LAPORAN HASIL PENELITIAN HIBAH PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL

DIPA UNIVERSITAS BRAWIJAYA TAHUN 2010

Judul : Peningkatan Komponen Bioaktif Laktoferin dan Kasein-Fosfopeptida Susu Kambing Melalui Fermentasi dan Aktivitasnya Sebagai Antimikroba-Antioksidan Serta Peranannya Sebagai Pangan Fungsional

Ketua : Dr.Ir. Lilik Eka Radiati, MS Anggota : 1. Prof. Ir. Hari Purnomo, M. App.Sc. Ph.D

2. Ir. Eny Sri Widyastuty, MP

Dibiayai Oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan Nasional, melalui DIPA Universitas Brawijaya berdasarkan SK Rektor Nomor :

035A/SK/2010, tanggal 12 Februari 2010.

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2010

PANGAN

RINGKASAN

Pendahuluan

Kambing dapat beradaptasi dengan baik pada kondisi lingkungan di lahan kering, karena dapat mengkonversi pakan dengan baik (Hilario, Puga, Ocana dan Romo, 2010). Salah satu program Pemerintah Kabupaten Malang adalah pemberdayaan masyarakat dengan memberikan kambing, untuk menghasilkan susu kambing, sebagai sumber pangan fungsional (Radiasi, Dwiargo dan Haridwiutami, 2008).

Perkembangan pangan fungsional diransang dengan klaim dapat meningkatkan kesehatan dan mengurangi resiko beberapa penyakit. Susu kambing dan produk olahannya mengandung berbagai senyawa bioaktif yang konsentrasinya dapat ditingkatkan melalui fermentasi. Salah satu olahan produk tersebut dikenal dengan kefir (Fardiaz, 1997). Beberapa senyawa bioaktif dapat mengurangi kerusakan DNA, terutama disebabkan oleh adanya radikal bebas (Jalaka et al., 2010.) dan menghambat pertumbuhan mikroba (Radiasi, 2008). Senyawa tersebut adalah laktoferin, like-laktoferin dan peptida lainnya (Schanbacher, et al., 1998) yang mempunyai aktivitas antimikroba dan antioksidan. Senyawa bioaktif tersebut dipengaruhi oleh panas yang dapat mendenaturasi protein, namun dengan fermentasi lebih lanjut pembentukan peptida novel akan diproduksi (Tomita et al,. 1994; Sokolinska, Dankow, dan Pikul, 2008). Aktivitas antimikroba kefir kambing susu telah dipelajari (Radiasi, 2008), tetapi penelitian ini untuk melengkapi informasi tentang senyawa khusus sebagai antimikroba dan antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah: Untuk mengeksplorasi senyawa bioaktif kefir susu kambing, karakterisasi protein, aktivitas antimikroba dan antioksidan. Bahan dan Metode

Tiga puluh liter susu kambing yang diperoleh dari peternakan di Ampel gading Malang. Perlakuan pertama adalah tingkat pemanasan susu pada pasteurisasi: T0 (susu segar), T1 (63 º C selama 30 menit),. T2 (72 ºC selama 15 detik) dan T3 (85 º C selama 2 detik). Susu didinginkan pada suhu 35oC dan Whey disiapkan dengan menambahkan 20% CaCl2 (0,04% v/v) dan 0,02 % renin (v/v) (Isnia, 2004). Setelah itu, whey disaring dengan kain, dikumpulkan, dan disaring dengan No whatman 41. Sampel whey dikeringkan bekukan dengan freeze dryer tipe Kinetika EZKERING selama 15 jam sampai menjadi bubuk. kefir yang mempunyai kandungan senyawa bioaktif tinggi diperlakukan lebih lanjut: disimpan pada suhu sekitar 5ºC selama L0 (tanpa penyimpanan), L1 (6 hari), L3 (9 hari) dan L4 ( 12 hari).

Pemurnian senyawa bioaktif secara kromatografi kolom (F 3 x 40 cm) sepadex dextran G-100 dengan eluen bufer fosfat pH 6,8 menurut Walker (1996). Penentuan protein terlarut metode Bradford, absorbansi diukur pada l595 nm, kalibrasi konsentrasi protein menggunakan kurve standar Bovine Serum Albumin. Penentuan berat molekul protein secara elektroforesis SDS-PAGE (Hames dan Rickwood, 1990).

Uji aktivitas antimikroba dilakukan pada nutrien agar cawan, yang mengandung Escheriachia coli (5 x 105 cfu/ml). Membuat sumur F 5 mm, Ttap sumur ditetesi 30 dan 50 µl (100 ug/ml sampel). Selama percobaan kontrol ditambahkan bufer fosfat. Campuran diinkubasi pada 37ºC selama 24 jam. Radius areal bening (mm) dinyatakan sebagai aktivitas antimikroba terhadap pertumbuhan bakteri uji (Radiati, 2008). Aktivitas antioksidan ditentukan berdasarkan aktivitas penangkapan terhadap radikal DPPH+, dengan pengukuran penurunan absorbansi DPPH+ pada l 517 nm (Mc Cue dan Shetty 2005).

