LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASICiri-Ciri Fisiologis BakteriRabu, 25 Maret 2015 Pukul 13.00 16.00 WIBKelompok II

Nama NPM Tugas Rico Saputra260110130099Pembahasan, SimpulanNur Fitriatuzzakiyyah 260110130100Prosedur, Data pengamatanAni Hanifah260110130101Tujuan, Prinsip, Prosedur, Alat bahanHendita Faradina260110130102Pembahasan, SimpulanQisty Ahla D260110130103Tujuan, Prinsip, Prosedur, Alat bahanAngelika Riati260110130104Pembahasan, Simpulan

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARAN2015NilaiTTD

( Shintya ) (Benedictus)

I. TUJUAN Mengamati secara langsung atau tidak langsung produk. kegiatan enzimatik bakteri.II. PRINSIP1. AseptisTeknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Kerja aseptic dilakukan dengan bekerja diantara dua nyala api Bunsen dengan jarak +/- 20 cm. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kontaminasi.2. InkubasiInkubasi merupakan waktu yang diperlukan untuk berlangsungnya setiap proses pertumbuhan tertentu. Misalnya, jangka waktu untuk bakteri untuk tumbuh adalah masa inkubasi.3. Sifat fisiologis bakteriSifat fisiologis bakteri merupakan sifat-sifat khusus yang dimiliki oleh suatu bakteri terhadap reagen-reagen tertentu.. hal ini sangat penting didalam proes identifikasi suatu bakteri.4. Pertumbuhan bakteriPertumbuan bakteri dibagi kedalam 4 fase, yaitu fase lag phase yang merupakan fase adaptasi bakteri, lalu Log phase yang merupakan fase pertumbuhan dari suatu bakteri, lalu Stationer phase dimana pertumbuhan dan kematian seimbang atau stasioner, dan yang terahir adalah Death phase yang merupakan fase kematian dari bakteri.

