Praktikum bioteknologi ada beberapa tahap yang harus dikerjakan sebelum kita mendapatkan hasil murni dari isolasi DNA dan isolasi Kromosom. Pada awal praktikum kita melakukan Transformasi, transformasi disini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Coli. Transformasi disini memiliki prinsip diantaranya pembuatan sel kompenten yang dapat disisipi vektor DNA rekombinan, transformasi E. Coli dengan plasmid rekombinan dan menyeleksi koloni E.coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan menggunakan cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG.

Pada praktikum transformasi genetic ini dilakukan pembuatan sel kompeten E.coli strain DH5α dan transformasi plasmid DNA. Transformasi genetic adalah proses introduksi gen dari satu organism ke organisme lain yang memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Transformasi genetic merupakan salah satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi gen, pengujian metabolisme, mempelajari fisiologi serta perkembangan tanaman. (Wibowo, 2002)

Sebelumnya telah dilakukan pembuatan sel kompeten oleh asisten sehingga pada praktikum kali ini praktikan tinggal melakukan transformasi DNA plasmid. Sel Kompeten (Competent Cells, CC, C-Cells) adalah sel (bakteri atau yeast) yang telah mengalami perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya. Artinya membrane sel dari bakteri atau yeast tersebut mampu dilewati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah masuk tersebut akan bertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba tersebut. Pembuatan sel kompeten dimulai dengan mengkultur semalaman strain E.coli DH5α ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni stran E.coli JM 109 ke media LB cair. Setelah itu diinkubasi

di dalam shaker-inductor dengan kecepatan rotasi 125rpm dengansuhu 37⁰C selama 16 jam. Kultur sel sendiri merupakan metode dimana suatu sel dari suatu jaringan diambil dan ditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol dan aseptik. Sel yang digunakan untuk dikultur biasanya diambil darijaringan eukariot. Sel tersebut akan tumbuh dan bertambah banyak dalam kondisi in vitro.

Setelah dikultur dan diinkubasi selama 16 jam, kultur dipindahkan ke media LB cair 25 mL dengan cara mengambil 250 mikro liter E.coli JM 109 kedalam media LB cair 25 mL, lalu diinkubasi kembali dengan shaker – incubator dengan kecepatan 125 rpm selama 2 jam pada suhu yang sama. Tahap ini dilakukan agar sel sema kin memperbanyak diri sehingga jumlahnya mena dibanyak sehingga untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah melalui media tersebut.

Kemudian 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam, Kultur hasil inkubasi 2 jam ini diperkirakan telah mengalami fase log. Fase log diperlukan agar jumlah bakteri yang terisolasi untuk pembuatansel kompeten optimal. Setelah itu kultur diambil kembali dan untuk selanjutnya dimasukkan tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5700 x g selama 5 menit hal ini dilakukan untuk memisahkan bakteri dengan medium pertumbuhannya.

Supernatan yang dihasilkan dibuang dan kedalam tabung ditambahkan 500 mikro liter CaCl2 dingin. DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk mengcloning gen.

Supernatan tersebut mengandung DNA plasmid sehingga harus dipisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom sedangkan fungsi penambahan CaCl2 sendiri akan mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas(Utomo,2005).

Setelah dilakukan penambahan CaCl2 dingin, kemudian diresuspensi dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama dan waktu yang sama seperti sebelumnya Supernatan dibuang kembali ditambahkan lagi CaCl2 dingin di resuspensi lagi dan selanjutnya diinkubasi dalam es. Sentrifugasi dilakukan berulang – ulang bermaksud agar DNA plasmid benar – benar sudah tidak bercampur lagi dengan DNA kromosom. Sedangkan penginkubasian dalam es bertujuan untuk membuat suhu di dalam media menjadi ekstrem hal ini akan berpengaruh dengan tahap selanjutnya yaitu “heat – shock’. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid kedalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

Untuk mengetahuisel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai markaseleksi. Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, makaselE. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasaldariseltunggal. Semuabakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.

Tabung mikro sentrifuga hasil inkubasi 2jam yang masing-masingberisi 200μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10μl plasmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan plasmid. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42 Cc dan segera dipindah kan kedalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

Tabung mikro sentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37 Cc dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam. Sebanyak 100 μl hasil diinkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa kloramfenikol . Inkubasi dilakukan selama 18jam /over night pada 37 CC.

Untuk cawan yang berisi E.Coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. Setelah cawan petri diinkubasi selama 20 jam di dalam inkubator untuk menumbuhkan bakteri , maka cawan petri tersebut dikeluarkan dari inkubator . Inkubasi cawan petri tersebut bertujuan untuk memastikan bahwa transformasi

yang dilakukan telah berhasil dimana bakteri E.coli DH5α telah berhasil dimasukkan plasmid pCambia1200 kedalam bakteri tersebut. Sehingga keberhasilan transformasi dapat diketahui dengan adanya pertumbuhan bakteri E.coli DH5α berplasmid pada media berantibiotik.