Hasil Penelitian dan Pembahasan

Laktoferin dan metabolit lainnya hasil fermentasi kefir susu kambing merupakan protein dengan berat molekul tinggi, kadungan komponen tersebut dalam bahan sangat kecil, sehingga diperlukan purifikasi untuk analisis keberadaan senyawa tersebut.

Karakterisasi laktoferin dan peptida like–laktoferin secara elektroforesis SDS-PAGE menunjukkan fraksi protein BM 84 kDa, 80 kDa, 65 kDa. Pasteurisasi dan lama penyimpanan kefir mempengaruhi konsentrasi laktoferin. Bobot molekul laktoferin dalam susu kambing dan kefir diperkirakan 84 kDa dan 80 kDa. Konsentrasi rata-rata laktoferin adalah (T0) 1915 µg/ml, (T1) 1579 µg/ml, (T2) 954 µg/ml dan (T3) 322 µg/ml. Konsentrasi rata-rata laktoferin dalam kefir selama penyimpanan (L0) 663 µg / ml, (L1) 448 µg/ml, (L2) 249 µg/ml, (L3) 142 µg/ml dan (L4) 48 µg/ml. Pasteurisasi pada suhu 65oC 30' dapat mempertahankan konsentrasi laktoferin lebih tinggi dari suhu 73oC 15''dan suhu 83oC 2''.

Aktivitas antimikroba senyawa bioaktif dalam kefir susu kambing, khususnya laktoferin dan peptida like-laktoferin terhadap E. coli menunjukkan areal hambat (T0) 2,80 mm, (T1) 2,65 mm dan (T2) 2, 0,55 mm dan (T3) 2,00 mm. Analisis aktivitas antimikroba selama penyimpanan kefir adalah (L0) 2,60 mm, (L1) 3,22 mm, (L2) 3,32 mm, (L3) 3,40 mm dan (L4) 3,64 mm.

Aktivitas antioksidan berdasarkan penangkapan radikal bebas terhadap DPPH+ (Hilario, et al, 2010.), menunjukkan aktivitas antioksidan (T0) 63,68 %, (T1) 60,27% dan (T2) 58,28 % dan (T3) 40,06 %. Analisis kinetik aktivitas antioksidan selama penyimpanan kefir adalah (L0) 60,28%, (L1) 62,22%, (L2) 63.09%, (L3) 65,09% dan (L4) 67,33%.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kefir susu kambing memiliki antimikroba dan antioksidan. Rendah aktivitas antimikroba dan antioksidan pada pasteurisasi susu karena protein dan peptida yang merupakan senyawa bioaktif mengalami denaturasi. Seperti yang dilakukan Zulveta et al (2009) yaitu menurunnya konsentrasi albumin dalam susu pasteurisasi. Pasteurisasi pada 63 ºC selama 30' dan penyimpanan 12 hari mempunyai nilai lebih tinggi daripada perlakuan lainnya. Hal ini diduga karena metabolisme kefir selama penyimdalam masih berlanjut dan menghasilkan senyawa tertentu dengan aktivitas antimikroba dan antioksidan. Senyawa ini diduga like-laktoferin dan peptida lainnya yang mempunyai berat molekul hampir sama. Kesimpulan

Antimikroba dan antioksidan kefir susu kambing dapat dimodifikasi melalui proses fermentasi. Perlakuan pasteurisasi sebelum fermentasi dapat menurunkan komponen bioaktif, namun selama penyimpanan yang optimal dapat meningkatkan komponen bioaktif. Diduga komponen bioaktif tersebut merupakan metabolit proses fermentasi lebih lanjut selama penyimpanan. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan potensi kefir susu kambing sebagai makanan fungsional, dengan melakukan pemeraman pada suhu dingin, dengan melihat senyawa bioaktif yang lainnya.

SUMMARY

Introduction

Goat adapt well to environmental conditions in arid lands, being able to obtain adequate

diet, even when forage is scare and they can feed over rough and other wise inaccessible

terrain (Hilario, Puga, Ocana dan Romo, 2010). In Malang Indonesia, some government

programs for community empowerment by giving goats, which gives milk has nutritive

properties, being a significant source of bioactive compounds (Radiati, Dwiargo dan

Haridwiutami, 2008).

The concepts in nutrition have changed considerably during the past decade. Growing

interest in functional food which apart from nutritional values might be health promoting and

reduce the risk several of disease, is one of the stimuli these changes. Milk and milk-

products

provide a wide range of bioactive compound with potentially functional properties which are

improved by their fermentation process. The products as well known as kefir that is

produced by kefir grain fermentation (Fardiaz, 1997). Some compounds can diminish DNA

change, mainly caused by the presence of free radicals (Jalaka et al., 2010) and inhibit

microbial growth (Radiati, 2008). These compounds with potentially functional properties

like lactoferin and other peptides (Schanbacher, et al, 1998) which having antimicrobial and

antioxidant activities. The bioactive compound is influenced by processing such as heat

treatment cause of protein denaturation, by fermentation further the formation novel

peptides be produced (Tomita et al, 1994; Sokolinska, Dankow, and Pikul, 2008). The

antimicrobial activity of goat’s milk kefir has already been studied (Radiati, 2008), but this

research to complete the information about the specific compound as antimicrobial and

antioxidants.

The objective of this study was : To explore the bioactive compound of goat’s milk kefir,

characterization and its antimicrobial and antioxidant activities.

Material and Methods

Thirty liter goat’s milk collected from Ampel gading Farm in Malang; 10 lt were curded

from raw milk. The first treatmen was pasteurization consist of 4 kinds of kefir were made

from T0 (Raw milk), T1 (63ºC for 30 min), T2 (72ºC for 15 seconds) and T3 (85ºC for 2

seconds). The milk was set in the same temperature at 35oC. Whey was prepared by

adding CaCl2 20% (0,04% v/v) and enzyme rennin 0,02% (v/v) (Isnia, 2004). After which,

whey was separated into cheese cloth, was collected, and filtrated with whatman No. 41.

The whey sample was freeze dried with freeze dryer type Kinetics EZ-DRY for 15 h and

kept powder. The higher bioactive compound kefir with vary temperature pasteurization

above was storage at refrigerator around 5 ºC for L0 (without storage), L1 (for 6 days), L3

(for 9 days) and L4 (for 12 days).

Sample purification was conducted with sepadex dextran G-100 chromatography

column (F 3 x 40 cm), with phosphate buffer eluent at pH 6,8 (Walker, 1996). Determination

of soluble protein by Bradford Method, and protein absorbance measure at 595 nm,

calibration by Bovine Serum Albumin standard curve. Determination protein molecule

weight by electrophoresis SDS-PAGE (Hames dan Rickwood, 1990).

Antimicrobial activities assay was carried out in sterile nutrient agar plate, which contain

of Escheriachia coli (5 x 105 cfu/ml). Make honey comb, each wells filled 30 and 50 µl (100

ug/ml samples). As control experiment added phosphate buffer was applied into the wells,

incubated at 37º C for 24 h. The clear zone round the well determined as value of inhibition

bacterial growth (mm) (Radiati, 2008).

Determination of Scavenging stable of DPPH+ free-radical was a very fast method to

evaluate the antioxidant activity of the peptides, by measurement of the decrease in

absorbance of DPPH+ at 517 nm the method used was describe by Mc Cue and Shetty

(2005).

Research Results and Discussion

Lactoferrin and other metabolites fermentation in goat’s milk kefir as protein with high

molecular weight is minor constituent of real sample, need pufification process. Lactoferrin

and other peptides profile in goat milk and kefir shown 84 kDa, 80 kDa, 65 kDa fractions in

SDS-PAGE. Pasteurization and storage after fermentation process influenced lactoferrin

concentration significant. The molecule weights of lactoferrin in goat milk and kefir were

estimated at 84 kDa and 80 kDa. The average concentration of lactoferrin was (T0) 1915

µg/ml, (T1) 1579 µg/ml, (T2) 954 µg/ml and (T3) 322 µg/ml. The average concentration of

lactoferrin in kefir during storage was (L0) 663 µg/ml, (L1) 448 µg/ml, (L2) 249 µg/ml, (L3)

142 µg/ml and (L4) 48 µg/ml. Pasteurization at temperature 65oC 30’ can defend

concentration of lactoferrin higher than temperature 73oC 15’’ and temperature 83oC 2’’.

Antimicrobial activity of bioactive compound in goat’s milk kefir, particular the lactoferrin

and peptides like lactoferrin had antimicrobial activities to E. coli. The inhibitory zone by

(T0) 2.80 mm, (T1) 2.65 mm and (T2) 2,.55 mm and (T3) 2.00 mm. Antimicrobial activity

during kefir storage was (L0) 2.60 mm, (L1) 3.22 mm, (L2) 3.32 mm, (L3) 3.40 mm and (L4)

3.64 mm.

Antioxidan activity base on free-radical scavenging to DPPH+ (Hilario, et al., 2010)

shown (T0) 63.68%, (T1) 60.27% and (T2) 58.28% and (T3) 40,06%. Antioxidan activity

during kefir storage was (L0) 60.28 %, (L1) 62.22 %, (L2) 63.09%, (L3) 65.09% and (L4)

67.33%. The results showed that goat’s milk kefir has antimicrobial and antioxidant. During

the kinetics Lower values of these activities in kefir are possible due to pasteurized milk

containing higher serum protein and less albumin, when denaturation (Zulveta et al.,2009)

who tested commercial milk in Italy to evaluated the total antioxidant activity. Inhibition zone

and free radical scavenging analysis of kefir during storage, shown pasteurized milk at

63ºC for 30’ the higher value of these activities, are possibly due to the metabolism of kefir

grains in certain compounds with antimicrobial and antioxidant activities. The compound is

sugessed like-lactoferrin and other peptides in similar molecular weight.

Conclusion

Antimicrobial and antioxidant goats’ milk kefir can be modified by fermentation process,

providing and increase of the total peptide concentration, pasteurization did have a

significant effect on these metabolites and diminished total bioactive compound. More

research is needed to elucidate the potential of goat’s milk kefir as functional food in

ripening condition.