LAPORAN

KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBA (BAKTERI Escherichia coli)

DISUSUN OLEH :

Kelompok 1

ANNISA NUR AULIANI : 101431003

ANNISSA APRILLIA :101431004

ANALIS KIMIA 2A

TANGGAL LAPORAN : Kamis, 14 Maret 2012

DOSEN PEMBIMBING : Bintang IM

POLITEKNIK NEGERI BANDUNG

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pertumbuhan merupakan proses bertambahnya ukuran atau subtansi atau masa zat suatu

organisme, misalnya kita makhluk makro ini dikatakan tumbuh ketika bertambah tinggi,

bertambah besar atau bertambah berat. Pada organisme bersel satu pertumbuhan lebih

diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu pertambahan jumlah koloni, ukuran koloni

yang semakin besar atau subtansi atau masssa mikroba dalam koloni tersebut semakin

banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai pertambahan jumlah sel mikroba

itu sendiri. Pertumbuhan merupakan suatu proses kehidupan yang irreversible artinya

tidak dapat dibalik kejadiannya. Pertumbuhan didefinisikan sebagai pertambahan

kuantitas konstituen seluler dan struktur organisme yang dapat dinyatakan dengan

ukuran, diikuti pertambahan jumlah, pertambahan ukuran sel, pertambahan berat atau

massa dan parameter lain. Sebagai hasil pertambahan ukuran dan pembelahan sel atau

pertambahan jumlah sel maka terjadi pertumbuhan populasi mikroba.

Pada mikroba jika ditambahkan larutan esensial (nutrient) pada kondisi (suhu dan

pH) yang sesuai maka akan terjadi pertumbuhan.  Pertumbuhan adalah hasil dari

keduanya (replikasi dan perubahan ukuran sel). Mikroorganisme dapat tumbuh pada

berbagai kondisi  fisik, kimia dan nutrisi.  Dalam medium dengan nutrient yang sesuai,

mikroorganisme mengekstrak nutrient dari medium dan merubahnya menjadi produk

biologi.  Sebagian nutrient digunakan produksi energy dan sebahagian untuk biosintesis

dan pembentukan produk.  Hasil dari pemakaian nutrient adalah bertambah nya biomassa

sel terhadap waktu.

Mikroba tumbuh dalam suatu spektrum lingkungan fisik dan kimiawi yang sangat

luas. Sehingga pertumbuhan dan kegiatan fisiologik lainnya merupakan suatu respon

terhadap lingkungan fisiko-kimiawinya. Pertumbuhan mikroba bukan hanya

menggambarkan pertumbuhan sel aktif, tetapi juga kegiatan sel-sel istirahat dan sel mati.

Pertumbuhan mikrobial biasanya dicirikan dengan waktu yang dibutuhkan untuk

menggandakan massa sel atau jumlah sel. Kinetika pertumbuhan mikroba secara batch

terdiri dari beberapa fasa yang menunjukkan bahwa sel mikroba bervariasi terhadap

waktu. Pada umumnya pertumbuhan diukur dengan peningkatan massa, sehingga laju

pertumbuhan spesifik, µ dapat digunakan. Nilai besaran µX adalah laju pertumbuhan

volumetrik (produktivitas volumetrik) dalam berat/ vol.t.

Pertumbuhan suatu mikroba dapat ditinjau dari dua segi, yaitu pertumbuhan sel

secara individu dimana adanya penambahan volume sel dan pertumbuhan kelompok

sebagai satu populasi dimana merupakan akibat dari adanya pertumbuhan individu , misal

dari satu sel menjadi dua, dari dua menjadi empat dst hingga berjumlah banyak.

Pada pertumbuhan populasi bakteri misalnya, merupakan penggambaran jumlah atau

massa sel yang terjadi pada saat tertentu. Untuk mengkaji pertumbuhan mikroba perlu

dilakukan evaluasi populasi mikroba dengan teknik yang sesuai. Salah satu caranya yaitu

dengan metode yang dilakukan pada praktikum kali ini yaitu penetapan melalui metode

spektrofotometri.

1.2. Tujuan

Secara umum mahasiswa diharapkan :

Berkompeten dalam mengkaji dan memantau fenomena pertumbuhan mikroba.

