara

makroskopis dan mikroskopis. Isolat BAL terpilih dari hasil karakterisasi dilakukan pengukuran

aktivitas enzim menggunakan spektrofotometer visible dengan substrat o-nitrophenyl-β-D-

galactopyranoside (ONPG) dan dilanjutkan uji kadar protein dengan metode Bradford. Hasil

isolasi didapatkan 6 isolat BAL dengan morfologi terbaik. Isolat SM6 memiliki nilai aktivitas enzim

tertinggi yaitu 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Dari data diatas dapat

disimpulkan bahwa buah sirsak mengandung bakteri asam lakat yang berpotensi sebagai penghasil

enzim β-galaktosidase.

Kata Kunci: Bakteri Asam Laktat, fermentasi, enzim β-galaktosidase, buah sirsak

(Annona Muricata. L)

DAFTAR ISI

Halaman Pengesahan ............................................................................ ii

Surat Perjanjian Kontrak ....................................................................... iii

Abstrak .................................................................................................. v

Daftar Isi ................................................................................................ vi

Bab 1. Pendahuluan ............................................................................... 1

Bab 2. Tinjauan Pustaka ....................................................................... .4

Bab 3. Metodologi Penelitian ............................................................... .9

Bab 4. Hasil dan Pembahasan .............................................................. 13

Bab 5. Simpulan dan Saran……………………………………………21

Bab 6. Luaran Yang dicapai…………………………………………..22

Bab 7. Rencana Tindak Lanjut Dan Proyeksi Hilirisasi………………23

Daftar Pustaka ...................................................................................... 24

Lampiran-lampiran……………………………………………...….…28

iv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Daging buah sirsak sebelum dan setelah fermentasi ................. .… 14

Tabel 2. Hasil isolasi bakteri asam laktat pada fermentasi buah sirsak ... ….14

Tabel 3. Hasil karakterisasi isolate bakteri asam laktat…………………… 16

Tabel 4. Hasil produksi Enzim β-Galaktosidase…… .............................. … 17

Tabel 5. Rerata aktivitas enzim β-Galaktosidase ……………………….…18

Tabel 6. Rerata kadar protein enzim β-Galaktosidase ………….………...…..20

v

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hidrolisis Laktosa oleh Enzim β-Galaktosidase…………..…….…. 5

1

BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Tanaman sirsak (Annona muricata L.) merupakan komoditas hasil pertanian yang

banyak ditanam di Indonesia. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah sirsak

merupakan sumber yang potensial untuk mendapatkan bakteri asam laktat. Salah satu

jenis karbohidrat pada buah sirsak adalah gula pereduksi (glukosa dan fruktosa), yang

merupakan sumber karbon utama bagi mikroorganisme dalam proses fermentasi

(Diniyah dkk. 2013). Menurut Buckle (1987), fermentasi asam laktat terjadi karena

adanya aktivitas bakteri asam laktat yang mengubah glukosa menjadi asam laktat,

sehingga jumlah bakteri asam laktat meningkat selama proses fermentasi berlangsung

yang akan diikuti dengan penurunan pH. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri

Gram-positif yang mengeksresikan asam laktat sebagai produk akhir fermentasi yang

berperan sebagai preservasi bahan makanan (Schnurer dan Magnusson 2005).

Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah satu kelompok bakteri yang

mempunyai enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004).

Enzim β- galaktosidase merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi

glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-galaktosida pada ujung nonreduksi β-

D-galaktosa (Gary dan Kindell 2005). Secara alamiah, enzim β- galaktosidase

(laktase) terdapat pada usus halus manusia (Campbell et al. 2005). Kekurangan laktase

sementara pada individu dengan kadar β- galaktosidase normal juga dapat diakibatkan

oleh kerusakan pada lapisan usus yang disebabkan oleh infeksi virus atau bakteri,

kemoterapi kanker, kondisi alergi atau autoimun dan penurunan β- galaktosidase yang

terkait dengan penuaan (Sinuhaji 2006).

Enzim β-galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk

mengatasi masalah intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase

(Artolozaga et al. 1998). Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa

menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah (Marsh dan

Riley 1998). Laktosa tidak mudah diserap, tetapi harus dihidrolisis oleh laktase (β-

galaktosidase) menjadi monosakarida (mudah diserap usus). Jika laktosa tidak dapat

dihidrolisis oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut, mulas, kejang perut,

pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Untuk mengurangi masalah tersebut

2

penderita lactose intolerance dapat mengkonsumsi suplemen β- galaktosidase atau

dengan mengkonsumsi susu rendah laktosa. Karena semakin meningkatnya penderita

intoleransi laktosa pada saat ini, oleh karena itu perlu dilakukan penelitian dan

ditemukan sumber-sumber baru penghasil enzim ß-galaktosidase yang terdapat dialam

yang nantinya bisa digunakan sebagai produk atau suplemen kesehatan bagi penderita

intoleransi laktosa.

Secara luas, enzim β-galaktosidase dapat diperoleh dari beberapa sumber antara

lain mikroorganisme, tanaman, dan hewan (Grosova et al. 2008). Enzim β-galaktosidase

juga dapat diisolasi dari ragi kelompok Kluyveromyces sp. dan fungi kelompok

Aspergillus sp. (Harti 2015). Dibandingkan dengan sumber tanaman dan hewan, enzim

yang diisolasi dari mikroorganisme lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan setelah

disekresikan ke dalam media pertumbuhan mikroorganisme (Radji 2009). Informasi

mengenai BAL yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayur telah banyak

dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah

sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014) yang

telah berhasil mengisolasi 7 isolat BAL. Namun, isolasi BAL yang berpotensi

penghasil enzim β-galaktosidase pada fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.)

belum pernah dilakukan. Mengingat banyaknya manfaat dari BAL dan enzim ß-

galaktosidase terhadap kesehatan maka perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang

isolasi BAL penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi buah sirsak (Annona

muricata L.).

2 Rumusan Masalah

Berdasarkan hal yang telah di uraikan di latar belakang, diketahui bahwa fermentasi

buah sirsak mengandung bakteri asam laktat serta adanya kemampuan bakteri asam

laktat dari produk fermentasi yang mampu menghasilkan enzim β-Galaktosidase.

Adanya informasi tersebut, maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan isolat

BAL yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-Galaktosidase dari

fermentasi buah sirsak.

3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri asam laktat

penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.)

3

disertai pengukuran aktivitas enzim β-galaktosidase. Informasi ini selanjutnya akan di

publikasikan dalam bentuk jurnal ilmiah.

4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini yaitu diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah

mengenai bakteri asam laktat yang dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase yang

diisolasi dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.). Dengan demikian dapat

diaplikasikan sebagai probiotik maupun produk farmasi untuk penderita lactose

intolerance.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1. Sirsak

Deskripsi Tanaman

Sirsak merupakan tanaman buah yang tumbuh dengan baik di daerah tropis lembab.

Tanaman ini dapat tumbuh di dataran rendah sampai daerah berketinggian 500 meter

dari permukaan laut (mdpl), beriklim basah sampai kering, bersuhu 22-28oC,

kelembaban udara (RH) 60-80%, dan curah hujan berkisar antara 1.500-2.500 mm per

tahun (Zuhud 2011).Sirsak merupakan tanaman dengan tinggi pohon sekitar 8 meter.

Batang coklat berkayu, bulat, bercabang. Mempunyai daun bebentuk telur atau lanset,

ujung runcing, tepi rata, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang tangkai 5

mm, hijau kekuningan. (Syamsu hidayat dan Hutapea 1991). Buah sirsak mengandung

protein, kalsium, fosfor, vitamin A, dan vitamin C. Batang dan daun kaya akan tannin,

fitosterol, kalsium oksalat, serta alkaloid mirisine. Anggota famili Annonaceae itu

bersifat manis (buah masak). Faedahnya sebagai astrigen (daun dan buah mentah),

antibakteri dan antikejang.

2. Fermentasi

Fermentasi adalah perubahan glukosa secara anaerob yang meliputi glikolisis dan

pembentukan NAD. Fermentasi menghasilkan jumlah energi yang relatif lebih sedikit

daripada energi yang dihasilkan melalui respirasi secara normal. Fermentasi dibedakan

menjadi dua tipe reaksi, yaitu fermentasi alcohol dan fermentasi asam laktat. Proses

fermentasi asam laktat adalah proses fermentasi glukosa yang menghasilkan asam

laktat. Proses fermentasi asam laktat dimulai dengan proses glikolisis yang

menghasilkan asam piruvat, kemudian proses ini dilanjutkan dengan perubahan asam

piruvat menjadi asam laktat. Dalam proses fermentasi asam laktat, asam piruvat

bereaksi secara langsung dengan NADH membentuk asam laktat. Hasil dari

fermentasi, setiap molekul glukosa akan menghasilkan 2 molekul ATP. Sementara itu,

dari respirasi aerobik akan dihasilkan 36 molekul ATP (Karmana 2008).

3. Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat

menjadi asam laktat. Bakteri yang memproduksi asam laktat termasuk ke dalam

5

golongan bakteri Gram positif, sebagian besar bersifat katalase negatif, tidak

membentuk spora, berbentuk batang. Golongan bakteri asam laktat ini dapat tumbuh

dengan atau tanpa oksigen (Casida 1968). Kelompok bakteri asam laktat terdiri dari

famili Micrococcaceae yaitu spesies dari genus Micrococcus dan Staphylococcus,

famili Lactobacillaceae yaitu spesies dari genus Lactobacillus dan bakteri yang

termasuk dalam famili Streptococcaceae, yaitu spesies dari genus Leuconostoc,

Streptococcus, Pediococcus dan Aerococcus (Fardiaz 1992). Bakteri asam laktat

(BAL) merupakan bakteri mampu hidup pada berbagai habitat yang cukup luas di

alam seperti pada tanaman, saluran pencernaan hewan dan manusia, pada produk

makanan kalengan, produk susu, produk fermentasi, buah- buahan dan sayur-sayuran

tropis (Misgiyarti dan Widowati 2005). BAL ini dapat digolongkan menjadi 2

golongan yaitu golongan bakteri homofermentatif dan bakteri heterofermentatif

(Soeharsono 2010).

4. Enzim β-Galaktosidase

Enzim β-galaktosidase adalah golongan enzim yang dapat menghidrolisis residu

ikatan β- galaktosa dari berbagai senyawa dan biasanya digunakan untuk

menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Nama sistematiknya adalah ß-

D-galaktosida galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase. Enzim ini

bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast tetapi bersifat ekstraseluler pada fungi

(IUBMB Enzyme Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisa

ikatan ß-(1,4)-glikosida pada laktosa (Gambar 1.). Penggunaan enzim ß- galaktosidase

dalam proses hidrolisa ini mempunyai kekurangan di mana hidrolisa laktosa secara

keseluruhan tidak mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya

galaktosa di dalam reaksi hidrolisis (Boyer 2002).

Menurut Tryland dan Fiskdal (1997), ß-galaktosidase dapat dihasilkan oleh

bakteri Gram negatif (Enterobacteriaceae, Vibrinoceae, Pseudomonaceae dan

Neisseriaceae), bakteri Gram positif (Lactobacteriaceae, Streptococcaceae), yeast

dan fungi. Enzim ß-galaktosidase yang dihasilkan oleh yeast (Kluyveromyces fragilis

dan Kluyveromyces lactis) bersifat aktif pada pH tinggi sedangkan yang berasal dari

fungi (Aspergillus oryzae dan Aspergillus niger) bersifat aktif pada pH rendah. Enzim

ß-galaktosidase yang berasal dari fungi mempunyai pH optimum 5 dan suhu optimum

50oC, sedangkan yang berasal dari yeast mempunyai pH optimum 6 dan suhu

6

optimum 37oC. Enzim ß-galaktosidase dari bakteri mempunyai pH optimum 7 dengan

suhu optimum 37oC (Aurand 1987).

