Deteksi dan Produksi Amilaseoleh :

Restu Nugraha

105090100111007

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIJURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG2013Deteksi dan Produksi AmilaseRestu N., Jurusan Biologi, Fakultas MIPA,

Universitas Brawijaya, Malang

2013

Abstrak

Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil. Penggunaan enzim amilase sangat luas dalam skala industri, misalnya dalam pembuatan roti, pembungkus kertas, pabrik sirup dan glukosa, binatu, obat pencernaan, dan pembersih pakaian . Tujuan dari praktikum ini adalah memahami proses produksi enzim amilase dari mikroorganisme dan mengetahui bakteri yang unggul dalam produksi enzim amilase. Produksi enzim amilase menggunakan metode ekstraksi dengan substrat pati. Langkah awal yang dilakukan adalah deteksi bakteri penghasil amilase, produksi amilase dalam media, ekstraksi enzim, uji aktivitas amilase, dan perhitungan aktivitas amilase. Berdasarkan hasil yang telah didapat pada grafik di atas dapat dilihat bahwa bakteri Bacillus subtilis mempunyai aktivitas amilase tertinggi yaitu 2.68 unit. Sedangkan untuk bakteri Bacillus thuringiensis dan Bacillus coagulans mempunyai aktivitas amilase yang sama besar yaitu sebesar 0.568. Hal ini sesuai dengan pengamatan luasan zona bening yang dihasilkan ketiganya, yaitu Bacillus subtilis mempunyai zona bening terluas.

Kata kunci : amilase, B. coagulans, B. subtilis, B. thuringiensisiDAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ...........i

BAB I PENDAHULUAN ...1

1.1 Latar Belakang ....1

1.2 Rumusan Masalah .......2

1.3 Tujuan .....................2

1.4 Manfaat .......................2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........3

2.1 Amilase....................................................................3

2.2 Bakteri Genus Bacillus....5

BAB III METODE .....................................8

3.1 Waktu dan Tempat ......................8

3.2 Cara Kerja .......................................8

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........10

BAB V PENUTUP ..................................................14

5.1 Kesimpulan .........................14

5.2 Saran................14

DAFTAR PUSTAKA .........15

Bab I

Pendahuluan

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme golongan bakteri mempunyai prospek yang sangat menjanjikan dalam banyak bidang kehidupan manusia. Salah satu prospek tersebut adalah sebagai penghasil enzim. Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil (Reddy et al., 2003). Enzim yang digunakan untuk keperluan industri sebagian besar diisolasi dari mikroba. Pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan dengan enzim yang diisolasi dari tumbuhan maupun hewan. Keuntungan itu antara lain sel mikroba lebih mudah untuk ditumbuhkan dan kecepatan pertumbuhannya relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah ditingkatkan apabila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif lebih murah, kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya perubahan musim dan waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih singkat (Poernomo, 2003). Amilase secara umum diproduksi oleh tumbuhan, hewan, manusia dan mikroba, tetapi enzim amilase yang berasal dari fungi dan bakteri mendominasi penggunaan enzim amilase di bidang industri. Beberapa dari jenis Bacillus sp. dan Actinomycetes, termasuk Termomonospora dan Thermoactinomycetes merupakan kelompok yang memiliki kemampuan besar dalam meproduksi enzim amilase,

Enzim amilase yang dihasilkan oleh mikroba terutama dari bakteri, merupakan jenis enzim ekstraseluler (Palmer, 1985). Bakteri menghasilkan enzim ini di dalam sel dan menggunakannya di luar sel, yaitu untuk menghidrolisis sumber makanan yang mengandung amilum yang terdapat di lingkungannya.

