1

LAPORAN AKHIR

PENELITIAN HIBAH BERSAING

JUDUL PENELITIAN

OLEH

Ir. Yurleni, MSi NIDN 0013066801

Dr. Ir. Hj. Mardalena, MP NIDN 0019016303

Prof. Dr. Ir. Ulil Amri, MS NIDN 0005025504

Dibiayai oleh DIPA UNJA/DIPA DP2M dengan No. Kontrak

77/UN21.6/PL/2014 Tanggal 12 Maret 2014 Sesuai dengan

Perjanjian Pelaksanaan Hibah Bersaing No: 107/UN21/PL/2014

Tanggal 10 Maret 2014

UNIVERSITAS JAMBI

November 2014

IDENTIFIKASI MOLEKULAR BAKTERI ASAM LAKTAT PADA

DURIAN FERMENTASI DAN APLIKASINYA TERHADAP

RUMEN MODIFIER TERNAK RUMINANSIA

211/ ILMU PETERNAKAN

2

RINGKASAN

Yurleni, Amri dan Mardalena: Identifikasi molekuler bakteri asam laktat pada

durian fermentasi dan aplikasinya terhadap rumen modifier ternak ruminansia. Untuk meningkatkan produktivitas ternak ruminansia, sumber protein untuk pertumbuhan selain berasal dari pakan, juga berasal dari mikrob rumen. Peningkatan aktivitas dan populasi mikrob rumen dapat dilakukan dengan rumen modifier yaitu dengan menambahkan probiotik dari bakteri asam laktat (BAL) potensial yang berasal dari durian fermentasi. Penelitian bertujuan untuk menguji sifat-sifat bakteri hasil isolasi untuk dikembangkan sebagai probiotik dan karakterisasi BAL potensial sebagai antimikrob serta identifikasi molekuler dengan 16S rRNA terhadap beberapa isolat BAL yang ada pada durian fermentasi. Penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu Universitas Jambi dan identifikasi molekuler di PAU IPB, Bogor. Penelitian meliputi isolasi dan pemurnian koloni BAL, identifikasi morfologi koloni BAL secara mikrobiologi dengan pewarnaan gram, uji aktifitas anti bakteri dan anti jamur dan identifikasi BAL potensial pada durian fermentasi menggunakan gen 16S rRNA dengan Polymerase Chain Reaction

(PCR). Hasil penelitian adalah Ditemukan isolate BAL potensial probiotik dari durian

fermentasi asal Jambi jenis durian local (DFY1), stabil pada pH 4.37 dan 6.

Menggunakan metode pengkulturan didapatkan jumlah BAL pada pengenceran

10-9

adalah 6,2 x 106 CFU/g dan dari serangkaian uji kandidat BAL didapatkan

isolat DFY1 mempunyai sifat probiotik yaitu, mempunyai aktivitas antimikroba

terhadap bakteri pathogen (salmonella typhimurium, ATCC 14028; Escherichia

coli ,ATCC 25922; Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus, ATCC 25923)

dan tahan terhadap 0.3 dan 0.5% garam empedu. Dengan menggunakan sekuen

16S rDNA isolat BAL teridentifikasi sebagai Lactobacillus sp, Lactobacillus

plantarum strain NRIC, Lactobacillus praplantarum strain RTA-18 , walaupun

demikian ketiganya

Key word : Isolasi molekuler, Bakteri asam laktat, Durian fermentasi, Rumen

modifier.

3

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala

limpahan rahmat, taufik dan hidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan pembuatan laporan akhir Hibah Bersaing yang berjudul

“Identifikasi Molekuler Bakteri Asam Laktat Pada Durian Fermentasi dan

Aplikasinya Terhadap Rumen Modifier Ternak Ruminansia”.

Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada

Direktorat Jenderal Pendididikan Tinggi (DIKTI) yang telah mendanai penelitian

Hibah Bersaing ini dan tak lupa pula penulis mengucapkan terimakasih kepada

Lembaga Penelitian Universitas Jambi, Rektor Universitas Jambi dan Dekan

Fakultas Peternakan Universitas Jambi.

Ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada Kepala Laboratorium

Pusat Antar Universitas (PAU) IPB, bogor beserta laborannya serta Kepala

Laboratorium Terpadu Universitas Jambi beserta laborannya yang telah

membantu dalam penelitian ini hingga terselesaikannya laporan ini.

Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan dan bagi penulis dalam penerapan penelitian selanjutnya.

Jambi, November 2014

Penulis

4

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .......................................................................... v

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………. vi

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………. vii

BAB I. PENDAHULUAN

- Latar Belakang ............................................................. 1

- Urgensi Penelitian........................................................ 2

- Perumusan Masalah..................................................... 3

- Tujuan Penelitian......................................................... 3

- Manfaat Penelitian...................................................... 3

- Keluaran yang Diharapkan.......................................... 4

BAB II. STUDI PUSTAKA

- Bakteri Asam Laktat (BAL).......................................... 5

- Durian Fermentasi ....................................................... 7

BAB III. METODE PENELITIAN........................................ 9

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………… 12

DAFTAR PUSTAKA .............................................................. 26

LAMPIRAN .................................................................................. 30

5

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Rataan jumlah koloni BAL pada berbagai tingkat pengenceran ….. 14

2. Karakteristik morfologis BAL penelitian ………………………….. 16

3. Rataan TPC pertumbuhan BAL penelitian (CFU/g) …………. 17

4. Uji ketahanan isolate DFY1 terhadap garam empedu (koloni) … 20

5. Hasil pengukuran uji antagonis isolate DFY1 sebagai

antimikroba pada pH 4.37 dan pH 6 ………………………….. 21

6. Hasil analisis BLAST sekuen DNA pada isolate DFY1 ………… 25

6

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Skema Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) …… 11

2. Bagan alir proses pembuatan durian fermentasi …………………… 12

3. Kultur murni isolate BAL DFY1 yang menunjukkan adanya zona bening

disekitar koloni.(a. zona bening sekitar koloni, b.koloni bakteri ….. 14

4. Isolat bakeri gram positif, (a). berbentu batang (basil);

(b). berbentuk bulat …………………………………………… 15

5. Kurva Pertumbuhan BAL …………………………………………… 18

6. Hasil uji ketahanan isolatDFY1 terhadap garam empedu ………….. 20

7. Hasil pengukuran uji antagonis isolate DFY1 sebagai

antimikroba pada pH 4.37 dan pH 6 …...................................... 23

.

7

BAB. I. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Peningkatan produktivitas ternak terkendala oleh ketersediaan pakan, baik

secara kuantitas maupun kualitas. Kondisi ini diperparah pada saat musim

kemarau. Kandungan protein yang rendah dan serat kasar yang tinggi pada pakan

ternak dapat menurunkan efisiensi penggunaan pakan dan kesehatan ternak,

karena tidak mencukupi kebutuhan hidup pokok. Bahan pakan yang mengandung

protein kasar < 7 % menyebabkan aktivitas mikrob rumen terhambat, karena

kekurangan unsur nitrogen sehingga pemanfaatan karbohidrat oleh mikrob rumen

tidak maksimal (Marthen et al, 2009). Didalam rumen semua zat-zat makanan

mengalami proses fermentasi dan hidrogenasi oleh mikrob rumen. Jumlah dan

jenis mikrob yang berkembang dalam rumen dapat dimodifikasi (rumen modifier)

dengan penambahan jenis pakan tertentu. Pemberian pakan dengan konsentrat

tinggi (65%) pada ternak kerbau dan sapi menyebabkan bakteri proteolitik lebih

berkembang dibandingkan dengan bakteri selulolitik dan amilolitik (Yurleni et al.

2013).

Upaya meningkatkan nilai gizi pakan ternak dan aman penggunaannya

adalah dengan memanfaatkan jasa mikrob khususnya bakteri asam laktat (BAL).

Rekayasa bioteknologi dengan menggunakan isolat bakteri asam laktat yang

diperoleh dari tanaman dan buah-buahan, karakteristiknya berbeda dengan BAL

yang berasal dari produk hewan karena pada tanaman terdapat senyawa metabolit

sekunder bioflavonoid yang bersifat antioksidan (Okade, 2003). Menurut Urnemi

et al. (2012), hasil fermentasi buah-buahan seperti kakao dapat menghasilkan

BAL potensial yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti

(Eschericia coli NBRC 14237, Staphylococcus aureus NBRC 13276, Listeria

monocytogenesis, Bacillus subtilis NBRC 3134 dan Salmonella typii ).

