BAB I

DAFTAR PUSTAKA

BAB I3PENDAHULUAN31.1.Pendahuluan31.2. Tujuan Praktikum4BAB II5TINJAUAN PUSTAKA52.1. DNA5Karakteristik kimia52.2.Isolasi DNA82.2.Genomik DNA142.3.Sentrifuge142.4.Komponen Sel15BAB III18PRINSIP KERJA183.1. Prinsip kerja sentrifuge183.2. Vortex mixer193.3. Hot plate203.4. Inkubator (Incubator)20BAB IV22ALAT DAN BAHAN22BAB V25CARA KERJA25BAB VI......26HASIL....26BAB VII28KESIMPULAN28DAFTAR PUSTAKA29

BAB IPENDAHULUANIsolasi DNA dari Darah Vena

1.1. PendahuluanSampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton. Sebagai materi genetik suatu organisme nukleotida hanya dapat dianalisis secara tidak langsung melalui analisis urutan protein dan RNA atau melalui analisis genetic. Kini menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu genome, yaitu total informasi genetic yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.Teknologi rekombinan DNA yang menjadi pusat kegiatan dalam aktifitas Bioteknologi, merupakan suatu teknik yang menggabungkan suatu segmen DNA dengan DNA yang lain, telah menjadi pengetahuan yang memberikan banyak manfaat bagi kehidupan manusia, seperti dalam produksi vaksin dan hormone. Aktifitas utama dalam teknik rekombinan DNA, antara lain:Memotong DNA pada tempat (site) yang spesifik dengan enzim restriksi nuclease. Dengan teknik ini, dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara individual.Kloning DNA dengan menggunakan suatu vector atau teknik Polymerase Chains Reaction (PCR), yang memungkinkan suatu molekul DNA dapat dikopi untuk meghasilkan jutaan molekul identik.Hibridisasi asam nukleat, teknik untuk menemukan urutan DNA atau RNA yang spesifik dengan tingkat akurasi yang tinggi berdasarkan kemampuannya mengikat urutan asam nukleat komplemennyaPengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen DNA yang telah dipurifikasi. Bertujuan untuk mengidentifikasi gen dan memperkirakan urutan asam amino yang membentuk protein. Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel dengan menggunakan teknik mircroarry asam nukleat.

1.2. Tujuan Praktikum1. Mengisolasi DNA dari hepar ayam dengan menggunakan kit wizard genomic DNA purification2. Melakukan pemisahan DNA dari organel-organel sel dengan menggunakan kit wizard genomic dan alat serta bahan lainnya

BAB IITINJAUAN PUSTAKA2.1. DNAAsam deoksiribonukleat, lebih dikenal denganDNA(bahasa Inggris:deoxyribonucleicacid), adalah sejenisasam nukleatyang tergolongbiomolekulutama penyusunberat keringsetiaporganisme. Di dalamsel, DNA umumnya terletak di dalaminti sel.Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagaimateri genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenisvirus(dan virus tidak termasuk Karakteristik kimia

Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenina dengan timina dan guanina dengan sitosina) yang membentuk DNA beruntai ganda.

DNA merupakanpolimeryang terdiri dari tiga komponen utama, gugusfosfat gula deoksiribosa basa nitrogen, yang terdiri dari: Adenina(A) Guanina(G) Sitosina(C) Timina(T)Sebuah unitmonomerDNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakannukleotida, sehingga DNA tergolong sebagaipolinukleotida.Rantai DNA memiliki lebar 22-24, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 [2]. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotidaRangka utama untai DNA terdiri dari gugusfosfatdangulayang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gulapentosa(berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melaluiikatan fosfodiesterantara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalahribosa.DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk strukturheliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagaiantiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalahadenina(dilambangkan A),sitosina(C, daricytosine),guanina(G), dantimina(T). Adenina berikatan hidrogen dengan timina, sedangkan guanina berikatan dengan sitosina. SegmenpolipeptidadariDNAdisebutgen, biasanya merupakanmolekulRNA.

Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan.Replikasimerupakan proses pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel akanmembelah diri. Pada setiap sel, kecualisel gamet, pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semuaselturunan memiliki informasigenetikyang sama. Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari duarantaidan rantai yang satu merupakan "konjugat" dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk.Ada beberapa teori yang mencoba menjelaskan bagaimana proses replikasi DNA ini terjadi. Salah satu teori yang paling populer menyatakan bahwa pada masing-masing DNA baru yang diperoleh pada akhir proses replikasi; satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA sebelumnya, sedangkan rantai pasangannya merupakan rantai yang baru disintesis. Rantai tunggal yang diperoleh dari DNA sebelumnya tersebut bertindak sebagai "cetakan" untuk membuat rantai pasangannya.Proses replikasi memerlukan protein atauenzimpembantu; salah satu yang terpenting dikenal dengan namaDNA polimerase, yang merupakan enzim pembantu pembentukan rantai DNA baru yang merupakan suatupolimer. Proses replikasi diawali dengan pembukaan untaian ganda DNA pada titik-titik tertentu di sepanjang rantai DNA. Proses pembukaan rantai DNA ini dibantu oleh enzim helikase yang dapat mengenali titik-titik tersebut, dan enzim girase yang mampu membuka pilinan rantai DNA.Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA polimerase masuk dan mengikat diri pada kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA polimerase bergeser. Hal ini berlanjut sampai seluruh rantai telah benar-benar terpisah.Proses replikasi DNA ini merupakan proses yang rumit namun teliti. Proses sintesis rantai DNA baru memiliki suatu mekanisme yang mencegah terjadinya kesalahan pemasukan monomer yang dapat berakibat fatal. Karena mekanisme inilah kemungkinan terjadinya kesalahan sintesis amatlah kecil.

2.2. Isolasi DNAPrisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000).Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000).Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010).Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.00050.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000).Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA.Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003).Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001).Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20C. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20C bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20C. Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. Berikut adalah bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan menggunakan Kit Nucleon Phytopure.

2.2. Genomik DNA

DNA Genom yaitu seluruh DNA yang ada pada suatu organisme (makhluk hidup), baik yang berfungsi atau yang tidak, baik yang ada di inti sel, mitokondria, atau kloroplas. Atau dengan kata lain DNA genom adalah DNA mentah yang masih memiliki komponen lengkap seperti promoter gen, bagianexon, dan bagianintron. Lebih lengkap tentang bagian-bagian DNA dijelaskan dalam tulisan Bagian-bagian DNA.

2.3. Sentrifugesentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975). Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Dalam bentuk yang sederhana sentrifus terdiri atas sebuah rotor dengan lubang-lubang untuk melatakkan wadah/tabung yang berisi cairan dan sebuah motor atau alat lain yang dapat memutar rotor pada kecepatan yang dikehendaki. Semua bagian lain yang terdapat pada sentrifus modern saat ini hanyalah perlengkapan yang dimaksudkan untuk melakukan berbagai fungsi yang berguna dan mempertahankan kondisi lingkungan dimana rotor tersebut bekerja. Penggunaan sentrifus cukup luas, meliputi koleksi dari pemisahan sel, organel dan molekul (Hendra 1989)

2.4. Komponen SelSel-sel yang membentuk tubuh makhluk hidup memiliki bermacam-macam bentuk dan ukuran. Antara sel hewan dan sel tumbuhan terdapat beberapa perbedaan dan persamaan. Pada dasarnya, sel hewan maupn sel tumbuhan memiliki 3 bagian utama, yaitu membran sel, sitoplasma, dan inti sel.

1. Nukleus (Inti Sel)

Nukleus berfungsi sebagai pengatur aktivitas sel. Dalam nukleus terdapat benang-benang kromatin. Pada waktu sel membelah benang-benang ini berubah menebal menjadi kromosom yang merupakan faktor pembawa keturunan (gen) , selaput inti, nukleoplasma, (cairan inti), dan nukleolus (anak inti) yang berperan dalam sintesis protein secara tidak langsung.