Penggunaan enzim amilase sangat luas dalam skala industri, misalnya dalam pembuatan roti, pembungkus kertas, pabrik sirup dan glukosa, binatu, obat pencernaan, dan pembersih pakaian (Brock dan Brock, 1978). Melihat segala potensi di atas, proses produksi enzim dalam praktikum ini menjadi penting untuk dilakukan. 11.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah yang dapat diambil dari praktikum ini adalah :a. Bagaimana proses produksi enzim amilase oleh bakteri?

b. Bakteri apa yang memproduksi enzim amilase tertinggi?1.3 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah :a. Memahami proses produksi enzim amilase dari mikroorganisme.

b. Mengetahui bakteri yang unggul dalam produksi enzim amilase.1.4 Manfaat

Manfaat yang didapat setelah melakukan praktikum ini adalah mampu memproduksi enzim amilase dengan bantuan bakteri tertentu untuk kemudian dapat dikomersialkan mengingat beragam manfaat dari enzim amilase. 2Bab II

Tinjauan Pustaka

2.1 Amilase

Salah satu jenis enzim yang banyak dihasilkan oleh mikroorganisme adalah enzim amilase. Enzim amilase memiliki distribusi yang sangat luas dan merupakan salah satu jenis enzim yang paling banyak dipelajari baik di Indonesia maupun di luar Indonesia. Enzim ini memiliki aplikasi untuk skala yang sangat luas mulai dari industri tekstil sampai ke pengujian-pengujian yang sangat luas (Aiyer, 2005). Kebutuhan amilase di dunia sangat tinggi. Tercatat pada tahun 2004 saja penjualan mencapai sekitar US $2 milyar, sedangkan amilase yang digunakan untuk industri makanan dan minuman pada tahun 2004 bernilai sekitar US $11 juta. Produksi amilase sendiri diperoleh oleh Bacillus lichineformis dan Aspergillus sp. sekitar 300 ton enzim murni pertahun (Sivaramkrisnan et al., 2000). Enzim amilase digunakan dalam menghidrolisis berbagai jenis sumber amilum menjadi senyawa-senyawa sederhana seperti maltosa, glukosa dan produksi bioetanol yang memiliki nilai ekonomi lebih tinggi. Enzim amilase merupakan salah satu dari enzim hidrolitik yang dapat memecah ikatan-ikatan pada amilum hingga terbentuk maltosa (Poedjiadi, 1994). Pengetahuan tentang manfaat amilase yang berasal dari mikroba untuk hal yang bersifat komersial merupakan awal dari penggunaan enzim dalam industri beberapa dekade yang lalu (Walter & Nagesh, 1965). Saat ini amilase yang bersumber dari mikroorganisme termofil dan hipertermofil lebih banyak digunakan dalam bidang industri, terutama industri yang menggunakan suhu tinggi dalam prosesnya. Hal ini terjadi karena enzim yang berasal dari mikroorganisme tersebut memiliki termostabilitas dan aktivitas yang tetap optimal pada suhu yang tinggi (Vieille & Zeikus, 2001).

Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil (Reddy et al., 2003). Amilase dihasilkan oleh berbagai jenis organisme hidup, mulai dari tumbuhan, hewan, manusia bahkan pada mikroorganisme seperti bakteri dan fungi. Kelompok enzim ini memiliki banyak variasi dalam aktivitasnya, sangat spesifik, tergantung pada sumber asli 3

organismenya dan tempatnya bekerja. Enzim amilase memiliki nama diastase dan pertama kali ditemukan dan diisolasi oleh Anselme organismenya dan tempatnya bekerja. Enzim amilase memiliki namaPayen pada tahun 1833. Seiring dengan penemuan-penemuan baru di bidang penelitian kelompok enzim amilase yang dapat mendegradasi amilum dan senyawa polisakarida lainnya juga semakin bertambah jumlahnya. Menurut Aiyer (2005), Hagihara et al. (2001) beberapa

kelompok enzim amilase tersebut adalah: a. Alpha amilase ( amilase), EC.3.2.1.1

Disebut juga dengan 1,4-D-glukan glukanohidrolase atau glukogenase. Enzim ini bekerja memutus ikatan -1,4 glikosida pada amilum secara acak terutama pada rantai yang panjang sehingga menghasilkan maltotriosa dan maltosa dari polimer amilosa pada amilum, dan menghasilkan glukosa dan sedikit dekstrin dari polimer amilopektin penyusun amilum. Karena sifatnya yang dapat memutus ikatan glikosida secara acak, enzim ini bekerja lebih cepat dibanding amilase lainnya terutama -amilase. Pada kelompok hewan amilase merupakan enzim pencerna amilum yang utama. Enzim amilase merupakan kelompok metaloenzim yang tidak dapat bekerja sama sekali bila ion kalsium tidak ada (Palmer, 1985). Amilase merupakan jenis enzim yang bersifat calcium metalloenzyme dependent.b. Beta amilase (-amilase) , EC.3.2.1.2

