Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin/10 Maret 2014

Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Syaefudin, SSi, MSi

Asisten : Dwi Ayu S

Nazula Rahma S

M. Maftuchin S.

PENENTUAN PROTEIN METODE BRADFORD

Kelompok 26

Navia Belladina G84120059

Khairika Helyuputri G84120093

Saepul Rahmat G84120029

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PENDAHULUAN

Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau

manusia. Protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam

pembentukkan dan pertumbuhan tubuh. Protein merupakan polipeptida yang

mempunyai bobot molekul dari 5000 hingga satu juta (Poedjiadi dan Supriyanti

2007).

Metode analisis protein dapat dilakukan dengan uji kualitatif. Untuk

mengetahui keberadaan atau jenis protein dalam suatu bahan, sedangkan uji

kuantitatif dapat dilakukan untuk mengetahui jumlah kandungan proteindalam

suatu bahan. Beberapa jenis uji yang dilakukan pada protein diantaranya uji

ninhidrin, uji biuret,xantoprotein, Uji Hopkins-Cole, Uji Heller, Uji Koagulasi

Panas, Uji Asam Sulfosalisilat, Uji Orto-Tolidin, Uji Benzidin, Uji Guaiac, Uji

Bradford (Bintang 2010). Uji protein yang digunakan dalam praktikum ialah

penggunaan metode uji Bradford.

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk

menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat

warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein (Bradford 1976). Zat warna

tersebut akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang

mengandung protein tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan.

Panjang gelombang yang digunakan 595 nm. Hal itu dikarenakan zat warna yang

diikat oleh bagian hidrofobik protein ialah bentuk anionnya yang nilai absorbansi

maksimumnya berada pada panjang gelombang terebut (Bradford 1976). Metode

ini hanya digunakan untuk mendeteksi protein yang memiliki konsentrasi hingga 20

L.

Praktikum bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan

metode spektrofotometri dengan menggunakan kurva standar. Praktikum juga dapat

mempraktikan prinsip metode Bradford dalam analisis protein.

METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum dilakukan pada hari Senin, 10 Maret 2014 pukul 08.00-11.00 WIB

di Laboratorium Pendidikan-1 Biokimia, Departemen Biokimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, Dramaga,

Bogor.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektrofotometer 20,

neraca analitik, gelas piala, dan pipet. Bahan-bahan yang digunakan pada

praktikum ini antara lain reagen Bradford, BSA,NaCl, dan sampel protein.

Prosedur Percobaan

Pembuatan kurva standar. Dua belas tabung reaksi yang bersih dan

kering di siapkan. Kemudian pada tabung 1, dicampurkan larutan BSA 0L dan

NACL 100L. Tabung 2 dicampurkan larutan BSA 10L dan NaCl 90L. Tabung

3 dicampurkan larutan BSA 20L dan NaCl 80L. Tabung 4 dicampurkan larutan

BSA 30L dan NaCl 70L. Tabung 5 dicampurkan larutan BSA 50L dan NaCl

50L. Tabung 6 dicampurkan larutan BSA 100L dan NaCl 0L. kemudian,

tambahkan 5 ml reagen Bradford pada setiap tabung, lalu dikocok dan dibiarkan

selama selang waktu lima menit hingga satu jam. Pada tabung 1, digunakan sebagai

larutan blanko. Kemudian, baca pada absorbans 595nm untuk setiap tabung.

Terakhir, kurva standar dibuat antara absorbans 595nm dan rata-rata konsentrasi

protein.

Penentuan konsentrasi protein sampel. Praktikum ini dilakukan dengan

mengencerkan terlebih dahulu 0,5 ml suatu sampel protein dengan 4,5 ml aquades.

Lalu, dipipet kedalam dua tabung reaksi masing-masing sebanyak 0,05 ml dan

2,5ml reagen Bradford. Kemudian kedua tabung larutan diukur nilai absorbannya

dengan menggunakan spektrofotometer.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Berikut adalah hasil percobaan yang dilakukan terhadap pembuatan kurva

standar dan analisis kadar protein.