Gambar 1. Hidrolisis Laktosa oleh Enzim β-Galaktosidase

5. Isolasi Bakteri

Isolasi merupakan suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme dari sampel

atau alam dan menumbuhkan dalam media kultur secara in vitro sehingga diperoleh

biakan murni (Harti 2015). Dalam mengisolasi bakteri menjadi biakan murni perlu

dilakukan secara aseptik agar terhindar dari kontaminasi mikroorganisme lain. Teknik

aseptik merupakan suatu cara untuk mengkulturkan mikroorganisme dengan

menggunakan alat, bahan atau metode secara mikrobiologis. Dengan adanya teknik

aseptis. maka dapat mencegah tercemarnya biakan murni dan melindungi diri dari

infeksi akibat masuknya mikroorganisme yang tidak dikehendaki (Harti 2015).

6. Uji aktivitas Enzim β-galaktosidase

Pengujian aktivitas enzim β-galaktosidase dilakukan menggunakan substrat O-

Nitrophenyl-β- D-Galactopyranoside (ONPG). Satu unit aktivitas β-galaktosidase

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 μmol O-

Nitrophenol (ONP) dari subsrat ONPG per menit pada kondisi perlakuan (Khusniati

dkk. 2015). Aktivitas enzim β- galaktosidase dinyatakan dalam unit (U/ml) dan dapat

dihitung dengan rumus berikut :

"Aktivitas (U/ml) = mikromol ONP /V x t ……………………………….(1)

Keterangan :

Mikromol ONP = Jumlah ONP saat percobaan

V = Volume enzim yang diuji (0,1 ml)

t = Waktu Inkubasi (menit)

7

Senyawa ONPG merupakan senyawa yang tidak berwarna dan berfungsi untuk

mendeteksi aktivitas β-galaktosidase. Adanya aktivitas β-galaktosidase menyebabkan

terjadinya reaksi hidrolisis ONPG menjadi dua senyawa, yaitu galaktosa dan ONP.

7. Uji Kadar Protein (Bradford Method)

Pengukuran kadar suatu enzim dapat diujikan dengan menggunakan metode

Bradford. Metode Bradford merupakan suatu metode pengukuran konsentrasi protein

total secara kolorimetri dalam suatu larutan. Metode ini didasarkan pada pengikatan

antara pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang terdapat dalam reagen Bradford

dengan protein pada sampel larutan dalam suasana asam sehingga menghasilkan

kompleks bewarna biru. Kedua interaksi bersifat hidrofobik dan menstabilkan ion

bentuk anionik pewarna yang menyebabkan perubahan warna terlihat. Dengan

demikian, secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometri pada panjang gelombang 465‐595 nm (Purwanto 2006).

Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginin, dan sedikit bereaksi

dengan histidin, lisin, tirosin, triptofan, dan residu fenilalanin. Uji Bradford agak

sensitif terhadap albumin serum sapi, dua kali lebih dari rata-rata protein secara umum

(Bintang 2010). Pengujian kadar protein dengan metode Bradford merupakan

pengujian yang cukup akurat karena sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji

ulang dalam beberapa menit sehingga uji ini konstan pada rentang konsentrasi 10 kali

lipat. Selain itu, pengujian ini bersifat sensitif, selektif dan juga cukup stabil terhadap

keberadaan surfaktan sebagai pengotor (Purwanto 2006).

State Of The Art

Bakteri asam laktat merupakan salah satu kelompok bakteri yang mempunyai

enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004). Enzim β-

galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk mengatasi masalah

intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase (Artolozaga et al. 1998).

Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan

galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah (Marsh dan Riley 1998). Jika

laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut,

mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Semakin

meningkatnya penderita intoleransi laktosa pada saat ini, mendorong untuk dilakukan

penelitian dan penemuan sumber-sumber baru penghasil enzim ß-galaktosidase yang

8

terdapat dialam yang nantinya bisa digunakan sebagai produk atau suplemen

kesehatan bagi penderita intoleransi laktosa.


lain mikroorganisme, tanaman, dan hewan (Grosova et al. 2008). Dibandingkan

dengan sumber tanaman dan hewan, enzim yang diisolasi dari mikroorganisme lebih

mudah dipisahkan dan dimurnikan setelah disekresikan ke dalam media pertumbuhan

mikroorganisme (Radji 2009). Informasi mengenai BAL yang diisolasi dari

fermentasi buah dan sayur telah banyak dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi

bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan

aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014) yang telah berhasil mengisolasi 7 isolat BAL.

Isolasi BAL yang berpotensi penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi

buah sirsak (Annona muricata L.) belum pernah dilakukan. Isolasi BAL dari Produk

atau tanaman fermentasi memiliki keunggulan dimana BAL yang dihasilkan memiliki

kualitas yang lebih baik dan jumlah isolat yang di dapat juga lebih banyak, hal ini

disebabkan terjadinya optimalisasi reaksi enzimatis pada proses fermentasi (Fardiaz

1992). Mengingat banyaknya manfaat dan peranan yang dihasilkan oleh Bakteri Asam

Laktat (BAL) dan enzim ß-galaktosidase terhadap kesehatan, maka perlu dilakukan

penelitian lanjutan tentang produksi enzim ß-galaktosidase Bakteri Asam Laktat yang

berasal dari fermentasi buah/tanaman asli lokal seperti fermentasi buah sirsak (Annona

muricata L.)

RoadMap Penelitian

9

BAB III

METODE PENELITIAN

Rancangan Penelitian

A. Lokasi penelitian : Di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Bioteknologi,

dan Laboratorium Kimia Terpadu Fakultas Farmasi dan Sains Universitas

Muhammadiyah Prof. DR. Hamka dan Laboratorium Riset Oral Biologi Fakultas

Kedokteran Gigi Universitas Indonesia.

B. Desain Penelitian : Desain Yang digunakan adalah desain eksperimental secara

kualitatif

C. Sampel Penelitian: Sampel Penelitian berupa Buah Sirsak yang sudah matang

D. Cara Kerja

1. Persiapan dan pengambilan sampel

Persiapan awal yaitu terdiri dari menyiapkan alat dan bahan serta pembuatan

media. Alat- alat gelas di sterilisasi dalam oven suhu 1600C, medium yang telah di

siapkan di sterilisasi dalam autoklaf suhu 1210C, laminar air flow di sterilkan

menggunakan etanol 70%. Bahan yang digunakan sebagai sampel uji adalah Sirsak

Fermentasi kubis

sebagai sumber

isolat BAL

Isolat BAL yang

memiliki kemampuan

dalam menghasilkan

enzim β Galaktosidase

yang bermanfaat bagi

penderita intoleransi

laktosa

Isolasi BAL Dan

karakterisasi

morfologi

1

Produksi enzim

β Galaktosidase

Penentuan kadar

protein enzim β

Galaktosidase

Uji aktivitas

enzim β

Galaktosidase

4

3

2

10

(Annona Muricata L.). Sirsak terlebih dahulu dideterminasi di Pusat Penelitian Biologi

LIPI Cibinong.

2. Fermentasi Buah Sirsak

Pada tahap fermentasi, isi buah dikeluarkan dan dibungkus dengan daun pisang

steril, ditempatkan dalam wadah fermentasi dan dikondisikan agar udara tidak masuk.

Fermentasi dilakukan pada suhu ruang selama 72 jam (Sari 2013).

3. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak

Hasil fermentasi ditimbang sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam 45 mL MRSB,

lalu dihomogenkan sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Kemudian diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, sampel diencerkan menggunakan

media pepton water hingga pengenceran 10-9. Dari pengenceran 10-9, diambil 100 µl

sampel dan ditanam dengan metode sebar pada cawan petri yang telah berisi media

MRS Agar, kemudian diratakan dengan drugalsky yang sebelumnya disterilkan

dengan alkohol dan dibakar dengan bunsen lalu diangin- anginkan. Inokulum

disimpan dalam anaerob jar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 48 jam pada

suhu 37ºC dan dilakukan pengkodean petridish dengan menandai masing-masing

petridish.

Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan BAL yaitu bulat licin berwarna

putih dipindahkan ke media MRS Agar untuk pemurnian koloni dengan metode streak

yaitu dengan menggunakan jarum ose kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu

37ºC (Purwati et al. 2005).

4. Karakterisasi Bakteri

Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dilakukan dengan identifikasi morfologi

bakteri asam laktat secara makroskopik dan mikroskopik.

5. Produksi Enzim β-galaktosidase

Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari MRSA slant dipindahkan ke dalam media

produksi yang sudah disterilisasi (MRSB dengan kandungan laktosa 1% dan pH

medium: 8). Kemudian media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sel dipanen

dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu

4°C. Peletnya dicuci sebanyak dua kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH 7. Kemudian

pemecahan sel dengan sonikator selama 5 menit pada suhu 4°C. Suspensi sel

11

disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan

yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase kasar (Fazriyani 2015).

6. Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase

Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan 1000 μl buffer fosfat

0,1 M pH 7 dan 100 μl enzim β-galaktosidase dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Larutan yang sudah diinkubasi kemudian

ditambahkan 200 μl ONPG 4 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit.

Pada menit ke-15, larutan ditambahkan 1000 μl Na2CO3 1 M. Selanjutnya, larutan

dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ 420 (Khusniati dkk.

2015).

7. Uji Kadar Protein

Sebanyak 20 µl enzim β-galaktosidase ditambahkan 1 ml larutan Bradford.

Larutan dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada

λ 595 nm. Nilai absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kurva

standar BSA untuk menentukan kadar protein yang terkandung dalam sampel enzim

β-galaktosidase (Bradford 1976).

E. Indikator pencapaian hasil penelitian

Indikator pencapaian hasil penelitian yaitu dengan mendapatkan isolate BAL

yang menghasilkan enzim β-galaktosidase ditandai dengan adanya aktivitas enzim β-

galaktosidase dalam menghidrolisis Substrat ONPG menjadi ONP. Atau dapat juga

dikatakan bahwa satu unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam

banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat

ONPG per menit. Dengan adanya aktivitas enzim β- galaktosidase ini dapat

disimpulkan bahwa BAL yang berasal dari fermentasi buah sirsak memiliki atau dapat

menghasilkan enzim β-galaktosidase.

F. Diagram Alir Penelitian

12

G. Fishbond Penelitian

3

4

5

6

7

Persiapan dan

pengambilan

sampel

Uji kadar

protein enzim

dg metode

bradford

Fermentasi

sirsak dan

isolasi bakteri

asam laktat

Identifikasi

morfologi BAL

Uji aktivitas

enzim dengan

spektro UV Vis

Produksi enzim

b galaktosidase

Isolate BAL yang dapat

menghasilkan enzim

B galaktosidase

13

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi

Hasil determinasi yang diperoleh di Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia Cibinong menyatakan bahwa sampel yang diperoleh dari Pasar

Klender, Jakarta Timur adalah benar buah sirsak (Annona muricata L.).

