LAPORAN KEMAJUAN

PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA

JUDUL PROGRAM

PENGARUH APLIKASI MEMBRAN POLIMER KOLAGEN-KITOSAN

TERHADAP PROLIFERASI FIBROBLAS PADA

PROSES PENYEMBUHAN LUKA GINGIVA

(Kajian In Vivo pada Tikus Sprague Dawley)

BIDANG KEGIATAN:

PKM-PENELITIAN

Diusulkan oleh:

Esra Prasetyo (G1G010055/Angkatan 2010)

Mutiara Desty (G1G010027/Angkatan 2010)

Sofyan Ahmad Fauzi (G1G012008/Angkatan 2012)

Andito Yudhotomo (G1G012022/Angkatan 2012)

Adnan Al Thoriq (G1F012021/Angkatan 2012)

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2015

iii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................. ii

DAFTAR ISI .............................................................................................................. iii

RINGKASAN ........................................................................................................... iv

BAB 1. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG .................................................................................... 1

B. PERUMUSAN MASALAH ........................................................................... 2

C. TUJUAN .......................................................................................................... 2

BAB 2. TARGET LUARAN .................................................................................... 3

BAB 3. METODE PELAKSANAN

A. WAKTU DAN LOKASI PENELITIAN ........................................................ 3

B. ALAT DAN BAHAN ...................................................................................... 3

C. PROSEDUR PENELITIAN ............................................................................ 3

D. ALUR PENELITIAN ...................................................................................... 6

E. ANALISIS DATA ........................................................................................... 6

BAB 4. HASIL YANG DICAPAI ............................................................................ 7

BAB 5. POTENSI HASIL ......................................................................................... 7

BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA .................................................. 8

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 12

LAMPIRAN

iv

RINGKASAN

Latar belakang: Gingiva merupakan salah satu bagian dari jaringan

periodontal yang melekat pada prosesus alveolaris dan mengelilingi gigi. Gingiva

sering mengalami perlukaan baik karena trauma, penyakit periodontal, tindakan

pasca pencabutan maupun tindakan bedah dengan perlukaan (Newman, 2002).

Penyembuhan luka yang terhambat akan meningkatkan kemungkinan infeksi, rasa

sakit dan gangguan estetis. Banyak upaya untuk mempercepat penyembuhan luka,

diantaranya menggunakan obat-obatan kimia, namun penggunaan obat-obatan

kimia tersebut dapat berefek buruk bagi tubuh, khususnya bagi orang dengan

kondisi sistemik tertentu. Oleh karena itu, sebagai alternatif dalam penyembuhan

luka dapat digunakan membran kolagen-kitosan. Tujuan: Penelitian ini bertujuan

untuk membandingkan pengaruh aplikasi membran polimer kolagen-kitosan

terhadap proliferasi fibroblas pada proses penyembuhan luka gingiva (kajian in

vivo pada tikus Sprague Dawley) pada hari ke-3, 5, dan 7 setelah perlakuan serta

untuk membandingkan pengaruh aplikasi membran polimer kolagen-kitosan

dengan kelompok kontrol terhadap jumlah fibroblas pada proses penyembuhan

luka gingiva (kajian in vivo pada tikus Sprague Dawley) pada hari ke-3, 5, dan 7.

Metode: Penelitian ini menggunakan jenis penelitian laboratorium eksperimental

dengan rancangan percobaan post test only control group design. Hasil sementara

yang didapatkan yaitu, penelitian ini menghasilkan membran tipis yang semi

transparan dan cukup elastis serta dapat digunakan menjadi obat alternative pada

tahap selanjutnya.

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Rongga mulut sebagai bagian integral tubuh, sering mengalami trauma

dalam melakukan fungsinya yang pada akhirnya dapat menimbulkan luka pada

mukosa rongga mulut (Rachmawati dkk, 2006). Salah satu jaringan yang ada di

rongga mulut yang sangat sering terjadinya perlukaan yaitu gingival. Gingiva

merupakan salah satu bagian dari jaringan periodontal yang melekat pada

prosesus alveolaris dan mengelilingi gigi. Gingiva sering mengalami perlukaan

baik karena trauma, penyakit periodontal, tindakan pasca pencabutan maupun

tindakan bedah dengan perlukaan (Newman, 2002).