Tabel 1 Absorbansi kurva standar BSA

Tabung Absorbansi Terukur Absorbansi Terkoreksi

[BSA] mg/ml

1 0,694 0 0,0000

2 0,816 0,122 0,1000

3 0,864 0,170 0,2000

4 0,925 0,231 0,3000

5 1,059 0,365 0,5000

6 2,230 1,536 1,0000

Contoh Perhitungan :

Konsentrasi BSA tabung 2

V1 X M1=V2 X M2

0,01 ml x 1 mg/ml = 0,1 ml x M2

M2= 0,1 mg/ml

Gambar 1 Hubungan konsentrasi BSA dengan Absorbansi

Tabel 2 Analisis kadar protein

Sampel Absorbansi

terukur

Absorbansi

terkoreksi

[Protein] (mg/ml)

1 0,883 0,189 2, 071

2 0,984 0,290 2,743

Contoh Percobaan

Faktor Pengenceran (FP)=

Kadar protein sampel

Y= a + bx

Y = 1.5047x - 0.1227

0,189 = 1.5047x- 0.1227

0,3117 = 1.5047x

x = 0,2071 x FP

x = 0,2071 x 10

x = 2,071 mg/ml

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk

menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat

warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein. (Bradford 1976). Prinsip

metode Bradford adalah pengikatan zat warna oleh protein. Zat warna tersebut

akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang mengandung protein

tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara

zat warna Coomassie Blue G-250 dan protein dapat terjadi dikarenakan adanya

gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls dapat terjadi karena adanya

bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian dari zat warna Coomassie

Blue G-250( penyusun reagen Bradford) yang bersifat non polar sehingga

mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian hidrofobik

protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat kekuatan ionik yang

memperkuat ikatan antara keduanya dan membuat zat warna tersebut menjadi

stabil. Hal ini lah yang digunakan pada metode Bradford untuk menentukan kadar

protein di dalam suatu larutan (Bradford 1976).

Reagen Bradford yang digunakan pada percobaan ini dibuat dengan cara

melarutkan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan

100 ml 85% (w / v) asam fosfat. Kemudian diencerkan sampai 1 L dengan akuades.

Reagen harus disaring melalui Whatman no. 1 filter kertas dan kemudian disimpan

dalam botol kuning pada suhu kamar. Reagen yang disimpan harus disaring terlebih

dahulu sebelum digunakan. (Rosenberg 2004)

Penggunaan NaCl digunakan sebagai tamabahan pada larutan Bovine Serum

Albumin (BSA) yang berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Jika NaCl

yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin banyak

maka protein yang larut akan semakin banyak pula. Hal ini mengakibatkan

pengompleksanantara protein dan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250dalam

reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. Jadi, jika penambahan NaCl semakin

banyak maka nilai absorbansi larutan tersebut semakin kecil(Khopkar 2007). Pada

tabel 1, dapat terlihat seiring berkurangnya volume NaCl pada tabung satu hingga

tabung enam, nilai absorbansi yang terukur semakin besar. Hal ini sesuai dengan

pernyataan Khopkar. Kesalahan yang terjadi dapat diakibatkan dari pengocokkan

yang belum homogen.

Persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar yang menghubungkan

antara nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA)

adalah Y= 1,5047x 0,1227dengan r2 sebesar 0,9209. Ketepatan data dapat dilihat

dari nilai r2 yang diperoleh. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya kesalahan

selama percobaan. Nilai absorbansi sampel ulangan pertama adalah sebesar 0,189

dengan nilai konsentrasi sampel sebesar 2,071 mg/mL. Nilai absorban sampel

ulangan kedua adalah sebesar 0,290 dengan nilai konsetrasi sampel sebesar 2,743

mg/mL. Penentuan kadar protein terlebih dahulu praktikan melakukan pengenceran

larutan. Hal ini disebabkan karena sebelum pengenceran nilai absorbansi semakin

besar. Faktor pengenceran yang didapat adalah 10. Kemudian dikali dengan nilai x

pada persamaan regresi, lalu didapat kosentrasi protein mg/ml.