Cawan A yaitu cawan berisi Luria Bertani Agar , Kloramfenikol , dan E.coli DH5α yang diberi plasmid pCambia1200 , dibuat dalam 3 cawan yaitu A1 , A2, dan A3. Namun jumlah E.coli DH5α yang dimasukkan kedalam cawan A1 , A2, dan A3 berbeda – beda , yaitu masing masing 20 µL, 20µL , dan 20 µL . Penanaman bakteri dalam 3cawan berbeda dengan kondisi yang sama dilakukan agar perlakuan dilakukan secara triplo , agar meminimalisir kegagalan dalam penumbuhan bakteri. Kloramfenikol ditambahkan pada masing masing media dilakukan untuk menyeleksi bakteri untuk tumbuh di dalam media tersebut , sehingga bakteri yang diharapkan untuk tumbuh adalah bakteri yang sudah memilki plasmid resistensi Kloramfenikol , dimana pada praktikum ini bakteri yang diharapkan tumbuh adalah bakteri E.coli DH5α yang telah dimasukkan plasmid pCambia1200.

pCambia1200

Berdasarkan peta gen plasmid diatas pCambia1200 merupakan plasmid yang memiliki gen resiten kloramfenikol dan bersifat plasmid high copy number sehingga pCambia1200 dalam praktikum ini dimasukkan kedalam bakteri E.coli DH5α , selain itu E.coli DH5α telah diketahi peta gen nya sehingga E.coli DH5α mudah untuk ditangani. Gen resisten kloramfenikolnya membuat bakteri yang telah dimasukkan pCambia1200 akan mampu tumbuh pada lingkungan berkloramfenikol.

Hasil yang didapat pada cawan A1 , A2 ,A3 adalah terdapat pertumbuhan bakteri pada semua cawan A baik A1, A2 maupun A3 . Berdasarkan teori , bakteri yang mampu tumbuh pada media yang telah diberi kloramfenikol adalah hanya bakteri yang resisten terhadap kloramfenikol . Seperti yang sudah diketahui plasmid pCambia1200 memiki gen resistensi kloramfenikol , jika pCambia1200 tersebut berhasil dimasukkan i ke E.coliDH5α, atau dengan kata lain proses transformasi terhadap E.coliDH5α berhasil ,maka E.coliDH5α tersebut mampu tumbuh pada cawan A1 ,A2,A3. Dengan hasil adanya pertumbuhan bakteri pada cawan A1 :

,

Gambar cawan A1

Gambar Cawan A2

Gambar Cawan A3

Cawan A1,A2, dan A3 yang didapat diatas maka diperkirakan yang tumbuh tersebut adalah bakteri E.coliDH5α berplasmid pCambia1200 , dan diperkirakan transformasi berhasil.

Pertumbuhan bakteri pada cawan A2 lebih bening dibandingkan A1 dan A3 hal ini dikarenakan jumlah bakteri yang dimasukkan kedalam cawan A2 lebih sedikit dibandingkan A1 dan A3.

Bakteri E.coli DH5α mendapatkan plasmid pCambia1200 melalui proses transformasi . Transformasi adalah proses perpindahan materi genetik dari lingkungan ke sel resipien yang kompeten , plasmid pCambia1200 sebagai materi genetik dan Bakteri E.coli DH5α bertindak sebagai sel kompeten . Sel kompeten adalah sel yang memiliki kemampuan untuk menerima materi genetik dari lingkungan , sel kompeten mampu mengikat materi genetik bebas 1000 kali lebih tinggi dibandingkan non kompeten . Bakteri E.coli DH5α bukan sel bakteri yang kompeten secara alamiah , sehingga sel bakteri E.coli DH5α harus diberi perlakuan khusus agar menjadi kompeten supaya mudah tertransformasi. Untuk menjadikannya kompeten , sel bakteri E.coli DH5α diberi CaCl2 dingin , tujuan penambahan CaCl2 dingin adalah agar Sel bakteri E.coli DH5α menjadi bermuatan positif , dan suhu dinginnya untuk mengkondisikan lingkungan agar nanti ada perubahan suhu ekstrim yang sangat berarti untuk perlakuan selanjutnya. Setelah mengkondisikan Sel bakteri E.coli DH5α menjadi bermuatan positif (kompeten) , plasmid pCambia1200 ditambahkan kedalam eppendorf berisi Sel bakteri E.coli DH5α kompeten tersebut . Karena plasmid memiliki sifat bermuatan negatif, maka plasmid pCambia1200 menempel pada permukaan sel bakteri E.coli DH5α tersebut. Kemudian eppendorf berisi pCambia1200 dan sel bakteri E.coli DH5α diberi heatshock berupa suhu 42°C pada waterbath selama 90detik , dan direcovery pada suhu es kembali. Pada saat heatshock itulah , plasmid dan sel bakteri diberikan kejut sehingga plasmid masuk kedalam sel bakteri. Dan proses transformasi terjadi. Pada cawan kontrol negatif terdapat pertumbuhan jamur yang diperkirakan terjadi akibat kontaminasi udara. Hal ini dikarenakan cara pengerjaan yang kurang aseptis sehingga udara yang ada disekitar mencemari media pada cawan. Seharusnya pada cawan kontrol negatif ini tidak ada pertumbuhan.