Penggunaan BAL sebagai probiotik dan antibiotik alami pada pakan ternak

adalah untuk mengurangi penggunaan antibiotik sintetis dan efek negatif dari

konsumsi antibiotik terus menerus. Penggunaan antibiotik terus menerus akan

mengakibatkan resistensi terhadap mikrob tertentu dan sangat berbahaya bagi

8

lingkungan. Selain itu pada ternak akan meninggalkan residu pada produk ternak

seperti daging/karkas dan susu.

Berdasarkan hal tersebut diatas maka dilakukan identifikasi molekuler

terhadap BAL yang berasal dari durian fermentasi melalui proses isolasi,

identifikasi morfologi, karakteristik biokimia, identifikasi DNA molekuler hingga

dapat ditemukan kandidat probiotik menggunakan 16S rRNA dengan teknik PCR.

Urgensi Penelitian

Durian fermentasi berbentuk seperti pasta berwarna putih kekuningan

memiliki aroma khas dan tajam. Di Provinsi Jambi durian fermentasi ditemukan

ketika musim durian tiba dan hampir seluruh rumah makan dan restoran dijumpai

makanan dengan menu utama durian fermentasi yang dimasak dengan ikan patin

maupun ikan sungai lainnya. Durian fermentasi umumnya dijadikan sebagai

bumbu masakan dengan rasa sedikit asam. Rasa asam durian fermentasi dikaitkan

dengan asam yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat (BAL) selama proses

fermentasi.

Melalui proses fermentasi, daging durian dapat disimpan selama 2 bulan

sampai 1 tahun. Sifat awet yang ditunjukkan oleh durian fermentasi sangat baik

untuk kesehatan, diduga BAL yang terdapat dalam durian fermentasi bersifat

sebagai probiotik. Durian mengandung karbohidrat yang cukup tinggi yaitu 25,7

% (Hanum et al. (1977), sehinggan bakteri asam laktat dapat berkembang biak

dengan baik. Bakteri asam laktat yang berasal dari durian fermentasi akan

mampu membunuh bakteri patogen di dalam rumen dan mendesak bakteri

patogen keluar dari usus. Hal ini membuat kondisi usus lebih sehat, dan proses

pencernaan berjalan baik (Purwati et al., 2005). Selain itu selama proses

fermentasi, terjadi perombakan senyawa-senyawa makro molekul oleh bakteri

asam laktat serta sifat awet yang ditunjukkan oleh durian fermentasi sangat baik

untuk kesehatan ternak karena pengawetan yang terjadi tidak menggunakan bahan

kimia.

Untuk mendapatkan BAL yang potensial perlu dilakukan isolasi,

identifikasi morfologi, karakteristik biokimia, identifikasi DNA molekuler,

purifikasi dan uji bakteriosin hingga dapat digunakan sebagai kandidat probiotik

untuk menjaga kesehatan. BAL potensial diaplikasikan di bidang kesehatan,

9

keamanan pangan dan bidang peternakan sebagai probiotik/supplement (Yunenshi

et al., 2011). BAL dapat diisolasi dari tanaman dan buah-buahan, akan tetapi

karakteristiknya akan berbeda dengan BAL yang berasal dari produk hewan

karena pada tanaman terdapat senyawa metabolit sekunder bioflavonoid yang

bersifat antioksidan (Okade, 2003). Hal inilah yang menarik untuk diteliti untuk

mendapatkan stater BAL baru dari durian fermentasi sebagai probiotik melalui

proses isolasi dan karakterisasi molekul bakteri asam laktat dan selanjutnya

probiotik asal durian fermentasi diaplikasikan pada ternak ruminansia.

Perumusan Masalah

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :

1. Apakah BAL yang berpotensi sebagai probiotik dapat membunuh bakteri

patogen dalam rumen sapi.

2. Bagaimana potensi isolat-isolat BAL tersebut sebagai antimikroba patogen di

dalam rumen ternak sapi.

3. Apakah spesies BAL tersebut dapat diidentifikasi secara DNA molekuler

dengan menggunakan 16S rRNA ?

Tujuan penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Melakukan isolasi BAL, skrining dan penentuan aktifitas antimikrob dari

durian fermentasi.

2. Mempelajari karakterisasi BAL yang potensial sebagai antimikrob dari durian

fermentasi.

3. Melakukan identifikasi molekuler dengan 16S rRNA terhadap beberapa isolat

BAL yang potensial.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan menemukan spesies BAL yang berpotensi

sebagai kandidat probiotik untuk pakan ternak sapi sebagai rumen modifier dalam

meningkatkan proses fermentasi pada rumen ternak.

10

Keluaran yang Diharapkan

Ditemukan BAL dari durian fermentasi sebagai probiotik yang telah

diidentifikasi menggunakan gen 16S rRNA dan dikarakterisasi molekular.

11

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Bakteri Asam Laktat (BAL)

Pada proses fermentasi dihasilkan mikroorganisme salah satunya adalah

Bakteri Asam Laktat (BAL). BAL didefinisikan sebagai bakteri pembentuk asam

laktat dalam metabolisme karbohidrat dan terdiri dari berbagai macam kelompok

bakteri gram positif. BAL memiliki peranan penting dalam pengawetan bahan

pangan dan melawan bakteri patogen melalui senyawa peptida antimikroba. BAL

umumnya digunakan sebagai starter untuk fermentasi daging dan sayuran, industri

fermentasi saos, bahan flavor, dan juga berperan dalam perubahan aroma, warna,

serta kualitas nutrisi produk fermentasi. BAL dikenal sebagai Food Grade

Microorganism atau dikenal sebagai mikroorganisme yang Generally Recognized

As Safe (GRAS) yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan

dan bahkan berguna bagi kesehatan (Surono, 2004).

Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang diperoleh dari hasil

fermentasi. BAL merupakan bakteri Gram positif, pada proses fermentasi BAL

mampu mengubah glukosa (fruktosa dan sukrosa) menjadi asam laktat yang

dinamakan fermentasi asam laktat. Genus bakteri yang tergolong kepada BAL

adalah Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,

Pediococcus, Streptococcus, Propionibakterium (Nettles dan Barefoot, 1993).

Terbentuknya asam laktat, dapat menurunkan nilai pH lingkungan

pertumbuhannya 3-4.5 yang menimbulkan rasa asam. Kondisi ini mengakibatkan

pertumbuhan dari beberapa jenis mikroorganisme patogen lainnya terhambat

(Seppo, 2004 dan Afrianto, 2006)).

BAL biasa digunakan sebagai bahan pengawet makanan, karena mampu

memproduksi asam organik, menurunkan pH lingkungan dan mensekresikan

senyawa yang mampu menghambat bakteri patogen seperti H2O2, diasetil, CO2,

asetaldehi, asam-asam amino dan bakteriosin. BAL tergolong kedalam bakteri

probiotik, karena melihat manfaat dan kandungan yang terdapat di dalamnya.

Probiotik adalah suplemen mikroba hidup yang memberikan efek positif kepada

manusia atau hewan dengan memperbaiki mikroflora usus (Surono, 2004).

Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang bila dikonsumsi dapat meningkatkan

12

kesehatan manusia ataupun ternak dengan cara menyeimbangkan mikroflora

dalam saluran pencernaan jika dikosumsi dalam jumlah yang cukup. Probiotik

mempunyai kemampuan untuk menurunkan kadar kolesterol serum darah

(Kusumawati et al., 2003).

Salah satu senyawa yang dihasilkan oleh BAL adalah bakteriosin.

Bakteriosin merupakan senyawa protein yang dieksresikan oleh bakteri yang

bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain terutama yang memiliki

kekerabatan erat secara filogenetik. Bakteriosin mudah terdegradasi oleh enzim

proteolitik dalam pencernaan manusia dan hewan. Penelitian tentang bakeriosin

yang dihasilkan BAL semakin banyak berkembang, sehingga semakin banyak

pula jenis bakteriosin baru yang ditemukan. Bakteriosin tersebut dapat digunakan

sebagai antibiotik alami, karena memiliki kemampuan sebagai antibakteri patogen

yang dapat menghancurkan sel-sel bakteri tersebut sehingga perkembangannya

terganggu.