III. TEORI DASARIsolasi dan identifikasi merupakan metode konvensional dalam pemeriksaan bakteri yang didasarkan pada reaksi biokimia. Oleh karena itu, dalam isolasi dan identifikasi bakteri diperlukan media yang selektif. Setelah dilakukan pewarnaan Gram dilanjutkan dengan uji biokimia pada berbagai media seperti gula. Bakteri yang sudah diisolasi dan diidentifikasi selanjutnya diuji secara serologis untuk menentukan serotipenya. Isolasi dan identifikasi untuk berbagai jenis bakteri dapat mengikuti metode Cowan (suwito, 2010).Selain itu,isolasi bakteri merupakan proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006).Metabolisme adalah semua reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi dan yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan-kegiatan selular, seperti pergerakan. Reaksi kimiawi yang membebaskan energi melalui perombakan nutrient disebut reaksi disimilasi atau penguraian; jadi merupakan kegiatan katabolik sel. Sedangkan reaksi kimiawi yang menggunakan energi untuk sintesis dan fungsi-fungsi sel lainnya disebut reaksi asimilasi atau anabolik. Jadi, reaksi disimilasi menghasilkan energi, dan reaksi asimilasi menggunakan energi (Singleton dan Sainsbury, 2006).Bila sel merombak ikatan-ikatan kimiawi tertentu selama metabolisme, energi yang dilepaskan menjadi tersedia untuk melangsungkan kerja biologis. Selama masa hidup sel, kerja ini bersifat ekstensif dan beragam. Mikroorganisme heterotrofik nonfotosintesik memperoleh energinya dari oksidasi (pengusiran electron atau atom hydrogen) senyawa-senyawa anorganik (Pelczar dan Chan, 1986).Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem endoenzim selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik.sedangkan eksoenzim yaitu enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Sebagian besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel (Waluyo, 2004).Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor nonprotein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger, 1995).Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang menghasilkan warna reagen. Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk menghidrolisis lemak (Pelczar dan Chan, 1986).Dalam mengidentifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni serta pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri tersebut.Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahui sifat-sifat suatu koloni bakteri. Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004).Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).Uji biokimia dapat digunakan untuk menentukan sifat metabolisme bakteri dilihat melalui interaksi reagen - reagen kimia dengan metabolit - metabolit yang dihasilkan. Selain itu juga dapat dilihat dari kemampuan bakteri dalam pemakaian suatu senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi. Metode Uji Biokimia dapat digunakan sebagai upaya untuk proses identifikasi bakteri (Backmann,2006).Menurut Cappucino (1978) besar kecilnya daerah hambatan dipengaruhi oleh laju pertumbuhan mikroorganisme,kemampuan dan laju difusi bahan aktif pada medium, kepekaan mikroorganisme terhadap zat aktif serta ketebalan dan viskositas medium (zaraswati dan eva (2005).Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji antara lain uji dalam melakukan fermentasi, reduksi terhadap nitrat, uji oksidase, produksi katalase, hidrolisis protein, uji sitart simmons, hidrolisis urea, hidrolisis H2S dan uji motilitas (Funke, 2004). Uji kebutuhan oksigen dengan medium NB Uji kebutuhan oksigen dilakukan untuk mengetahui sifat pertumbuhan bakteri dengan menggunakan medium NB. Sifat pertumbuhan yang diamati adalah aerob, anaerob, fakultatif atau mikroaerofil (Volk & Wheeler, 1993). Uji Katalase Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut :2 H2O2+ 2 H2O+O2(Volk & Wheeler, 1993). Uji fermentasi karbohidrat Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis gula, yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa (Lay, 1994). Uji hidrolisis pati Uji hidrolisis pati untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati dengan cara menghasilkan enzim amilase. Pati merupakan polisakarida yang memiliki berat molekul yang tinggi, karena ukurannya yang besar, polisakarida tidak mampu diserap oleh membran sel (Cappuccino dan Sherman, 1992). Uji indol Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari asam amino esential triptofan (Lay, 1994). Uji fermentasi gula, H2S, dan gas dengan TSIA Uji ini menggunakan medium TSIA yang mengandung glukosa, laktosa dan ferosulfat (Volk & Wheeler, 1993). Uji MR-VR Uji MR bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroorganisme untuk mengoksidasi glukosa dan menstabilkan konsentrasi asam yang tinngi sebagai produk akhir. Sedangkan uji VR untuk membedakan kemampuan mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir non-asam atau netral seperti asetilmetilkarbonil dari asam organik yang dihasilkan dari metabolisme glukosa (Lay, 1994). Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi (Capuccino dan Sherman, 1992). Uji hidrolisis urea Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis urea dengan menggunakan enzim urease dan mengubah pH media dari pH netral menjadi basa (Lay, 1994). Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu, yang mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup disekitarnya (Dwidjoseputro, 1994).Komposisi media yang digunakan dalam uji uji tersebut antara lain (Strohl, 2001):1. Medium Skim Milk: Susu skim Agar2. Medium Pati: Agar Pati 1 % 3. Fermentasi Karbohidrat: Laktose Maltose Glukose Sukrose Mannitol 4. Uji MR- VP: MR (Metil-Red) / VP (Voges-Proskauer)5. Reduksi Nitrat : Nitrat cair 6. Produksi Katalase: Larutan hidrogen peroksida 7. Hidrolisis asam amino triptofan: TSB atau tripton cair 1% 8. Hidrolisis Urea: Urea cair 9. Uji Sitrat Simons: Sitrat Garam amonium indikator biru bromtimol 10. Uji Motilitas Indikator garam tetrazoliumBakteri yang digunakan pada praktikum ini adalah E. Coli.Dimana E. Coli ini termasuk bakteri berbahaya karena dapat menyebabkan diare. Salah satu syarat E. coli dalam SNI 01-6366-2000 harus negatif. Pemeriksaan E. coli dapat menggunakan metode AOAC (1996), sedangkan untuk strain E. coli O157:H7 mengikuti Robert et al. (Suwito, 2010).IV. ALAT DAN BAHAN4.1 Alat Autoclave Bunsen Inkubator Ose berujung lurus dan bundar Rak tabung reaksi Tabung durham Tabung reaksi