Selain menggunakan metode Bradford, terdapat berbagai cara dalam

penentuan kadar protein. Refraktori (menyelupkan refraktomer menurut Pulrich)

dengan standar kadar protein n = 0,002/ 1% protein, sangat cepat pelaksanaannya

dan hanya memerlukan sedikit bahan, namun tidak spesifik jadi hanya baik untuk

pengenalan protein. Uji biuret, metode ini untuk penentuan konsentrasi dengan cara

meneteskan protein ke dalam larutan CuSO4 dari berbagai macam konsentrasi.

Penentuan kekeruhan dengan Nephelometer yaitu penentuan intensitas kekeruhan

dengan memberikan standar sulfosalsilat pada larutan protein, namun metode ini

jarang digunakan. Fotometri (reaksi warna), yaitu dengan meneteskan biuret atau

fenol ke dalm larutan protein, reaksi warna akan menjadi biru dari reagenisa biuret

dan reduksi asam heteropoli. Penyisaan basah menurut Kjeldahl merupakan metode

analitik klasik sehingga perlu persiapan lama dan N dari non protein ikut dalam

perhitungan. Selain itu, penentuan kadar protein yang menggunakan dengan metode

Lowry akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada

konsentrasi protein yang ditera. Dalam percobaan kali ini akan digunakan metode

Bradford yang menggunakan suatu pereaksi pewarna yang mampu mengikat

protein di dalam sampel (Kusnawidjaja, 2007).

Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat

sederhana serta mudah disiapkan. Selain itu kompleks warna biru pada larutan yang

diberi reagen Bradford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil. Kestabilan warna

biru coomassie ini karena adanya inteaksi antara lapisan hidrofobik dari protein

dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang

menstabilkan bentuk anion tersebut (adanya gaya van der walls) (Bradford 1976).

Selain itu, uji Bradford juga sangat menguntungkan karena nilai akurasi dan presisi

data yang didapatkan cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel

yang berada di luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan

beberapa menit saja. Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat.

Kelemahan utama metode Bradford adalah reagen khususnya dapat

mengakibatkan perbedaan respon tes untuk jenisprotein yang berbeda. Hal itu

membuat kita harus teliti dalam memilih protein yang akan di ujikan. Sebaiknya

protein yang akan diuji ialah protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati

konsentrasi sampel protein yang diujikan. uji ini kurang akurat untuk asam protein

dasar.Selain itu kelemahan lainnya ialah kurangnya sensitivitasterhadap sampel

yang hanya memiliki sedikit kandungan protein.(Bradford 1976)

SIMPULAN

Kadar protein yang didapat adalah pada ulangan pertama 2,071 mg/ml, pada

ulangan kedua 2,743 mg/ml .praktikan menggunakan kurva standar yang digunakan

untuk menentukan konsentrasi sampel yang nilai absorbansinya telah diketahui.

Prinsip metode Bradford ialah pengikatan zat warna Coomassie Blue G-250 dengan

protein.

DAFTAR PUSTAKA

Bintang Maria.2010.Biokimia teknik Penelitian. Jakarta(ID) : Erlangga.

Bradford MM .1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye

binding. Analitical Biochemistry72 , 248-254.

Khop Rosenberg I.M. 2004. Protein Analysis and Purification: Benchtop

techniques. Massachusetts General Hospital: Bostonkar, S. 2007. Konsep

Dasar Biokimia. Jakarta(ID) : UI Press.

Kusnawidjaja K. 2007. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Negeri

Yogyakarta(ID): Yograkarta.

Poedjiadi A dan Supriyanti FMT. 2007.Dasar-Dasar Biokimia Edisi Revisi.

Jakarta(ID): UI Press.