Secara khusus mahasiswa diharapkan :

Ketrampilan dalam pembuatan kultur mikroba, inokulum/starter, teknik aseptik

dapat dikuasai dengan benar

Ketrampilan untuk melakukan sampling pengukuran populasi sel secara periodik

dapat dilakukan dengan benar

Ketrampilan dalam melakukan evaluasi populasi mikroba dengan berbagai teknik

( berat kering sel, spektrofotometri, kurva baku ) dapat dilakukan dengan benar

Ketrampilan dalam menerapkan hubungan antara jumlah sel (X) dengan waktu (t)

dapat dilakukan dengan benar

Ketrampilan dalam mengkaji fasa-fasa pertumbuhan mikroba dapat dilakukan

dengan benar

Ketrampilan dalam mendapatkan nilai laju pertumbuhan spesifik (µ) dengan

menggunakan grafik ln X terhadap t dapat dilakukan dengan benar

BAB II

DASAR TEORI

Secara umum kinetika pertumbuhan mikroba secara curah (batch) disajikan pada  gambar

1, tipe kurva pertumbuhan meliputi lima fase;

1. fase lag

2. fase log (eksponensial)

3. fase perlambatan

4. fase stationer dan

5. fase kematian

Gambar 3.1 Kurva pertumbuhan untuk populasi mikroorganisme secarabatch

Tipe kurva pertumbuhan untuk populasi bakteri

1. Fase lag

Berlangsung lambat  setelah mokulasi dan secara periodic sel-sel menyesuaikan dengan

lingkungan yang baru.  Pada fase ini terjadi sentesis enzim sel bertambah sangat sedikit tanpa

penambahan densitas jumlah sel, oleh karena itu

x  =  xo   =  tetap

Dimana     xo   =  konsentrasi seluler pada t = 0

                 Laju pertumbuhan (g/l) sama dengan nol

             N  =   dx/dt  = 0

             Laju pertumbuhan spesifik (Nnet)  = nol

      

Umur dari kultur inokulum berpengaruh kuat terhadap lamanya fase lag.  Biasanya

periode fase lag bertambah dengan umur inokulum. Umur meminimal kan durasi fase lag.  Sel-

sel diadaptasikan dengan kondisi media pertumbuhan selama mokulasi sehingga sel-sel menjadi

muda (sel-sel fase eksponensial) dan aktif, jumlah inokulum 5% - 10% volum.  Beberapa industri

fermentasi skala komersial, biasanya waktu fase lag diperpendek untuk memperoleh

produktivitas yang tinggi.

2. Fase eksponensial (exponential phase).

Setelah fase awal selesai, mulai terjadi reproduksi selular, perlahan-lahan makin lama

konsentrasi biomassa meningkat (jumlah sel dan densitas jumlah sel).

Dengan demikian laju reproduksi atau pertumbuhan dx/dt dan laju pertumbuhan spesifik

meningkat.  Pada saat itu laju pertumbuhan atau reproduksi selular mencapai titik maksimum,

maka terjadi pertumbuhan secara legaritrik atau eksponensial.  Pada fase ini keadaan

pertumbuhan adalah mantap.  Dengan laju pertumbuhan spesifik (N tetap), komposisi selular

tetap, sedangkan komposisi kimiawi media biakan berubah akibat terjadinya sintetis produk dan

penggunaan substrat.  Selama fase eksponensial. Laju pertumbuhan dx/dt  meningkat berbanding

dengan x

dx/dt   =  N net   x      dx/dt  = i/x   = N net

x = xo pada t =0

ln x/xo  =  N net t atau x =xo l-N net1

dimana ; x dan xo adalah konsentrasi sel pada waktu t dan t = 0

Pertumbuhan eksponensial dapat disajikan secara grafik semilogaritmik Ln x terhadap waktu.