B. Fermentasi Buah Sirsak

Pada tahap awal proses fermentasi, daging buah sirsak dibungkus dengan daun

pisang dan disimpan dalam wadah fermentasi selama 72 jam secara anaerob karena

bakteri asam laktat bersifat anaerob fakultatif. Sirsak yang digunakan adalah sirsak yang

telah matang dengan ciri-ciri duri sirsak tidak tajam lagi, dipegang terasa empuk dan

kulit sirsak berubah menjadi hijau buram. Daging buah sirsak diambil menggunakan

pinset yang sudah steril lalu dibungkus dengan daun pisang karena daun pisang dapat

menghalangi cahaya yang masuk, hal itu merupakan salah satu syarat untuk terjadinya

fermentasi (Suprapti 2003). Kandungan polifenol pada daun pisang juga dapat

menghambat pertumbuhan bakteri lain dan akan lebih memaksimalkan proses

fermentasi. Proses fermentasi ini dilakukan dengan tujuan untuk meningkatkan jumlah

bakteri asam laktat yang tumbuh secara spontan karena adanya nutrisi untuk

pertumbuhan bakteri asam laktat yang terkandung dalam buah sirsak terutama

karbohidrat berupa glukosa, fruktosa atau sukrosa (Utami 2011). Karbohidrat tersebut

akan terurai menjadi senyawa-senyawa sederhana seperti asam laktat, asam asetat, asam

propionat dan etil alkohol (Sari 2013).

Hasil fermentasi setelah 72 jam menunjukkan terjadinya perubahan pH dari sebelum

dan sesudah fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) yaitu dari pH 5 menjadi 4

(Tabel 1.). Terjadinya perubahan pH ini disebabkan karena peningkatan jumlah mikroba

penghasil asam sehingga terjadi proses oksidasi anaerobik pada saat fermentasi yang

menghasilkan alkohol serta beberapa senyawa asam (Sari 2013). Proses fermentasi juga

memberikan perubahan secara organoleptis terhadap buah sirsak seperti warna, rasa,

bau dan serat sirsak. Buah sirsak yang telah difermentasi akan menghasilkan perubahan

warna dari putih menjadi putih kekuningan, dengan rasa dan bau seperti tape namun

khas sirsak. Sebelum fermentasi, daging buah sirsak terlihat lebih berserat namun

setelah proses fermentasi teksturnya terasa lebih lunak (Tabel 1.). Peningkatan jumlah

14

bakteri asam laktat selama fermentasi menunjukkan terjadinya seleksi pertumbuhan

yang dapat disebabkan karena terjadi perubahan kondisi pada saat fermentasi.

C. Isolasi Bakteri Asam Laktat

Pada tahap awal isolasi bakteri asam laktat, buah sirsak yang telah difermentasi

dimasukkan ke dalam medium MRSB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.

Hasil inkubasi menunjukkan terjadinya kekeruhan pada media dari kondisi sebelumnya

yang bewarna coklat jernih. Perubahan kekeruhan ini terjadi akibat pertumbuhan bakteri

asam laktat dan peningkatan senyawa asam laktat yang dihasilkan oleh bakteri tersebut

yang diekskresikan keluar sel, sehingga terakumulasi dalam cairan fermentasi yang

akhirnya menyebabkan terbentuknya endapan (Sari 2013). Dalam melakukan isolasi

dilakukan beberapa proses sampai didapatkan kultur murni isolat bakteri asam laktat.

Proses yang dilakukan meliputi pengenceran dengan rentang pengenceran 10-1 sampai

10-9. Hal ini bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang

tersuspensi dalam cairan. Larutan pengenceran yang digunakan adalah pepton water

yang berguna sebagai sumber karbon nitrogen dan vitamin untuk pertumbuhan dan

perkembangan bakteri dalam menghasilkan enzim yang diharapkan (Prihantini 2013).

15

Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya

hasil pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat

dalam hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Medium MRSA merupakan medium selektif

untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Teknik isolasi dilakukan dengan menggunakan

metode sebar agar koloni yang tumbuh dapat tersebar secara merata pada bagian

permukaan agar, sehingga memudahkan dalam pengambilan koloni bakteri. Suspensi

bakteri yang telah disebar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC yang merupakan suhu

optimum untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Setelah inkubasi selama 48 jam,

didapatkan jumlah koloni pada hasil sebar pengenceran 10-9 sebanyak 2 koloni

sehingga kedua koloni tunggal tersebut yang diambil untuk proses pemurnian. Hasil

sebar pada pengenceran 10-8 didapatkan 5 koloni, namun hanya 3 koloni tunggal terbaik

yang diambil sedangkan hasil sebar pada pengenceran 10-7 diambil 1 koloni tunggal

terbaik dari 52 koloni yang tumbuh.

Pemilihan koloni tunggal berdasarkan bentuk morfologi terbaik yang mencirikan

koloni BAL yaitu bulat, cembung, licin, dan bewarna putih susu. Keenam koloni

tunggal yang diambil harus dilakukan pemurnian terlebih dahulu untuk mendapatkan

isolat bakteri asam laktat yang murni dengan menggunakan metode gores kuadran

karena metode tersebut lebih mudah untuk mendapatkan koloni tunggal dibandingkan

metode gores lainnya. Isolat bakteri asam laktat yang telah murni disimpan sebagai stok

pada medium MRSA slant dalam tabung reaksi dan diberikan kode isolat SM1 yang

berasal dari pengenceran 10-7. Kode isolat SM2, SM3 dan SM4 berasal dari

pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode isolat SM5

dan SM6. Stok isolat disimpan untuk pengujian ke tahap selanjutnya.

D. Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

Isolat bakteri asam laktat yang telah murni selanjutnya dilakukan pengujian

karakterisasi. Uji karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan 2 cara yaitu

identifikasi makroskopik dan mikroskopik. Pada identifikasi makroskopik, koloni

bakteri yang tumbuh diamati warna, bentuk, tepian dan elevasi dari koloni. Koloni

bakteri asam laktat yang diamati morfologinya adalah koloni yang tumbuh pada

medium MRSA dalam cawan petri.

16

Berdasarkan data pada Tabel 3 diketahui keenam isolat bakteri yang diperoleh dari

fermentasi buah sirsak memiliki kesamaan morfologi baik makroskopik maupun

mikroskopik. Hasil identifikasi secara makroskopik memperlihatkan hasil berupa isolat

koloni bewarna putih susu, bentuk bulat, tepian licin dan elevasi cembung, dengan hasil

mikroskopik yang menunjukkan sel bakteri bewarna ungu (Gram positif) dan berbentuk

basil. Isolat BAL hasil isolasi dari fermentasi buah sirsak ini menunjukkan gambaran

morfologi makroskopik dan mikroskopik yang sama dengan BAL pada penelitian

sebelumnya yang berasal dari buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011; Ibrahim 2015).

E. Produksi Enzim β-Galaktosidase

Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan pada medium MRSB yang telah

ditambahkan laktosa 1%. Laktosa sebagai sumber energi, karbon, dan induser enzim ß-

galaktosidase (Kilara & Shahani 1975). Medium MRSB mengandung pepton, beef

extract, Yeast extract, tween 80, magnesium sulfat dan mangan sulfat yang dibutuhkan

untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Pepton dan beef extract berfungsi sebagai

sumber karbon, nitrogen, dan vitamin untuk pertumbuhan bakteri. Yeast extract sebagai

sumber vitamin dan asam amino. Tween 80 sebagai surfaktan untuk membantu

penyerapan nutrien oleh bakteri asam laktat.

Magnesium sulfat dan mangan sulfat merupakan sumber kation yang digunakan

untuk metabolisme (Man et al. 1960). Pada saat produksi, bakteri asam laktat dibiakan

pada medium MRSB selama 24 jam. Menurut Prihantini (2013), inkubasi selama 24

jam merupakan waktu produksi enzim β-galaktosidase yang optimum. Pada fase

tersebut, sel membelah dengan laju konstan, jumlah masa menjadi dua kali lipat dengan

laju yang sama, aktivitas metabolit konstan dan menghasilkan enzim untuk

17

pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986). Enzim ß-galaktosidase pada bakteri asam laktat

merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan dinding sel (Huang et

al. 1993). Proses pemecahan dinding sel diawali dengan pemanenan bakteri asam laktat

yang dilakukan dengan cara sentrifugasi. Teknik sentrifugasi akan memisahkan sel dari

larutan media sehingga sel akan mengendap dalam media. Sentrifugasi dilakukan

dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC agar tidak terjadi

kerusakan enzim. Sel yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer fosfat 0.1

M pH 7 agar terbebas dari pengotor yang berasal dari media.

Pemecahan dinding sel dilakukan dengan metode sonikasi. Sonikasi adalah salah

satu metode yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan metode lain untuk

gangguan dinding sel bakteri (Engler 1985) dan terbukti lebih efektif untuk melepaskan

β-gal (Toba et al. 1990; Sakakibara et al. 1994). Enzim kasar diperoleh dengan cara

sentrifugasi dengan mengambil bagian supernatan. Data volume supernatan yang

diperoleh pada penelitian ini dapat dilihat pada tabel 4.

F. Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase

Enzim kasar yang telah didapatkan dari tahap produksi segera dilakukan pengujian

aktivitas enzim β-galaktosidase menggunakan substrat kromogenik yaitu o-nitrophenyl-

ß-D-Galactoside (ONPG). Senyawa ONPG tidak berwarna, namun dengan adanya β-

Galaktosidase, diubah menjadi galaktosa dan o- nitrophenol. O-nitrophenol berwarna

kuning dan bisa diukur penyerapannya pada panjang gelombang 420 nm. Jika

konsentrasi ONPG cukup tinggi, maka jumlah o-nitrophenol yang dihasilkan sebanding

dengan jumlah enzim β-galaktosidase yang ada pada saat enzim β-galaktosidase

bereaksi dengan ONPG. Reaksi dihentikan dengan menambahkan larutan Na2CO3, yang

mengubah pH larutan menjadi basa yaitu sekitar pH 10-11 karena pada pH ini enzim ß-

18

galaktosidase tidak aktif (Yuningtyas 2008). Intensitas warna kuning yang dihasilkan

dari ONP dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi enzim. Jumlah ONP yang

terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada λ = 420 nm (Miller 1972).

Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan pembuatan kurva standar

ONP terlebih dahulu dengan rentang konsentrasi 0-2.5mM untuk menentukan

konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat yang akan diuji. Satu

unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam banyaknya enzim yang

diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat ONPG per menit pada kondisi

percobaan (Miller 1972). Aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dari buah sirsak

dibandingkan dengan bakteri pembanding yaitu Bakteri Lactobacillus plantarum.

Bakteri Lactobacillus plantarum digunakan sebagai pembanding karena bakteri ini

mempunyai aktivitas enzim β- galaktosidase yang cukup tinggi (Prihantini 2013).

Berdasarkan hasil percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh

dari bakteri pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat

yaitu 0,776 U/ml. Nilai aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat

SM6 yaitu 0,292 U/ml, sedangkan nilai aktivitas enzim β- galaktosidase terendah

dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu 0,232 U/ml. Nilai aktivitas enzim rata-rata isolat

bakteri asam laktat dan bakteri pembanding kecil, hal ini disebabkan karena waktu dan

kondisi yang diukur belum optimum serta masih banyak enzim lain selain enzim ß-

galaktosidase yang terdapat dalam ekstrak enzim kasar tersebut.

G. Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase

Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford, yaitu

untuk mengukur konsentrasi protein total secara kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam

19

uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue G250 (CBBG) yang

berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan

warna (kebiruan) dengan absorbansinya diukur pada λ 595 nm. Ikatan antara zat warna

CBBG dan protein dapat terjadi karena adanya gaya van der walls antara keduanya.

Gaya van der walls ini terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik

mengikat bagian zat warna dari CBBG yang bersifat non polar dan mengakibatkan zat

warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian hidrofobik protein. Kompleks warna

biru pada larutan yang diberi reagen Bradford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil

karena antara zat warna dan protein terdapat kekuatan ionik yang memperkuat ikatan

antara keduanya sehingga membuat zat warna tersebut menjadi stabil (Ninfa et al.

2009). Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginine dan bereaksi dengan

histidin, lisin, tirosin, triptofan dan residu fenilalanin (Bintang 2010) yang mungkin

terkandung dalam ekstrak enzim kasar. Jumlah CBBG yang terikat pada protein

proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein.