Setiap tindakan akan menyebabkan rusaknya jaringan tubuh yang

selanjutnya akan pulih kembali melalui proses penyembuhan luka, namun

waktu sembuhnya luka tergantung penagananan luka itu sendiri. Penyembuhan

luka memiliki 3 fase yaitu fase inflamasi, fase proliferasi, dan fase maturasi

(Steed, 2003). Komponen yang berperan penting dalam proses penyembuhan

luka adalah kolagen, angiogenesis dan granulasi (Midwood dkk., 2004).

Penyembuhan luka bedah bergantung pada kemampuan perbaikan jaringan

ikat. Proses penyembuhan luka diawali dengan proses inflamasi diikuti proses

fibroplasia, kemudian remodeling jaringan dan pembentukan jaringan parut.

Setelah proses inflamasi berkurang, dilanjutkan dengan proses fibroplasia

tahap awal yaitu migrasi dan proliferasi fibroblas di daerah jejas. Pada hari ke-

3, sejumlah fibroblas muda terlokalisir pada daerah jejas (Newman, 2002).

Fibroblas dalam jaringan berpindah dari tepi luka sepanjang benang-benang

fibrin di luka (Sabiston, 1995). Sintesis kolagen oleh fibroblas dimulai relatif

awal pada proses penyembuhan yaitu pada hari ke 3-5 dan berlanjut terus

sampai beberapa minggu tergantung ukuran luka (Kumar dkk., 2005).

Selanjutnya proses penyembuhan luka memasuki fase remodeling pada hari ke-

14 (Rachmawati dkk., 2006).

Dalam proses penyembuhan luka, sel utama yang terlibat adalah

fibroblas (Junqueira dkk., 1998). Fibroblas merupakan elemen selular yang

banyak ditemukan pada jaringan ikat gingiva yang berproliferasi dan aktif

mensintesis komponen matriks pada proses penyembuhan luka dan perbaikan

jaringan yang rusak (Fawcett, 2002). Fibroblas merupakan bahan dasar

pembentukan jaringan parut dan kolagen yang memberikan kekuatan daya

rentang pada penyembuhan luka jaringan lunak (Robbins & Kumar, 1995).

Berdasarkan proses penyembuhan luka tersebut, diperlukan terapi efektif

yang dapat mengoptimalkan kinerja komponen tersebut. Banyak upaya untuk

mempercepat penyembuhan luka, diantaranya menggunakan obat-obatan kimia

yang berfungsi dalam penyembuhan (Lewis, 2004). Pemberian obat-

2

obatan dengan kandungan kimia dapat berefek buruk untuk tubuh misalnya pada

orang dengan kondisi sistemik tertentu, selain itu pada rongga mulut penggunaan

obat topikal akan mudah hilang karena adanya saliva dalam rongga mulut.

Menurut Gitarja (2002), teori perawatan luka sangat membutuhkan suasana

lembab, hal ini dikarenakan Mempercepat fibrinolisis, mempercepat angiogenesis,

menurunkan resiko infeksi, mempercepat pembentukan Growth factor, dan

mempercepat terjadinya pembentukan sel aktif.