         Zd  ln2/N net  = 0,693/ N net , Zd = waktu penggandaan

Tabel : Waktu penggandaan dan laju pertumbuhan spesifik berbagai mikroorganisme

   Organisme      Zd (jam)   N net (jam -1)

 Bakteri        0.3       2.3

 Kahmir        1.5     0,46

 Jamur         3     0,23

 Sel tanaman        24     0,0287

3. Fase Stationer (stationary phase)

       Permulaan fase stationer adalah pada akhir dari permulaan fase perlambatan (deceleration

phase),  dimana laju pertumbuhan spesifik adalah nol (tidak ada devision sel).  Selama fase ini

sel-sel masih aktif secara metabolic dan menghasilkan metabolit sekunder.  Metabolit primer

adalah produk yang terkait dengan pertumbuhan (growth related product),  sedangkan metabolit

sekunder tidak terkait dengan pertumbuhan (non – growth – related).  Tapi beberapa produk

metabolit tertentu meningkat selama fase stasioner (c.q antibiotic, beberapa hormone), hal ini

disebabkan oleh deregulasi metabolit. Selama fase stasioner, satu atau lebih fenomena mungkin

terjadi:

1. Total konsentrasi massa sel konstan, tetapi jumlah sel-sel yang hidup berkurang.

2. Lisis sel terjadi, dan massa sel yang hidup turun drastis.  Suatu pertumbuhan fase kedua

meningkatkan.

3. Sel-sel tidak dapat tumbuh tetapi metabolism tetap aktip untuk memproduksi metabolit

sekunder,  metabolit sekunder diproduksi hasil dari deregulasi metabolit.

4. Fase mati (Death phase)

           Pada akhir fase stasioner, nutrient sudah berkurang drastic atau terbentuk dan terjadi

akumulasi produk toksik.  Pada keadaan tersebut permulaan terjadinya fase mati (death phase),

kecepatan fase kematian mengikuti kinetika orde kesatu.

dN/dt  = k ld N atau N = Ns l-k lt

Dimana Ns  = konsentrasi sel pada akhir fase stasioner.. Berdasarkan kajian pertumbuhan

mikroba tersebut dapat ditentukan beberapa parameter pertumbuhan antara lain kofisien

perolehan (randamen).  Contoh fermentasi adalah

Yx /x = x – xo /so – s  atau     \ x/    \s

Dimana           So            =  konsentrasi awal substrat

                         S             =  konsentrasi substrat tersisa (mendekat nol)

                      yx/s            =  dinyatakan dalam gram bobot kering sel (pergram substrat

                                   Yang dikonsumsi)

Selain itu kofisien perolehan (yx / x ) didasarkan pula pada substrat lain atau pembentukan

produk dengan defenisi

Yx / o2  =    \x /    \o2 yp / x =     \p/    \s

Dalam fermentasi curah (batch) fase akuatik yang mengandung mikroba, substrat dan lain-lain

hanya sekali yang dimasukkan ke dalam fermentor, kemudian hasilnya dikeluarkan sekaligus

pada akhir proses, oksigen tertimbun dalam fermentasi dalam berbagai bentuk (biomassa, produk

fermentasi).

BAB III

PERCOBAAN

3.1. Bahan dan Alat yang digunakan

3.1.1. Bahan yang digunakan

10 ml air garam steril

50 ml media cair/ kaldu nutrien steril

50 ml inokulum mikroba yang telah diaktifkan selama 24 jam, suhu ruang di

dalam shaker incubator

400 ml media cair/ kaldu nutrien steril

Satu tabung media agar miring berisi mikroba

Kertas grafik

3.1.2. Alat yang digunakan

Pipet steril 10ml

Erlenmeyer/reaktor 500 ml

Erlenmeyer 250 ml

Kuvet spektrofotometer

Spektrofotometer (spektronik)

Spiritus

Neraca analitik

Shaker incubator

Tissue, label

3.2. Rancangan Percobaan

3.2.1. Pembuatan Inokulum dan Media Pertumbuhan Mikroba

3.3. Prosedur Kerja

Catatan penting : Seluruh tahapan pekerjaan harus dilakukan secara aseptik

3.3.1. Pembuatan inokulum dan media pertumbuhan mikroba

1. Masukkan 10 ml air garam steril kedalam satu buah tabung agar miring yang

berisi kultur mikroba. Kocok perlahan-lahan

2. Masukkan kultur diatas kedalam erlenmeyer yang berisi media cair/kaldu

nutrien sebanyak 90 ml.