BAL bersifat antimikroba, membunuh bakteri patogen, tidak membunuh

bakteri baik, BAL disebut dengan probiotik (Purwati dan Syukur, 2006). Sebelumnya

Silalahi (2000) menyatakan, kemampuan probiotik dapat membunuh bakteri

patogen karena, probiotik memiliki senyawa H2O2 , CO2, asetaldehid dan

Bacteriocin. Kemampuan bakteriosin sebagai antimikrobial biasanya digunakan

indikator patogen Eschericia coli NBRC 14237, Staphylococcus aureus NBRC

13276, Listeria monocytogenesis, Bacillus subtilis NBRC 3134 dan Salmonella

typhosa, Lima bakteri ini sering ditemukan menginfeksi manusia secara langsung

maupun melalui makanan. (Purwati, 2003) dan (Syukur, 2011).

Penelitian yang telah dilakukan dengan menggunakan probiotik untuk

penurunan kadar kolesterol adalah pada telur ayam dengan persentase penurunan

5% pemberian 3,2 x 106 CFU/g Bacillus subtilis (Mahdavi et al., 2005). ). Yousefi

dan Karkoodi (2007) juga sudah telah melakukan penelitian pada ayam broiler,

dimana penurunan kadar kolesteril pada kuning telur ayam dengan pemberian

probiotik Thepax® yaitu 9% (dengan pemberian 0,05% probiotik) dan pemberian

Saccaromyces (ragi) yaitu 7,3% (dengan pemberian 0,15% ragi). Penurunan

kolesterol pada kuning telur ayam dengan pemberian Lactococcus plantarum asal

blondo dalam ransum ayam petelur menurunkan kadar kolesterol kuning telur

13

pada pemberian 3 ml (3,9 x 108 CFU/g) probiotik dengan persentase penurunan

53,6% (Purwati, 2011).

Kemampuan BAL menurunkan kadar kolesterol disebabkan karena

kemampuannya menghasilkan enzim bile salt hydrolase (BSH) (Loin, et al.,

2005). BSH mampu mendekonjugasi asam empedu sehingga menghasilkan garam

empedu bebas atau terdekonjugasi yang akan disekresi melalui feses (Surono,

2004 dan Loin, et al., 2005). Pembentukan garam empedu bebas yang disekresi

melalui feses ini dapat menurunkan kadar kolesterol.

Penelitian BAL pada susu, yogurt, dadih, keju dan aplikasinya terhadap

penurunan kolesterol telah banyak diteliti. Penelitian penurunan kolesterol pada

daging ayam dengan pemberian Lactococcus plantarum asal blondo dalam

ransum, mampu menurunkan kadar kolesterol kuning telur ayam petelur pada

pemberian 3 ml (3,9 x 108 CFU/g) (Purwati, 2011). Pemberian 3 ml (3x

0,127x108 CFU/g) Pediococcus pentosaceus asal fermentasi buah kakao telah

dapat menurunkan kadar kolesterol itik lokal secara signifikan (Urnemi et al.,

2012).

2.2. Durian Fermentasi

Durian fermentasi adalah hasil fermentasi dari buah durian yang memiliki

bau yang khas dan warna kuning krem dan banyak dikonsumsi di Malaysia dan

Indonesia sebagai lauk dan bumbu (Battcock dan Ali, 1998; Gandjar, 2000).

Durian fermentasi berupa campuran bubur durian dengan garam yang

difermentasi dalam kondisi anaerob dalam wadah tertutup. Fermentasi biasanya

membutuhkan waktu sekitar 4-7 hari dan tekstur daging durian berubah dari

bentuk padat menjadi konsistensi semi padat dengan bau dan rasa asam dominan.

Keasaman durian fermentasi dilaporkan sekitar 2,8-3,6%. Rasa asam tempoyak

dikaitkan dengan asam yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat (BAL) selama

fermentasi. (Amin et al., 2004, Leisner et al., 2002).

Dari beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri asam laktat

merupakan mikroorganisme yang dominan dalam durian fermentasi (Amiza et al.,

2006). Komposisi kimia dari buah durian dengan kandungan gula 15-20% (Ketsa

dan Daengkanit, 1998) dapat mendukung pertumbuhan bakteri asam laktat.

Dilaporkan bahwa spesies Lactobacillus merupakan bakteri asam laktat yang

14

diisolasi dari durian fermentasi asal Indonesia dan Malaysia. Strain BAL dan

mikroorganisme lainnya bervariasi tergantung dari mana durian fermentasi dibuat.

Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. mali, Lb. fermentum ditemukan pada durian

fermentasi asal Malaysia (Leisner et al., 2001). Leisner et al., (2002) melaporkan

spesies baru Lactobacillus, L. durianis sp., terisolasi dari tempoyak Malaysia.

BAL lainnya yang ada pada durian fermentasi dari Malaysia adalah Leuconostoc

mesenteroides.

15

III. METODE PENELITIAN

Penelitian ini dirancang selama 2 (dua) tahun. Penelitian tahun pertama,

isolasi BAL dilakukan di Laboratorium Terpadu Universitas Jambi dan

identifikasi BAL secara molekuler di Laboratorium PAU IPB, Bogor. Pada Tahun

kedua akan dilakukan penelitian secara in vitro berdasarkan hasil penelitian pada

tahun 1. Penelitian tahun 2 direncanakan akan dilakukan di Laboratorium Nutrisi

Ternak Fakultas Peternakan Universitas Jambi

Penelitian Tahun Pertama

Prosedur pembuatan bakteri asam laktat (BAL) dari durian fermentasi adalah :

1. Isolasi dan Pemurnian Koloni Bakteri Asam Laktat

Proses pengkayaan (enrichment), yaitu 1 gram sampel dicampurkan

kedalam 9 ml MRS Broth (Difco), dihomogenkan sehingga didapatkan

pengenceran 1: 9 atau 10-1n

kemudian dimasukan kedalam inkubator pada suhu

370C selama 24 jam. Sampel diencerkan menggunakan 0.9 ml MRS Broth pada

tabung eppendorf melalui proses pengenceran (serial delution) sampai 10-7

dengan cara diambil 0.1 ml dari enrichment/10-1

lalu ditambahkan kedalam

tabung eppendorf yang berisi 0.9 ml MRS Broth, sehingga didapatkan

pengenceran 10-2

, diambil 0.1 ml dari pengenceran 10-2

ditambahkan kedalam

tabung eppendorf yang berisi 0.9 ml MRS Broth sehingga didapatkan

pengenceran 10-3

dan seterusnya hingga didapatkan pengenceran 10-7

. Kemudian

dilanjutkan dengan proses penanaman (planting) dimana diambil 0.1 ml dari

tabung eppendorf pada pengenceran 10-7

kemudian ditanam pada medium MRS

agar (Difco), diratakan dengan menggunakan hockey stick, diinkubasi dalam

inkubator pada suhu 370C selama 48 jam, setelah 48 jam dihitung jumlah koloni

BAL dengan menggunakan alat Quebec Colony Counter. Pemurnian dilakukan

Setelah 48 jam, Single Colony yang mencirikan bakteri asam laktat yang tumbuh

dipindahkan ke media de Mann Rogosa Sharpe (MRS). Agar untuk pemurnian

koloni kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC, dilakukan 2 x

pemurnian dan identifikasi morfologi dengan pewarnaan Gram (Purwati et al

2005).

16

2. Identifikasi Morfologi Koloni BAL secara Mikrobiologi dengan

Pewarnaan Gram

Identifikasi morfologi Bakteri Asam Laktat (BAL) dilakukan dengan dua

cara, yaitu identifikasi makroskopis dan mikroskopis. Makroskopis yang diamati

adalah bentuk, warna, tepian koloni BAL yang tumbuh pada medium MRS agar.

Identifikasi mikroskopis yaitu bentuk sel, dengan pewarnaan Gram. Pewarnaan

diawali dengan pengambilan biakan bakteri tunggal dari medium dengan

menggunakan jarum ose, bakteri diratakan di atas kaca benda (preparat) yang

telah dibersihkan dengan alkohol, lalu dikeringkan di atas bunsen atau alat

pengering, ditetesi dengan zat warna crystal violet, kemudian ditunggu selama 1

menit agar zat warna meresap oleh bakteri, lalu dibilas dengan air mengalir dan

ditetesi dengan larutan iodine kompleks, kemudian ditunggu selama 1 menit, lalu

dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan alkohol dengan cara mencelupkan ke

dalam alkohol encer, ditetesi dengan zat warna safranin, lalu ditunggu 30 detik,

setelah itu dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop 10 kali lipat dapat

dilihat hasil uji gram bakteri (Urnemi,2012).