Disebut juga 1,4-D-glukan maltohidrolase ataupun sakarogen amilase. Enzim ini dijumpai pada kelompok tumbuhan, bakteri dan fungi. Enzim ini bekerja menghidrolisis amilum dari bagian ujung non reduksi dan menghidrolisis ikatan -1,4 glikosida pada tahap kedua hidrolisis amilum sehingga terbentuk molekul maltosa yang disusun oleh dua unit glukosa pada saat yang sama setelah -amilase bekerja. Selama proses pematangan buah -amilase bekerja memecah amilum menjadi gula sehingga buah yang matang terasa manis. Jaringan hewan tidak menghasilkan enzim -amilase, kecuali bila ada mikroorganisme yang bersimbiosis di saluran pencernaannya.

c. Gamma amilase ( amilase), EC.3.2.1.3

Disebut juga glucan 1,4-glukosidase, amiloglukosidase, ekso-1,4-glukosidase, lisosomal -glukosidase, glukoamilase, 1,4--D-glukan glukohidrolase. Merupakan pemutus terakhir ikatan glikosida pada bagi ujung non reduksi dari amilosa dan amilopektin 4

untuk menghasilkan unit glukosa.d. Pullulanase, EC.3.2.1.41

Merupakan enzim pemutus cabang, menghidrolisis hanya pada ikatan -1,6 glikosida, seperti pullulan 6-glukanohydrolase.e. -Glukosidase,EC.3.2.1.20

Memutus ikatan -1,4 glikosida dari molekul amilosa ataupun amilopektin menjadi rantai-rantai pendek oligosakarida.

f. Enzim Penghasil Siklodekstrin

Enzim yang dapat menghidrolisis amilum menjadi jenis siklik D-glukosil non reduksi yaitu suatu jenis polimer yang disebut siklodekstrin atau sakhardinger dekstrin. Jenis ini dijumpai misalnya pada amilase yang dihasilkan oleh Bacillus macerans.

Berdasarkan arahnya memutus ikatan glikosida dari amilum, maka enzim amilase dapat dikategorikan menjadi 2 kelompok (Reddy et al., 2003) yaitu endoamilase dan ektoamilase. Endoamilase melakukan hidrolisis secara acak dari bagian depan molekul amilumsehingga menghasilkan molekul oligosakarida dalam bentuk rantai lurus maupun bercabang dengan panjang rantai yang bervariasi sedangkan ektoamilase melakukan hidrolisis dari ujung non reduksi dan dengan produk akhir molekul yang pendek. Enzim amilase secara konstitusi merupakan kelompok enzim yang sangat dibutuhkan dalam bidang industri, dengan pangsa pasar mencapai hampir 25% dari pasaran enzim di dunia (de Carvalho et al., 2008). Penggunaan enzim amilase dalam industri sangat luas mulai dari industri pembuatan roti, sirup, pemanis, campuran oligosakarida, dekstrin, industri tekstil, pembuatan etanol, pengujian limbah cair yang mengandung amilum, industri detergen, industri obat dan suplemen enzim (Palmer, 1985). Karena enzim ini sangat bernilai komersil maka perlu ditemukan banyak sumber-sumber penghasil enzim amilase dengan karakteristik yang sesuai dengan yang dibutuhkan. 2.2 Bakteri Genus Bacillus

Bakteri yang digunakan untuk produksi amilase dalam praktikum ini adalah 3 kelompok bakteri Bacillus, yaitu Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, dan Bacillus coagulans. Secara umum, kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (bersifat aerobik) 5

sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus dapat membentuk endospora yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki toleransi yang tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah (Priyani et al, 2006).