Oleh karena itu sebagai alternatif dalam penyembuhan luka yang

diketahui aman dan memberikan kelembaban dan memberikan rasa sejuk serta

pilihan yang efektif sebagai penutup luka adalah membran polimer kolagen-

kitosan. Kolagen memegang peranan yang sangat penting pada setiap tahap

proses penyembuhan luka. Dewasa ini, kitosan banyak dikembangkan dalam

berbagai aspek bidang. Salah satunya adalah dalam bidang medis. Kitosan

dapat merangsang pertumbuhan fibroblas dan mempengaruhi aktifitas

makrofage untuk mempercepat penyembuhan luka (Balassa, 1978). Penelitian

sebelumnya oleh Ratnawati (2012), membuat membran polimer biomedis

dengan bahan dasar kolagen dan kitosan dengan perbandingan Membran

kolagen-kitosan 1:1 w/w memiliki hasil yang lebih baik untuk digunakan

sebagai aplikasi pembalut. Bertitik tolak dari uraian di atas, maka penulis

tertarik untuk mengkaji lebih dalam mengenai manfaat mebran polimer

kolagen-kitosan di bidang kedokteran gigi dengan melakukan penelitian

tentang pengaruh aplikasi membran polimer kolagen-kitosan pada proses

penyembuhan luka gingival dengan indikator proliferasi fibroblas.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut dapat dirumuskan suatu

permasalahan yaitu bagaimana pengaruh aplikasi membran polimer kolagen-

kitosan. terhadap proliferasi fibroblas pada proses penyembuhan luka gingiva

tikus Sprague Dawley? C. Tujuan

1. Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh aplikasi membran polimer kolagen-kitosan

terhadap proliferasi fibroblas pada proses penyembuhan luka gingiva tikus

Sprague Dawley. 2. Tujuan Khusus

a. Mengetahui proliferasi fibroblas pada proses penyembuhan luka gingiva

tikus Sprague Dawley pada hari ke-3, 5, dan 7 setelah diberi aplikasi

membran polimer kolagen-kitosan. b. Membandingkan proliferasi fibroblas pada proses penyembuhan luka

gingiva tikus Sprague Dawley pada kelompok kontrol dan perlakuan.

3

BAB II

TARGET LUARAN

Target luaran yang diharapkan dari penelitian ini yaitu program kreatifitas

ini dapat menjadi artikel yang dipatenkan.

BAB III

METODE

A. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan selama 1 bulan. Membran polimer kolagen-

kitosan dibuat di Laboratorium kimia fisik UNSOED, kemudian penelitian pada

tikus dilaksanakan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT)

UGM Yogyakarta, sediaan histologis dibuat di Laboratorium Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta dan pembacaan hasil dilakukan di

Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UNSOED Purwokerto.

B. Alat dan Bahan

1. Alat alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari neraca listrik, pH meter,

gelas erlenmayer, labu pengenceran, gelas ukur, pipet, baki, plat kaca, batang

pengaduk, desikator, hot plate stirrer, magnetic stirrer, wrap plastic, plastik

steril

2. Bahan bahan

kolagen, kitosan, asam asetat glasial, alkohol, akuades, asam klorida, natrium

hidroksida 10 %, indikator pH produksi PT. Macherey-Nagel.

C. Prosedur penelitian

1. Pembuatan Membran Kolagen-Kitosan

Prosedur Sebanyak 0,5 gram kitosan dilarutkan dalam 0,5M asam asetat

sebanyak 25 ml hingga homogen. Kemudian kitosan distirrer selama 30 menit.

Setelah itu ditambahkan kolagen dengan perbandingan (g) kolagen dengan

kitosan 1:1 dan distirrer selama 30 menit. Membran dapat dicetak dengan

menuangkan komposit kolagen-kitosan ke dalam plat kaca dan meratakan

permukaannya dengan ketebalan 1 mm. Kemudian kita diamkan selama 24

jam pada suhu kamar. Bioplastik yang sudah kering dimasukkan dalam bak

koagulan berisi NaOH 4% untuk membantu melepaskan membran yang masih

melekat pada kaca. Diamkan membran selama 24 jam agar mudah

pengambilannya. Kemudian dikeringkan di atas mika untuk mempermudah

pengambilan membran ketika sudah kering.