3. Uji Aktifitas Antibakteri dan Antijamur BAL Durian Fermentasi

Uji in vitro (dilakukan dengan menggunakan bakteri dan jamur pathogen

yaitu Escherichia coli (NBRC 14237), Staphylococcus aureus (ATCC 6539),

Staphylococcus typhi (P2KIM colection), Bacillus subtilis (BTCC 612), Listeria

monocytogenes (BTCC B693), Fusarium sp, Aspergilus sp dan Candida sp.

Metode yang digunakan adalah metode paper disc (modifikasi metode Yamato et

al. 2003). Pengamatan terhadap zona bening yang terbentuk pada jam ke-3, 5, 8

dan 24 jam.

4. Identifikasi BAL Potensial Durian Fermentasi 16S rRNA dengan

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Identifikasi BAL di awali dengan isolasi genom menggunakan metode

Sambrook & Russel (2001). Genom yang di dapat dijadikan sebagai template

untuk reaksi PCR. PCR dilakukan dengan membuat larutan reaction mixture

dengan volume total sebesar 50 µl dibuat berdasarkan komposisi sebagai berikut

38 µl ddH2O, 5 µl 10x PCR buffer, 1,5 µl 50 mM MgCl2, 1 µl 10 mM dNTP, 0,5

µl primer F1, 0,5 µl primer R1, 0,5 µl Taq Polimerase, dan 3 µl DNA template.

Semua larutan reaction mixture kemudian dimasukkan ke dalam mesin thermal

17

cycler PCR. Mesin thermal cycler PCR diatur berdasarkan suhu dan waktu yang

telah dioptimasi dengan kondisi predenaturasi 96oC selama 5 menit, denaturasi

96oC selama 1 menit, annealing 55

oC selama 1 menit, polimerisasi 72

oC selama 3

menit, dan polimerisasi akhir 72oC selama 3 menit.

Cara kerja Isolasi BAL (Bakteri Asam Laktat) dapat dilihat pada Gambar

berikut ini :

Gambar 1. Skema Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL)

Preenrichment : 1 g durian fermetasi + 9 ml de Mann Rogosa Sharpe (MRS) Broth (Pengenceran 1 : 10),

Pengenceran 10-1 dimasukkan dalam an aerobik jar,

diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan

suhu 37 ºC

Serial Pengenceran

0,1 ml Pengenceran 110 + 0,9 ml de Mann

Rogosa Sharpe (MRS) Broth

(Pengenceran 1 : 10), Pengenceran 72 1010

100 µl dari serial pengenceran 10-7

diinokulasikan

pada media de Mann Rogosa Sharpe (MRS) Agar,

dimasukkan dalam an aerobik jar, diinkubasi

dalam inkubator selama 48 jam dengan suhu 37 ºC

Single Colony yang mencirikan BAL yang

tumbuh dipindahkan

ke media MRS Agar untuk pemurnian koloni

kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC

Pewarnaan Gram

Uji PCR (Polymerase Chain

Reaction)

18

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pembuatan Durian Fermentasi

Durian fermentasi atau tempoyak adalah sejenis bubur durian yang rasanya

asam. Pembuatan durian fermentasi penelitian ini adalah secara tradisional. Buah

durian yang telah matang dikupas dan diambil isinya. Isi buah durian dipisahkan

antara daging dengan bijinya, kemudian daging durian tanpa biji ditambah garam

sebanyak 2% (b/b) dan dimasukkan kedalam stopples yang tertutup rapat

selanjutnya difermentasi pada suhu ruang selama satu minggu (Gambar 2).

Gambar 2. Bagan alir proses pembuatan durian fermentasi

Tujuan dari fermentasi durian yang dilakukan sendiri adalah untuk

memperoleh hasil fermentasi yang tidak tercemar oleh mikroba pathogen lain.

Jika menggunakan durian fermentasi yang dijual di pasar, tidak dapat diketahui

umur fermentasi sehingga sampel yang digunakan tidak homogen dan

dikhawatirkan tercemar dengan bakteri lainnya.

Durian matang

Pegupasan buah

durian

Buah durian tanpa kulit

kulit

Pemisahan antara daging dengan biji

Daging durian tanpa biji

biji

Fermentasi

Garam

Tempoyak

19

Pada hari ke tujuh rasa dan aroma durian berubah dan mempunyai bau

yang khas. Perubahan ini disebabkan oleh mikroorganisme yang menguraikan

senyawa-senyawa yang terkandung dalam substrat durian. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa terjadi perubahan pH selama proses fermentasi. pH durian

fermentasi berkisar antara 3.2 - 3.8. Pada proses fermentasi menghasilkan asam-

asam organik yang merupakan hasil hidrolisis senyawa kompleks seperti

karbohidrat, asam lemak dan juga sebagai hasil aktivitas pertumbuhan bakteri

yang menghasilkan asam laktat, asam asetat, etanol dan CO2 (Yulia dkk., 2013).

4.2. Isolasi dan Pemurnian Koloni Bakteri Asam Laktat

Isolat bakteri yang digunakan pada penelitian ini berasal dari durian

fermentasi jenis durian lokal Jambi. Hasil isolasi dan inkubasi bakteri selama 48

jam didapatkan bakteri asam laktat sebanyak 10 koloni yang ditandai dengan

adanya zona bening disekeliling koloninya. Untuk mendapatkan bakteri asam

laktat dari hasil seleksi, ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni

setelah inkubasi 2-3 hari (Djide dan Wahyudin 2008). Karena bakteri asam laktat

akan menghasilkan asam laktat yang akan bereaksi dengan CaCO3, Setelah masa

inkubasi 2-3 hari, disekitar koloni yang tumbuh pada media akan terlihat adanya

daerah bening akibat terbentuknya Ca-laktat yang larut dalam media. Salah satu

isolat yang menunjukkan adanya zona bening pada sekitar koloninya tampak pada

Gambar 3.

a

b

Gambar 3. Kultur murni isolate BAL DFY1 yang menunjukkan

adanya zona bening disekitar koloni.(a. zona bening

sekitar koloni, b.koloni bakteri

20

Total koloni asam laktat yang dihasilkan pada pengenceran 10-4

- 10-9

seperti terlihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Rataan jumlah koloni BAL pada berbagai tingkat pengenceran

No Tingkat pengenceran Jumlah koloni BAL (CFU/g)

1.

2

3

4

5

6

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

3.8 x 106

1.0 x 107

1.3 x 107

8.1 x 106

6.0 x 106

6.2 x 106

Jumlah koloni bakteri asam laktat yang dihasilkan pada pengenceran 10-9

adalah 6,2 x 106 CFU/g. Hasil ini sesuai dengan ketentuan pangan probiotik

menurut FAO/WHO bahwa penambahan pangan probiotik harus memperhatikan

kesehatan inang tempat bakteri hidup konsentrasi itu berkisar antara 106- 10

7

CFU/mL tujuan ini agar terjadi keseimbangan mikroflora di usus. (Nur 2005).

Setelah dilakukan pengamatan secara makroskodan didapatkan kultur

murni kemudian dilakukan pengamatan secara makroskopis terhadap 10 isolat

yang menunjukkan karakteristik probiotik. Bakteri yang tumbuh dengan koloni

tunggal diremajakan dalam media MRS cair, kemudian digoreskan pada media

padat dalam anaerobik jar untuk memverifikasi kemurniannya. Isolat setelah

diremajakan ditumbuhkan selama 24 jam pada media MRS cair dalam anaerobik

jar agar pertumbuhannya lebih baik dan diinkubasi pada suhu 37 0C, selanjutnya

dilanjutkan dengan uji karakterisasi koloni.

4.3. Identifikasi Morfologi Koloni BAL secara Mikrobiologi dengan

Pewarnaan Gram

Identifikasi isolat BAL dari durian fermentasi dilakukan secara

mikroskopis dan makroskopis. Secara makroskopis pengamatan meliputi uji

katalase, bentuk koloni dan warna koloni, sedangkan secara mikroskopis berupa

pewarnaan gram untuk mengamati bentuk sel bakteri (Gambar 4).

