Laporan Dena

ISOLASI DNA

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Dena Rahayu : B1J010019 : IV :4 : Tia Apriani

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2012

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. Molekul molekul yang berisi ikatan demikian itu mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah struktur kimia yang berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu. Misalnya saja satu atom hidrogen dapat berpindah dari suatu gugusan asam amino (-NH2), dengan meninggalkan gugusan asam amino (-NH) dan muatan negatif netto yang diserap oleh sistem cincin molekul yang berkonjugasi. Fluktuasi kimia semacam itu disebut pergeseran tautomer, dan struktur struktur molekul berbeda yang dihasilkannya disebut tautomer. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya. DNA adalah polimer bukleotida biasa : bila dua nukleotida digabungkan, molekul resultannya disebut dinukleotida ; bila tiga menjadi trinukleotida ; bila beberapa membentuk polinukleotida. Hanya satu gugusan fosfat dari setiap trifosfat pelopor termasuk dalam polimer. Gugusan fosfat ini, yang terikat pada 5- karbon gula pentosa pada satu nukleotida, juga terikata secara kimiawi pada 3- karbon gula nukleotida kedua, sehingga suatu deret 5-3 pautan fosfat mengikat nukleotida nukleotida itu menjadi satu sejauh panjangnya polimer. Ikatan ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester.

B. Tujuan Tujuan dari praktikum Isolasi DNA buah dan bakteri adalah untuk mengisolasi DNA buah dan bakteri serta mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah kantung plastik, kain kasa (perban), pipet plastik, sarung tangan, rak plastik, tabung effendorf, bak, tabung mikrosentrifuge 1,5 ml, sarung tangan, tabung reaksi, beaker glass, saringan, tabung falcon, sendok, penangas air dan kertas saring. Bahan yang digunakan adalah deterjen cair, NaCl (garam dapur), alkohol 96%, akuades, tenderizer, buah Alpukat (Persea americana), buah Naga (Hylocereus undatus), buah Mangga (Mangifera indica), bawang bombay (Allium sativum L.), isolat E.coli.

B. Metode Isolasi DNA buah 1. Buah dimasukkan kedalam kantung plastic dan dihancurkan. 2. Larutan ekstraksi 50 ml ditambahkan (900 ml akuades, 100 ml deterjen, 2 sendok teh garam dapur) kedalam kantung plastik yang berisi buah. 3. Ekstrak buah disaring ke dalam tabung. 4. Alkohol 96% ditambahkan ke dalam tabung reaksi tadi hingga timbul kabut putih. 5. Amati kabut putih yang terbentuk dan diambil kabut putih tadi dengan pipet kemudian, dimasukkan ke tabung effendorf lalu, amati dan dielektroforesis. Isolasi DNA bakteri E.coli 1. Isolat E.coli diambil dan disentrifuge 1,5 ml dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. 2. Supernatan dibuang dan dipisahkan kemudian, ditambahkan 100 l akuades, dan disuspensi. 3. Inkubasi suhu 1000C selama 10 menit kemudian, disentrifuge 12000 rpm selama 10 menit. 4. Supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge steril. 5. Simpan pada suhu -200C. 6. Elektroforesis.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Tabel 1. Isolasi DNA kromosom Kabut putih yang terbentuk Kelompok Isolasi DNA Isolasi DNA buah atau bawang bombay 1. 2. 3. 4. 5. 6. Buah Alpukat Bawang Bombay Bawang Bombay Buah Naga Buah Strawberry Buah Mangga Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Isolat E. coli