Gambar Cawan kontrol negatif

Pada media B berisi LB agar yang ditambahkan kloramfenikol dan E.Coli, namun perbedaannya dengan media A ialah bakteri E.Coli yang digunakan pada media B ini merupakan bakteri kompeten yang tidak disisipi oleh plasmid. Media B ini digunakan sebagai

pembanding karena seharusnya pada media B ini tak ada koloni bakteri yang tumbuh karena bakteri kompeten yang ditambahkan tidak memiliki kemampuan untuk bertahan dari kloramfenikol dan tak memiliki plasmid resisten terhadap kloramfenikol. Namun dapat dilihat bahwa ternyata hasil yang didapatkan pada praktikum kali ini adalah terdapat pertumbuhan koloni bakteri pada media B. Hal ini dimungkinkan disebabkan oleh adanya kontaminasi dari udara dan kurang aspestis dalam pengerjaan sampel atau media yang digunakan.

Pada media C yang merupakan media kontol negatif ini hanya ditambahkan LB agar didalamnya. Karena media C ini digunakan sebagai pembanding untuk media A dan media B. Karena pada media ini hanya terdapat LB agar maka media C ini tidak ditumbuhi oleh kolono bakteri.

Gambar Cawan B

Setelah melakukan transformasi selanjutnya adalah isolasi DNA kromosom. Tujuan dari isolasi DNA kromosom adalah memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif menggunakan GeneJET tm Genomic DNA purification Kit. Pada percobaan isolasi DNA kromosom yang pertama dilakukan adalah diambil transforman bakteri E.coli DH5a sebanyak 1 ose dari biakan, lalu transforman tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi kloramfenikol dan Lurea Bertani (LB) agar kemudian diinkubasi pada suhu 37o.C selama 16-24 jam didalam inkubator. Kemudian tabung dikeluarkan dari inkubator dan diambil 1 ose lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi yang sudah berisi Lurea Bertani (LB) cair steril 5ml dan kloramfenikol. Lalu biakan tersebut diinkubasi selama 16-24 jam pada suhu 37oC sambil di shaker dan dihasilkan suspensi transforman E.coli DH5a.

Langkah selanjutnya yaitu mengambil 1ml biakan bakteri dari suspensi transforman E.coli DH5a dan dimasukkan kedalam tabung Eppendorf 1,5ml. Lalu disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm (5.000 x g) selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pada langkah ini dilakukan 2 kali untuk menghasilkan pelet bakteri yang lebih banyak. Setelah supernatan dibuang, kedalam tabung Eppendorf ditambahkan aquabides (ddH2O) sebanyak 500 μL, lalu disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm (5.000 x g) dan supernatannya dibuang kembali, tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali.

Pelet sel bakteri dari hasil pencucian dan sentrifugasi diresuspensi dalam 45 µL Digestion Solution dengan cara pipeting, lalu di tambahkan 5μL Proteinase K. Campuran dikocok menggunakan alat Vortex atau pemipetan berulang untuk menghasilkan suspensi yang homogen. Penambahan Proteinase K berfungsi untuk menghilangkan sisa protein atau mengendapkan protein yang masih terdapat dalam suspensi. Kemudian suspensi dinkubasi pada suhu 56oC sambil sesekali divortex atau dimasukkan ke dalam shaking water bath selama 30 menit hingga sel terlisis sempurna dan dihasilkan ekstrak sel.

Ekstrak sel tadi ditambahkan 5µL RNase A Solution, lalu dikocok menggunakan vortex. Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Penambahan RNAse A Solution dilakukan untuk menghilangkan RNA yang terdapat dalam suspensi karena yang akan diisolasi hanya DNA saja. 50 μL Lysis Solution ditambahakan kedalam campuran, dikocok menggunakan vortex selama 15 detik hingga diperoleh campuran yang homogen. Adapun fungsi penambahan Lysis solution adalah sebagai reagen pelisis agar komponen DNA dalam sitoplasma sel biasa keluar dan diisolasi.