Beberapa anggota Bacillus memiliki S-layer yang merupakan lapisan crystalline di permukaan subunit protein atau glikoprotein. Bagian kapsul kebanyakan anggota Bacillus mengandung D atau L-glutamic acid, sedangkan beberapa lainnya memiliki kapsul yang mengandung karbohidrat. Variasi struktur dinding sel seperti pada kebanyakan bakteri gram negatif tidak ditemukan pada genus Bacillus. Dinding sel vegetatif kebanyakan anggota Bacillus terbuat dari peptidoglikan yang mengandung Meso-Diaminopimelic acid (DAP) dengan tipe Glyserol Teichoic Acid sangat bervariasi diantara spesies. Kebanyakan anggota genus Bacillus merupakan bakteri yang bersifat motil dan memiliki flagela tipe peritrik (Priyani et al, 2006).

Bakteri Bacillus biasanya banyak ditemukan di tanah. Cara untuk mendapatkan bakteri Bacillus sp. yaitu dengan mengambil sampel tanah menggunakan sendok yang telah disterilisasikan terlebih dahulu kemudian ambil tanah sekitar kedalaman 3 cm dari permukaan tanah. Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif dengan sel batang berukuran 0,3-22x1,27-7 m, sebagian bersifat motil (mampu bergerak) mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel, jika dipanaskan akan membentuk endospora, yaitu bentuk dorman sel vegetatif sebagai bentuk pertahanan diri yang muncul saat kondisi ekstrim yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora dibentuk dalam sporangium di dalam sel dan dibentuk saat sel masak. Endospora memiliki dinding tebal, reaktif, dan sangat resisten. Letak endospora dalam sel ukuran selama pembentukannya tidak sama antara spesies satu dengan lainnya. Beberapa spesies memiliki spora sentral, terminal, atau letal. Endospora dapat berbentuk oval, silindris, bulat, atau lainnya (Priyani et al, 2006).

Bacillus sp. bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, metabolisme dengan fermentasi dan respirasi. Isolat-isolat murni ter-

6

sebut dipelihara dalam medium agar miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Bacillus, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecatan gram, pengecatan negatif, dan motilitasnya. Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainnya berdasarkan sifat-sifatnya yaitu: keseluruhannya merupakan pembentuk spora, hidup pada kondisi aerob baik sebagai jasad yang sepenuhnya aerob maupun aerob fakultatif, selnya berbentuk batang, dan memproduksi katalase.

Kebanyakan anggota genus Bacillus adalah organisme saprofit yang banyak terdapat dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan, seperti Bacillus cereus dan Bacillus subtilis. Beberapa di antaranya patogen bagi insekta. Bacillus cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Organisme ini kadang-kadang dapat menimbulkan penyakit pada orang fungsi imun yang terganggu (misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivitis, atau gastro enteritis akut) (Dwipayana, 2010).7

Bab III

Metodologi

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada 3 Mei 2013, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang.3.2 Cara Kerja3.2.1 Deteksi Bakteri Penghasil Amilase

Praktikum ini menggunakan 3 jenis sampel yang digunakan yaitu Bacillus thuringensis, Bacillus subtilis, dan Bacillus coagulans. Ketiga jenis bakteri ini dikulturkan pada media Nutrien Agar yang mengandung 1 % w/v soluble starch. Kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam. Koloni yang telah tumbuh dilihat mana yang mampu menghasilkan amilase (dapat menghidrolisis pati) yang ditandai dengan terbentuknya zona bening dengan penambahan larutan iodin (Gram B) (Cappuccino, 1983). Bagian yang berwarna hitam menunjukkan masih terdapat kandungan pati disana. Bakteri yang mampu menghasilkan amilase dipindahkan ke media NA miring (agar slant) yang mengandung 1% pati. 3.2.2 Produksi Amilase

Sampel yang telah dikulturkan pada media NA slant diambil 1 oose bakteri diinokulasikan pada media produksi amilase. dengan komposisi sebagai berikut:

Bacteriological pepton

6 gr /lMgSO4.7H2O

0,5 gr /lKCl

0,5 gr /lpati

1 gr /lMedia tersebut dibagi kira-kira sebanyak 30-40 ml. Selanjutnya media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit. Isolat bakteri yang telah diinokulasikan pada media tersebut diagitasi dengan menggunakan shaker selama 72 jam pada kecepatan 120 rpm.