Gambar alat:

4.2 Bahan Agar miring sitrat Simmons Agar miring TSIA/H2S biakan dalam agar miring trypticase soy agar (TSA); Staphylococcus aureus. biakan dalam trypticase soy broth (TSB) berumur 24 jam: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis, bacillus cereus, streptococcus mitis, streptococcus pyogenes, streptococcus faecalis Indikator merah metil Kaldu glukosa Kaldu laktosa Kaldu maltosa Kaldu manosa Kaldu sakarosa Kaldu tripton Media Sulfite SIM Medium MR Medium VP Nutrient Agar Reagen Barritt Reagen Kovac Reagen uji nitrit Suspensi bakteri

V. PROSEDUR

1. Uji fermentasi karbohidrat Biakan diamati di dalam tabung durham berisi kaldu glukosa dengan indicator merah fenol. Bila Warna medium berubah menjadi kuning, artinya bakteri tersebut membentuk asam dari fermentasi glukose. Bila pada tabung kecil yang diletakkan terbalik di dalam tabung media itu terdapat gelembung, artinya dari fermentasi tersebut terbentuk pula gas. Kemudian hasil pengamatan ditulis dalam tabel pengamatan.2. Uji MR (methyl red, merah metil) Sebanyak 2 tabung bersih berukuran 13 x 100 mm dan biakan MR-VP disiapkan, kemudian kedua biakan tersebut dituangkan masing-masing setengahnya ke dalam tabung-tabung bersih dan tabung diberi tanda agar tidak tertukar. Sisanya disimpan untuk uji berikutnya (uji VP). 3-4 tetes indikator merah metil ditambahkan pada salah satu tabung MR-VP dari setiap organisme. Bila warna medium berubah menjadi merah, artinya terbentuk asam. hasil pengamatan dicatat dalam tabel hasil pengamatan.3. Uji VP (Voges-Proskauer) Reagen Barritt yaitu 10 tetes larutan A dan 10 tetes larutan B ditambahkan pada sisa biakan dalam medium MR-VP masing-masing organisme. Tabung-tabung tersebut dikocok keras-keras selama 20-30 detik, Bila terlihat merah muda artinya terjadi pembentukan 2,3-butandiol atau reaksi Voges-Proskauer positif. Kadang-kadang diperlukan waktu 2 jam untuk memperoleh dari hasik uji ini. hasil pengamatan dicatat dalam tabel Hasil Pengamatan. 4. Uji motilitasOse kawat lurus disterilisasi kemudian suspensi bakteri ditusukkan secara tegak lurus ke dalam tabung reaksi yang berisi media agar (padat). Tabung diinkubasikan selama 24 jam dan diamati. bakteri yang dinyatakan positif motil atau bergerak akan ditunjukan dengan adanya kekeruhan pada media uji yang menunjukan pertumbuhan koloni.. 5. Uji indol biakan-biakan TSB diambil lalu ditambahkan masing-masing 10-20 tetes reagen Kovac kedalamnya. Bila dalam biakan tersebut terdapat indol, maka dibagian atas biakan akan segera terbentuk lapisan berwarna merah. Hasil pengamatan dicatat dalam tabel hasil pengamatan. 6. Uji hidrogen sulfide / TSIATabung reaksi diinokulasikan dengan ose yang disterilisasi dengan cara digoreskan secara zigzag ke agar miring suspensi bakteri. Tabung diinkubasikan selama 24 jam. Kemudian, perubahan diamati. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan hitam dengan gas. 7. Uji penggunaan sitrat Biakan agar miring sitrat Simmons diamati, apakah ada perubahan warna dan apakah ada petumbuhan. Hasil pengamatan dicatat pada tabel hasil pengamatan. Bila organisme yang diuji dapat tumbuh dengan menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya maka akan terlihat adanya pertumbuhan pada permukaan agar miring yang Anda gores disamping berubahnya warna medium menjadi biru.