Penentuan panjang gelombang maksimum digunakan larutan standar Bovine Serum

Albumin (BSA) dengan konsentrasi 400 ppm. Setelah dilakukan pengukuran, panjang

gelombang maksimum berada pada 595,0 nm dengan absorbansi sebesar 0,8236. Data

hasil pengukuran panjang gelombang maksimum kemudian ditentukan konsentrasi

minimum dan maksimum untuk membuat kurva kalibrasi untuk mengetahui linieritas

hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan absorbansinya. Rentang

konsentrasi untuk pembuatan kurva kalibrasi BSA yaitu 73 ppm, 158 ppm, 243 ppm,

328 ppm, dan 413 ppm. Uji protein keenam isolat bakteri asam laktat dan bakteri

pembanding dilakukan secara triplo. Kadar protein tertinggi ditunjukan pada isolat

bakteri SM6 yang memiliki nilai rata-rata kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml,

sedangkan yang terendah ditunjukan pada isolat bakteri SM3 yaitu sebesar 0,6690

mg/ml (Tabel 6.). Jika dibandingkan dengan kadar protein L. plantarum, kadar protein

keenam isolat lebih rendah. Hal ini disebabkan oleh tingginya produksi enzim pada

L.plantarum.

21

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan keenam isolat

bakteri asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase namun

isolat SM6 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar

0,8092 mg/ml.

B. Saran

Untuk penelitian berikutnya, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kondisi

optimum pada produksi enzim β-galaktosidase sehingga dapat menghasilkan enzim β-

galaktosidase yang maksimal serta dilakukan pemurnian enzim untuk mendapatkan

aktifitas enzim β-galaktosidase yang lebih tinggi.

22

BAB VI

LUARAN YANG DICAPAI

Nama Jurnal Al-Kauniyah

Website Jurnal journal.uinjkt.ac.id/index.php/kauniyah/user

Status Makalah Submitted

Jenis Prosiding -

Tanggal Submit 2 Mei 2020

Nama Jurnal JURNAL PSR UI

Website Jurnal http://psr.ui.ac.id/index.php/journal/user

Status Makalah Submitted

Jenis Prosiding -

Tanggal Submit 24 FEBRUARI 2020

https://bicfh2019.com/

23

BAB VII. RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI

Hasil penelitian yang telah didapatkan merupakan pengembangan ilmu dari

mikrobiologi dimana didapatkan sumber alami bakteri asam laktat yang berasal dari

fermentasi buah sirsak yang memiliki keunggulan dibandingkan sumber bakteri asam

laktat yang lain, seperti dari buah sirsak atau buah2an yang tanpa proses fermentasi.

Keunggulannya yaitu terjadinya reaksi enzimatis yang lebih optimum pada buah sirsak

yang melalui proses fermentasi, karena pada proses fermentasi dilakukan penyesuaian

lingkungan hidup dari bakteri asam laktat tersebut. Sehingga reaksi enzimatis yang

optimal tersebut dapat meningkatkan jumlah dari bakteri asam laktat dan meningkatkan

kualitas dari bakteri asam laktat yang di hasilkan. Selain itu juga merupakan

pengembangan ilmu biokimia, dimana pada penelitian ini didapatkan sumber enzim beta

galaktosidase bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak yang sebelumnya belum

pernah dilakukan atau diteliti.

Setelah dilakukannya penelitian ini, peneliti akan melanjutkan untuk melakukan

optimasi aktivitas enzim beta galactosidase yang dihasilkan dari bakteri asam laktat

fermentasi buah sirsak, sehingga nantinya dapat digunakan sebagai kondisi atau bahan

pertimbangan dalam menghasilkan produk kesehatan yang berasal dari enzim beta

galactosidase bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak. Selain itu peneliti juga

akan melakukan uji aktifitas morfologi dan optimasi terhadap bakteri asam laktat serta

enzim beta galactosidase yang dihasilkan pada berbagai parameter.

24

DAFTAR PUSTAKA

Alimsardjono L, Purwono PB. 2015. Buku ajar Pemeriksaan Mikrobiologi Pada

Penyakit Infeksi. Sagung Seto, Jakarta. Hlm. 30-31

Aurand LW, Woods AE, Wells MR. 1987. Food Composition and Analysis. Van

Nostrand Reinhold. New York. Hlm. 307

Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta. Hlm. 103-104

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of

microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Journal Analytical Biochemistry. 1(72): 248-254

Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 1985. Ilmu Pangan, Terjemahan:

Purnomo H, Adiono, Food Science. Jakarta.

Campbell AK, Waud JP, Matthews SB. 2005. The Molecular Basis of Lactose

Intolerance. Journal Science Progress. 88(3): 157-202

Candra JI. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Produk Bekasam

Ikan Bandeng (Chanos Chanos). Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Hlm. 38

Desniar, Rusmana I, Suwanto A, Mubarik NR. 2012. Senyawa antimikroba yang

dihasilkan oleh bakteri asam laktat asal bekasam. Skripsi. Departemen Biologi,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor,

Bogor. Hlm. 2

Diniyah N, Subagio A, Fauzi M. 2013. Produksi Minuman Fungsional Sirsak (Annona

muricata L.) dengan Fermentasi Bakteri Asam Laktat. Jurnal Fakultas

Teknologi Pertanian Universitas Jember. Hlm. 1007-1012

Engler CR. 1985. Disruption of microbial cells. Journal comprehensive Biotechnology,

(Second Edition). Pergamon, UK. (2): 305–324

Fazriyani R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim β-

galaktosidase dari Buah Durian. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains

Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka. Jakarta.

Fueller R. 1989. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology . 5(66):

365-378

Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi dasar dalam praktek teknik dan prosedur dasar

laboratorium. Gramedia, Jakarta.

Hariana A. 2007. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya seri 3. Penebar Swadaya, Jakarta.

Hlm. 89-90

Harti AS. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika, Yogyakarta.

1(16): 109-111

25

Hartono LK. 2013. Purifikasi parsial dan karakterisasi β-galaktosidase dari isolat bakteri

asam laktat (BAL) strain b134. Skripsi. Fakultas matematika dan ilmu

pengetahuan alam Institut pertanian bogor, Bogor. Hlm. 4-6

Hermawan AW, Wikandari PR. 2016. Pengaruh jenis kultur starter bakteri asam laktat

terhadap karakteristik soyghurt. UNESA Journal of Chemistry Vol. 5 No.1.

Departemen kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Negeri Surabaya, Surabaya. Hlm. 14

Huang DQ, Prevost H, Divies C. 1995. Principal characteristics of ß-galactosidase from

Leuconostoc spp. J Int Dairy. 1(5): 29-43

Ibrahim A, Fridayanti A, Delvia F. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat

(BAL) dari Buah Mangga (Mangifera indica L.). Jurnal Ilmiah Manuntung.

Laboratorium Penelitian dan Pengembangan FARMAKA TROPIS. Fakultas

Farmasi Universitas Mulawarman. Kalimantan Timur. 1(2): 159-163

Irma A, Dwyana Z, Haedar N. 2010. Efektivitas antimikroba bakteri probiotik dari usus

itik pedaging Anas domesticus terhadap pertumbuhan Vibrio spp. Jurnal

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin,

Makassar. Hlm: 4

ISO International Standardisation Organisation. Microbiology of food and animal

feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic

acid bacteria - Colony-count technique at 30°C. ISO 15214:1998

Karmana O. 2008. Biologi untuk kelas XII semester 1 sekolah menengah atas.

Grafindo Media Pratama, Bandung.

Khusniati T, Aditya AT, Choliq A, Sulistiani. 2013. Characterization and identification

of the best screened indigenous lactic acid bacteria producing β-galactosidase.

Knowledgee Publishing Services. High School of Industrial Technology and

Pharmacy, Bogor. Hlm: 441

Khusniati T, Mariyani N, Lioe HN, Faridah DN, Choliq A. 2015. Purifikasi parsial dan

karakterisasi β-galaktosidase Lactobacillus plantarum B123 indigenos dan

hidrolisis laktosa untuk produksi susu ultra high temperature rendah laktosa.

Jurnal Departemen Teknologi Pangan, FATETA, Universitas Pertanian

Bogor, Bogor. Hlm: 2

Kilara A, Shahani KM. 1975. Lactase activity of cultured and acidified dairy products.

Jurnal Dairy Sci. 59(12): 2031-2035

Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β-

galactosidase from Lactobacillus Indigen B5. Process Biochemistry. 2(44):

232-236

Man JC, de RM, Sharpe ME. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli. Dalam

: Jurnal appl. Bact. 23(1): 130-135

26

Mardalena. 2016. Fase Pertumbuhan Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Tempoyak Asal

Jambi yang Disimpan Pada Suhu Kamar. Jurnal Sain Peternakan Indonesia

Vol. 11 No. 1, ISSN 1978-3000. Fakultas Peternakan Universitas Jambi, Jambi.

Hlm: 59-61

Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC, Jakarta.

Hlm. 98

Miller J. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory,

New York.

Nur F, Hafsan, Wahdiniar A. 2015. Isolasi Bakteri Asam Laktat Berpotensi Probiotik

pada Dangke, Makanan Tradisional dari susu Kerbau di Curio Kabupaten

Enrekang. Jurnal Biogenesis, ISSN 2302-1616 Vol.3 No. 1. Fakultas Sains dan

Teknologi, UIN Alaudin, Malang. 1(3): 60-65

Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Terjemahan: Hadioetomo

RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. UI Press, Elements of Microbiology.

Prasad, L. N., Ghosh, B. C., Sherkat, F. and Shah, N. P. 2013. Extraction and

characterisation of β-galactosidase produced by Bifidobacterium animalis spp.

lactis Bb12 and Lactobacillus delbrueckiispp. Bulgaricus ATCC 11842 grown

in whey. International Food Research Journal. School of Biomedical and

Health Sciences, Victoria University, Australia. 20(1): 487-494

Prihantini NN, Khusniati T, Bintang M, Choliq A, Sulistiani. 2013. Purifikasi Parsial

dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus Plantarum Strain D-210.

Jurnal Kedokteran Yarsi. Universitas Kristen Indonesia, Jakarta. 21(1): 014-

026

Poedjiadi A, Supriyanti FMT. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Press, Jakarta. Sari

YNM, Syukur S, Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA

Bakteri Asam Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari Fermentasi

Markisa Ungu (Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurnal Kimia FMIPA.

Universitas Andalas. Hlm: 84.

Schnurer J, Magnusson J. 2005. Antifungal Lactic Acid Bacteria as biopreservatives.

Journal Trends Food Sci Technol. 16(1): 70-78.

Sinuhaji AB. 2006. Intoleransi Laktosa. Majalah Kedokteran Nusantara. Departemen

Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera

Utara/Rumah Sakit H. Adam Malik, Medan. Hlm. 425

Sudjijo. 2014. Mengenal Sirsak Varietas Ratu dan Lokal. Balai Penelitian. Tanaman

Buah Tropika, Solok Sumatera Barat.

Sunatmo TI. 2007. Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium. Ardy Agency,

Bogor.

27

Suprapti L. 2003. Pembuatan Tempe. Kanisius, Yogyakarta.

Surono IS. 2004. Probiotik: Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya, Jakarta.

Syamsuhidayat SS, Hutapea JR. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia, edisi kedua,

Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Toba T, Hayasaka I, Taguchi S, Adachi S. 1990. A new method for manufacture of

lactose-hydrolysed fermented milk. Journal of Science Food Agriculture.

52(3): 403–407

Utami DA, Syukur S, Darma A. 2011. Karakterisasi Molekular Bakteri Asam Laktat

(BAL) Probiotik dengan Gen 16s rRNA yang Berpotensi Menghasilkan

Bakteriosin dari Fermentasi Sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera Barat.