Sebanyak 100 μL etanol 50% ditambahkan kedalam campuran untuk menghilangkan sisa endapan protein atau untuk pencuci hasil isolasi, lalu dikocok menggunakan vortex atau pemipetan berulang untuk ,memisahkan supernatan. Selanjutnya Lisat dituangkan ke GeneJET TM Genomic DNA Purcification Column dalam tabung kolektor. Kolom disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 7.000 rpm (6000 x g). Supernatan dalam tabung dibuang, kolom dimasukkan kembali ke tabung kolektor yang sama. Pada kolom berisi Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu. Setelah itu ditambahkan 250 μL Wash Buffer I ke dalam kolom dengan bantuan mikropipet dan tip kecil, dalam tahap ini diharapkan berhati- hati karena Wash Buffer I merupakan zat pengiritasi sehingga perlu memakai sarung tangan dan masker. Lalu disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9.400 rpm (8000 x g). Supernatan yang tertampung pada tabung kolektor dibuang, lalu kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama. Fungsi dari Wash Buffer I adalah untuk mengambil DNA.

Sebanyak 250 μL Wash Buffer II (dengan penambahan etanol) ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 14.000 rpm (12.000 x g). Jika larutan residu masih terlihat dalam kolom purifikasi, maka disentrifugasi kembali setelah tabung kolektor dikosongkan dari supernatan. Sentrifugasi kembali selama 1 menit. Setelah itu, supernatan pada tabung kolektor dibuang dan kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml baru.

Sebanyak 100 μL Elution Buffer ditambahkan ke bagian tengah membran kolom plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom) usahakan posisinya tegak lurus, fungsi Elution Buffer adalah untuk mengelusi DNA kromosom atau untuk melepaskan ikatan matriks dan silica gel denngan DNA. Lalu kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 9.400 rpm (8000 x g) selama 1 menit. Pada tahap ini dilakukan sebanyak 2 kali.

Setelah itu kolom purifikasi dilepaskan dari tabung Eppendorf. DNA murni dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu - 20C C. Hasil isolasi DNA kromosom bakteri

yang murni dapat dilihat dengan menggunakan metode elektroforesis gel agarosa. Keberedaan DNA kromosom bakteri ditunjukan dengan adanya pita DNA yang tervisualiasi pada sampel Isolasi DNA Kromosom yang di loading ke dalam gel agarosa. Kuantitas DNA dan BM dihitung dengan perbandingan antara laju migrasi DNA kromosom dengan laju fragmen-fragmen DNA marker.

Setelah kita melakukan isolasi DN kromosom, selanjutnya kita melakukkan isolasi DNA plasmid, isolasi DNA plasmid ini bertujuan untuk memahami metode isolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif menggunakan GrneJET tm Plasmid Miniprep Kit. Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Rasio OD260/OD280antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)

Elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis.

I.II. Hasil Gambar Elektroforesis

Keterangan gambarM – Lambda DNA/HindIII Marker (#SM0101)1 – human bone marrow2 – human blood3 – rat spleen4 – mouse heart5 – mouse liver6 – HeLa cells

7 – Jurkat cells8 – E.coli DH5alfa cells

Prinsip dari isolasi plasmid adalah kultur bakteri dipanen dan dilisat. Lisat tersebut kemudian dibersihkan dengan sentrifugasi dan diterapkan pada kolom silika untuk selektif mengikat molekul DNA pada konsentrasi garam tinggi. DNA teradsorpsi dicuci untuk menghilangkan kontaminan, dan DNA plasmid murni dielusi dalam volume kecil buffer elusi atau air. DNA dimurnikan siap untuk segera digunakan di semua prosedur biologi molekular seperti pencernaan cepat dan konvensional dengan enzim restriksi, PCR, dalam transkripsi vitro, transformasi dan sequencing otomatis.

Sebanyak 1,5 mL biakan bakteri dimaksudkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL, disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (6.800 x g) selama 2 menit, lalu supernatannya dibuang. Sebanyak 1,0 mL biakan bakteri ditambahkan ke dalam pellet bakteri, disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (6.800 x g) selama 2 menit, lalu supernatan di buang. Supernatan dibuang karena supernatan tidak di gunakan dan yang akan digunakan kembali hanya peletnya saja. Dilakukan sentrifugasi dengan 8.000 rpm (6.800 x g) agar menghasilkan pellet yang banyak dan memisahkan supernatan dan pellet.

Pellet bakteri di tambahkan 1,0 mL aquabides, di sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (6.800 x g) selama 1 menit, lalu supernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali. Supernatan di buang karena yang digunakan kembali hanya pelletnya saja dan di tambahan bakteri bertujuan untuk pencucian.

Seluruh prosedur di lakukan dengan suhu kamar agar karena pellet yang dihasilkan

stabil pada suhu kamar. Pellet sel bakteri diresuspensi dalam 125 Resuspension Solution

menggunakan vortex atau dengan pemipetan berulang sampai tidak terdapat sisa gumpalan. Ini dilakukan bertujuan agar pellet sel bakteri dan Resuspension Solution tercampur dengan baik dan tidak terdapat gumpalan di dalamnya. Adapun fungsi Resuspension Solution adalah fungsi larutan ini adalah untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanenan menggunakan sentrifugasi.