3.2.3 Ekstraksi Enzim dari Bakteri

Bakteri yang didapat disentrifugasi dengan kecepatan selama 5000 rpm selama 20 menit. Hasil supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar dari amilase.83.2.4 Uji Aktivitas Amilase

Laritan Citrate-phosphate buffer pH 6.5 dibuat dengan mencampurkan larutan A 13.6 ml dan B 36.4 ml. Larutan A terdiri dari 0.1 M larutan asam sitrat (0.9605 gr asam sitrat dalam 50 ml aquadest). Sedangkan larutan B adalah 0.2 M larutan Dibasic Sodium Phosphate. Selanjutnya, sebanyak 1 ml ekstrak enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 1% soluble starch yang telah dilarutkan dalam larutan Citrate phospate buffer pH 6.5 yang telah dibuat sebelumnya. Kemudian diinkubasi dalam water bath pada suhu 40oC selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 2 ml reagen DNS (1 gr 3,5-dinitrosaliyclic acid). Kemudian dididihkan selama 5 menit. Setelah suhu turun, dan ditambahkan dengan 20 ml aquadest. d Diukur adsorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. 9

Bab IVHasil dan Pembahasan4.1 Deteksi Bakteri Penghasil Amilase

B. thuringensisB. subtilisB. coagulans

Gambar 1.1 Hasil pengamatan terbentuknya zona bening setelah

penambahan iodin.

Seperti telah dijelaskan, uji untuk melihat aktivitas amilase awal adalah terbentunya zona bening setelah penambahan larutan iodin. Zona bening yang terbentuk di sekeliling isolat setelah ditetesi larutan iodin menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut telah menghidrolisis pati di bagian media pati tersebut (Cappuccino, 1983). Diameter zona bening yang dihasilkan dibagi menjadi beberapa kriteria potensinya. Menurut Igarashi et al (1998), yang mengisolasi bakteri termofilik penghasil enzim amilase dengan aktifitas hidrolitik, potensi tinggi adalah yang zona beningnya > 26 mm, potensi sedang bila diameter zona beningnya berkisar 1426 mm dan potensi rendah bila diameter zona beningnya < 14 mm. Pada praktikum ini tidak dilakukan pengukuran zona bening yang dihasilkan masing-masing isolat, sehingga tidak dapat ditentukan apakah termasuk dalam kategori potensi amilase tinggi, rendah, atau sedang. Tetapi berdasarkan hasil pengamatan, terlihat bahwa zona bening yang yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis memiliki zona bening yang paling luas dibanding kedua isolat lain. Selanjutnya zona bening yang dihasilkan oleh Bacillus coagulans nampak lebih besar bila dibandingkan dengan zona bening pada Bacillus thuringensis. Sehingga kemungkinan besar potensi terbesar produksi amilase dimiliki oleh Bacillus subtilis. 10

4.2 Aktivitas Amilase

Tabel 1. Aktivitas Amilase Jenis Bakteri yang Digunakan

Grafik di atas menyatakan aktivitas amilase dalam satuan unit pada bakteri Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, dan Bacillus coagulans. Perhitungan aktivitas amilase dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Aktivitas enzim amilase (unit):

Konst gula: konsentrasi gula (x)Vol total reaksi: volume total reaksi (ml)

BM

: berat molekul glukosa Vol enzim: volume enzim(ml)

t inkubasi : waktu inkubasi (35 menit)

Satu unit enzim amilase adalah jumlah enzim yang diperlukan yang diperlukan untuk menghasilkan 1 umol gula tereduksi (maltosa) per menit pada suhu 40C (Anam, 2010). Berdasarkan hasil yang telah didapat pada grafik di atas dapat dilihat bahwa bakteri Bacillus subtilis mempunyai aktivitas amilase tertinggi yaitu 2.68 unit. Sedangkan untuk bakteri Bacillus thuringiensis dan Bacillus coagulans mempunyai aktivitas amilase yang sama besar yaitu sebesar 0.568. Hal ini sesuai dengan pengamatan luasan zona bening yang dihasilkan ketiganya, yaitu Bacillus subtilis mempunyai zona bening terluas.

11

Enzim amilase dapat dihasilkan oleh berbagai mikroorganisme dimana salah satunya adalah bakteri dari jenis Bacillus. Pada praktikum kali ini, untuk memproduksi enzim amilase digunakan pati (starch) sebagai substrat. Penggunaan substrat bertujuan untuk dapat menginduksi bakteri untuk menghasilkan enzim amilase. Bacillus dapat dikatakan sebagai inducible enzyme, karena memerlukan substrat dalam proses produksi enzim, maka enzim amilase yang diproduksi dari bakteri jenis (Anam, 2010).