3. Aktifkan campuran diatas selam 24 jam pada suhu 300C di dalam shaker

incubator. Campuran ini untuk selanjutnya dinamakan inokulum.

4. Masukkan inokulum ke dalam erlenmeyer/reaktor yang telah berisi 400 ml

media cair nutrien steril.

5. Campuran di dalam reaktor ini untuk selanjutnya disebut media pertumbuhan

mikroba. Media ini digunakan untuk membuat kurva pertumbuhan mikroba.

3.3.2. Pembuatan Kurva Pertumbuhan mikroba dengan metode spektrofotometri

1. Cari panjang gelombang maks (λmax) antara 550 – 650 nm dengan

menggunakan inokulum sebagai larutan standar. Untuk larutan blanko

digunakan media cair nutrien.

2. Buat kurva baku antara absorbansi A terhadap berat sel kering X (mg/ml)

(data telah tersedia)

3. Pada to diambil/disampling sejumlah kultur cair dari reaktor (sesuai dengan

ukuran kuvet). Kemudian diukur absorbansinya (A) pada λmax

4. Reaktor diatas segera diinkubasi di dalam shaker incubator,suhu 30 ºC

5. Ulangi sampling diatas pada 30 menit ke 2 dan seterusnya hingga diperoleh

kurva sampai pada fasa stasioner

catatan : waktu sampling disesuaikan dengan jenis mikroba yang digunakan

6. Plotkan semua data A ke dalam kurva baku sehingga diperoleh nilai berat sel

kering (X)

7. Plotkan semua data berat sel kering (X) diatas terhadap waktu sehingga

diperoleh fasa-fasa pertumbuhan mikroba

8. Ubah nilai X ke ln X sehingga diperoleh hubungan antara ln X dengan t

9. Buat grafik antara lnX terhadap t sehingga didapat tg α = µ

10. Laju pertumbuhan spesifik,µ (t-1 ) dari mikroba dapat ditentukan

3.4. Keselamatan Kerja

Mengingat bahaya serta sifat bahan biologis yang digunakan, maka untuk keselamatan

kerja perlu diperhatikan hal hal tersebut dibawah ini :

Praktikan wajib mengenakan alat keselamatan kerja a.l; lab-jas, masker, penutup kepala,

sarung tangan. Hal ini dilakukan agar mikroba yang akan dibiakkan tidak terhirup.

Memperlakukan kultur mikroba harus hati-hati. Teknik aseptik harus dilakukan dengan

benar sehingga tidak terjadi kontaminasi khususnya bila mikroba yang digunakan bersifat

pathogen.

Menggunakan alat pembakar spiritus harus hati-hati untuk menghindari terjadinya

kebakaran.

Sebelum praktikum dimulai praktikan sangat disarankan sarapan dan minum susu.

BAB IV

PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Pengamatan

Penentuan panjang gelombang maksimum

λ (nm) % T ABSORBANSI (A)

550 18,6 0,730

560 19,4 0,712

570 19,5 0,709

580 19,9 0,701

590 21,3 0,671

600 20,5 0,688

610 20,8 0,681

620 21,3 0,671

630 21,4 0,669

640 21,4 0,669

650 22,7 0,643

540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 6600.58

0.6

0.62

0.64

0.66

0.68

0.7

0.72

0.74

λ (nm)

ABSO

RBAN

SI (A

)

PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM = 550 nm

Data Absorbansi kultur cair (Escherichia coli)

WAKTU (JAM) ABSORBANSI (A)

0 0,105

0,5 0,117

1,0 0,116

1,5 0,120

2,0 0,127

2,5 0,147

3,0 0,171

3,5 0,253

4,0 0,300

4,5 0,209

5,0 0,150

Pembuatan kurva baku antara absorbansi A terhadap berat sel kering X (mg/ml)

berdasarkan data dibawah ini :

ABSORBANSI (A) BERAT SEL KERING (X)

0,06 0,40

0,18 1,09

0,28 1,81

0,39 2,50

0,57 3,72

0,83 5,31

0,92 5,89

1,08 6,90

1,21 7,79

1,34 8,84

Kurva baku ABSORBANSI VS BERAT SEL KERING (data yang tersedia)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.10.20.30.40.50.60.70.80.9