Kemudian suspensi bakteri ditambahkan 125µL Resuspension Solution dengan pemipetan berulang sampai tidak terdapat sisa gumpalat pellet lagi. Resuspension solution berisikan GTE (glucose/tris/EDTA) solution: 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM , EDTA (pH 8.0). Suspensi bakteri ditambahkan 125 µL Lysis solution , Lysis solution berisikan alkaline–SDS solution atau EDTA , atau lysozime .SDS merupakan sejenis deterjen sehingga dapat digunakan untuk merusak membrane sel . EDTA sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium . Lysozime merupakan enzim pemotong protein . Penambahan lysis solution bertujuan untuk melisis dinding sel bakteri , cara tersebut termasuk kedalam cara kimia . Tabung dikocok dengan cara bolak balik 4 – 6 kali sampai larutan menjadi kental dan agak jernih . Pengocokan tidak boleh menggunakan vortex karena akan menyebabkan pemotongan DNA kromosom . Larutan tidak boleh diinkubasi lebih dari 5 menit , karena dapat menyebabkan denaturasi bentuk superkoil dari DNA plasmid.Apabila DNA kromosom terpotong makan DNA kromosom tersebut menjadi fragment kecil yang tidak ada perbedaan

besar nya dengan DNA plasmid sehingga, DNA kromosom tidak mengendap,dan tidak terpisahkan dengan DNA plasmid.

Sebanyak 175 µL Neutralization solution ditambahkan ke dalam larutan tersebut , lalu tabung dikocok dengan cara bolak – balik 4 – 6 kali . Pengocokan dilakukan perlahan untuk mencegah endapan debris sel bakteri . Lisat bakteri yang telah dinetralkan akan keruh dan kental. Netralization solution( berisikan potassium acetate/acetic acetate) menjadikan larutan berubah pH menjadi netral dan mengendapkan lipid serta protein besar , kromosom DNA juga terjebak pada endapan . hanya plasmid DNA yang tetap larut. Lalu lisat bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10000rpm (12000 g) selama 5menit untuk memisahkan debris sel dan DNA Kromosom. Kecepatan pada proses sentridugasi berbeda-beda karena komponen-komponen itu memiliki massa yang berbeda-beda pula Komponen dengan massa besar akan membentuk pelet (sedimen di dasar tabung sentrifugasi) lebih dulu sehingga pelet debris sel dan DNA kromosom terpisah karena memiliki massa yang berbeda.

Supernatan dipipet kedalam kolom spin GeneJETTM dan tabung kolektornya . Endapan putih jangan sampai terpipet. Netralization solution( potassium acetate/acetic acetate) menjadikan larutan berubah pH menjadi netral dan mengendapkan lipid serta protein besar , kromosom DNA juga terjebak pada endapan . hanya plasmid DNA yang tetap larut. Supernatan tersebut berisikan plasmid. Endapan putih ( pellet) merupakan DNA kromosom dan protein yang mengendap beserta lipid.

Supernatan tersebut disentrifugasi pada kecepatan 10000rpm (12000g) selama 1menit . Cairan pada lubang kolektor dibuang, lalu kolom diletakkan pada tabung kolektor yang sama. SDS membuat kolom menyukai DNA plasmid, sehinggan DNA plasmid menempel pada kolom . Saat disentrifugasi , cairan yang tidak disukai oleh kolom akan turun ke tabung kolektor , sedangkan DNA plasmid tetap menempel pada kolom . Tahap ini digunakan untuk memastikan tidak bahwa hanya DNA plasmid yang berada di kolom.

Sebanyak 250µL Wash Solution ditambahkan pada kolom spin , lalu disentrifugasi pada kecepatan 10000rpm (12000 g) selama 1 menit . Cairan pada tabung kolektor dibuang , lalu kolom diletakkan pada tabung kolektor yang sama .Wash solution merupakan Ethanol . Penambahan wash solution bertujuan untuk menghilangkan kontaminan yang ada di kolom , selain itu berfungsi untuk memekatkan , dan memishkan DNA dari larutan dan juga mengendapkan DNA( . Tahap dilakukan sebanyak 2 kali untuk menghilangkan sisa Wash Solution dan mencegah adanya residu etanol dalam endapan plasmid.

Setelah itu kolom dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 mL baru, lalu ditambahkan 50 µL Elution buffer ke bagian tengah membran spin kolom untuk mengelusi DNA plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom) agar kolom tidak rusak dan tidak terkontaminasi oleh mikroba. Adapun fungsi dari Elution Buffer adalah untuk mengelusi DNA kromosom atau untuk melepaskan ikatan matriks dan silica gel denngan DNA. Kemudian tabung diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000- 14.000 rpm (12.000x g) selama 2 menit.