VI. DATA PENGAMATANNoJenis ujiSebelumSesudahketerangan

1Uji fermentasi karbohidrat(glukosa)

Gelembung udara

Media berubah dari merah menjadi kuning, dan terdapat gas

2Uji fermentasi karbohidrat (laktosa)

Gelembung udara

Media berubah dari merah menjadi kuning, dan terdapat gas

3Uji fermentasi karbohidrat (sakarosa)

Media berubah dari merah menjadi kuning, tanpa ada gas

4Uji fermentasi karbohidrat (manosa)

Gelembung udaraWarna media berubah dari merah menjadi kuning, terbentuk gas

5

Uji fermentasi karbohidrat (maltose)

Gelembung udara

Warna media berubah dari merah menjadi kuning, terbentuk gas

6Uji MR

warna media berubah menjadi merah setelah ditambah methyl red

7Uji VP

Tidak terjadi perubahan setelah diberi pereaksi -naftol dan KOH

8

Uji indol

Tidak terbentuk cincin merah setelah diberi reagen Kovac

9Uji TSIA

Media tidak berubah

10Uji sitrat

Media tidak berubah

11Uji motilitas

Tidak tampak adanya motilitas dari bakteri di sekitar tusukan

VII. PEMBAHASAN

1. Uji Fermentasi KarbohidratPada pengujian fermentasi karbohidrat, tabung durham berisi kaldu glukosa, laktosa, maltosa, sukrosa dan manosa dengan diberikan indikator merah fenol. Menurut Volk dan Wheeler (1993) organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat atau gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator merah fenol yang terdapat dalam perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah (indikator merah fenol).Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses penggunaan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Pembentukan gas dapat dilihat adanya udara di dalam tabung peragian atau fermentasi (Volk dan Wheeler, 1993).Pertumbuhan mikroba diambil dengan ose steril dan dinokulasikan ke dalam medium glukosa, laktosa, maltosa, sukrosa dan manosa kemudian diinkubasi 2 x 24 jam pada suhu 37C dengan uji positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna dan menghasilkan gas atau gelembung udara (Naid dkk, 2013). Namun pada praktikum dilakukan inokulasi dengan jarum ose bulat steril dan di masukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah diberi tabung durham dan selanjutnya diinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Perlakuan ini dilakukan untuk semua tabung yang mengandung glukosa, laktosa, maltose, sakarosa dan manosa. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap pertama. Sedangkan, laktosa, maltosa, sukrosa dan manosa akan di hidrolisis terlebih dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan glukosa. Monosakarida jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa melalui reaksi epimerisasi. Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO2dan kemudian pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam asetat di reduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk asam laktat dan etanol (Volk dan Wheeler, 1993).Berdasarkan hasil pengamatan didapat tabung yang berisi glukosa, laktosa, maltose, sakarosa dan manosa mengalami perubahan warna dari merah menjadi kuning. Uji fermentasi karbohidrat dikatakan positif jika terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning dengan menggunakan indikator merah fenol. Hal ini mengacu pada bakteri Escherichia coli yang berdasarkan literatur bahwa Escherichia coli dapat memfermentasikan karbohidrat. Perubahan warna tersebut terjadi dikarenakan hasil fermentasi oleh Escherichia coli adalah asam. Merah fenol dalam keadaan basa memiliki warna merah sedangkan dalam keadaan asam memiliki warna kuning. Hal ini menunjukkan bahwa sebelum Escherichia coli dapat melakukan fermentasi, medium masih memiliki pH basa, sedangkan setelah Escherichia coli melakukan fermentasi menghasilkan medium yang bersifat asam.Hasil fermentasi karbohidrat selain asam yang ditandai perubahan warna adalah adanya gas. Gas tersebut dapat dilihat dengan adanya gelembung pada tabung durham. Gas yang dihasilkan dari proses fermentasi merupakan gas karbondioksida. Berdasarkan hasil pengamatan, tabung yang menghasilkan gas adalah tabung dengan adanya kandungan glukosa, laktosa, maltosa dan manosa. Sedangkan pada tabung sakarosa tidak ditemukan adanya gelembung. Maka berdasarkan literatur, hasil pengamatan ini dengan pengujian fermentasi karbohidrat semakin mengacu pada bakteri Escherichia coli walaupun pada tabung sakarosa tidak menghasilkan gelembung atau gas. Sebab berdasarkan literatur pada fermentasi sakarosa dapat terjadi adanya gas atau tidak. Namun yang paling menentukan adanya uji fermentasi karbohidrat yang positif adalah perubahan warna pada medium.