4

2. Persiapan hewan uji coba

Sebelum dilakukan pengujian terhadap hewan uji coba, peneliti mengurus

ethical clearance di Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta. Hewan coba

diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Unit IV

UGM Yogyakarta. Hewan coba dilakukan aklimatisasi selama tujuh hari, diberi

makanan standar dan minum. Hal ini bertujuan untuk memperoleh keseragaman

sebelum dilakukan penelitian dan untuk mengontrol hewan coba.

Pengelompokan sampel dilakukan secara simple random sampling. Hal ini

berarti tiap anggota memiliki peluang yang sama untuk masuk ke dalam

kelompok penelitian. Hewan coba diberi nomor, kemudian dipilih secara acak

dan dikelompokkan sebagai berikut.

a. Kelompok kontrol (A): diberi perlukaan pada gingiva labial kemudian diberi

larutan salin

b. Kelompok perlakuan (B): diberi perlukaan kemudian ditutup dengan

membran polimer kolagen-kitosan

4. Tahap perlukaan gingiva

a. Dua puluh empat ekor tikus yang telah dipilih sesuai kriteria sebagai subyek

penelitian dianestesi menggunakan ketamin.

b. Tikus yang telah teranestesi dibuat perlukaan menggunakan punch biopsy

pada gingiva tikus bagian labial rahang bawah antara gigi incisivus dengan

diameter 3 mm, hingga kedalaman mencapai tulang alveolar. Luka yang

terjadi dibersihkan dengan NaCl fisiologis dan H2O2 3%.Siapkan membran

kolagen-kitosan, Beri perlakuan,

5. Tahap pembuatan preparat histology

a. Pembuatan preparat histologi (Prosedur Laboratorium Patologi Anatomi FK

UGM).

1) Tikus dikorbankan dengan anastesi menggunakan eter, selanjutnya

dilakukan pembedahan dan pengambilan jaringan pada daerah percobaan

menggunakan scalpel dengan ketebalan 0,3-0,5 mm.

2) Dilakukan proses fiksasi dengan merendam preparat ke dalam larutan

neutral buffered formalin (NBF) minimal 48 jam kemudian dilakukan

proses pencucian dengan larutan alkohol 70% I (30 menit) dan larutan

alkohol 70% II (30 menit) untuk menghilangkan larutan fiksatif.

3) Dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alkohol secara bertingkat

dengan alkohol 70%, 80%, 90%, dan 100% I dan II masing-masing

selama 30 menit. Dehidrasi ini dilakukan untuk menarik air yang masih

terdapat dalam jaringan dan Dilakukan penjernihan secara bertahap

dengan urutan alkohol : xylol = 3 : 1 selama 30 menit, alkohol : xylol = 1 :

1 selama 30 menit, alkohol : xylol = 1 : 3 selama 30 menit, zylol murni 1

5

selama 30 menit dan xylol murni II selama 30 menit. Penjernihan

berfungsi untuk menarik alkohol (dealkoholisasi) sehingga preparat

tampak transparan.

4) Dilakuan infiltrasi parafin dengan urutan xylol : parafin = 3 : 1 selama 30

menit, xylol : parafin = 1 : 1 selama 30 menit, xylol : parafin = 1 : 3

selama 30 menit, parafin murni I selama 30 menit dan parafin II salama

30 menit. Proses ini dilakukan pada inkubator pada suhu 58-60 0C.

5) Dilakukan penanaman (embedding) dengan menyiapkan cetakan dari

kotak-kotak karton, kemudian diisi parafin cair. Parafin cair yang ada

dalam cetakan diletakkan sesaat di atas balok es sehingga bagian bawah

dari parafin agak memadat. Preparat dimasukan ke dalam parafin cair

pada cetakan karton dan diatur letaknya sesuai dengan tujuan pengirisan,

dan diletakkan kayu pemegang (holder) yang sudah diberi kode sesuai

dengan sampel. Parafin diletakkan kembali di atas balok es sehingga

parafin membeku secara sempurna kemudian pengirisan (sectioning)

dilakukan pada bidang balok parafin yang mengandung preparat dapat

dikurangi panjang dan lebarnya sebelum dilakukan pengirisan, sehingga

organ berada 3-5 mm dari tepi. Pemegang (holder) dipasang pada rotary

microtrome dan diiris ketebalan 6 m.