21

Gambar 4. Isolat bakeri gram positif, (a). berbentu batang

(basil); (b). berbentuk bulat

Hasil identifikasi morfologi koloni hampir sama dan seragam dengan

bentuk bundar warna berkisar putih, krem, permukaan cembung, tepi rata atau

serabut, permukaan mengkilat dan empuk teksturnya. Semua isolat menunjukkan

karakteristik khusus yang dimiliki bakteri asam laktat, seperti Gram positif, reaksi

katalase negative dan tidak membentuk endospora . Isolat DYF 2, 3 dan 4 sel nya

berbentuk batang sedangkan 6 (enam) isolate lainnya berbentuk bulat (DFY1,

DFY5, DFY6, DFY7, DFY8, DFY9, DFY10). Identifikasi BAL yang didapat

hampir seragam sehingga untuk uji selanjutnya menggunakan isolate DFY1,

DYF2 dan DYF5 dengan bentuk morfologi bulat dengan bentuk sel batang

pendek.

Surono (2004), menyatakan bahwa variasi karakteristik bakteri asam l

aktat normal terjadi, namun yang mutlak adalah sifatnya sebagai bakteri Gram

positif. Karakteristik koloni dan pengujian gram semuanya menunjukkan hasil

positif, karena selnya berwarna ungu tua. Hasil ini ditunjang oleh pendapat

Purwati (2003) dan Urnemi dkk, (2012) yang menyatakan bahwa salah satu teknik

pewarnaan yang paling penting untuk mengidentifikasi bakteri adalah dengan

metode Gram atau pewarnaan Gram. Identifikasi isolat bakteri asam laktat hasil

pengamatan secara makroskopis dapat dilihat pada Tabel 2

Tujuan identifikasi dengan pewarnaan Gram adalah untuk

mengelompokkan bakteri berdasarkan reaksi kimia. Pewarnaan Gram akan

a b

22

membagi bakteri menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negative,

perbedaan ini disebabkan karena lapisan dinding sel bakteri yang berbeda.

Tabel 2. Karakteristik morfologis BAL penelitian

Jenis

isolate

Warna

koloni

Pewarnaan

gram

Uji

katalase

morfologi

DFY 1

DFY2

DFY3

DFY4

DFY5

DFY6

DFY7

DFY8

DFY9

DFY10

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Putih susu

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Gram positif

Negative

Negative

Negative

Negative

Negative

Negative

Negative

Negative

Negative

Negative

Bulat, bentuk sel batang pendek

Batang, susunan tunggal rantai

pendek

Batang, susunan tunggal rantai

pendek

Batang, susunan tunggal rantai

pendek

Bulat, bentuk sel batang pendek

Bulat, bentuk sel batang pendek

Bulat, bentuk sel batang pendek

Bulat, bentuk sel batang pendek

Bulat, bentuk sel batang pendek

Bulat, bentuk sel batang pendek

Menurut Sneath et al, (1986) dan Hayakawa (1992), kelompok bakteri

asam laktat yang berbentuk batang (rod) termasuk juga kokobasili dan batang

kurus, katalase negative, tergolong Lactobacillus. Sedangkan bakteri yang

berbentuk bulat dengan susunan rantai panjang maupun pendek termasuk kedalam

genus Streptococcus (Fardiaz 1992).

Bakteri asam laktat bersifat non motil dan menghasilkan berbagai senyawa

metabolit lainnya disamping asam laktat. Uji katalase merupakan salah satu uji

untuk mengidentifikasi mikroba yang mampu menghasilkan enzim katalase yang

digunakan untuk memecah hydrogen peroksida yang terbentuk dari proses

respirasi aerob dan bersifat toksik terhadap bakteri, menjadi dihidrogen oksida

(H2O) dan oksigen (O2) yang tidak bersifat toksik lagi. Hasil uji katalase isolate

penelitian memperlihatkan semuanya negative. Djide dan Wahyudin (2008)

menjelaskan bahwa reaksi katalase menunjukkan hasil positif bila terbentuk

gelembung udara yang mengindikasikan terbentuknya gas O2 dan hasil negatif

jika tidak menunjukkan adanya gelembung gas. Hasil uji katalase terhadap ke-10

23

isolat menunjukkan hasil negatif untuk semua isolat, tidak terdapat gelembung gas

pada H2O2 yang telah disuspensikan dengan isolat bakteri, tampak pada tabel 2.

Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri asam laktat tersebut bersifat

homofermentatif (Djide dan Wahyudin, 2008).

4.4. Kurva tumbuh BAL

Penggunaan isolate BAL dapat dilakukan dengan isolat tunggal ataupun

campuran. BAL dengan kultur tunggal kemungkinan bisa kurang efektif, tetapi

pengaruh yang dihasilkan akan mudah dipelajari. BAL dengan kultur campuran

kemungkinan lebih efektif kalau terjadi sinergi antar isolat dan adanyasimbiosa

mutualisma dengan inang. Akan tetapi juga bisa kurang efektif bila terjadi

persaingan antar kultur. Pada penelitian ini untuk menentukan kultur tunggalnya

dapat diketahui dari pola pertumbuhan isolatnya. Proses fermentasi sangat

dipengaruhi oleh adanya pertumbuhan bakteri asam laktat. Beberapa faktor

lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan asam laktat adalah kadar garam,

suhu, pH dan tersedianya karbohidrat sebagai sumber makanan Pelczar dan Chan

(2005). Untuk pertumbuhan yang ideal bagi bakteri asam laktat perlu dibuat suatu

kondisi yang optimal. Kurva tumbuh BAL bertujuan mengetahui fase logaritmik

pertumbuhan BAL yang merupakan fase untuk pengujian. Untuk mengetahui

kurva tumbuh kultur atau isolate di inkubasi selama 48 jam pada suhu 370C

kemudian disebar mulai 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24 jam. Rataan waktu pertumbuhan

BAL penelitian dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 5.

Tabel 3. Rataan TPC pertumbuhan BAL penelitian (CFU/g)

Waktu (jam) Jumlah bakteri

Isolat DYF1

Jumlah bakteri

Isolat DYF2

Jumlah bakteri

Isolat DYF5

0

1

2

3

4

5

6

24

62 x 106

46 x 106

50 x 106

152 x 106

582 x 106

273 x 106

612 x 106

20 x 106

70 x 106

58 x 106

105 x 106

239 x 106

432 x 106

266 x 106

722 x 106

52 x 106

83 x 106

33 x 106

62 x 106

140 x 106

488 x 106

169 x 106

659 x 106

40 x 106

24

Puncak pertumbuhan bakteri asam laktat yang diamati terjadi pada jam

keempat dengan jumlah bakteri isolat DFY1, DFY2 dan DFY5 masing-masing

adalah 588 x 106

, 432 x 106

dan 488 x 10

6 CFU/g dan jam ke 6 masing-masing

dengan jumlah bakteri 611 x 106

, 722 x 10

6, 659 x 10

6 CFU/g kemudian menurun

sampai jam ke 24.

Secara keseluruhan dapat dilihat bahwa pertumbuhan bakteri DFY1lebih

tinggi dibandingkan dengan DFY2 dan DFY5. Dari gambar 3 diatas terlihat

bahwa fase pertumbuhan BAL terdiri dari 3 fase yaitu fase lag, fase eksponensial,

fase stasioner dan fase kematian (Urnemi dkk, 2012). Pada fase lag peningkatan

jumlah bakteri berlangsung lambat hal ini disebabkan bakteri sedang melakukan

proses aklimatisasi terhadap kondisi lingkungan (pH, suhu dan nutrisi). Fase lag

pada BAL potensial penelitian terjadi selama jam ke-0 sampai jam ke-4. Fase

selanjutnya adalah fase eksponensial yang merupakan fase dimana pertumbuhan

bakteri berlangsung sangat cepat. Pada pertumbuhan isolate BAL DFY1, 2 dan 5

fase eksponensial terjadi pada jam ke 4 sampai jam ke 7. Fase berikutnya adalah

fase stasioner pada fase ini tidak terjadi penambahan bakteri karena jumlah sel

yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Fase pertumbuhan stasioner

terjadi mulai jam ke-8 sampai jam ke-24. Penurunan ini disebabkan karena nutrien

dalam media dan cadangan energy mulai menipis.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

1 2 3 4 5 6 7 8

Ju

mla

h b

ak

teri

( x 1

06

) C

FU

/g

Waktu (jam)

Isolat

DYF1

Isolat

DYF2

Isolat

DYF5

Gambar 5. Kurva Pertumbuhan BAL

25

4.5. Uji Ketahanan BAL terhadap garam empedu

Mikroflora normal yang terdapat di dalam saluran pencernaan dan

mempunyai ketahanan yang bervariasi terhadap garam empedu salah satunya

adalah Lactobacillis. Ketahanan terhadap garam empedu merupakan prasarat

suatu isolat untuk dapat membentuk koloni dan melakukan aktivitas metabolism

pada inang (Havenaar et al, 1992). Uji ketahanan BAL terhadap garam empedu

diuji menggunakan larutan Oxgall Bile (GE) pada konsentrasi 0.3 % dan 0.5 %

dengan lama waktu 0 dan 3 jam.. Sebagai kontrol diuji BAL yang ditumbuhkan

hanya pada media MRS. Pertumbuhan isolate ditandai dengan adanya endapan

pada medium dan medium berubah warna menjadi keruh. Hasil uji terhadap

garam empedu tampak pada Gambar 6 dibawah ini.