Tesis. Universitas Andalas, Padang.

Wati SW. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim β-

galaktosidase dari Buah Tomat. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains


Yulia F. 2014. Isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata

L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya. Skripsi. Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang.

Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi β-galaktosidase bakteri asam laktat dari

makanan hasil fermentasi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

alam Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hlm: 1-2, 5

Zahro F. 2014. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Asal Fermentasi Markisa

Ungu (Pasiflora edulis var. Sims) sebagai Penghasil Eksopolisakarida. Skripsi.

Fakultas Sains dan Teknologi UIN Malang, Malang. Hlm: 3

Zuhud EAM. 2011. Bukti Kedahsyatan Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta: AgroMedia

Pustaka. Hlm: 18

28

LAMPIRAN

Bukti submit jurnal akreditasi sinta 2

29

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM β-GALAKTOSIDASE

BAKTERI ASAM LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK

(ANNONA MURICATA. L)

ISOLATION AND ACTIVITY TEST OF ß-GALACTOSIDASE ENZYME LACTIC ACID BACTERIA FROM FERMENTATION OF SOURSOUP FRUIT (ANNONA

MURICATA. L)

Fitri Yuniarti1*, Wahyu Hidayati1, Septi Setiawati1 , Khansa Nabilah1 1Universitas Muhammadiyah Prof DR Hamka, Jl Delima Raya II/IV Perumnas Klender, Jakarta

Timur.13460

*Corresponding author: [email protected]

Abstrak

Bakteri asam laktat memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase

yang berguna untuk penderita intoleransi laktosa. Salah satu sumber penghasil bakteri asam

laktat adalah buah sirsak (Annona Muricata. L) dengan kandungan glukosa yang cukup

tinggi yang berguna untuk pertumbuhan bakteri asam laktat, terutama pada proses

fermentasi buah sirsak. Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari

fermentasi buah sirsak yang memiliki aktivitas enzim β-galaktosidase. Produksi enzim β-

galaktosidase menggunakan metode sonikasi. Uji aktivitas enzim dilakukan dengan melihat

kemampuan enzim β- Galaktosidase dalam menguraikan laktosa menjadi monosakarida.

Penelitian ini di awali dengan isolasi BAL dari fermentasi buah sirsak, kemudian dilakukan

karakterisasi Bakteri Asam Laktat secara makroskopis dan mikroskopis. Isolat BAL terpilih

dari hasil karakterisasi dilakukan pengukuran aktivitas enzim menggunakan

spektrofotometer visible dengan substrat o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)

dan dilanjutkan uji kadar protein dengan metode Bradford. Hasil isolasi didapatkan 6 isolat

BAL dengan morfologi terbaik. Isolat SM6 memiliki aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,292 U/ml

dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Dari data diatas dapat disimpulkan bahwa buah

sirsak mengandung bakteri asam lakat yang berpotensi menghasilkan enzim β-galaktosidase.

Hasil Penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi tambahan mengenai bahan alam

yang menjadi sumber Bakteri Asam Laktat penghasil enzim β- Galaktosidase yang nantinya

dapat dimanfaatkan bagi penderita intoleransi laktosa.

Kata kunci: Bakteri asam laktat; buah sirsak (annona muricate. L.); enzim β-

galaktosidase; fermentasi.

Abstract

Lactic acid bacteria have the ability to produce β-galactosidase enzymes that are useful for

patients with lactose intolerance. One source of producing lactic acid bacteria is soursop

(Annona Muricata. L) with a fairly high glucose content which is useful for the growth of lactic

acid bacteria, especially in the fermentation process of soursop fruit. This study aims to obtain

lactic acid bacterial isolates from soursop fruit fermentation that has β-galactosidase enzyme

activity. The production of the β-galactosidase enzyme uses the sonication method. Enzyme

activity testing is done by looking at the ability of the β-galactosidase enzyme in breaking

down lactose into monosaccharides. This research began with BAL isolation from soursop

fermentation, then macroscopic and microscopic characterization of Lactic Acid Bacteria.

LAB isolates selected from the results of the characterization were measured by enzyme

activity using a visible spectrophotometer with o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)

mailto:[email protected]

30

substrate and continued with protein content testing using Bradford method. The isolation

results obtained 6 LAB isolates with the best morphology. SM6 isolates had the highest enzyme

activity, 0.292 U / ml with protein content of 0.8092 mg / ml. From the above data it can be

concluded that the soursop fruit contains lactic acid bacteria which has the potential to

produce the β-galactosidase enzyme. The results of this study are expected to be additional

information about natural materials which are the source of Lactic Acid Bacteria producing

β-Galactosidase enzymes which can later be utilized for people with lactose intolerance.

Keywords: Lactic acid bacteria; soursop fruit (annona muricate. L.); β-galactosidase

enzyme;

fermentation.

PENDAHULUAN

Tanaman sirsak (Annona muricata L.) merupakan komoditas hasil pertanian

yang banyak ditanam di Indonesia. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah

sirsak merupakan sumber yang potensial untuk mendapatkan bakteri asam laktat.

Salah satu jenis karbohidrat pada buah sirsak adalah gula pereduksi (glukosa dan

fruktosa), yang merupakan sumber karbon utama bagi mikroorganisme dalam

proses fermentasi (Diniyah dkk. 2013). Menurut Buckle (1987), fermentasi asam

laktat terjadi karena adanya aktivitas bakteri asam laktat yang mengubah glukosa

menjadi asam laktat, sehingga jumlah bakteri asam laktat meningkat selama proses

fermentasi berlangsung yang akan diikuti dengan penurunan pH. Bakteri asam

laktat (BAL) merupakan bakteri Gram-positif yang mengeksresikan asam laktat

sebagai produk akhir fermentasi yang berperan sebagai preservasi bahan makanan

(Schnurer dan Magnusson 2005). Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah

satu kelompok bakteri yang mempunyai enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat

dehidrogenase (Surono 2004). Enzim β- galaktosidase merupakan enzim yang

menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-

galaktosida pada ujung nonreduksi β-D-galaktosa. Secara alamiah, enzim β-

galaktosidase (laktase) terdapat pada usus halus manusia (Campbell et al. 2005).

Kekurangan laktase sementara pada individu dengan kadar β- galaktosidase normal

juga dapat diakibatkan oleh kerusakan pada lapisan usus yang disebabkan oleh

infeksi virus atau bakteri, kemoterapi kanker, kondisi alergi atau autoimun dan

penurunan β- galaktosidase yang terkait dengan penuaan (Sinuhaji 2006).

Enzim β-galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk

mengatasi masalah intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase.

Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan

galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah (Marsh dan Riley 1998).

31

Laktosa tidak mudah diserap, tetapi harus dihidrolisis oleh laktase (β-galaktosidase)

menjadi monosakarida (mudah diserap usus). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis

oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut, mulas, kejang perut,

pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Untuk mengurangi masalah tersebut

penderita lactose intolerance dapat mengkonsumsi suplemen β- galaktosidase atau

dengan mengkonsumsi susu rendah laktosa. Karena semakin meningkatnya

penderita intoleransi laktosa pada saat ini, maka perlu dilakukan penelitian dan

ditemukan sumber-sumber baru penghasil enzim ß-galaktosidase yang terdapat

dialam yang nantinya bisa digunakan sebagai produk atau suplemen kesehatan bagi

penderita intoleransi laktosa.


lain mikroorganisme, tanaman, dan hewan. Enzim β-galaktosidase juga dapat

diisolasi dari ragi kelompok Kluyveromyces sp. dan fungi kelompok Aspergillus sp.

(Harti 2015). Dibandingkan dengan sumber tanaman dan hewan, enzim yang

diisolasi dari mikroorganisme lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan setelah

disekresikan ke dalam media pertumbuhan mikroorganisme (Radji 2009). Informasi

mengenai BAL yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayur telah banyak

dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah

sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014)

yang telah berhasil mengisolasi 7 isolat BAL. Namun, isolasi BAL yang berpotensi

penghasil enzim β-galaktosidase pada fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.)

belum pernah dilakukan. Mengingat banyaknya manfaat dari BAL dan enzim ß-

galaktosidase terhadap kesehatan maka perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang

isolasi BAL penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi buah sirsak (Annona

muricata L.). Berdasarkan hal ini diharapkan bakteri asam laktat yang berhasil di

isolasi pada penelitian ini dapat dijadikan sebagai sumber baru dalam menghasilkan

enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita

intoleransi laktosa. Selain itu buah sirsak hasil fermentasi juga membawa dampak

positif di dalam dunia industri dan kesehatan karena akan mengasilkan buah sirsak

probiotik yang baik untuk usus yang mengkonsumsinya.

MATERIAL DAN METODE

Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak

32

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah buah sirsak lokal (Annona

muricata L.) matang yang diperoleh dari Pasar Klender. Sebelum dilakukan isolasi,

buah sirsak difermentasi terlebih dahulu dengan cara isi buah dikeluarkan dan

dibungkus dengan daun pisang steril, ditempatkan dalam wadah fermentasi dan

dikondisikan agar udara tidak masuk. Fermentasi dilakukan pada suhu ruang selama

72 jam (Sari 2013). Hasil fermentasi ditimbang sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam

45 mL MRSB, lalu dihomogenkan sehingga didapatkan pengenceran 10-1.

Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, sampel

diencerkan menggunakan media pepton water hingga pengenceran 10-9. Dari

pengenceran 10-9, diambil 100 µl sampel dan ditanam dengan metode sebar pada

cawan petri yang telah berisi media MRS Agar. Inokulum disimpan dalam anaerob

jar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 37ºC.

Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan BAL yaitu bulat licin berwarna

putih dipindahkan ke media MRS Agar baru untuk pemurnian koloni dengan metode

streak yaitu dengan menggunakan jarum ose kemudian diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37ºC (Purwati et al. 2005).

Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan secara makroskopis yaitu

identifikasi morfologi bakteri asam laktat dan secara mikroskopis/pewarnaan gram.

Produksi Enzim β-galaktosidase

Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari MRSA slant dipindahkan ke dalam media

produksi yang sudah disterilisasi (MRSB dengan kandungan laktosa 1% dan pH

medium: 8). Kemudian media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sel

dipanen dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit

pada suhu 4°C. Peletnya dicuci sebanyak dua kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH

7. Kemudian pemecahan sel dengan sonikator selama 5 menit pada suhu 4°C.

Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada

suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase kasar

(Fazriyani 2015).

Uji Aktivitas Enzim β-galaktosidase

Uji aktivitas ß-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1000 µL buffer

33

fosfat 0,1 M pH 7 dan 100 µL enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu

diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 200 µL o-

nitrofenil-ß-D-galaktopiranosida (oNPGal) 4 mg/mL dan diinkubasi pada suhu

37°C selama 15 menit. Pada menit ke-15 ditambahkan 1000 µL Na2CO3 1 M.

Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 420 nm (Lu et al. 2009).

Penentuan Kadar Protein

Sebanyak 20 µL enzim β-galaktosidase ditambahkan 1 ml larutan Bradford.

Larutan dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya

pada λ 595 nm. Absorbansi yang diperoleh dikonversikan pada persamaan garis dari

kurva standar BSA yang telah dibuat, sehingga dapat diperoleh kadar protein dari

enzim β-galaktosidase (Fazriyani 2015).

HASIL

Fermentasi Buah Sirsak

Pada tahap awal proses fermentasi, dilakukan secara anaerob karena bakteri

asam laktat bersifat anaerob fakultatif. Proses fermentasi ini dilakukan dengan

tujuan untuk meningkatkan jumlah bakteri asam laktat yang tumbuh secara spontan

karena adanya nutrisi untuk pertumbuhan bakteri asam laktat yang terkandung

dalam buah sirsak terutama karbohidrat berupa glukosa, fruktosa atau sukrosa

(Utami 2011). Karbohidrat tersebut akan terurai menjadi senyawa-senyawa

sederhana seperti asam laktat, asam asetat, asam propionat dan etil alkohol (Sari

2013).