Gambar 1. Kelompok 1 Isolasi DNA buah alpukat

Gambar 2. Kelompok 1 Isolasi DNA E. Coli

Gambar 3. Kelompok 2 Isolasi DNA Bawang Bombay

Gambar 4. Kelompok 2 Isolasi DNA E. coli

Gambar 5. Kelompok 3 Isolasi DNA Bawang Bombay


Gambar 7. Kelompok 4 Isolasi DNA Buah Naga


Gambar 9. Kelompok 5 Isolasi DNA Buah Strawberry


Gambar 11. Kelompok 6 Isolasi DNA Buah Mangga


B. Pembahasan Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang digunakan untuk memisahkan DNA dari sel, baik dari inti, mitokondria, maupun kloroplas. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada dibagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Pierce, 2005:203). Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA oleh kelompok 4 menggunakan Buah Naga sebagai sampel. Langkah awal isolasi DNA adalah potongan Buah Naga dimasukkan kedalam plastik kemudian dihancurkan. Selanjutnya

ditambahkan akuades dan garam dapur serta deterjen cair. Akuades digunakan sebagai pelarut. Penambahan garam dapur berfungsi sebagai buffer penyangga pH larutan dan deterjen cair untuk melisiskan sel. Kemudian hasilnya disaring dan ditambahkan tenderizer. Tenderizer atau pengempuk daging ini berfungsi seperti halnya enzim protease. Kemudian dari penyaringan tadi ditambahkan alkohol 96% dan selanjutnya diambil 2 ml untuk dimasukkan kedalam tabung effendorf. Hasil yang didapatkan ialah timbulnya kabut putih yang kemudian dimasukkan kedalam tabung effendorf. Kabut ini diduga mengandung DNA setelah dielektroforesis. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain : preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein

dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan detergen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball, 1996). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002 : 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254). Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain ytang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secra kimiawi. Jika dengan cara mekanik bisa dilakukan dengan memblender atau menggerus dengan menggunakan mortar dan pistil. Fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat. Karena pada garam ini memang dapat menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi. Penambahan garam juga dpat digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir dengan kutub negatif fosfat DNA. Dalam hal ini penambahan garam bisa dikatakan dapat membantu dalam hal pemekatan DNA (Dollard, 1994). Selain itu, garam atau NaCl memegang peran penting yang lain untuk menghilangkan protein dan karbohidrat atau sebagai buffer karena garam dapat menyebabkan kedua terpresipitasi dan bersama sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer.

Fungsi dari penambahan deterjen yaitu untuk melisiskan barier sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel. Karena pada deterjen mengandung sodium dodesil sulfat (SDA) yang dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membran akan rusak dan melisiskan isi sel (Machfud, 2006). Pada saat penghancuran jaringan jaringan sampel pada awal proses isolasi DNA, terjadi pelepasan senyawa polifenol dan polisakarida (Zubaidah, : 38). Macam-macam deterjen yang digunakan juga berpengaruh pada hasil dari isolasi DNA dengan kualitas baik karena kandungan pada masing masing detergen berbeda. Detergen yang digunakan pada praktikum kali ini adalah detergen cair. Fungsi dari penambahan alkohol atau etanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu alkohol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan (Jamilah, 2005). Alkohol yang digunakan pada praktikum ini adalah alcohol 96%. Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air (Jamilah 2005). Jika melihat dari jenis buah yang digunakan sebagai sumber DNA, ternyata buah yang memiliki kadar air rendah menghasilkan presipitasi DNA yang lebih baik jika dibandingkan dengan sumber DNA yang dari buah yang memiliki kadar air yang tinggi. Praktikum kali ini, selain mengisolasi DNA dari berbagai macam buah dan bawang Bombay, kita juga melakukan Isolasi DNA bakteri E.coli yang dilakukan dengan cara kultur 1,5 ml E.coli di sentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit setelah itu supernatan dibuang, tambahkan 10 mikro liter detergen dan 90 mikro liter akuades steril dan dipanaskan pada suhu C selama 10 menit, lalu

disentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Simpan

dielektroforesis. Isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan

menambahkan deterjen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. Menurut Anonim (2005, dalam Jamilah, 2005) proses ekstraksi DNA dari sel adalah langkah pertama dalam prosedur pemisahan DNA dari substansi lain yang tidak dionginkan dengan sangat hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah mengeluarkan DNA dari dalam sel. Hal ini dapat dilakukan dengan merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti. Usaha ini bisa dilakukan dengan cara fisik maupun kimiawi. Cara fisik bisa dilakukan dengan kekuatan mekanis seperti pemblenderan, penggerusan, atau peremasan dengan tangan. Sedangkan cara kimiawi bisa dilakukan dengan cara melisiskan barier sel menggunakan senyawasenyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel (Anonim, 2005). Menurut Chen (2010) ekstraksi DNA merupakan langkah rutin dalam studi biologi yang meliputi identifikasi molekuler, inferensi filogenetik, genetika, dan genomik. Selain itu, ekstraksi DNA juga sering digunakan dalam pemeriksaan medis, diagnosa klinis, dan penyelidikan forensik. Oleh karena itu, berbagai metode telah dibentuk untuk mengisolasi molekul DNA dari bahan biologis dan banyak ekstraksi DNA kit tersedia secara komersial. Metode yang berbeda memiliki berbagai efek pada ekstraksi DNA. Teknik ekstraksi yang ideal harus mengoptimalkan hasil DNA, meminimalkan degradasi DNA, dan efisien dalam hal biaya, waktu, tenaga, dan persediaan. Hal ini juga harus sesuai untuk mengekstraksi beberapa sampel dan menghasilkan limbah berbahaya yang minimal.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan diperoleh kesimpulan sebagai berikut : 1. Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang digunakan untuk memisahkan DNA dari sel, baik dari inti, mitokondria, maupun kloroplas. 2. Tahap-tahap isolasi DNA meliputi perusakan dan pembuangan dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel dan pemisahan DNA dari protein dan RNA. 3. Tahapan isolasi pada DNA bakteri ialah isolasi DNA, pemberian fenolkloroform, sentrifuge 5000 rpm kemudian supernatan dibuang, penambahan isoamil alkohol dan disentrifuge kembali 12000 rpm, penambahan fenol kemudian disentrifuge, dan yang terakhir ditambah kloroform.

B. Saran Diharapkan mahasiswa dapat lebih memahami tentang isolasi DNA, dan mampu membedakan isolasi DNA bakteri maupun isolasi DNA buah.

DAFTAR REFERENSI

Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Roberts, K., Watson, J.D., 1994, Molecular Biology Of The Cell, Third ed, 1255, 1269, 1270, 1282, 1283, Garland Publ Inc,NY and London. Anonim. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ, (Online), (http://www.gslc.genetics.utah.edu/units/activities/wheatgerm.html, diakses 28 Mei 2012). Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2002. Biologi. Terj. dari Biology; oleh Lestari, R. dkk. Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm. Chen, H., Rangasamy, M., Yee Tan, S., Wang, H., D. Siegfried, B., 2010. Evaluation of Five Methods for Total DNA Extraction from Western Corn Rootworm Beetles. Department of Entomology, University of NebraskaLincoln, Lincoln, Nebraska, United States of America. Plos One. Volume 5, Issue 8, e11963. Choirul Mahfud. 2006. Pendidikan Multikultural. Yogyakarta : Pustaka Pelajar. Dollard.1994. Personality and psychotherapy: an analysis in terms of learning, thinking and culture. New York: McGraw-Hill. Harley. 2005. The Internet Complete Reference, second edition. McGraw-Hill, California. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Kimball, J.W. 1996. Biologi. Erlangga, Jakarta. Mary B Pierce. 2005. Age at menarche and adult BMI in the Aberdeen Children of the 1950s Cohort Study. American Journal of Clinical Nutrition. October. Vol. 82. No. 4. 733-739. Zubaidah, Siti. 2004. Identifikasi, Variasi Genetik, Distribusi dan Upaya Eliminasi Bakteri Penyebab CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration). Desertasi tidak diterbitkan. Malang: Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya.

Laporan Dena

Documents

Transcript of Laporan Dena