2. Uji MR (methyl red, merah metil) Pada uji ini, pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 18-21 jam. Setelah diinkubasi, biakan suspensi bakteri tersebut kemudian ditetesi indikator metil merah sebanyak 3-4 tetes, kemudian dilihat apakah terjadi perubahan warna menjadi merah atau tidak. Hasil positif ditunjukkan oleh perubahan warna suspensi bakteri menjadi merah. Hasil dari uji MR ini adalah positif. Hal ini sesuai dengan literatur pada bakteri Escherichia coli yang menunjukkan uji MR adalah positif. Bakteri Escherichia coli memfermentasi glukosa di dalam medium MR-VP dan menghasilkan banyak sekali- asam laktat, asetat, suksinat, dan format disamping C02, H2 dan etanol. Akumulasi asam-asam ini menurunkan pH sampai 0,5 atau kurang.

3. Uji VP (Voges-Proskauer) Pada uji ini, pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 18-21 jam. Setelah diinkubasi, suspensi bakteri kemudian ditambahkan reagen Barritt yang dapat dengan mudah mendeteksi adanya asetoin (asetil-metil dan karbinol), yaitu prekusor 2,3-butandiol. Reagen ini terdiri dari -naftol dan KOH. Kemudian ditambahkan pereaksi -naftol dan KOH masing-masing sebanyak 3-10 tetes ke dalam tabung reaksi, kemudian dikocok selama 30 detik, lalu dilihat adanya perubahan warna menjadi merah atau tidak. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah yang artimnya terjadi pembentukan 2,3-butandiol dan etanol. Hasil uji bakteri kami adalah negatif, yang artinya bakteri kami tidak menghasilkan alkohol. Hal ini sesuai dengan literatur yang menunjukkan uji VP pada bakteri Escherichia coli adalah negatif.

4. Uji Motilitas Selanjutnya dilakukan uji motilitas. Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari Enterobacteriaceae. Uji motilitas dilakukan dengan cara Uji motilitas berperan dalam mengetahui pergerakan bakteri (Shields dkk, 2013). Untuk uji motilitas dilakukan dengan cara ose kawat lurus yang sudah disterilisasi, suspensi bakteri ditusukkan secara tegak lurus ke dalam tabung reaksi yang berisi media agar (padat). Tabung diinkubasikan selama 24 jam dan diamati. Hasilnya tidak didapatkan adanya pergerakan bakteri (negatif) dimana pada media pertumbuhan bakteri tidak terdapat kekeruhan pada media yang telah ditusukkan. Menurut Shields (2013), bakteri yang dinyatakan positif motil atau bergerak akan ditunjukan dengan adanya kekeruhan pada media uji yang menunjukan pertumbuhan koloni.Motilitas merupakan salah satu ciri penting pengkarakterisasian bakteri. Sifat ini diakibatkan oleh adanya alat motor cambuk yang disebut flagela sehingga sel bakteri dapat berenang di dalam lingkungan air. Motilitas sebagian besar jenis bakteri motil pada suhu relatif rendah 15-25 C dan mungkin tidak motil pada suhu 37 C. Namun suatu resiko tersendiri bagi organisme berukuran kecil untuk menerima kenyataan bahwa dengan ukurannya tersebut sel bakteri dapat dipengaruhi oleh aktivitas molekul air/pelarut disekitarnya yang dinamakanBrownian movement. Gerak brown adalah gerak partikel koloid yang bergerak dengan arah tak beraturan, gerakan ini disebabkan oleh molekul-molekul pelarut dengan molekul koloid yang saling berbenturan. Gerakan acak molekul air ini dapat membuat sel bakteri bergoyang-goyang cepat atau lebih tepatnya bergetar tak beraturan sehingga bagi mata yang awas akan terlihat motil. Sel yang terpengaruh gerak brown dapat diamati pada perbesaran 1000X dengan mikroskop cahaya, tentunya dengan preparat ulas sederhana dari media kaldu atau koloni yang dicampur air, dapat juga dengan metodehanging drop preparation (Barrow, 1993).