Hasil fermentasi setelah 72 jam menunjukkan terjadinya perubahan pH dari

sebelum dan sesudah fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) . Terjadinya

perubahan pH ini disebabkan karena peningkatan jumlah mikroba penghasil asam

sehingga terjadi proses oksidasi anaerobik pada saat fermentasi yang menghasilkan

alkohol serta beberapa senyawa asam (Sari 2013). Proses fermentasi juga

memberikan perubahan secara organoleptis terhadap buah sirsak seperti warna, rasa,

bau dan serat sirsak.

Isolasi Bakteri Asam Laktat

34

Dalam melakukan isolasi dilakukan beberapa proses sampai didapatkan kultur

murni isolat bakteri asam laktat. Proses yang dilakukan meliputi pengenceran dengan

rentang pengenceran 10-1 sampai 10-9. Hal ini bertujuan untuk memperkecil atau

mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Larutan pengenceran

yang digunakan adalah pepton water yang berguna sebagai sumber karbon nitrogen

dan vitamin untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri dalam menghasilkan

enzim yang diharapkan (Prihantini 2013).



dalam hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Teknik isolasi dilakukan dengan

menggunakan metode sebar agar koloni yang tumbuh dapat tersebar secara merata

pada bagian permukaan agar, sehingga memudahkan dalam pengambilan koloni

bakteri. Suspensi bakteri yang telah disebar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC

yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri asam laktat.



dalam hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Pemilihan koloni tunggal berdasarkan

bentuk morfologi terbaik yang mencirikan koloni BAL yaitu bulat, cembung, licin,

dan bewarna putih susu. Isolat bakteri asam laktat yang telah murni disimpan sebagai

stok pada medium MRSA slant dalam tabung reaksi dan diberikan kode isolat SM1

yang berasal dari pengenceran 10-7. Kode isolat SM2, SM3 dan SM4 berasal dari

pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode isolat SM5

dan SM6. Stok isolat disimpan untuk pengujian ke tahap selanjutnya.

35

Gambar 1. Hasil pemurnian bakteri asam laktat


Isolat bakteri asam laktat yang telah murni selanjutnya dilakukan pengujian

karakterisasi. Uji karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan 2 cara yaitu

identifikasi makroskopik dan mikroskopik. Pada identifikasi makroskopik, koloni

bakteri yang tumbuh diamati warna, bentuk, tepian dan elevasi dari koloni. Koloni

bakteri asam laktat yang diamati morfologinya adalah koloni yang tumbuh pada

medium MRSA dalam cawan petri. Hasil identifikasi secara makroskopik

memperlihatkan hasil berupa isolat koloni bewarna putih susu, bentuk bulat, tepian

licin dan elevasi cembung, dengan hasil mikroskopik yang menunjukkan sel bakteri

bewarna ungu (Gram positif) dan berbentuk basil. Isolat BAL hasil isolasi dari

Isolat SM6 Isolat SM5



36

fermentasi buah sirsak ini menunjukkan gambaran morfologi makroskopik dan

mikroskopik yang sama dengan BAL pada penelitian sebelumnya yang berasal dari

buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011; Ibrahim 2015).

Produksi Enzim β-Galaktosidase

Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan pada medium MRSB yang telah

ditambahkan laktosa 1%. Laktosa sebagai sumber energi, karbon, dan induser enzim

ß-galaktosidase (Kilara & Shahani 1975). Pada saat produksi, bakteri asam laktat

dibiakan pada medium MRSB selama 24 jam. Menurut Prihantini (2013), inkubasi

selama 24 jam merupakan waktu produksi enzim β-galaktosidase yang optimum.

Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju konstan, jumlah masa menjadi dua

kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolit konstan dan menghasilkan

enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986). Enzim ß-galaktosidase pada

bakteri asam laktat merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan

dinding sel (Huang et al. 1993). Pemecahan dinding sel dilakukan dengan metode

sonikasi. Sonikasi adalah salah satu metode yang paling banyak digunakan

dibandingkan dengan metode lain untuk gangguan dinding sel bakteri (Engler 1985)

dan terbukti lebih efektif untuk melepaskan β-gal (Toba et al. 1990; Sakakibara et

al. 1994). Enzim kasar diperoleh dengan cara sentrifugasi dengan mengambil bagian

supernatan.

Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase

Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan pembuatan kurva

standar ONP terlebih dahulu dengan rentang konsentrasi 0-2.5mM yang bertujuan

untuk menentukan konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat

yang akan diuji. Satu unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam

banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat

ONPG per menit pada kondisi percobaan (Miller 1972). Berdasarkan hasil

percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari bakteri

pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat yaitu 0,776

U/ml. Nilai aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat SM6

yaitu 0,292 U/ml, sedangkan nilai aktivitas enzim β- galaktosidase terendah

dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu 0,232 U/ml.

37

Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase

Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford. Uji

protein keenam isolat bakteri asam laktat dan bakteri pembanding dilakukan secara

triplo. Kadar protein tertinggi ditunjukan pada isolat bakteri SM6 yang memiliki

nilai rata-rata kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml, sedangkan yang terendah

ditunjukan pada isolat bakteri SM3 yaitu sebesar 0,6690 mg/ml . Jika dibandingkan

dengan kadar protein L. plantarum, kadar protein keenam isolat lebih rendah. Hal

ini disebabkan oleh tingginya produksi enzim pada L.plantarum.

PEMBAHASAN

Pengujian aktivitas enzim β-galaktosidase menggunakan substrat kromogenik

yaitu o-nitrophenyl-ß-D-Galactoside (ONPG). Senyawa ONPG tidak berwarna,

namun dengan adanya β-Galaktosidase, diubah menjadi galaktosa dan o-

nitrophenol. O-nitrophenol berwarna kuning dan bisa diukur penyerapannya pada

panjang gelombang 420 nm. Jika konsentrasi ONPG cukup tinggi, maka jumlah o-

38

nitrophenol yang dihasilkan sebanding dengan jumlah enzim β-galaktosidase yang

ada pada saat enzim β-galaktosidase bereaksi dengan ONPG. Reaksi dihentikan

dengan menambahkan larutan Na2CO3, yang mengubah pH larutan menjadi basa

yaitu sekitar pH 10-11 karena pada pH ini enzim ß-galaktosidase tidak aktif

(Yuningtyas 2008). Aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dari buah sirsak

dibandingkan dengan bakteri pembanding yaitu Bakteri Lactobacillus plantarum.

Bakteri Lactobacillus plantarum digunakan sebagai pembanding karena bakteri ini

mempunyai aktivitas enzim β- galaktosidase yang cukup tinggi (Prihantini 2013).

Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue G250

(CBBG) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam

sehingga memberikan warna (kebiruan) dengan absorbansinya diukur pada λ 595

nm. Ikatan antara zat warna CBBG dan protein dapat terjadi karena adanya gaya van

der walls antara keduanya. Gaya van der walls ini terjadi karena adanya bagian

protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian zat warna dari CBBG yang bersifat

non polar dan mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian

hidrofobik protein. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford

sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil karena antara zat warna dan protein

terdapat kekuatan ionik yang memperkuat ikatan antara keduanya sehingga

membuat zat warna tersebut menjadi stabil. Pereaksi Bradford bereaksi terutama

dengan residu arginine dan bereaksi dengan histidin, lisin, tirosin, triptofan dan

residu fenilalanin (Bintang 2010) yang mungkin terkandung dalam ekstrak enzim

kasar. Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif

yang ditemukan pada protein.

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, didapatkan keenam isolat

bakteri asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase. Ini

membuktikan bahwa isolate bakteri asam laktat yang berasal dari fermentasi buah

sirsak dapat dijadikan sumber baru dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang

bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita intoleransi laktosa.

SIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan keenam

isolat bakteri asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β-

galaktosidase. Isolat SM6 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan

39

kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Untuk penelitian berikutnya, perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut terhadap kondisi optimum pada produksi enzim β-

galaktosidase sehingga dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase yang maksimal

serta dilakukan pemurnian enzim untuk mendapatkan aktifitas enzim β-

galaktosidase yang lebih tinggi.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini dibiayai oleh Lembaga Penelitian dan Pengembangan UHAMKA

Tahun Anggaran 2019-2020.

REFERENSI

Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta. Hlm. 103-104

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of

microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye

binding. Journal Analytical Biochemistry. 1(72): 248-254

Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 1985. Ilmu Pangan, Terjemahan:

Purnomo H, Adiono, Food Science. Jakarta.

Campbell AK, Waud JP, Matthews SB. 2005. The Molecular Basis of Lactose

Intolerance. Journal Science Progress. 88(3): 157-202

Diniyah N, Subagio A, Fauzi M. 2013. Produksi Minuman Fungsional Sirsak

(Annona muricata L.) dengan Fermentasi Bakteri Asam Laktat. Jurnal

Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Jember. Hlm. 1007-1012

Engler CR. 1985. Disruption of microbial cells. Journal comprehensive

Biotechnology, (Second Edition). Pergamon, UK. (2): 305–324

Fazriyani R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim

β-galaktosidase dari Buah Durian. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains


Harti AS. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika, Yogyakarta.

1(16): 109-111

Huang DQ, Prevost H, Divies C. 1995. Principal characteristics of ß-galactosidase

from Leuconostoc spp. J Int Dairy. 1(5): 29-43

Ibrahim A, Fridayanti A, Delvia F. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam

Laktat (BAL) dari Buah Mangga (Mangifera indica L.). Jurnal Ilmiah

Manuntung. Laboratorium Penelitian dan Pengembangan FARMAKA

TROPIS. Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman. Kalimantan Timur.

1(2): 159-163

Kilara A, Shahani KM. 1975. Lactase activity of cultured and acidified dairy

products. Jurnal Dairy Sci. 59(12): 2031-2035

Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β-

40

galactosidase from Lactobacillus Indigen B5. Process Biochemistry.

2(44): 232-236

Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC, Jakarta.

Hlm. 98

Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Terjemahan: Hadioetomo

RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. UI Press, Elements of

Microbiology.

Prihantini NN, Khusniati T, Bintang M, Choliq A, Sulistiani. 2013. Purifikasi Parsial

dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus Plantarum Strain D-

210. Jurnal Kedokteran Yarsi. Universitas Kristen Indonesia, Jakarta.

21(1): 014-026

Sari YNM, Syukur S, Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA

Bakteri Asam Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari

Fermentasi Markisa Ungu (Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurnal

Kimia FMIPA. Universitas Andalas. Hlm: 84.

Schnurer J, Magnusson J. 2005. Antifungal Lactic Acid Bacteria as

biopreservatives. Journal Trends Food Sci Technol. 16(1): 70-78.

Sinuhaji AB. 2006. Intoleransi Laktosa. Majalah Kedokteran Nusantara.

Departemen Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran. Universitas

Sumatera Utara/Rumah Sakit H. Adam Malik, Medan. Hlm. 425

Surono IS. 2004. Probiotik: Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya,

Jakarta.

Toba T, Hayasaka I, Taguchi S, Adachi S. 1990. A new method for manufacture of

lactose-hydrolysed fermented milk. Journal of Science Food Agriculture.

52(3): 403–407

Utami DA, Syukur S, Darma A. 2011. Karakterisasi Molekular Bakteri Asam Laktat

(BAL) Probiotik dengan Gen 16s rRNA yang Berpotensi Menghasilkan

Bakteriosin dari Fermentasi Sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera

Barat. Tesis. Universitas Andalas, Padang.

Yulia F. 2014. Isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona

muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya. Skripsi. Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang.


Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi β-galaktosidase bakteri asam laktat

dari makanan hasil fermentasi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan alam Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hlm: 1-2, 5

41

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM B-GALAKTOSIDASE BAKTERI

ASAM LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK (ANNONA

MURICATA. L)

ISOLATION AND ACTIVITY TEST OF B-GALACTOSIDASE ENZYM LACTIC ACID

BACTERIA FROM FERMENTATION OF SOURSOP FRUIT (ANNONA MURICATA. L)

Fitri Yuniarti1*, Wahyu Hidayati1, Septi Setiawati1 , Khansa Nabilah1 1Universitas Muhammadiyah Prof DR Hamka, Jl Delima Raya II/IV Perumnas Klender, Jakarta Timur.13460

*Corresponding author: [email protected]

Abstrak

Bakteri asam laktat memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang

berguna untuk penderita intoleransi laktosa. Salah satu sumber penghasil bakteri asam laktat adalah

buah sirsak (Annona Muricata. L) dengan kandungan glukosa yang cukup tinggi yang berguna untuk

pertumbuhan bakteri asam laktat, terutama pada proses fermentasi buah sirsak. Penelitian ini bertujuan

mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak yang memiliki aktivitas enzim β-

galaktosidase. Produksi enzim β-galaktosidase menggunakan metode sonikasi. Uji aktivitas enzim

dilakukan dengan melihat kemampuan enzim β- Galaktosidase dalam menguraikan laktosa menjadi

monosakarida. Penelitian ini di awali dengan isolasi BAL dari fermentasi buah sirsak, kemudian

dilakukan karakterisasi Bakteri Asam Laktat secara makroskopis dan mikroskopis. Isolat BAL terpilih

dari hasil karakterisasi dilakukan pengukuran aktivitas enzim menggunakan spektrofotometer visible

mailto:[email protected]

42

dengan substrat o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) dan dilanjutkan uji kadar protein

dengan metode Bradford. Hasil isolasi didapatkan 6 isolat BAL dengan morfologi terbaik. Isolat SM6

memiliki aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Dari data

diatas dapat disimpulkan bahwa buah sirsak mengandung bakteri asam lakat yang berpotensi menghasilkan

enzim β-galaktosidase. Hasil Penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi tambahan mengenai

bahan alam yang menjadi sumber Bakteri Asam Laktat penghasil enzim β- Galaktosidase yang nantinya

dapat dimanfaatkan bagi penderita intoleransi laktosa.

Kata kunci: Bakteri asam laktat; buah sirsak (annona muricate. L.); enzim β-galaktosidase; fermentasi.

Abstract

Lactic acid bacteria have the ability to produce β-galactosidase enzymes that are useful for patients with

lactose intolerance. One source of producing lactic acid bacteria is soursop (Annona Muricata. L) with

a fairly high glucose content which is useful for the growth of lactic acid bacteria, especially in the

fermentation process of soursop fruit. This study aims to obtain lactic acid bacterial isolates from

soursop fruit fermentation that has β-galactosidase enzyme activity. The production of the β-

galactosidase enzyme uses the sonication method. Enzyme activity testing is done by looking at the ability

of the β-galactosidase enzyme in breaking down lactose into monosaccharides. This research began with

BAL isolation from soursop fermentation, then macroscopic and microscopic characterization of Lactic

Acid Bacteria. LAB isolates selected from the results of the characterization were measured by enzyme

activity using a visible spectrophotometer with o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) substrate

and continued with protein content testing using Bradford method. The isolation results obtained 6 LAB

isolates with the best morphology. SM6 isolates had the highest enzyme activity at 0.292 U / ml with

protein content of 0.8092 mg / ml. From the above data it can be concluded that soursop contains lactic

acid bacteria which has the potential to produce β-galactosidase enzymes. The results of this study are

expected to be additional information about natural materials which are the source of Lactic Acid

Bacteria that produce β-galactosidase enzymes which can later be utilized for people with lactose

intolerance..

Keywords:Lactic acid bacteria; soursop fruit (annona muricate. L.); β-galactosidase enzyme;

fermentation.

PENDAHULUAN

Tanaman sirsak (Annona muricata L.) merupakan komoditas hasil pertanian yang banyak

ditanam di Indonesia. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah sirsak merupakan sumber

yang potensial untuk mendapatkan bakteri asam laktat. Salah satu jenis karbohidrat pada buah

sirsak adalah gula pereduksi (glukosa dan fruktosa), yang merupakan sumber karbon utama

bagi mikroorganisme dalam proses fermentasi (Diniyah dkk. 2013). Menurut Buckle (1987),

fermentasi asam laktat terjadi karena adanya aktivitas bakteri asam laktat yang mengubah

glukosa menjadi asam laktat, sehingga jumlah bakteri asam laktat meningkat selama proses

fermentasi berlangsung yang akan diikuti dengan penurunan pH. Bakteri asam laktat (BAL)

merupakan bakteri Gram-positif yang mengeksresikan asam laktat sebagai produk akhir

fermentasi yang berperan sebagai preservasi bahan makanan (Schnurer dan Magnusson 2005).

Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah satu kelompok bakteri yang mempunyai

enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004). Enzim β- galaktosidase

43

merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dengan

memutus ikatan β-galaktosida pada ujung nonreduksi β-D-galaktosa. Secara alamiah, enzim β-

galaktosidase (laktase) terdapat pada usus halus manusia (Campbell et al. 2005). Kekurangan

laktase sementara pada individu dengan kadar β- galaktosidase normal juga dapat diakibatkan

oleh kerusakan pada lapisan usus yang disebabkan oleh infeksi virus atau bakteri, kemoterapi

kanker, kondisi alergi atau autoimun dan penurunan β- galaktosidase yang terkait dengan

penuaan (Sinuhaji 2006).

Enzim β-galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk mengatasi

masalah intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase. Laktosa intoleran adalah

ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim ß-

galaktosidase yang rendah (Marsh dan Riley 1998). Laktosa tidak mudah diserap, tetapi harus

dihidrolisis oleh laktase (β-galaktosidase) menjadi monosakarida (mudah diserap usus). Jika

laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut, mulas,

kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Untuk mengurangi masalah tersebut

penderita lactose intolerance dapat mengkonsumsi suplemen β- galaktosidase atau dengan

mengkonsumsi susu rendah laktosa. Karena semakin meningkatnya penderita intoleransi

laktosa pada saat ini, maka perlu dilakukan penelitian dan ditemukan sumber-sumber baru

penghasil enzim ß-galaktosidase yang terdapat dialam yang nantinya bisa digunakan sebagai

produk atau suplemen kesehatan bagi penderita intoleransi laktosa.

Secara luas, enzim β-galaktosidase dapat diperoleh dari beberapa sumber antara lain

mikroorganisme, tanaman, dan hewan. Enzim β-galaktosidase juga dapat diisolasi dari ragi

kelompok Kluyveromyces sp. dan fungi kelompok Aspergillus sp. (Harti 2015). Dibandingkan

dengan sumber tanaman dan hewan, enzim yang diisolasi dari mikroorganisme lebih mudah

dipisahkan dan dimurnikan setelah disekresikan ke dalam media pertumbuhan mikroorganisme

(Radji 2009). Informasi mengenai BAL yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayur telah

banyak dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah

sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014) yang telah

berhasil mengisolasi 7 isolat BAL. Namun, isolasi BAL yang berpotensi penghasil enzim β-

galaktosidase pada fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) belum pernah dilakukan.

Mengingat banyaknya manfaat dari BAL dan enzim ß-galaktosidase terhadap kesehatan maka

perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang isolasi BAL penghasil enzim β-galaktosidase dari

fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.). Berdasarkan hal ini diharapkan bakteri asam

laktat yang berhasil di isolasi pada penelitian ini dapat dijadikan sebagai sumber baru dalam

menghasilkan enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita

44

intoleransi laktosa. Selain itu buah sirsak hasil fermentasi juga membawa dampak positif di

dalam dunia industri dan kesehatan karena akan mengasilkan buah sirsak probiotik yang baik

untuk usus yang mengkonsumsinya.

MATERIAL DAN METODE

Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah buah sirsak lokal (Annona muricata L.)

matang yang diperoleh dari Pasar Klender. Sebelum dilakukan isolasi, buah sirsak difermentasi

terlebih dahulu dengan cara isi buah dikeluarkan dan dibungkus dengan daun pisang steril,

ditempatkan dalam wadah fermentasi dan dikondisikan agar udara tidak masuk. Fermentasi

dilakukan pada suhu ruang selama 72 jam (Sari 2013). Hasil fermentasi ditimbang sebanyak 5

g dimasukkan ke dalam 45 mL MRSB, lalu dihomogenkan sehingga didapatkan pengenceran

10-1. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, sampel diencerkan

menggunakan media pepton water hingga pengenceran 10-9. Dari pengenceran 10-9, diambil

100 µl sampel dan ditanam dengan metode sebar pada cawan petri yang telah berisi media MRS

Agar. Inokulum disimpan dalam anaerob jar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 48

jam pada suhu 37ºC.

Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan BAL yaitu bulat licin berwarna putih

dipindahkan ke media MRS Agar baru untuk pemurnian koloni dengan metode streak yaitu

dengan menggunakan jarum ose kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC (Purwati

et al. 2005).


Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan secara makroskopis yaitu identifikasi

morfologi bakteri asam laktat dan secara mikroskopis/pewarnaan gram.

Produksi Enzim β-galaktosidase

Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari MRSA slant dipindahkan ke dalam media produksi

yang sudah disterilisasi (MRSB dengan kandungan laktosa 1% dan pH medium: 8). Kemudian

media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sel dipanen dengan cara disentrifugasi

dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Peletnya dicuci sebanyak dua

kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH 7. Kemudian pemecahan sel dengan sonikator selama 5

menit pada suhu 4°C. Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15

menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase kasar

(Fazriyani 2015).

45

Uji Aktivitas Enzim β-galaktosidase

Uji aktivitas ß-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1000 µL buffer fosfat 0,1

M pH 7 dan 100 µL enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu

37°C selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 200 µL o-nitrofenil-ß-D-galaktopiranosida

(oNPGal) 4 mg/mL dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Pada menit ke-15

ditambahkan 1000 µL Na2CO3 1 M. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-

Vis pada panjang gelombang 420 nm (Lu et al. 2009).

Penentuan Kadar Protein

Sebanyak 20 µL enzim β-galaktosidase ditambahkan 1 ml larutan Bradford. Larutan

dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada λ 595 nm.

Absorbansi yang diperoleh dikonversikan pada persamaan garis dari kurva standar BSA yang

telah dibuat, sehingga dapat diperoleh kadar protein dari enzim β-galaktosidase (Fazriyani

2015).

HASIL

Fermentasi Buah Sirsak

Pada tahap awal proses fermentasi, dilakukan secara anaerob karena bakteri asam laktat

bersifat anaerob fakultatif. Proses fermentasi ini dilakukan dengan tujuan untuk meningkatkan

jumlah bakteri asam laktat yang tumbuh secara spontan karena adanya nutrisi untuk

pertumbuhan bakteri asam laktat yang terkandung dalam buah sirsak terutama karbohidrat

berupa glukosa, fruktosa atau sukrosa (Utami 2011). Karbohidrat tersebut akan terurai menjadi

senyawa-senyawa sederhana seperti asam laktat, asam asetat, asam propionat dan etil alkohol

(Sari 2013).

Hasil fermentasi setelah 72 jam menunjukkan terjadinya perubahan pH dari sebelum dan

sesudah fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) . Terjadinya perubahan pH ini disebabkan

karena peningkatan jumlah mikroba penghasil asam sehingga terjadi proses oksidasi anaerobik

pada saat fermentasi yang menghasilkan alkohol serta beberapa senyawa asam (Sari 2013).