Hasil yang didapat menujukkan perbedaan nilai aktivitas amilase dari ketiga isolat. Hal ini dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti suhu, waktu inkubasi, dan substrat yang digunakan. Pada umumnya enzim amilase secara optimum dihasilkan di titik tertentu pada fase logaritmik dari kurva pertumbuhan mikroorganisme, akan tetapi ada fase tertentu dimana fase logaritmiknya lebih panjang sehingga enzim amilase tidak diproduksi karena fase tersebut belum tercapai sehingga lama inkubasi berpengaruh dalam produksi enzim amilase. Sedangkan faktor suhu dapat berpengaruh karena ada beberapa bakteri yang bersifat thermophilic yaitu bakteri yang lebih optimum dalam produksi enzim amilase dalm kondisi suhu yang lebih tinggi. Tetapi karena dalam praktikum ini digunakan bakteri genus Bacillus yang sebagiann merupakan bakteri thermophilic (Igarashi, 1998), termasuk ketiga isolat yang digunakan, sehingga kemungkinan faktor suhu tidak terlalu berpengaruh.

Untuk lebih mengetahui karakter Bacillus sp. maka diperlukan percobaan lanjutan seperti pengaruh lamanya inkubasi, sampel ekstrak enzim kasar diambil pada selang waktuwaktu tertentu sehingga dapat diketahui beapa lama bakteri tersebut mulai memproduksi enzim amilase dan dapat diketahui juga waktu optimum produksi. Selain itu dapat dilakukan inkubasi pada suhusuhu tertentu sehingga diperoleh pada suhu berapa enzim tersebut optimum memperoduksi enzim amilase. Apabila telah dilakukan optimasi dan produksi enzim yang dihasilkan meningkat sampai pada level tertentu, protein terlarut yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim amilase dapat dikurangi dengan cara pemurnian enzim yaitu bisa dengan dialysis, kromatografi penukar ion, atau dengan ultra filtrasi sehingga aktivitas enzim amilase dari produk yang dihasilkan dapat ditingkatkan (Anam, 2010).

Kisaran suhu optimum pada aktivitas enzim kasar dari ketiga isolat tersebut didukung hasil penelitian sebelumnya yang pernah 12

dilakukan terhadap berbagai jenis enzim amilase dimana suhu optimum untuk enzim amilase dari mikroorganisme thermophilic berkisar antara 50oC70C (Madi et al., 1987; Bessler et al., 2003; Cordeiro et al., 2002). Beberapa spesies Bacillus yang termofil juga ada ditemukan menghasilkan enzim amilase yang memiliki aktivitas optimum pada suhu 80C (Vihinen & Mantsala, 1990; Viara et al., 1993; Carvalho et al., 2008). Mikroorganisme termofil, termasuk kelompok Bacillus, dapat menghasilkan enzim yang memiliki aktivitas pada suhu yang tinggi melebihi enzim dari mikroorganisme mesofil karena 3 komponen perlengkapan yang dimiliki oleh mikroorganisme termofil itu sendiri pertama berupa protein yang tetap stabil, tahan terhadap denaturasi dan proteolisis (Kumar dan Nussinov, 2001). Protein ini dikenal dengan nama Chaperonins yang dapat membantu mikroorganisma termofil mengembalikan fungsi aktivitas enzimnya bila terdenaturasi oleh suhu yang tinggi (Everly dan Alberto, 2000).