6) Penempelan irisan jaringan pada gelas benda dengan sedemikian rupa

sehingga pada setiap object glass tertempel beberapa irisan. Sampel

dikeringkan didalam temperatur ruangan (+ 250C) selama 24 jam agar

preparat dapat melekat lebih baik. Irisan yang telah menempel pada object

glass disimpan pada kotak penyimpanan bila pewarnaan tidak dilakukan

secara langsung..

7) Dilakukan staining (pewarnaan irisan jaringan) yang sebelumnya

dilakukan deparafinasi dengan cara preparat yang telah diletakkan pada

gelas benda dicelupkan dalam xylol murni 2 x 5 menit. Lakukan rehidrasi

dalam alkohol bertingkat terdiri darii alkohol absolut 100%, alkohol 90%,

alkohol 80%, alkohol 70% masing-masing 30 celupan dan 30 celupan

akuades hingga tanpak jernih. Sampel direndam dalam larutan Mayer's

Hematoxylin selama 10 menit dan dicelup air selama 1 menit. Selanjutnya

jaringan dicelupkan dalam air scott selama 8-10 celupan, diikuti

pencucian dalam air mengalir selama 1 menit. Sampel kemudian

dicelupkan ke dalam larutan Eosin selam 2 menit dan dicuci beberapa

saat dalam air mengalir dan selanjutnya dehidrasi dalam larutan alkohol

bertingkat 70%, 80%, 90%, 100% 2x masing-masing 30 celupan. Sampel

dijernihkan dalam larutan xylol murni 2 x 2 menit dan ditutup dengan

gelas penutup menggunakan perekat entelan new.

6

8) Sediaan histologi yang sudah diwarnai dan ditutup dengan entelan new

diberi label sesuai sampel.

6. Perhitungan Jumlah fibroblas

Penghitungan di mikroskop dengan gratikule yang pembesarannya

400x. Selanjutnya dibaca sel fibroblas dengan cara menghitung sel fibroblas

dalam kotak gratikule pada 5 lapang pandang

D. Alur Penelitian

Gambar 3.3 alur penelitian

Aklimatisasi tikus (Sprague Dawley) (30 ekor) selama 1 minggu

Anestesi tikus menggunakan ketamin 24 g BB/ml

Punch biopsy (3 mm) pada gingiva labial hingga kedalaman mencapai mukoperiosteum

Kelompok kontrol (A) Kelompok perlakuan (B)

Larutan salin Membran membran kolagen-kitosan

K1

Hari ke-3

5 ekor

Euthanasia, eksisi jaringan dan dibuat preparat

Pengamatan jumlah sel fibroblas

K2

Hari ke-5

5 ekor

K3

Hari ke-7

5 ekor

P1

Hari ke-3

5 ekor

P2

Hari ke-5

5ekor

P3

Hari ke-7

5 ekor

Analisis data

Pembuatan membran kolagen-kitosan

7

E. Analisis Data

Dari hasil penelitian kemudian data ditabulasi dan diuji normalitasnya

dengan test Kormogorov-Smirnov dan diuji homogenitasnya dengan uji Levene.

Data selanjutnya dianalisis dengan uji ANOVA dua arah dengan tingkat kemaknaan

95% (p

8

BAB VI

RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA

Rencana selanjutnya untuk sampai persentase penelitian 100%, yaitu

mengaplikasikan membran kolagen-kitosan ke tikus yang sebelumnya sudah dibuat

perlukaan menggunakan punch biopsy di LPPT IV UGM Yogyakarta. Kemudian

dilakukan pengamatan pada hari ke-3, 5, dan 7 untuk melihat jumlah sel fibroblas. Uji

validitas data antara dua orang pengamat menggunakan uji Korelasi Pearson. Setelah

data valid, hasil pengamatan diuji normalitasanya dengan menggunakan uji Saphiro

Wilk (N

9

LAMPIRAN

A. Penggunaan Dana

Sampai saat ini biaya yang digunakan adalah sebagai berikut :