Tahapan elusi diulangi dengan menambahkan 50 µL aquabides ke bagian tengah membran spin kolom. Tabung diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm ( 12.000x g) selama 2 menit. Pada tahap ini sisa DNA dilepaskan dari membran dan meningkatkan perolehan DNA sekitar 10- 20 %. Setelah itu kolom dilepaskan, tabung berisi DNA plasmid disimpan pada suhu - 20C C.

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong 3DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal.

Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10, 20 dan 50 ng. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya.Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur, pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler.

Setelah mengisolasi DNA plasmid, hal yang selanjutnya dikerjakan adalah Pemetaan DNA plasmid. Tujuan dari pemetaan DNA plasmid ini adalah untuk memahami pemetaan DNA plasmid dengan pemotongan / resrtiksi menggunakan beberapa enzim restriksi. Prinsip dari percobaan kali ini adalah DNA yang telah di purifikasi di inkubasi pada suhu 37o C dengan enzim restriksi (endonuklease restriksi) menghasilkan DNA yang terpotong pada posisi yang sesuai dengan restriksi. Kontrol negatif, yaitu sample yang diinkubasi tanpa penambahan enzim restriksi, akan tetap utuh. Enzim retriksi atau disebut juga ezim endonuklease adalah enzim yang memotong molekul DNA. Ezim retriksi memotong DNA pada rangkaian gula-fosfat tanpa merusak pasang basa. Enzim retriksi endonuklease mengenali urutan pasang basa yang spesifik atau dengan kata lain memotong DNA pada posisi diantara atau di luar sekuen yang dikenalinya. Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis.

Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “sticky end”. Dengan

memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu molekul DNA. Contoh enzim retriksi yang pertama kali dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII yang berasal dari E.coli, kemudian HindII dan HindIII yang berasal dari Haemophilis influenza. Enzimtersebut diketahui memotong DNA pada urutan basa yang spesifik, kemudian menghasilkan seukuran gen yang dapat disambung kembali. Fungsi utama enzim retriksi adalah memotong sekuen DNA, mempelajari organisasi, fungsi, dan struktur gen.

Prosedur pertama yang dilakukan pada percobaan kali ini adalah sebanyak 5-10 µg DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 2 µL larutan penyangga reaksi 10x (10%).Buffer atau larutan penyangga adalah larutan yang terdiri dari asam lemah dan garam-nya yang dapat mempertahankan dan menjaga pH. Dalam memilih buffer, yang harus diperhatikan adalah pH optimum serta sifat-sifat biologisnya. Banyak jenis buffer yang mempunyai impact terhadap sistem biologis, aktivitas enzim, substrate, atau kofaktor. Larutan buffer hanya berfungsi untuk mempertahankan pH. Ini tidak berarti bahwa pH tidak akan berubah. Perubahan dan gangguan yang besar dalam sistem dapat merubah pH meskipun telah ditambahkan buffer ke dalamnya. Hal ini karena buffer hanya menjaga agar pH tidak terlalu berubah signifikan dengan adanya perubahan konsentrasi ion hidrogen dalam sistem. Kemudian 1 µL enzim restriksi (10unit/ µL) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 µL dimasukkan kedalam tabung eppendorf 500 µL (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37o C. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. dH20 ditambahkan untuk mengencerkan larutan.

Setelah proses inkubasi selesai, elektoforesis dilakukan untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. Hasil elekroforesis ini akan menunjukkan pita-pita hasil pemecahan DNA. Jika DNA masih belum terpotong maka waktu inkubasi atau enzim retriksi ditambahkan lagi. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzin retriksi,diantaranya adalah gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Selain itu enzim retriksi ini merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu sebaiknya disimpan pada suhu -70 c. Jika DNA sudah terpotong, aktifitas enzim ini dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65 – 70 c. Pemanasan disini bertujuan untuk mengurangi aktifitas enzim estriksi. Dengan adanya panas enzim estriksi yang stabil di suhu -70 C akan menjadi tidak stabil di suhu 65 -70 C, sehingga aktifitas enzim bisa dihentikan.

Selanjutnya, dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.

Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. BamHI, 2. EcoRI, 3. HindIII, 4. Nde I . Enzim restriksi BamHI diisolasi dari Bacillus amylolyquefaciens . Enzim ini mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends . Sedangkan enzim restriksi EcoRI (diisolasi dari E. coli) yang mengenali urutan heksanukleotida 5′-GAATTC-3′ merupakan contoh enzim restriksi yang menghasilkan fragmen berujung lancip. HindIII (disebut juga "Hin D Tiga") adalah jenis II spesifik lokasi deoxyribonuclease enzim restriksi diisolasi dari Haemophilus influenzae yang memotong AAGCTT urutan DNA palindromic di hadapan kofaktor Mg2 + melalui hidrolisis. Pemotongan ini urutan antara hasil AA di overhang 5 'pada DNA yang disebut ujung lengket.