Proses fermentasi juga memberikan perubahan secara organoleptis terhadap buah sirsak seperti

warna, rasa, bau dan serat sirsak.

Isolasi Bakteri Asam Laktat

Dalam melakukan isolasi dilakukan beberapa proses sampai didapatkan kultur murni isolat

bakteri asam laktat. Proses yang dilakukan meliputi pengenceran dengan rentang pengenceran

46

10-1 sampai 10-9. Hal ini bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang

tersuspensi dalam cairan. Larutan pengenceran yang digunakan adalah pepton water yang

berguna sebagai sumber karbon nitrogen dan vitamin untuk pertumbuhan dan perkembangan

bakteri dalam menghasilkan enzim yang diharapkan (Prihantini 2013).

Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya hasil

pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat dalam hasil

pengenceran 10-1 sampai 10-6. Teknik isolasi dilakukan dengan menggunakan metode sebar agar

koloni yang tumbuh dapat tersebar secara merata pada bagian permukaan agar, sehingga

memudahkan dalam pengambilan koloni bakteri. Suspensi bakteri yang telah disebar kemudian

diinkubasi pada suhu 37oC yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri asam

laktat.

Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya hasil

pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat dalam hasil

pengenceran 10-1 sampai 10-6. Pemilihan koloni tunggal berdasarkan bentuk morfologi terbaik

yang mencirikan koloni BAL yaitu bulat, cembung, licin, dan bewarna putih susu. Isolat bakteri

asam laktat yang telah murni disimpan sebagai stok pada medium MRSA slant dalam tabung

reaksi dan diberikan kode isolat SM1 yang berasal dari pengenceran 10-7. Kode isolat SM2, SM3

dan SM4 berasal dari pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode

isolat SM5 dan SM6. Stok isolat disimpan untuk pengujian ke tahap selanjutnya.

47

Gambar 1. Hasil pemurnian bakteri asam laktat


Isolat bakteri asam laktat yang telah murni selanjutnya dilakukan pengujian karakterisasi.

Uji karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan 2 cara yaitu identifikasi makroskopik

dan mikroskopik. Pada identifikasi makroskopik, koloni bakteri yang tumbuh diamati warna,

bentuk, tepian dan elevasi dari koloni. Koloni bakteri asam laktat yang diamati morfologinya

adalah koloni yang tumbuh pada medium MRSA dalam cawan petri. Hasil identifikasi secara

makroskopik memperlihatkan hasil berupa isolat koloni bewarna putih susu, bentuk bulat,

tepian licin dan elevasi cembung, dengan hasil mikroskopik yang menunjukkan sel bakteri

bewarna ungu (Gram positif) dan berbentuk basil. Isolat BAL hasil isolasi dari fermentasi buah

sirsak ini menunjukkan gambaran morfologi makroskopik dan mikroskopik yang sama dengan

BAL pada penelitian sebelumnya yang berasal dari buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011;

Ibrahim 2015).




48

Produksi Enzim β-Galaktosidase

Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan pada medium MRSB yang telah ditambahkan

laktosa 1%. Laktosa sebagai sumber energi, karbon, dan induser enzim ß-galaktosidase (Kilara

& Shahani 1975). Pada saat produksi, bakteri asam laktat dibiakan pada medium MRSB selama

24 jam. Menurut Prihantini (2013), inkubasi selama 24 jam merupakan waktu produksi enzim

β-galaktosidase yang optimum. Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju konstan, jumlah

masa menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolit konstan dan

menghasilkan enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986). Enzim ß-galaktosidase pada

bakteri asam laktat merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan dinding sel

(Huang et al. 1993). Pemecahan dinding sel dilakukan dengan metode sonikasi. Sonikasi adalah

salah satu metode yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan metode lain untuk

gangguan dinding sel bakteri (Engler 1985) dan terbukti lebih efektif untuk melepaskan β-gal

(Toba et al. 1990; Sakakibara et al. 1994). Enzim kasar diperoleh dengan cara sentrifugasi

dengan mengambil bagian supernatan.

Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase

Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan pembuatan kurva standar ONP

terlebih dahulu dengan rentang konsentrasi 0-2.5mM yang bertujuan untuk menentukan

konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat yang akan diuji. Satu unit

aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam banyaknya enzim yang diperlukan untuk

menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat ONPG per menit pada kondisi percobaan (Miller 1972).

Berdasarkan hasil percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari bakteri

pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat yaitu 0,776 U/ml. Nilai

aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat SM6 yaitu 0,292 U/ml,

sedangkan nilai aktivitas enzim β- galaktosidase terendah dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu

0,232 U/ml.

49

Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase

Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford. Uji protein

keenam isolat bakteri asam laktat dan bakteri pembanding dilakukan secara triplo. Kadar

protein tertinggi ditunjukan pada isolat bakteri SM6 yang memiliki nilai rata-rata kadar protein

sebesar 0,8092 mg/ml, sedangkan yang terendah ditunjukan pada isolat bakteri SM3 yaitu

sebesar 0,6690 mg/ml . Jika dibandingkan dengan kadar protein L. plantarum, kadar protein

keenam isolat lebih rendah. Hal ini disebabkan oleh tingginya produksi enzim pada

L.plantarum.

PEMBAHASAN

Pengujian aktivitas enzim β-galaktosidase menggunakan substrat kromogenik yaitu o-

nitrophenyl-ß-D-Galactoside (ONPG). Senyawa ONPG tidak berwarna, namun dengan adanya

β-Galaktosidase, diubah menjadi galaktosa dan o- nitrophenol. O-nitrophenol berwarna kuning

dan bisa diukur penyerapannya pada panjang gelombang 420 nm. Jika konsentrasi ONPG

cukup tinggi, maka jumlah o-nitrophenol yang dihasilkan sebanding dengan jumlah enzim β-

galaktosidase yang ada pada saat enzim β-galaktosidase bereaksi dengan ONPG. Reaksi

dihentikan dengan menambahkan larutan Na2CO3, yang mengubah pH larutan menjadi basa

yaitu sekitar pH 10-11 karena pada pH ini enzim ß-galaktosidase tidak aktif (Yuningtyas 2008).

Aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dari buah sirsak dibandingkan dengan bakteri

pembanding yaitu Bakteri Lactobacillus plantarum. Bakteri Lactobacillus plantarum

digunakan sebagai pembanding karena bakteri ini mempunyai aktivitas enzim β- galaktosidase

yang cukup tinggi (Prihantini 2013).

Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue G250 (CBBG) yang

berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna

(kebiruan) dengan absorbansinya diukur pada λ 595 nm. Ikatan antara zat warna CBBG dan

50

protein dapat terjadi karena adanya gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls ini

terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian zat warna dari

CBBG yang bersifat non polar dan mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya

ke bagian hidrofobik protein. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford

sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil karena antara zat warna dan protein terdapat kekuatan

ionik yang memperkuat ikatan antara keduanya sehingga membuat zat warna tersebut menjadi

stabil. Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginine dan bereaksi dengan

histidin, lisin, tirosin, triptofan dan residu fenilalanin (Bintang 2010) yang mungkin terkandung

dalam ekstrak enzim kasar. Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan

muatan positif yang ditemukan pada protein.

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, didapatkan keenam isolat bakteri asam

laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase. Ini membuktikan bahwa

isolate bakteri asam laktat yang berasal dari fermentasi buah sirsak dapat dijadikan sumber baru

dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita

intoleransi laktosa.

SIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan keenam isolat bakteri

asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase. Isolat SM6 memiliki

aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Untuk

penelitian berikutnya, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kondisi optimum pada

produksi enzim β-galaktosidase sehingga dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase yang

maksimal serta dilakukan pemurnian enzim untuk mendapatkan aktifitas enzim β-galaktosidase

yang lebih tinggi.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini dibiayai oleh Lembaga Penelitian dan Pengembangan UHAMKA Tahun

Anggaran 2019-2020.

REFERENSI

Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta. Hlm. 103-104 Bradford MM.

1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Journal Analytical

Biochemistry. 1(72): 248-254

Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 1985. Ilmu Pangan, Terjemahan: Purnomo

H, Adiono, Food Science. Jakarta.

Campbell AK, Waud JP, Matthews SB. 2005. The Molecular Basis of Lactose Intolerance.

51

Journal Science Progress. 88(3): 157-202

Diniyah N, Subagio A, Fauzi M. 2013. Produksi Minuman Fungsional Sirsak (Annona muricata

L.) dengan Fermentasi Bakteri Asam Laktat. Jurnal Fakultas Teknologi Pertanian

Universitas Jember. Hlm. 1007-1012

Engler CR. 1985. Disruption of microbial cells. Journal comprehensive Biotechnology,

(Second Edition). Pergamon, UK. (2): 305–324

Fazriyani R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim β-

galaktosidase dari Buah Durian. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains Universitas

Muhammadiyah Prof. DR. Hamka. Jakarta.

Harti AS. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika, Yogyakarta. 1(16): 109-

111

Huang DQ, Prevost H, Divies C. 1995. Principal characteristics of ß-galactosidase from

Leuconostoc spp. J Int Dairy. 1(5): 29-43

Ibrahim A, Fridayanti A, Delvia F. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL)

dari Buah Mangga (Mangifera indica L.). Jurnal Ilmiah Manuntung. Laboratorium

Penelitian dan Pengembangan FARMAKA TROPIS. Fakultas Farmasi Universitas

Mulawarman. Kalimantan Timur. 1(2): 159-163

Kilara A, Shahani KM. 1975. Lactase activity of cultured and acidified dairy products. Jurnal

Dairy Sci. 59(12): 2031-2035

Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β- galactosidase

from Lactobacillus Indigen B5. Process Biochemistry. 2(44): 232-236

Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC, Jakarta. Hlm. 98

Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Terjemahan: Hadioetomo RS, Imas

T, Tjitrosomo SS, Angka SL. UI Press, Elements of Microbiology.

Prihantini NN, Khusniati T, Bintang M, Choliq A, Sulistiani. 2013. Purifikasi Parsial dan

Karakterisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus Plantarum Strain D-210. Jurnal

Kedokteran Yarsi. Universitas Kristen Indonesia, Jakarta. 21(1): 014-026

Sari YNM, Syukur S, Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA Bakteri Asam

Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari Fermentasi Markisa Ungu

(Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurnal Kimia FMIPA. Universitas Andalas. Hlm:

84.

Schnurer J, Magnusson J. 2005. Antifungal Lactic Acid Bacteria as biopreservatives. Journal

Trends Food Sci Technol. 16(1): 70-78.

Sinuhaji AB. 2006. Intoleransi Laktosa. Majalah Kedokteran Nusantara. Departemen Ilmu

Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera Utara/Rumah Sakit H.

Adam Malik, Medan. Hlm. 425

Surono IS. 2004. Probiotik: Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya, Jakarta.

Toba T, Hayasaka I, Taguchi S, Adachi S. 1990. A new method for manufacture of lactose-

hydrolysed fermented milk. Journal of Science Food Agriculture. 52(3): 403–407

52

Utami DA, Syukur S, Darma A. 2011. Karakterisasi Molekular Bakteri Asam Laktat (BAL)

Probiotik dengan Gen 16s rRNA yang Berpotensi Menghasilkan Bakteriosin dari

Fermentasi Sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera Barat. Tesis. Universitas

Andalas, Padang.

Yulia F. 2014. Isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) dan

penentuan aktivitas antimikrobanya. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang.


Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi β-galaktosidase bakteri asam laktat dari makanan

hasil fermentasi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan alam Institut

Pertanian Bogor, Bogor. Hlm: 1-2, 5

LAPORAN PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)

Documents

Transcript of LAPORAN PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)