26

Gambar 6. Hasil uji ketahanan isolatDFY1 terhadap garam empedu

27

Hasil rataan uji ketahanan hidup isolate BAL DFY1 pada kondisi adanya

garam empedu disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4. Uji ketahanan isolate DFY1 terhadap garam empedu (koloni)

Kode

isolate

MRS MRS +0.3% GE MRS+0.5% GE

Inkubasi

0 jam 3 jam

Inkubasi

0 jam 3 jam

Inkubasi

0 jam 3 jam

DFY1

10 -5

112/112 222/237 150 /173 238 / 240 205 / 212 199 / 210

10 -6

17/27 47 / 62 16 / 18 36 / 40 45 /50 45 / 44

10 -7

1/2 5 / 8 1 / 3 3 / 4 3 / 5 4 /6

Isolat DFY1 mampu bertahan hidup dan tumbuh pada medium yang

mengandung garam empedu sintetik (Oxgall Bile) dengan konsentrasi 0.3% dan

0.5% setelah 3 jam inkubasi. Isolat yang di uji sampai pengenceran 10-6

masih

dapat bertahan hidup pada medium yang mengandung Oxgall bile 0.5%. penelitian

Iniguez-Palomares et al. (2007) melaporkan bahwa isolat BAL tidak memiliki

resistensi terhadap CPBS (conjugated porcine bile salts) pada konsentrasi lebih

dari 0.1 % garam empedu. Empedu yang dikeluarkan di usus halus dapat merusak

bakteri karena efeknya dalam menghancurkan membran sel. Untuk beberapa

bakteri, seperti bakteri asam laktat yang memiliki enzim hidrolase (BSH = bile

salt hydrolase) yang bekerja terhadap garam empedu, sehingga BAL memiliki

kemampuan menghidrolisis garam empedu dan mengurangi kelarutannya. Untuk

meningkatkan viabilitas bakteri agar dapat melalui saluran pencernaan bagian

atas dapat dilakukan dengan metode enkapsulasi bakteri dengan alginat dan susu

skim (Chavarri et al. 2010).

4.6. Uji antagonis Bal dengan Salmonella, E. Coli, B. Cereus dan S. Aureus

Uji antagonis BAL bertujuan untuk melihat aktivitas antagonis BAL hasil

isolasi durian fermentasi terhadap empat bakteri patogen sebagai indicator bakteri

yaitu salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC 25922),

Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus (ATCC 25923) berupa zona hambat.

Daya hambat suatu senyawa anti bakteri dapat diketahui dengan melakukan uji

28

antagonis menggunakan difusi sumur agar. Metode ini sering digunakan untuk

penentuan jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan. Aktivitas hambatan terhadap

pertumbuhan bakteri patogen yang diujikan tampak sebagai zona bening

disekeliling sumur agar. Hasil pengukuran uji antagonis BALpotensial sebagai

antimikroba ditampilkan pada Tabel 5 dan Gambar 7.

Tabel 5. Hasil pengukuran uji antagonis isolate DFY1 sebagai antimikroba pada pH 4.37 dan pH 6.

Jenis bakteri patogen

Diameter zona hambat (cm)

Pada pH 4.37 Pada pH 6

Lingkaran

sumur

Lingkaran

zona bening

Ling.sumur Lingkaran

zona bening

P1 P 2 P1 P2 P1 P2 P1 P2

Bacillus cereus

S almonella

typhimurium

Esceria coli

Staphylococcus

aureus

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

1.3

1.3

1.1

1.2

1.2

1.3

1.1

1.2

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

1.2

1.1

1

1.1

1.1

1.1

1

1.1

29

Gambar 7. Lingkaran sumur dan zona bening isolat DFY1

pada uji terhadap beberapa bakteri patogen

Kriteriapenting yang digunakan untuk memilih isolat BAL yang akan

digunakan sebagai agensia probiotik adalah kemampuannya untuk menghambat

pertumbuhan bakteri patogen enterik yang menjadi penghuni saluran pencernaan.

Harimurti, et al. (2007) menggunakan Escherichia coli (gram negatif) sebagai

indikator bakteri enterik. Sementara itu Sari (2012) menggunakan bakteri

Staphylococcus aureus (gram positif) sebagai bakteri uji. Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus digunakan sebagai bakteri uji dalam penelitian ini

berdasarkan perbedaan gramnya. Sebagaimana diketahui, bakteri gram negatif dan

bakteri gram positif memiliki komponen dinding sel yang berbeda, sehingga

dalam proses penghambatan pertumbuhannyapun berbeda. Surono (2004)

menjelaskan bahwa beberapa jenis bakteri asam laktat menghasilkan bakteriosin,

suatu peptida yang bersifat antibakteri, toksin yang berupa protein yang dapat

mencegah pertumbuhan bakteri.

Hasil penelitian pada isolate DFY1 menunjukkan diameter zona hambat yang

tinggi yaitu mencapai 1 – 1.3 cm. Diameter zona hambat hasil penelitian ini jauh lebih

30

tinggi dibandingkan dengan yang didapat oleh Urnemi dkk (2012) dan Yulia dkk (2013)

pada isolate BAL asal fermentasi kakao varietas Trinitario/hibrida berkisar 27.00–32.50

mm dan 9.5-18 mm. Isolate DFY1 merupakan BAL paling potensial pada uji

antimikrobial karena memiliki zona hambat yang tinggi. Hasil uji daya hambat pada

penelitian ini sesuai dengan Surono (2004) yang menyatakan bahwa kebanyakan

bakteriosin yang dihasilkan oleh probiotik bersifat bakterisidal yaitu membunuh bakteri

dan bukan hanya menghambat, sebagai akibat dari hilangnya kemampuan potensi

membran.

Bakteri asam laktat digunakan sebagai probiotik untuk meningkatkan mikrobiota

normal usus inangnya karena kemampuannya menghasilkan berbagai zat antimikroba

termasuk asam laktat, alkohol, karbondioksida, diasetil, hydrogen peroksida, bekteriosin

dan metabolit lainnya (( Gaggia et al. 2010). Nouri et al. (2010) dan Heravi et al.

(2011), menyatakan bahwa Isolat-isolat BAL menunjukkankemampuan untuk

menghambat pertumbuhan patogen kemungkinan melaluikompetisi sel dalam

mendapatkan tempat dan makanan, penurunan pH lingkungandan produksi asam

organik atau bakteriosin. Asam organik yang dihasilkan olehBAL seperti asam

laktat dan asam asetat menghambat pertumbuhan bakteripatogen karena

kemampuan asam dalam bentuk tidak terdisosiasi menembusmembran sitoplasma,

sehingga menghasilkan pH intraseluler yang rendah danmengganggu proton motif

force transmembran (Alakomi et al. 2000).

4.7. Identifikasi BAL Potensial Durian Fermentasi 16S rRNA dengan

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Hasil uji PCR terhadap isolate BAL DFY1 asal fermentasi durian

menunjukkan intensitas fragmen yang dihasilkan tinggi dan layak digunakan

untuk kegiatan sekuensing. Identifikasi BAL dengan PCR sangat berpotensi

digunakan untuk mengetahui jenis bakteri asam laktat yang berperan pada

fermentasi durian tersebut. Penjajaran sekuen nukleotida 16S rRNA isolate

DFY1(1337 basa) dengan sekuen database GenBank terlihat menunjukkan bahwa

isolate DFY1 memiliki kemiripan dengan spesies lactobacillus (Tabel 5). Hasil

amplifikasi gen 16S rRNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)

dibandingkan dengan analisis BLAST sekuen DNA. Analisis BLAST dilakukan

dengan tujuan membandingkan data sekuen yang dimiliki dengan sekuen-sekuen

dari berbagai penjuru dunia dari bakteri yang didepositkan pada database atau gen

31

bank sekuen publik. Analisis BLAST dilakukan secara online pada website NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov.Jenis ini memiliki kemampuan memproduksi anti

mikroba yang dapat menghambat berbagai bakteri pathogen.