5. Uji Indol Selanjutnya dilakukan uji Indol. Menurut Leboffe (2011), Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol dengan menggunakan enzim tryptophanase. Uji indol dilakukan pada ose yang sudah distrelisasi, suspensi bakteri dipindahkan ke dalam tabung, yang didalamnya berisi media cair yang mengandung 10-20 tetes reagen kovac. Tabung diinkubasikan 24 jam kemudian hasil diamati. Bila dalam biakan tersebut terdapat indol, maka dibagian atas biakan akan segera terbentuk lapisan berwarna merah. Hasil yang didapat adalah negative, dapat ditunjukkan dengan tidak terbentuknya lapisan warna merah. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidakmembentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Produksi indol di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat dan amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae (Hemraj, 2013). Tryptophan adalah asam amino esensial, yang teroksidasi oleh beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat dan amonia. Uji indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam tryptophan broth, yang mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan dideteksi dengan menambahkan reagen Kovacs ini yang menghasilkan cincin berwarna merah. Lapisan alkohol berkonsentrasi warna merah berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol positif dinyatakan dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol bereaksi dengan aldehida (Sridhar, 2006).

6. Uji TSIA/ H2SKemudian dilakukan uji Hidrogen Sulfide (H2S)/ TSIA. .Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam. TSIA agar adalah media deferensial yang digunakan dalam menentukan fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, ujia TSIA ini juga dapat mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. TSIA membedakan bakteri berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa dan sukrosa dan produksi hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan dalam identifikasi Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri gram negatif lainnya (Lehman, 2005). Proses uji H2S/ TSIA dilakukan dengan tabung reaksi diinokulasikan dengan ose yang disterilisasi dengan cara digoreskan secara zigzag ke agar miring suspensi bakteri. Tabung diinkubasikan selama 24 jam. Kemudian, amati perubahan. Hasil uji H2S/TSIA menunjukkan hasil positif. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan hitam dengan gas. Gas positif dikarenakan gas yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah di media atau akan mengangkat agar-agar dari bagian bawah tabung (Leboffe, 2011).