1. Alat

No Alat Jumlah Satuan Harga (Rp) Total (Rp)

1 Plat Kaca 4 10.000 40.000

2 Lakban Hitam 1 7.000 7.000

3 Tissu 1 8.000 8.000

4 Plastik Wrap 1 15.000 15.000

5 Sewa alat (gelas

erlenmayer 8 buah,

batang pengaduk, gelas

ukur, labu pengenceran,

neraca, hot plate stirrer,

magnetic stirrer, ketas

lakmus pH)

- - 150.000

2. Bahan

No Bahan Jumlah Satuan Harga (Rp) Total

1 Kitosan 100 gram 200.000 200.000

2 Kolagen Teripang 200 gram 400.000 400.000

3 Asam Acetate, NaOH

10%, Aquadest

- 100.000 100.000

3. Lain-Lain

No Alat atau Bahan Jumlah Satuan Harga (Rp) Total

1 Kertas A4s 1 Rim 40.000 40.000

2 Tinta Printer Colour

dan Black

5 botol 25.000 125.000

10

3 Bensin transport - 100.000 100.000

4 Biaya Ethical

Clearance

- 300.000 300.000

5 Transportasi ke FK

UGM Yogyakarta

Untuk Ethical

Clearance

- 200.000 200.000

Jumlah 1.685.000

B. Bukti Pendukung Kegiatan

11

12

DAFTAR PUSTAKA

Balassa, L.L. dan Prudden, J.F. 1978. Application of Chitin and Chitosan in Wound

Healing Acceleration. In proc . 1 st internat. Conf. on chitin/ chitosan. MIT

Sea Grant Report MITSG.

Fawcett, D.W. 2002. Texbook of Histology. 12nd Edition. Disadur Jan Tambajong.

Buku Ajar Histologi. Edisi 12. Jakarta: EGC.

Gitarja. W.S. 2002. Perawatan Luka. Bogor: Wocare Indonesia.

Lewis, J. 2004. A Colour Handbook of Oral Medicine. London: Manson.

Midwood, K.S., Williams, L.V., dan Schwarzbauer, J.E. 2004. Tissue Repair And

The Dynamics of The Extracellular Matrix. The International Journal Of

Biochemistry and Cell Biology. 36(6): 1031-1037.

Newman, M.G., Takei, H., Klokkevold, P.R., dan Carranza, F.A. 2002. Clinical

Periodontology Edisi 9. Philadelphia: W.B.Saunders Company.

Rachmawati, N., Setyaningsih, W., Mandala, V., Dewi, M.S., dan Novita, G. 2006.

Re-epitelisasi, Kepadatan Fibroblast dan Serabut Kolagen pada Proses

Penyembuhan Luka Gingiva Labial Tikus Sprangue dawley Setelah

Pemberian Topikal Ekstrak Buah Adas (Foeniculum vulgare Mill.) 50%.

http://www.pkm.dikti.net/pkmiaward2006/pdf/pkmi/06 066.pdf. available at

04 November 20014.

Ratnawati, A., Izak R, D., dan Supardi, A. 2010. Sintesis dan Karakterisasi Kolagen

Dari Teripang dan Kitosan Sebagai Aplikasi Pembalut Luka. Surabaya:

UNAIR

Robbins, S.L. dan Kumar, V. 1995. Basic Pathology 4 th edition. Disadur Staf

Pengajar Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas

Airlangga. Buku Ajar Patologi. Jakarta: EGC.

Sabiston.Andrianto (alih Bahasa )., 1995 Buku Ajar Bedah I, EGC, Jakarta.

Steed, D.L., 2003. Wound Healing Trajectories. Surg Clin North Am, 83:54755.