Enzim Nde I adalah restriksi endonuklease dimurnikan dari strain Escherichia coli yang membawa gen dari NDE I dari Neisseria denitrificans. NDE I aktivitas tidak terpengaruh oleh metilasi bendungan, metilasi dcm dan metilasi CpG. NZYTech menyediakan NDE I dengan buffer tertentu, NZYBuffer A. NZYTech ini NDE I merupakan enzim yang bertindak pada 37 ° C. Untuk digestions ganda gunakan NZYBuffer U. NdeI adalah endonuklease restriksi yang digunakan dalam metode biologi molekuler untuk memotong DNA pada situs pengenalan 5'-CA / TATG-3 ', menghasilkan fragmen dengan 5'-kohesif berakhir. Lebih dari 2500 enzim restriksi telah diisolasi dan lebih dari 300 telah digunakan dalam laboratorium. Sebagian besar enzim restriksi mempunyai urutan target heksanukleotida, sedangkan yang lain mengenali urutan yang lebih pendek atau lebih panjang. Pada percobaan kali ini untuk melakukan replikasi DNA atau yang lebih mudah disebut dengan memperbanyak DNA adalah dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Metode PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme (in vitro). Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983, PCR banyak dilgunakan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

Dalam sistem kerjanya, PCR dilandasi oleh struktur DNA. Dalam keadaan nativenya, DNA merupakan doublehelix yang terdiri dari dua buah pita yang berpasangan anti pararel antara satu dengan yang lain dan berikatan dengan ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen terbentuk antara basa- basa yang komplementer, yaitu antara basa Adenin (A) dengan Timin (T), dan Guanin (G) dengan Sitosin (S). Basa- basa tersebut terikat dengan molekul gula, deoksiribosa, dan setiap satu molekul gula berikatan dengan molekul gula melalui ikatan fosfat (Lisdiyanti, 1997).

PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel. PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses

replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen. Adapun komponen- komponen yang dibutuhkan dalam proses PCR adalah tabung Eppendorf, template DNA, sepasang primer forward 16s rRNA dan reverse 16s rRNA, dNTP, dapar PCR, Taq polymerase, dan aqua bidestilata. DNA primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.

DNA primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, sehingga dirancang agar menempel mengampit daerah tertentu yang diinginkan. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) atau dapat disebut sebagai building blocks penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Komponen selanjutnya adalah buffer, biasanya terdiri atas bahan- bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Lalu ion logam biasanya digunakan ion logam bivalen, umumnya Mg2+ yang berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.

Prosedur yang dilakukan terlebih dahulu adalah dicampurkan ke dalam tabung Eppendorf dengan total volume 50 μL, campuran terdiri dari 1 μL template DNA, sepasang primer forward 16s rRNA dan reverse 16s rRNA masing- masing 20 pmol sebanyak 2 μL, 10 mM dNTP sebanyak 1 μL, 5 μL dapar PCR, 25 mM Mg2+ 5 μL, 5 unit/ μL Taq polymerase sebanyak 0,4 μL dan ditambahkan aqua bidestilata hingga 50 μL , yaitu 33,6 μL.

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang antara 20- 30 kali siklus dan melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap kerja PCR dalam setiap sikus, yaitu:

1. Tahap denaturasi

Pada tahap ini, ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal pada suhu tinggi, yaitu pada suhu 94- 96 CC selama dua menit. Biasanya pada tahap awal ini dilakukan agak lama untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template bagi DNA primer.

2. Tahap penempelan / annealing

Primer menempel pada bagian DNA template yang komplementer urutan basanya. Tahap ini dilakukan pada suhu 48 C C selama 1 menit. Pada suhu ini memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin. primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Penempelan ini bersifat spesifik, suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel pada sembarang tempat.

3. Tahap Pemanjangan/ Elongasi

Merupakan pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase yang digunakan. Karena yang digunakan adalah Taq Polymerase maka suhu yang digunakan adalah 72 CC selama 1 menit. Taq polymerase berasal dari bakteri termofilik Aquaticus thermis, yaitu bakteri tahan pada suhu tinggi.

Setelah itu produk PCR dielektroforesis dan hasil elektroforesis dilihat di bawah sinar UV 312 nm menggunakan alat transilluminator UV (Cole- Palmer) dan sebagai penampak bercak digunakan ethidium bromide. Bila tidak langsung dilakukan elektroforesis maka produk PCR harus disimpan pada suhu – 20 CC. Berikut adalah skema dari proses PCR

Gambar 1. Proses PCR

Gambar 2. Proses PCR

Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain sebagai berikut :

1. Pada saat pengambila gel salah

2. Pengambilan frimer ataupun reverse tertukar

3. Enzim

Pada saat ini, PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

1. Isolasi Gen

Sebagai contoh dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin. Maka dihasilkan insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan saat ini insulin dapat diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah bila dibandingkan dengan cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi.

2. DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye- dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang diberi label fluoresens. Karena warna fluoresens untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

3. Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban) atau korban kecelakaan/ bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian- bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

4. Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini bahkan satu fase lagi dari fase pandemic. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnose yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan, teknologi saat ini memungkinkan diagnose dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Dapat disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation)akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukanuntuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Prinsip dasar tekhnik elektroforesis ini adalah DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Agarosa merupakan polimer dari 3,6-Anhidro-L-galaktosa dengan b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak bermuatan. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut,rumput laut yang digunakan yaitu Evchema spinosum atau bisa juga dari jenisgolongan Phaephycophyta. Agarosa akan membentuk gel padat jika dilarutkandengan pemanasan pada konsentrasi antara 0,5% dan 2%. Agarosa yang digunakanuntuk elektroforesis lebih murni bila dibandingkan denga agar yang digunakanuntuk kultur bakteri. Agarosa akan membentuk pori yang besar sesuai dengankonsentrasi agarosa.Sambrook and Russel (2001), menambahkan bahwa gel ini mengandunglarutan buffer Tris Asetat EDTA(TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik untuk DNA. Gel agarosa mempunyai laju pemisahan lebih cepat, dapatmemisahkan fragmen DNA antara 100 bp–50 kb tergantung dari konsentrasi gelagarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal.

Fungsi dari masing-masing alat dan bahan yang digunakan pada praktikumelektroforesis adalah:

1. Sarung tangan, digunakan untuk mencegah keringat dari tangan pada mediumkarena keringat mengandung DNAase dan melindungi toksik dari EtBr. Selama pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin(Faatih, 2009)

2. Mikropipet, digunakan untuk mengambil sampel DNA.

3. Transiluminator, digunakan untuk mengvisualisasi DNA yang sudah dirunning.

4. Kertas parafilm, digunakan untuk mencampur atau menghomogenkan sampelDNA

dengan loading dye

5. Sisir elektroda, digunakan untuk membuat sumur untuk melekatkan DNA.

6. EtBr, digunakan sebagai pewarna yang menyisip pada pasang basa yang akan menunjukan posisi fragmen-fragmen dengan ukuran berbeda.

7. Loading dye , digunakan sebagai pemberat ( Bromophenol blue sebagai penanda

jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannyaelektroforesis.

8. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat

glasialsebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim perusak

DNA yaitu DNAase).

9. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.

10. Seperangkat elektroforesis, sebagai alat untuk elektroforesis DNA dengan 70 Vselama

35 menit.

250 larutan buffer TAE 1x dibuat dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml aquades. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki).Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada

kertas parafilm menggunakan mikropipet.buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarosa, sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNAMolekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalahlaju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.

2. Konsentrasi gel agarosaFragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuaidengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan.

Hasil yang didapatkan pada UV, tidak terdapat pita pita pada gel agarosa , pada semua DNA baik DNA marker , DNA kromosom , DNA plasmid , DNA plasmid hasil restriksi dimana pita pita tidak dapat teramati (pita tidak muncul ). Jika sesuai teori , maka seharusnya DNA marker , DNA kromosom , DNA plasmid , DNA plasmid hasil restriksi seharusnya didapat pita pita.

Pada DNA plasmid hasil restriksi seharusnya terdapat 2 pita ,karena plasmid pCambia 1200 tersebut dipotong dengan enzim restriksi Xho . Posisi pada peta plasmid yang mengenali Xho ada 2, yaitu pada …bp dan… bp. Diketahui pCambia1200 memilik …bp , maka dengan perhitungan teori , pita yang terbentuk oleh hasil restriksi adalah sebesar …bp dan …bp

Kemungkinan kesalahan yang terjadi pada semua DNA baik DNA marker , DNA kromosom , DNA plasmid , maupun DNA plasmid hasil restriksi dimana pita pita tidak dapat teramati (pita tidak muncul ) dapat dikarenakan oleh hal sebagai berikut:

1. DNA terdenaturasi sebelum dielektroforesis

2. Menurut Standfieldet al,(1996),kemungkinan terjadinya kegagalan tersebut karena DNA telah mengalami depolarisasi. Perlu diperhatikan bahwa pemberian arus listrik pada gel agarosa tidak boleh sembarangan karena jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akanmerubah bentuk pita DNA.

3. DNA dimasukan dalamsumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut

4. Perendaman yangterlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gelagarosa.

5. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel.