Tanggal Praktikum 24 Maret 2015Praktikum 3.4 TEKNIK ENUMERASI LANGSUNG

1. Bagaimana cara menghitung mikroba secara langsung menggunakan haemocytometer? Sebutkan dan jelaskan tahapannya

2. Apakah yang harus dilakukan, jika mikroba yang terlihat di Haemocytometer terlalu banyak? Jelaskan

3. Sebutkan ukuran kotak dalam haemocytometer dan tuliskan rumus yang digunakan untuk menghitung mikroba menggunakan haemocytometer

PRELAB

Perhitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 9 kotak besar berukuran 1 mm2 dan kotak-kotak kecil dimana 1 kotak besar sama dengan 25 kotak kecil sehingga satu kotak besar tersebut memiliki volume sebesar 0,0001 ml. Kotak yang paling kecil berfungsi untuk mempermudah perhitungan sel (Hansen, 2008).

DIAGRAM ALIR

Ukuran kotak pada haemocytometer totalnya adalah 9 mm2 dan masing-masing kotak besarnya berukuran 1 mm2 yang terdiri atas 25 kotak kecil. Volume kotak besar adalah 0,0001 ml. Rumus yang digunakan untuk menghitung mikroba adalah :

( nx )( 10.000

1 )=sel/mL

Keterangan :n = total sel hasil perhitunganx = faktor divisi berdasarkan presentase dari masing-masing kisi perhitungan (Chalid, 2010).

Haemocytometer

Dibersihkan dengan aquades kemudian alkohol lalu dikeringkan dengan tissue

Divortex kultur S.Cerevisae pada media PGYB dalam tabung reaksi

Diambil suspense sebanyak 1 ml

1. Perhitungan S.Cerevisae 24 jamYang pertama dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan. Alat yang digunakan

adalah tabung reaksi, gelas beker, pipet tetes, mikro pipet, mikro tip, haemocytometer, cover glass, rak tabung, mikroskop, pupil cam, dan bunsen. Tabung reaksi adalah alat yang digunakan untuk mereaksikan larutan, namun pada praktikum ini digunakan untuk wadah kultur dan tempat mengencerkan kultur. Kegunaan gelas beker digunakan untuk menaruh larutan, pada praktikum ini digunakan untuk wadah stelilisasi mikrop tip dan sebagai wadah untuk mencuci pipet tetes. Mikro pipet digunakan untuk menyedot larutan dengan volume tertentu. Mikro tip digunakan untuk wadah larutan yang akan diambil dengan mikro pipet. Haemocytometer adalah alat yang digunakan untuk menghitung jumlah sel secara langsung. Cover glass untuk menutup bagian haemocytometer. Rak tabung digunakan untuk wadah tabung reaksi. Mikroskop digunakan untuk mengamati mikroba/ mikroorganisme dengan pembesaran tertentu. Mikroskop terdiri dari lensa okuler yang dekat dengan mata, lensa objektif yang berada dekat pada objek, tabung mikroskop atau tubus yang berfungsi untuk mengatur fokus dan menghubungkan lensa objektif dan okuler, mikrometer (pemutar halus) berfungsi untuk menaik turunkan mikroskop secara lambat, makrometer (pemutar kasar) berfungsi untuk menaik turunkan tabung mikroskop secara cepat, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara memutarnya kemudian reflektor berfungsi untuk memantulkan cahaya dari cermin ke meja objek, Meja mikroskop berfungsi sebagai tempat meletakkan objek yang akan diamati, penjepit kaca berfungsi untuk menjepit kaca agar tidak mudah bergeser, kemudian lengan mikroskop dan kaki mikroskop. Pupil cam digunakan untuk menghubungkan antara mikroskop dengan laptop sehingga apa yang dilihat pada lensa mikroskop dapat terlihat pada laptop. Bunsen untuk mensterilkan alat dan menjaga agar tidak terjadi kontaminan. Bahan yang digunakan adalah alkohol 70% (untuk mengaseptis diri, lingkungan, maupun alat), pepton (digunakan untuk pengenceran), S.Cerevisae (digunakan untuk sample yang diamati), aquades (untuk mencuci dan sebagai pelarut). Setelah semua alat dan bahan siap, maka selanjutnya adalah melalukan aseptis diri dan lingkungan. Pada aseptis diri kita menyemprotkan alkohol pada telapak tangan kemudian diratakan hingga punggung telapak tangan. Pada aseptis lingkungan kita menyemprotkan alkohol pada meja kerja kemudian dilap secara searah dengan menggunakan tissue. Hal ini dilakukan agar mencegah terjadi kontaminan.

Lalu kita melakukan pengenceran kultur yang telah diinkubasi 24 jam pada media PGYB. Yang dilakukan pertama bunsen dinyalakan, lalu disterilisasi mikropipet dengan cara menyemprotkan alkohol keseluruh bagian kemudian dilap searah dengan menggunakan tissue. Kemudian diambil mikro tip dengan pada gelas beker. Cara mengambilnya dengan menekan tombol lalu dibuka kertas payung dan kapas. Ditancapkan mikropipet pada mikrotip dan tombol dilepas secara perlahan agar mikrotip terpasang. Kemudian diangkat mikropipet dan dirapat kan mikrotip dengan memegang dan memutar bagian kasarnya. Dihomogenkan kultur pada vortex hingga ada pusaran yang menyentuh dasar tabung. Setelah itu dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet dan diambil kultur pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu diambil tabung reaksi yang berisi pepton 9ml dengan berlabel 10-1. Dan dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan

ANALISA PROSEDUR

kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet dan dituangkan kultur pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Setelah itu dilakukan pengenceran lagi pada tabung reaksi berisi 9ml yang berlabel 10-2. Dengan mengambil 1ml pada tabung reaksi 10-1 dengan menggunakan mikropipet yang telah terpasang mikro tip baru. Dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet dan diambil larutan pada tabung reaksi sebanyak 1ml. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu diambil tabung reaksi 10-2 dan dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet yang berisi larutan 10 -1 sebanyak 1ml dan dimasukkan larutan tadi pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Setelah itu dihomogenkan dengan vortex hingga muncul pusaran yang menyentuh pada dasar tabung. Hal ini bertujuan agar larutan benar-benar homogen. Dan hasil pengenceran 10-2 yang digunakan untuk sample.

Lalu sample tadi diambil dengan menggunakan pipet tetes. Dengan cara dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan pipet tetes dan diambil larutan pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu diambil haemocytometer dan diteteskan sebanyak 1 tetes pada 2 kotak. Kemudian ditutup 2 kotak tadi dengan cover glass, caranya dengan sebelum menutup ditaruh dengan sudut 45ᴏ lalu ditutupkan secara perlahan. Hal ini bertujuan agar pada saat menututp tidak terdapat gelembung yang dapat mengganggu pengamatan.

Haemocytometer yang telah di meja mikroskop. Lalu dijepit dengan penjepit kaca agar tidak bergeser-geser atau bergerak. Digunakan lensa objektif dengan pembesaran 40x untuk memfokuskan. Jika sudah fokus, digunakan lensa objektif dengan pembesaran 400x. Dan dicari ujung terpojok. Misal ditemukan pada pojok kiri bawah, maka dihitung pada petak satu, jika sudah digeser dan dihitung petak satunya. Bergeraknya dari kiri kekanan hingga kelima dan jika sudah geser keatas hingga pola mengular. Setelah dihitung semua hingga didapatkan 25 petak. Selanjutnya di hitung jumlah sel/ml pada jumlah sel tadi dengan menggunakan rumus. Perhitungan S.Cerevisae 48 jam

Yang pertama dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan. Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, gelas beker, pipet tetes, mikro pipet, mikro tip, haemocytometer, cover glass, rak tabung, mikroskop, pupil cam, dan bunsen. Tabung reaksi adalah alat yang digunakan untuk mereaksikan larutan, namun pada praktikum ini digunakan untuk wadah kultur dan tempat mengencerkan kultur. Kegunaan gelas beker digunakan untuk menaruh larutan, pada praktikum ini digunakan untuk wadah stelilisasi mikrop tip dan sebagai wadah untuk mencuci pipet tetes. Mikro pipet digunakan untuk menyedot larutan dengan volume tertentu. Mikro tip digunakan untuk wadah larutan yang akan diambil dengan mikro pipet. Haemocytometer adalah alat yang digunakan untuk menghitung jumlah sel secara langsung. Cover glass untuk menutup bagian haemocytometer. Rak tabung digunakan untuk wadah tabung reaksi. Mikroskop digunakan untuk mengamati mikroba/ mikroorganisme dengan pembesaran tertentu. Mikroskop terdiri dari lensa okuler yang dekat dengan mata, lensa objektif yang berada dekat pada objek, tabung mikroskop atau tubus yang berfungsi untuk

mengatur fokus dan menghubungkan lensa objektif dan okuler, mikrometer (pemutar halus) berfungsi untuk menaik turunkan mikroskop secara lambat, makrometer (pemutar kasar) berfungsi untuk menaik turunkan tabung mikroskop secara cepat, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara memutarnya kemudian reflektor berfungsi untuk memantulkan cahaya dari cermin ke meja objek, Meja mikroskop berfungsi sebagai tempat meletakkan objek yang akan diamati, penjepit kaca berfungsi untuk menjepit kaca agar tidak mudah bergeser, kemudian lengan mikroskop dan kaki mikroskop. Pupil cam digunakan untuk menghubungkan antara mikroskop dengan laptop sehingga apa yang dilihat pada lensa mikroskop dapat terlihat pada laptop. Bunsen untuk mensterilkan alat dan menjaga agar tidak terjadi kontaminan. Bahan yang digunakan adalah alkohol 70% (untuk mengaseptis diri, lingkungan, maupun alat), pepton (digunakan untuk pengenceran), S.Cerevisae (digunakan untuk sample yang diamati), aquades (untuk mencuci dan sebagai pelarut). Setelah semua alat dan bahan siap, maka selanjutnya adalah melalukan aseptis diri dan lingkungan. Pada aseptis diri kita menyemprotkan alkohol pada telapak tangan kemudian diratakan hingga punggung telapak tangan. Pada aseptis lingkungan kita menyemprotkan alkohol pada meja kerja kemudian dilap secara searah dengan menggunakan tissue. Hal ini dilakukan agar mencegah terjadi kontaminan.

Lalu kita melakukan pengenceran kultur yang telah diinkubasi 48 jam pada media PGYB. Yang dilakukan pertama bunsen dinyalakan, lalu disterilisasi mikropipet dengan cara menyemprotkan alkohol keseluruh bagian kemudian dilap searah dengan menggunakan tissue. Kemudian diambil mikro tip dengan pada gelas beker. Cara mengambilnya dengan menekan tombol lalu dibuka kertas payung dan kapas. Ditancapkan mikropipet pada mikrotip dan tombol dilepas secara perlahan agar mikrotip terpasang. Kemudian diangkat mikropipet dan dirapat kan mikrotip dengan memegang dan memutar bagian kasarnya. Dihomogenkan kultur pada vortex hingga ada pusaran yang menyentuh dasar tabung. Setelah itu dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet dan diambil kultur pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu diambil tabung reaksi yang berisi pepton 9ml dengan berlabel 10-1. Dan dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet dan dituangkan kultur pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Setelah itu dilakukan pengenceran lagi pada tabung reaksi berisi 9ml yang berlabel 10-2. Dengan mengambil 1ml pada tabung reaksi 10-1 dengan menggunakan mikropipet yang telah terpasang mikro tip baru. Dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet dan diambil larutan pada tabung reaksi sebanyak 1ml. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu diambil tabung reaksi 10-2 dan dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan mikropipet yang berisi larutan 10 -1 sebanyak 1ml dan dimasukkan larutan tadi pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Setelah itu dihomogenkan dengan vortex hingga muncul pusaran yang menyentuh pada dasar tabung. Hal ini bertujuan agar larutan benar-benar homogen. Dan hasil pengenceran 10-2 yang digunakan untuk sample.

Lalu sample tadi diambil dengan menggunakan pipet tetes. Dengan cara dibuka sumbat kapas dengan cara menjepitnya diantara jari manis dan kelingking lalu ditarik. Setelah dibuka dipanaskan mulut tabung pada bunsen, lalu dimasukkan pipet tetes dan diambil larutan pada tabung reaksi. Kemudian dipanaskan lagi mulut tabung dan ditutup dengan menggunakan sumbat kapas tadi. Lalu diambil haemocytometer dan diteteskan sebanyak 1 tetes pada 2 kotak. Kemudian ditutup 2 kotak tadi dengan cover glass, caranya dengan sebelum menutup ditaruh dengan sudut 45ᴏ lalu ditutupkan secara perlahan. Hal ini bertujuan agar pada saat menututp tidak terdapat gelembung yang dapat mengganggu pengamatan.

Haemocytometer yang telah di meja mikroskop. Lalu dijepit dengan penjepit kaca agar tidak bergeser-geser atau bergerak. Digunakan lensa objektif dengan pembesaran 40x untuk memfokuskan. Jika sudah fokus, digunakan lensa objektif dengan pembesaran 400x. Dan dicari ujung terpojok. Misal ditemukan pada pojok kiri bawah, maka dihitung pada petak satu, jika sudah digeser dan dihitung petak satunya. Bergeraknya dari kiri kekanan hingga kelima dan jika sudah geser keatas hingga pola mengular. Setelah dihitung semua hingga didapatkan 25 petak. Selanjutnya di hitung jumlah sel/ml pada jumlah sel tadi dengan menggunakan rumus.

1. Tuliskan hasil pengamatan jumlah sel menggunakan Haemacytometer (Data Kelas)(Data ini adalah data 25 kotak besar) S.Cerevisae 24 jam inkubasi

No. Petak Jumlah sel No. petak Jumlah sel1. 2 14. 62. 3 15. 73. 3 16. 114. 3 17. 35. 7 18. 46. 2 19. 57. 7 20. 38. 7 21. 29. 4 22. 1110. 4 23. 211. 5 24. 512. 1 25. 813. 5

2. Hitunglah rata-rata jumlah sel serta jumlah sel dalam bahan/ml.

Menggunakan rumus :

Jumlah sel/ml = jumlah sel rata−rata petak x1000 x Fp

Luas Petak x Kedalaman Petak (Endriyati, 2010).

FP = 10-2

Rata-rata jumlah sel = 4,8 x1000 x 0,01

0,04 x 0,1= 48

4.10−3=1,2× 104 sel /mL

DATA HASIL PENGAMATAN

1. Tuliskan hasil pengamatan jumlah sel menggunakan Haemacytometer (Data Kelas)(Data ini adalah data 25 kotak besar) S.Cerevisae 48 jam inkubasi

No. Petak Jumlah sel No. petak Jumlah sel1. 1 14. 42. 5 15. 33. 6 16. 14. 4 17. 35. 7 18. 46. 3 19. 27. 3 20. 48. 0 21. 69. 6 22. 010. 4 23. 411. 5 24. 312. 1 25. 113. 2

2. Hitunglah rata-rata jumlah sel serta jumlah sel dalam bahan/ml.

Menggunakan rumus :

Jumlah sel/ml = jumlah sel rata−rata petak x1000 x Fp

Luas Petak x Kedalaman Petak (Endriyati,

2010).

FP = 10-2

Rata-rata : 8225

=3,28

Rata-rata jumlah sel = 3,28 x 1000 x0,01

0,04 x0,1= 32,8

4. 10−3=8,2 ×103 sel/mL

DATA HASIL PENGAMATAN

3. Bahas data yang anda peroleh.Dari kedua percobaan diatas didapatkan bahwa pada S. Cerevisiae yang diinkubasi selama 24 menghasilkan data yang berbeda pada saat diinkubasi selama 48 jam menghasilkan jumlah sel yang berbeda. Pada S. Cerevisiae yang diinkubasi 24 jam didapatkan jumlah sel/ml adalah sebesar 1,2 × 104 sel/ml. Dan pada S.Cerevisiae yang diinkubasi selama 48 jam didapatkan jumlah sel sebesar 8,2 × 103 sel/ml. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa terjadi kesalahan. Menurut Suryanto (2006), Jumlah bakteri yang diinkubasi lebih lama akan menghasilkan jumlah sel yang lebih banyak daripada jumlah sel yang lebih kecil, karena pada saat diinkubasi lebih lama maka bakteri tersebut akan membelah.