11.11.21.31.41.5

ABSORBANSI (A)

BERA

T SE

L KER

ING

(X)

Dan didapatkan persamaan regresi : y = 6,379 x + 0,0129

Lalu, Absorbansi dari kultur cair yang didapat (sebagai x) diplotkan ke dalam persamaan regresi

diatas sehingga didapat data berat sel kering (sebagai y) sebagai berikut :

WAKTU ( JAM )BERAT SEL KERING

(Escherichia coli) (X)Ln X

0 0,628 -0,382

0,5 0,759 -0,275

1,0 0,752 -0,285

1,5 0,778 -0,251

2,0 0,823 -0,194

2,5 0,950 -0,051

3,0 1,10 0,095

3,5 1,626 0,486

4,0 1,926 0,655

4,5 1,346 0,297

5,0 0,969 -0,031

Kurva BERAT SEL KERING (X) terhadap WAKTU (dilampirkan)

Kurva Ln X terhadap WAKTU (dilampirkan)

4.2. Pembahasan

Pertumbuhan adalah penambahan secara teratur semua komponen sel suatu jasad. Pada

jasad bersel tunggal (uniseluler), pembelahan atau perbanyakan sel merupakan pertambahan

jumlah individu. Misalnya pembelahan sel pada bakteri akan menghasilkan pertambahan jumlah

sel bakteri itu sendiri. Bakteri memiliki kemampuan untuk menggandakan diri secara

eksponensial dikarenakan sistem reproduksinya adalah pembelahan biner melintang, dimana tiap

sel membelah diri menjadi dua sel. Selang waktu yang dibutuhkan sel untuk membelah diri

disebut dengan waktu generasi. Pada praktikum kali ini, dilakukan pengamatan kinetika

pertumbuhan mikroba yaitu bakteri (Escherichia coli) yang dilakukan dengan metode

spektrofotometri, yaitu dengan mengukur absorbansi dari kultur cair atau inokulum yang dibuat,

lalu membuat grafik pertumbuhan bakteri, untuk melihat fase hidup dari bakteri tersebut.

Hal yang pertama dilakukan adalah dengan membuat inokulum dan media pertumbuhan.

Pengambilan kultur mikroba dari agar miring, dilakukan dengan cara memasukkan air garam

steril kedalam kultur tersebut dan mengocoknya agar mikroba bercampur dengan air garam steril

tersebut. Lalu setelah itu, campuran tersebut dimasukkan ke dalam media Nutrient Broth, karena

kulturnya sudah berbentuk cair. Kemudian diinkubasi selama 24 jam suhu 30°C dan campuran

ini dinamakan inokulum atau kultur cair. Inokulum tersebut, kemudian dimasukkan ke dalam

media pertumbuhan Nutrient Broth. Media ini yang akan digunakan untuk membuat kurva

pertumbuhan mikroba. Apabila suatu medium nutrient cair diinokulasi dengan suatu kultur,

maka organisme secara selektif menangkap/menggunakan nutrient terlarut dari medium dan

kemudian menjadi biomassa.

Yang kedua adalah membuat kurva pertumbuhan dengan metoda spektrofotometri.

Sebelum mengukur absorbansi dari inokulum, dilakukan penentuan panjang gelombang

maksimum ( λmaks ) terlebih dahulu pada penjang gelombang antara 500 nm-600 nm. Kerapatan

optic, dalam hal ini kekeruhan suatu suspense sel pada umumnya diukur melalui intensitas

cahaya pada rentang panjang gelombang tersebut. Berdasarkan percobaan, didapat panjang

gelombang maksimum pada 550 nm. Kisaran pandang ini dipandang tepat karena dalam daerah

tersebut tidak ada pengaruh dari pigmen mikroba yang digunakan.

Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi inokulum per 30 menit. Setelah inokulum

diukur absorbansinya, inokulum tersebut harus dimasukkan de dalam shaker incubator dahulu

sebelum dilakukan pengukuran selanjutnya. Hal ini dilakukan agar inokulum tersebut tetap

homogen (antara media dengan mikroba) sehingga pada saat pembacaan, hasil absorbansi yang

didapat merupakan absorbansi inokulum, bukan absorbansi media atau mikroba saja.