Beberapa makanan tradisional Indonesia dari produk fermentasi memiliki

potensi sebagai probiotik, misalnya dadih dari Sumatra Barat. Lactococcus lactis

ssp lactis R-22, leuconostoc paramesenteroides R-51, Leuconostoc

paramesentroides R-26 dan Lactobacillus casei ssp R-52 adalah galur dari hasil

isolasi dadih yang diketahui memenuhi syarat sebagai probiotik (Surono 2004).

Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolate terpilih mempunyai kemiripan 99%

dengan lactobacillus sp.

Tabel 6. Hasil analisis BLAST sekuen DNA pada isolate DFY1.

Accession Number (nomor aksesi)

Maksimum

skor

Hasil identifikasi

JX193619.1

AB362769.1

KJ802481.1

S 2172

S 2170

S 2167

Lactobacillus sp T2R2C12 (99%)

Lactobacillus plantarum strain NRIC 1960

(99%)

Lactobacillus praplantarum strain RTA-18

1960 (99%)

32

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

Dari hasil dan pembahas dapat diambil kesimpulan sebagaiberikut :

Ditemukan isolate BAL potensial probiotik dari durian fermentasi asal Jambi jenis

durian local (DFY1), stabil pada pH 4.37 dan 6. Menggunakan metode

pengkulturan didapatkan jumlah BAL pada pengenceran 10-9

adalah 6,2 x 106

CFU/g dan dari serangkaian uji kandidat BAL didapatkan isolat DFY1

mempunyai sifat probiotik yaitu, mempunyai aktivitas antimikroba terhadap

bakteri pathogen (salmonella typhimurium, ATCC 14028; Escherichia coli

,ATCC 25922; Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus, ATCC 25923) dan

tahan terhadap 0.3 dan 0.5% garam empedu. Dengan menggunakan sekuen 16S

rDNA isolat BAL teridentifikasi sebagai Lactobacillus sp, Lactobacillus

plantarum strain NRIC, Lactobacillus praplantarum strain RTA-18 , walaupun

demikian ketiganya

Saran

Untuk mendapatkan probiotik yang tahan terhadap lingkungan pencernaan

ruminansia sebagai rumen modifier perlu diaplikasikan lebih lanjut. Pemberian

probiotik perlu diperhatikan dosis yang tepat dan aplikasikan pada ternak

ruminansia secara in vitro dan in vivo.

33

DAFTAR PUSTAKA

Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, Mattila-Sandholm T, Latva-Kala K, Helander

IM. 2000. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting

the outer membrane. Appl Environ Microb, 66:2001-2005.

Amin, M.A., Zakiah, J., & Khim, Ng. L. (2004). Effect of salt on tempoyak

fermentation and sensory evaluation. Journal of Biology Science, 4, 650-

653.

Amiza, M.A., Zakiah, J., Khim, Ng L., & Lay K.W. (2006). Fermentation of

tempoyak using isolated tempoyak culture Research Journal of

Microbiology, 1,243-254.

Arora, S. P. 1989. Microbes Digestion in Ruminant. 2nd ed. Gadjah Mada

University Press: Yogyakarta.

Battcock, M., & Ali, S.A. (1998). Fermented fruits and vegetables, a

globalperspective FAO Agricultural Services Bulletin No 134, Rome,

Italy.

Chavarri, M, Marano I, Ares R, Ibanez FC, Marzo F, Villaran MC. 2010.

Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan

capsules improves survival in stimulated gastro-intestinal conditions. Int J

Food Microbiol. 142: 185-189.

Djide, M.N dan E. Wahyuddin. 2008. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Air Susu

Ibu dan Potensinya dalam Penurunan Kadar Kolesterol Secara In-vitro.

Majalah Farmasi dan Farmakologi. Vol 12 (3).

FAO/WHO. 2002. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting

Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London.

Fuller, R. 2002. Probiotic. What They are and What They Do. http://D: Probiotic.

What they and what do. Htm 1.

Gaggia F, Mattarelli P, Biavati B. 2010. Review : Probiotics and prebiotics in

animal feeding for safe food production. Int J of Food Microbiol.

141:S15–S28.

Gandjar, I. (2000). Fermentations of the far east. In RK Robinson,.C.A. Batt P.D.

Patel, (eds). Encyclopedia of Food Microbiology. New York: Academic

Press. 767-773.

General Laboratory Procedures. 1966. Department of Dairy Science. University of

Wisconsin. Madison.

Heravi RM, Kermanshahi H, Sankian M, Nassiri MR, Moussavi AH, Nasiraii LR,

Varasteh AR. 2011. Screening of lactobacilli bacteria isolated

fromgastrointestinal tract of broiler chickens for their use as probiotic.

African J. of Microbiol. Res. 5:1858-1868.

Hungate, R.E. 1966. The Rumen and It’s Mikrobes. Department of Bacteriology

and Agriculture Experiment Station University of California. Davis

California Academy Press. London.

Iniguez-Palomares C, Perez-Morales R, Acedo-Felix E. 2007. Evaluation of

probiotic properties in Lactobacillus isolated from samll intestine of

piglets. Microbiologia: 49:46-54.

34

Ketsa, S. & Daengkanit, T. (1998). Physiological changes during postharvest

ripening of durian fruit (Durio zibethinus Murray), The Journal of

Horticultural Science & Biotechnology, 73, 575-577.

Leisner, J.J., Vancanneyt, M., Rusul, G., Pot, B., Lefebvre, K., Fresi, A., & Tee,

LK. (2001). Identification of lactic acid bacteria constituting the

predominating microflora in acid-fermented condiment (tempoyak)

popular in Malaysia. International Journal of Food Microbiology, 63,149-

157.

Leisner, J.J., Vancanneyt, M., Lefebvre, K., Vandemeulebroecke, K., Hoste, B.,

Vilalta, N.E., Rusul, G., & Swings, J. (2002). Lactobacillus durianis

sp.nov., isolated from an acid-fermented condiment (tempoyak) in

Malaysia. International Journal of. Systematic and Evolutionary

Microbiology, 52, 927-931.

Mahdavi, A.H., H.R. Rahmani and J. Pourezza. 2005. Effect of probiotic

supplements on egg quality and laying henn’s performance. International

Journal of Poultry Science. 4 (7): 488-492.

Mansoub, N.H. 2010. Effect of probiotic bacteria utilization on serum cholesterol

and triglycerides contents and perormance of broiler chickens. Global

Veterinaria. 5 (3): 184-186.

Mardalena, L. Warly, E. Nurdin, R.W.R. Ningrat and S. Novianti. 2013. Feed

Supplement Evaluation of Pineapple Rind ((Ananas comosus L. Merr) and

Micro Mineral as Antioxidant Source to Rumen Fermentation of Etawah

Dairy Goats. J. Ind. Trop. Animal Agric. (Proses Terbit).

Marthen ML. Poppi DP and Stuart RM. 2009. Kuantifikasi efisiensi sintesis

protein mikroba rumen pada sapi jantan yang mengkonsumsi rumput tropis

segar. JITV14(2): 110-117.

McDonald, P., R.a. Edwards and J.F.D. Greenhalgh. 2002. Animal Nutrition. 5th

Ed. Longman. London.

Miller, T.L and M.J. Wollin. 2001. Inhibition of growth of methane-producing

bacteria of the ruminant forestomach by hydroxymethylglutaryl-SCoA

reductase inhibitors. J. Diry Sci. 84:1445-1448.

Nouri M, Rahbarizadeh F, Ahmadvand D, Moosakhani F, Sadeqzadeh E,

Lavasani S, Vishteh VK. 2010. Inhibitory effects of Lactobacillusalivarius

and Lactobacillus crispatus isolated from chicken gastrointestinal tract on

Salmonella enteritidis and Escherichia coli growth. Iranian J of

Biotechnol, 8: 32-37.

Nur, H. S., 2005, Pembentukan asam organik oleh isolat bakteri asam laktat pada

media ekstrak daging buah durian (Durio zibethinus Murr.). Bioscientiae,

Volume 2, Nomor 1: 15-24

Okade, S. 2003. Lactic acid bacteria of plant origin; Characteristic and

application. Proceedings. The 2nd

Asia Confrence of Lactic Acid Bacteria,

Taipei. 14-15.

O’sullivan, L., R.P., C. Ross and C. Hill. 2002. Potential of bactriocin-producing

lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality

Biochemic. Elsevier. 593-604.

Purwati, E., S Syukur dan Z. Hidayat. 2005. Lactobacillus sp. Isolasi dari

Biovicophitomega sebagai Probiotik. Di dalam Prooceding LIPI, Jakarta. Sas User’r. 1985. Guide: Statistics. Ed. Joyner SP. Sas Institute Inc.

35

Stanton, C., G. Gardiner, H. Meehan, K. Collins, G. Fitzgerald, P.B. Lynch and

R.P. Ross. 2001. Market potential for probiotics. A.m Journal Clin. Nutr.

73: 476-483s.

Steel RGD, Torrie JH. 1995. Prinsip dan Prosedur Statistika: Suatu Pendekatan

Biometrik.Sumantri B, Penerjemah. Jakarta: Gramedia. Terjemahan dari:

Principle and Procedures of Statistics.

Syukur, S, Urnemi, E. Purwati, Jamsari and Fajrul. 2011. Screening and in vitro,

protease activities from lactic acid bacteria associated wioth green cacao

fermentation in West Sumatera, in Proceeding International Seminar

Microbiology and Deseases. Yokohama, Japan. 15-20.

Sutardi, T. 1981. Sapi Perah dan Pemberian Makanannya. Bogor. Departemen

Ilmu Makanan Ternak, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.

Surono, I.S. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. PT Zitri. Cipta

Karya, Jakarta.

Tahir, I., S. Sumarsih, dan S. D. Astuti. 2008. Kajian Penggunaan Limbah Buah

Nenas Lokal (Ananas comosus, L) Sebagai Bahan Baku Pembuatan Nata.

Seminar Nasional Kimia XVIII, Jurusan Kimia FMIPA UGM,

Yogyakarta.

Tiley JMA. and Terry RA. 1966. A two stage technique for the in vitro digestion

of forage crop. Journal of British Grassland 18 : 104 – 111

Urnemi, S. Syukur, E. Purwati, I. Sanusi, Jamsari. 2012. Potensi bakteri asam

laktat sebagai kandidat probiotik penghasil bakteriosin terhadap mikroba

pathogen asal fermentasi kakao varietas Criollo. Jurnal Riset teknologi

Industri (LIPI). Vol. 6. No.13.

Yunenshi, F., S. Syukur dan E. Purwati. Pengaruh pemberian probiotik

Pediococcus pentosaceus asal fermentasi kakao hibrid terhadap penurunan

kolesterol telur itik pitalah. Masters Thesis. Program Pasca Sarjana

Universitas Andalas. Padang.

Yulia D, Sumaryati S dan Jamsari. 2013. Isolasi, karakterisasi dan identifikasi

DNA bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi sebagai antimikroba dari

fermentasi kakao varietas hybrid (Trinitario). Jurnal kimia Unand,

Padang.Volume 2 (2): 92-102.

Yurleni, R. Priyanto, E. Gurnadi dan K.G. Wiryawan. 2013. The effect of

protected lemuru fish oil on rumen microbes and its fermentation in

buffaloes and cattle. Jurnal Veteriner volume 14, No.3. Edisi

September2013. (Akan diterbitkan).

36

LAMPIRAN

Sequences producing significant alignments:

Select for downloading

or viewing reports Description

Max

score

Total

score

Query

cover

E

value Ident Accession

1 Select seq

gb|JX193619.1|

Lactobacillus sp.

T2R2C12 16S ribosomal

RNA gene, partial

sequence

2172 2172 99% 0.0 97% JX193619.1

2 Select seq

dbj|AB362769.1|

Lactobacillus plantarum

gene for 16S rRNA,

partial sequence, strain:

NRIC 1960

2170 2170 99% 0.0 97% AB362769.1

3 Select seq

gb|KJ802481.1|

Lactobacillus

paraplantarum strain

RTA-8 16S ribosomal

RNA gene, partial

sequence

2167 2167 99% 0.0 97% KJ802481.1

4 Select seq

gb|KJ779100.1|

Lactobacillus plantarum

strain MG26 16S

ribosomal RNA gene,

partial sequence

2167 2167 99% 0.0 97% KJ779100.1

5 Select seq

gb|KJ784537.1|

Lactobacillus sp. SMG67

16S ribosomal RNA

gene, partial sequence

2167 2167 99% 0.0 97% KJ784537.1

6 Select seq

dbj|AB733108.1|

Lactobacillus plantarum

gene for 16S rRNA,

partial sequence, strain:

CIF17AN2

2167 2167 99% 0.0 97% AB733108.1

7 Select seq

gb|JX232290.1|

Lactobacillus plantarum

strain P86 16S ribosomal

RNA gene, partial

sequence

2167 2167 99% 0.0 97% JX232290.1

37

Lactobacillus sp. T2R2C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Sequence ID: gb|JX193619.1|Length: 1533Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 73 to 1380GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand Frame

2172 bits(2408) 0.0() 1295/1330(97%) 23/1330(1%) Plus/Plus

Features:

Query 7

TTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACG 66

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 73

TTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACG 132

Query 67

TGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCCTGGAAACAGATTGCTAATACCGCATA 126

||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

||||||||||||||

Sbjct 133 TGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACC-TGGAAACAGAT-

GCTAATACCGCATA 190

Query 127

ACAAATTTGGCCCGCATGGTCCGGGTTTGAAAAAATGGTTTGGGCTATCACTTTTGGATG 186

|||| || || ||||||||||||||||||||| | ||| ||

||||||||||||||||||

Sbjct 191 ACAACTT-GGACCGCATGGTCCGGGTTTGAAAGA-

TGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 248

Query 187

GTCCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCCCCCATGGCAATGATACGTA 246

||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

||||||||||||||||

Sbjct 249 GTCCC-GCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACC-

ATGGCAATGATACGTA 306

38

Lactobacillus plantarum gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: NRIC 1960

Sequence ID: dbj|AB362769.1|Length: 1505Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 31 to 1339GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand Frame

2170 bits(2406) 0.0() 1294/1330(97%) 22/1330(1%) Plus/Plus

Features:

Query 7

TTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACG 66

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 31

TTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACG 90

Query 67

TGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCCTGGAAACAGATTGCTAATACCGCATA 126

||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

||||||||||||||

Sbjct 91 TGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACC-TGGAAACAGAT-

GCTAATACCGCATA 148

Query 127

ACAAATTTGGCCCGCATGGTCCGGGTTTGAAAAAATGGTTTGGGCTATCACTTTTGGATG 186

|||| |||| |||||||||||| |||||||| | ||| ||

||||||||||||||||||

Sbjct 149 ACAACATTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGA-

TGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 207

Query 187

GTCCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCCCCCATGGCAATGATACGTA 246

||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

||||||||||||||||

Sbjct 208 GTCCC-GCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACC-

ATGGCAATGATACGTA 265

39

Lactobacillus paraplantarum strain RTA-8 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Sequence ID: gb|KJ802481.1|Length: 1522Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 73 to 1380GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match

Alignment statistics for match #1

Score Expect Identities Gaps Strand Frame

2167 bits(2402) 0.0() 1294/1330(97%) 23/1330(1%) Plus/Plus

Features:

Query 7

TTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACG 66

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 73

TTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACG 132

Query 67

TGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCCTGGAAACAGATTGCTAATACCGCATA 126

||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

||||||||||||||

Sbjct 133 TGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACC-TGGAAACAGAT-

GCTAATACCGCATA 190

Query 127

ACAAATTTGGCCCGCATGGTCCGGGTTTGAAAAAATGGTTTGGGCTATCACTTTTGGATG 186

|||| || || |||||||||||| |||||||| | ||| ||

||||||||||||||||||

Sbjct 191 ACAACTT-GGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGA-

TGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 248

Query 187

GTCCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCCCCCATGGCAATGATACGTA 246

||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

||||||||||||||||

Sbjct 249 GTCCC-GCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACC-

ATGGCAATGATACGTA 306