Untuk pengaruh pH, aktivitas optimum dari produksi enzim amilase berkisar pada pH 8.0. Aktivitas optimum pada pH 8.0 pernah diteliti sebelumnya pada amilase dari isolat Bacillus sp. strain SMIA-2 (de Carvalho et al., 2008) juga pada amilase dari isolat Bacillus sp. KSM-K38 yang memiliki rentang pH optimumnya 8,0-9,5. Bahkan pada pH 10 aktivitas optimumnya masih mencapai 50% (Hagihara et al., 2001). Aktivitas optimum di pH 6,0 ini juga dijumpai pada enzim amilase dari isolat bakteri Thermus sp. (Fu-Shaw et al., 1995), dan enzim dari isolat limbah pabrik tapioka (Oboh, 2005).13Bab V

Penutup

5.1 Kesimpulan

Produksi enzim amilase menggunakan metode ekstraksi dengan substrat pati. Langkah awal yang dilakukan adalah deteksi bakteri penghasil amilase, produksi amilase dalam media, ekstraksi enzim, uji aktivitas amilase, dan perhitungan aktivitas amilase. Berdasarkan hasil yang telah didapat pada grafik di atas dapat dilihat bahwa bakteri Bacillus subtilis mempunyai aktivitas amilase tertinggi yaitu 2.68 unit. Sedangkan untuk bakteri Bacillus thuringiensis dan Bacillus coagulans mempunyai aktivitas amilase yang sama besar yaitu sebesar 0.568. Hal ini sesuai dengan pengamatan luasan zona bening yang dihasilkan ketiganya, yaitu Bacillus subtilis mempunyai zona bening terluas.

5.2 Saran

Untuk praktikum berikutnya bisa menggunakan kelompok bakteri lain dari genus Bacillus agar bisa dibandingkan produksi enzim amilasenya. 14Daftar PustakaAiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 1251529.Anam, Khoirul. 2010. Produksi Enzim Amilase. Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Bessler C, Schmitt J, Maurer KH & Schmitt RD. 2003. Directed evolution of bacterial -amylase: Toward enhance pH- performance and higher specific activity, Protein Science 12: 2141 149.Cappucino JG. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison Wesley Publishing Company.Cordeiro CA, Martin ML & Luciano AB. 2002. Production and properties of -amylase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 33: 57 61.De Carvalho RV, Correa T & da Silva J. 2008. Properties of an amylase from thermophillic Bacillus sp. Brazillian Journal of Microbiology. 39: 102-107.Dwipayana., Herto. D. 2010. Identification of Bacterial Diversity in Waste Recycling Paint Sludge by Conventuonal Microbiological Technique. Environmental Engineering Study Program. Bandung.Everly C & Alberto J. 2000. Stressors, stress and survival: overview. Front Bioscience. 5: 78086.Fu Shaw J., Fu Pang L & Chiu Chen S. 1995. Purification and properties of an extracellular -amylase from Thermus sp. Bot. Bull. Acad. Sin. 36: 195-200.Hagihara H, Igarashi K & Hayashi Y. 2001. Novel -amylase that is highly Resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM-K38. Applied and Environmental Microbiology. 67:17441750.Igarashi YH, Hiroshi H, Katsuhisha S & Mikio S. 1998. Enzymatic properties of a novel liquefying-amylase from an alkaliphilic Bacillus Isolate and entire nucleotida and amino acid sequences. Appl Environ Microbiol 64: 32823289.Kumar S & Nussinov R. 2001. How do thermophillic protein deal with heat ? A review. Cell. Moll. Life Sci. 58: 1216 233.Madi E, Antranikian G, Ohmiya, K & Gottschalk. 1987. Thermostable amylolytic enzyme from a new Clostridium isolates . Appl Environ Microbiol. 53:1661-1667.15Oboh G. 2005. Isolation and Characterization of amylase from fermented cassava (Manihot esculenta Crantz) waste water. African Journal of Biotechnology. 4: 11171123.Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher.Poedjiadi A. 1994. Dasardasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia coli dalam Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif Detergen. Jurnal Biologi Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37.Reddy N.S., Nimmagadda A & Rao K,R. 2003. An overview of the microbial -Amylase family. African Journal of Biotechnology. 2: 645648.Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Nampoothiri KD, Sossol CR & Pandey A.2006. -amylase from microbial sources- An overview on recent developments. Food. Technol. Biotechnol. 44: 173-184.Vieille C & Zeikus G. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Source, Uses, and Molecular Mechanism for Thermostability. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65: 143.Vihinen M & Mantsala P. 1990. Characterization of an thermostable Bacillus stearothermophilus alpha-amylase. Biotechnol. App. Biochem. 12: 427-433.Walter WW & Nagesh S. 1965. Microbial Amylases. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 273304.16

Aktivitas Amilase (unit)

Jenis bakteri