7. Uji SitratUji Sitrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan indikator pH bromothymol biru. Pemanfaatan sitrat melibatkan enzim citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium dari hijau menjadi biru (Hemraj, 2013). Bromothymol blue digunakan sebagai indikator saat asam sitrat dimetabolisme, menghasilkan karbondioksida yang menggabungkan natrium dengan air untuk membentuk natrium karbonat yang merupakan produk alkaline yang menghasilkan perubahan warna dari hijau menjadi biru dan hal ini menunjukkan tes tersebut positif (Sridhar, 2006).Dalam uji Sitrat dilakukan dengan tabung reaksi diinokulasikan dengan ose yang disterilisasi dengan cara digoreskan secara zigzag ke agar miring suspensi bakteri. Tabung diinkubasikan selama 24 jam. Kemudian, amati perubahan. Hasilnya berupa negatif dimana tidak terjadi perubahan warna pada media suspensi bakteri. Berdasarkan hasil uji biokimia terhadap bakteri No. 3A yang diujikan, dapat diketahui bahwa bakteri yang diujikan merupakan bakteri Escherichia coli. Hal ini diperkuat dengan hasil uji biokimia yang telah dilakukan. Tetapi berdasarkan literature yang ada, uji Indol seharusnya memberikan hasil yang positif. Hal ini dapat terjadi dikarenakan beberapa factor seperti kesalahan dalam prosedur kerja dimana besar kemungkinan kerja yang dilakukan kurang aseptis yang menyebabkan bakteri mati atau terkontaminasi dengan lingkungan yang menyebabkan tidak terjadi reaksi apa-apa pada saat uji indol.

VIII. SIMPULAN

Kegiatan enzimatik dari sampel bakteri dapat diamati dimana hasil identifikasi yang telah dibandingkan dengan karakteristik bakteri melalui uji biokimia menyimpulkan bahwa sampel bakteri No. 3A adalah bakteri Escherichia coli.

DAFTAR PUSTAKABackmann, A. 2006. Carbohydrate metabolism in bacteriause of differences in carbohydrate metabolism for identifying bacteria. Caister Academic Press. USA.Barrow, G.I. and R.K.A. Feltham. 1993. Cowan and Steels, Manual for the Biology 3rd Edition. John Wiley and Sons. Sussex, England.Cappuccino , J.G & Sherman. 1983. Microbiology a Laboratory Manual. Addison dari berbagai spesimen klinis. Vol. 23 No. 4Dr.Zaraswati Dwyana,M.Si dan Dra.Eva Johannes M.Si.2005. Uji Efektivitas Ekstrak Kasar Alga Merah Eucheuma cottonii Sebagai Antibakteria Terhadap Bakteri Patogen. Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambaran. Jakarta.Funke BR, Tortora GJ, Case CL . 2004. Microbiology: an introduction (8th ed, ed.). Benjamin Cummings. San Francisco.Hemraj V, Diksha S, Avneet G. A Review On Commonly Used Biochemical Test Biochemical Test for Bacteria. Innovare Journal of Life Science. 2013.1-7.Hera Noviana.2004.Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi diisolasi dari berbagai spesimen klinis. Vol. 23 No. 4Irianto, K.2006. Mikrobiologi.Yrama Widya : BandungLay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada. Jakarta.Leboffe MJ and Pierre BE. 2011. A Photographic Atlas for the Microbiology forLaboratory. Morton Publishing Company. Lehninger. 1995. Dasar dasar Biokimia. Jilid I. Erlangga. Jakarta.MalangMurray. 1995. Biokimia Harper. EGC. Jakarta.Naid, T., Kasim, S.,Marzuki, A.,Sumarheni. (2013). Produksi Antibiotika Secara Fermentasi dari Biakan Mikroorganisme Simbion Rumput Laut Eucheuma cottoni. Majalah Farmasi dan Farmakologi, Vol. 17, No.3, hlm. 61 68. Pelczar, M.J. Dan Chan, E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.Pelczar. 2008.Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.Singleton dan Sainsbury. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Identification of Medical Bacteria. New York: Cambridge University Press.Sridhar, RPN. 2006. IMViC Reaction. JJMMC. Strohl, William A., Rouse,H and Fisher, BD. 2001. Lippincotts Illustrated Reviews: Microbiology. Lippincott William & Wilkins. USA.Volk and Wheleer. 1993.Analisis Praktikum Mikrobiologi Umum untuk Perguruan Tinggi. Yogyakarta: UGM Press.Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang. Weshley Publishing Company. New YorkWidodo Suwito.2010.Bakteri Yang Sering Mencemari Susu:Deteksi, Patogenesis, Episemiologi, Dan Cara Pengendaliannya. Jurnal Litbang Pertanian.