4. Tuliskan kesimpulan yang anda peroleh pada praktikum ini!Enumerasi mikroba dilakukan dengan menghitung jumlah sel yang tampak pada saat diamati menggunakan mikroskop (Madigan, 2010). Metode enumerasi memiliki keunggulan yaitu hemat dan hasil dapat langsung dihitung. Dalam enumerasi mikroba dengan mengamati menggunakan haemocytometer. Dalam menghitung jumlah sel pada haemocytometer digunakan rumus :

Jumlah sel/ml = jumlah sel rata−rata petak x1000 x Fp

Luas Petak x Kedalaman PetakDari data S. Cerevisiae 24 jam didapatkan jumlah sel 1,2 × 104 sel/ml. Dan pada S. Cerevisiae 48 jam didapatkan hasil jumlah sel sebanyak 8,2 × 103 sel/ml

5. Sebutkan kelebihan dan kelemahan dalam penghitungan mikroba menggunakan haemocytometer!

Menurut Koesmadji (2006), kelebihan dalam menghitung mikroba dengan menggunakan haemocytometer adalah Mudah, murah karena tidak diperlukan banyak media, dapat dilakukan secara langsung. Namun kelemahan dari haemocytometer adalah tidak dapat membedakan antara sel hidup dengan sel mati sehingga kurang akurat, alat ini sangat sensitif (mudah rusak).

6. Jika pada pengamatan sel menggunakan haemocytometer diperoleh data sebagai berikut, hitunglah jumlah sel yeast per ml bahan!

No. Petak Jumlah sel No. petak Jumlah sel1. 46 14. 252. 59 15. 283. 37 16. 694. 53 17. 445. 41 18. 526. 52 19. 407. 35 20. 518. 48 21. 629. 54 22. 3910. 63 23. 5711. 42 24. 5112. 50 25. 6013. 49

Menggunakan rumus :

Jumlah sel/ml = jumlah sel rata−rata petak x1000 x Fp

Luas Petak x Kedalaman Petak (Endriyati, 2010).

Rata-Rata : 48,28

Jumlah sel/ml = 48,28 x1000 x 0,01

0,04 x 0,1=75437500 sel/ml

Komponen Penilaian :Jenis Penilaian Nilai Nilai yang diperoleh

Pre lab dan Diagram Alir 10Log book 10Data Hasil Pengamatan dan Pembahasan 70Aktivitas di lab 10

TOTAL 100

Kompetensi Mahasiswa dan Nilai Maksimal Tiap Kompetensi

No Kompetensi Bisa Tidak

1. Mampu membuat preparat untuk enumerasi langsung

2. Mampu menentukan petak yang digunakan pada pembacaan haemocytometer

3. Mampu menghitung jumlah mikroba menggunakan haemocytometer

4. Mampu menghitung jumlah mikroba per ml bahan

TOTAL 10

DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN

Koesmadji. 2002. Teknik Laboratorium. Jakarta : Universitas Pendidikan Indonesia PressMadigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2010. Brock Biology of Microorganisms. New Jersey:

Pearson Prentice HallSuryanto, D. dan E. Munir. 2006. Bahan Ajar : Mikrobiologi. Universitas Sumatera

Utara.Medan

KESIMPULAN

Enumerasi mikroba secara langsung dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang tampak pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Teknik ini banyak digunakan karena dapat dilaksanakan dengan cepat dan murah dengan menggunakan haemocytometer. Haemocytometer merupakan alat yang terbuat dari lempeng gelas yang pada permukaannya terdapat petak-petak yang sangat kecil berbentuk bujur sangkar dengan luas dan kedalaman tertentu.

Dari percobaan diatas didapatkan 2 hasil perhitungan. Pada S.Cerevisae yang diinkubasi selama 24 jam, jumlah selnya pada 1 kotak haemocytometer adalah sebanyak 700.000 sel/ml dengan faktor pengenceran 10-1. Kemudian pada S.Cerevisae yang diinkubasi selama 48 jam, jumlah selnya pada 1 kotak haemocytometer adalah sebanyak 295.000 sel/ml. Dari kedua data tersebut dapat dibandingkan bahwa S.Cerevisiae yang diinkubasi selama 24 jam dengan S.Cerevisiae yang diinkubasi selama 48 jam menghasilkan jumlah sel yang dihasilkan berbeda. Pada S.Cerevisiae jumlah sel yang dihasilkan adalah sebesar 700.000 sel/ml sedangkan pada S.Cerevisiae sebesar 295.000 sel/ml. Hal ini tidak sesuai dengan literature yang menyatakan bahwa jumlah bakteri yang berumur lebih lama akan menghasilkan jumlah sel yang lebih banyak karena bakteri semakin lama semakin banyak (membelah). Kesalahan yang terjadi kemungkinan karena adanya kesalahan dalam penghitungan atau keadaan lingkungan dan diri yang kurang aseptis sehingga terjadi kontaminasi dan jumlah bakteri yang terhitung menjadi lebih banyak.