Berdasarkan data yang didapat, absorbansi meningkat pada pengukuran 4 jam pertama.

Lalu menurun pada 1 jam terakhir ( pengukuran yang dilakukan keesokan harinya ). Kemudian,

membuat kurva baku absorbansi terhadap berat sel kering berdasarkan data yang sudah terdapat

dalam modul, sehingga didapat persamaan regresi : y = 6,379 x + 0,0129. Maka absorbansi dari

inokulum yang sudah diketahui (sebagai x) dapat diplotkan ke dalam persamaan regresi diatas

dan didapat data berat sel kering atau X (sebagai y).

Untuk selanjutnya, dibuat kurva berat sel kering (X) terhadap waktu dan kurva Ln X

terhadap waktu.

Lalu dihitung nilai laju pertumbuhan spesifik dengan besar sudut pada kurva Ln X

terhadap waktu yaitu Tan 72° = 3,07 t -1 (µ). Berdasarkan literature, laju pertumbuhan spesifik

bakteri Escherichia coli adalah (belum dapet)

Berdasarkan kurva pertumbuhan mikroba, dapat dilihat bahwa waktu tumbuh hingga

waktu mati bakteri sangat cepat. Dapat terlihat bahwa bakteri bakteri E. coli  mengalami fase

adaptasi, fase pertumbuhan dipercepat, fase eksponensial, lalu ke fase kematian tanpa mengalami

fase stationer.

Fase adaptasi : pada fase ini sel bakteri Escherichia coli belum mengalami perbanyakan,

tetapi air dan nutrient mulai masuk ke dalam sel dan mengalami adaptasi sel. Dapat

terlihat fase adaptasi pada waktu 0-60 menit (1 jam).

Fase eksponensial : pada fase ini, ketika sel telah menyesuaikan diri dengan lingkungan

yang baru, maka sel mulai membelah hingga mencapai populasi yang maksimum. Dapat

terlihat fase eksponensial terjadi pada menit ke 60 sampai menit ke 240 (3 jam).

Fase kematian : pada fase ini, ditandai dengan peningkatan laju kematian yang

melampaui laju pertumbuhan, sehingga secara keseluruhan terjadi penurunan populasi.

Pertumbuhannya akan berhenti dikarenakan nutrisi pada lingkungan sudah tidak

memadai lagi, sehingga akhirnya terjadi penurunan jumlah sel akibat banyak sel yang

sudah tidak mendapatkan nutrisi lagi. Hingga akhirnya pada titik ekstrim yaitu pada

menit ke 240 (1 jam), mengalami fase kematian dan menyebabkan terjadinya kematian

total bakteri Escherichia coli.

Berdasarkan literatur yang didapat, tiap spesies bakteri memiliki waktu generasi yang

berbeda-beda, seperti Escherichia coli, bakteri umum yang dijumpai di saluran pencernaan dan

di tempat lain, memiliki waktu generasi 15-20 menit. Hal ini artinya bakteri E. coli dalam waktu

15-20 menit mampu menggandakan selnya menjadi dua kali lipat. Hal ini menunjukkan

hubungan antara pertambahan sel dengan waktu adalah berbentuk geometrik eksponensial

dengan rumus 2n.  Jadi, bakteri E. coli dalam waktu 10 jam berkembang dari satu sel menjadi

1,09×1012 sel atau lebih dari 1 triliun sel. Pengetahuan akan kurva pertumbuhan bakteri sangat

penting untuk menggambarkan karakteristik pertumbuhan bakteri, sehingga akan mempermudah

di dalam menumbuhkan bakteri ke dalam suatu media, penyimpanan dan penggantian media.

BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

LAMPIRAN

Media Nutrien Broth Blanko

Inokulum (Escherichia coli) Bekerja dalam keadaan aseptic

DAFTAR PUSTAKA

http://matekim.blogspot.com/2010/04/kinetika-pertumbuhan.html

http://www.dyah-dyahrahayu.co.cc/2011/10/dasar-bioproses-iii-kinetika.html

http://teenagers-moslem.blogspot.com/2011/05/kurva-pertumbuhan-mikroba.html