2. Sitoplasma (Cairan di Luar Inti)Sitoplasma atau plasma sel adalah cairan kental yang mengisi ruangan antara membran sel dan inti sel.Di dalam sitoplasma terdapat organel-organel sel antara lain:1. Mitokondria, sebagai tempat berlangsungnya proses oksidasi sel (respirasi).2. Lisosom, pada sel hewan berfungsi sebagai penghasil enzim pencernaan dan zat kebal.3. Ribosom, merupakan tempat berlangsungnya sintesis protein. Letaknya ada yang bebas dan ada yang menempel pada retikulum endoplasma.4. Retikulum endoplasma, merupakan saluran halus yang mengandung ribosom yang berperan dalam transportasi hasil sintesis protein. Retikulum endoplasma yang tidak mengandung ribosom berperan dalam sintesis lemak, kolesterol, dan hormon.5. Badan golgi, merupakan organ yang berperan dalam ekskresi. Organel ini terdiri atas tumpukan-tumpukan kantong-kantong pipih yang dikelilingi oleh gelembung-gelembung. Kantong-kantong ini menampung dan mengumpulkan protein atau lipid dari retikulum endoplasma melalui perlengketan gelembung dari retikulum pada dinding kantong badan golgi yang akhirnya menyatukan cairan di dalamnya.6. Plastida, berupa butir-butir zat warna pada sel tumbuhan. Plastida yang utama adalah kloroplas yang berisi klorofil. Klorofil berfungsi untuk menangkap energi matahari, yang digunakan untuk fotosintesis.7. Vakuola. Vakuola yang terdapat pada sel tumbuhan berisi zat makanan dan zat hasil metabolisme. Semakin tua umur sel, maka ukuran vakuola semakin besar. Pada beberapa hewan bersel satu ada 2 jenis vakuola yaitu vakuola makanan dan vakuola kontraktil.8. Peroksiom, di dalamnya terdapat enzim katalase yang berfungsi mengubah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen.9. Sentriol/Sentrosoma, berperan dalam pembelahan sel dengan cara membentuk benang gelendong.

3. Membran Sel

Membran Sel

Membran sel tersusun atas lemak dan protein (lipoprotein) sehingga bersifat permeabel (selektif permeabel). Fungsinya mengatur peredaran zat dari dan ke dalam sel. Organel ini terletak di luar sitoplasma, bersifat tipis dan elastis.

3. Dinding SelDinding sel hanya terdapat pada pada sel tumbuhan. Letaknya di luar membran sel. Berfungsi untuk melindungi bagian dalam sel dan memberi bentuk sel. Dinding sel tersusun dari selulose (serat), pektin, dan lignin. Strukturnya berlapis-lapis tergantung pada umur sel.

BAB IIIPRINSIP KERJA

3.1. Prinsip kerja sentrifugeSentrifugemerupakan alat laboratorium yang memanfaatkan gaya sentrifugal , yaitu gaya yang timbul akibat benda yang diputar dari satu titik sebagai porosnya . untuk memisahkan partikel dari satu benda cair atau dengan kata lain memisahkan benda cair dari kepadatan yang berbeda.Benda cair ini merupakan cairan tubuh , contoh darah , serum , air seni , bahan reaksi lainnya , atau campuran dari kedua duanya dengan zat tambahan lainIni adalah gambar bagian bagiannya :

Prinsipkerjaalatcentrifugeadalahdenganmemanfaatkangayasentrifugal.Gayasentrifugaljugadipengaruhiolehgayagravitasi. Makincepatputarannyamakasemakintinggipulagayayangdihasilkan.Komponenutamapadaalatiniadalahmotor.Padamotorterdapatrotordanstato,Jikadialiriaruslistrikmakadiantararotordanstatorakantimbulmedanmagnetsecarabergantian.Padaprinsipnya,kerjacentrifugeyaitumerubahenergilistrikmenjadienergimekanikdalambentukputaran.3.2. Vortex mixerBagi tenaga analis kesehatan, sering kali kita menggunakan Vortex mixer pada laboratorium, ataupun Rumah Sakit dan di tempat-tempat lain. Pengertian Vortex mixer Alat ini dapat digunakan untuk percobaan pencampuran, reaksi atau pelarutan sampel cair dengan cepat. Sebuah mixer pusaran adalah perangkat sederhana yang digunakan untuk mencampur botol kecil cairan atau membubarkan padat menjadi cari. Kecepatan yang sesuai dengan kebutuhan analisa dapat mudah dilakukan dengan tombol yang tersedia. Kondisi pencampuran yang paling sesuai dapat dicapai dengan penggunaan motor. Alat ini terdiri dari sebuah motor listrik dengan drive shaft berorientasi vertikal dan melekat pada sepotong karet dipasang sedikit off-center. Sebagai motor berjalan, potongan karet berosilasi cepat dalam gerakan melingkar. Ketika tabung reaksi atau wadah lain yang sesuai ditekan ke bagian karet (atau menyentuh ke tepi) gerak ditransmisikan ke cairan di dalamnya dan pusaran dibuat. Ini mixer vortex memiliki pengaturan kecepatan variabel dan dapat diatur untuk terus berjalan, atau berjalan hanya ketika tekanan diterapkan ke bagian karet.

3.3. Hot plate

3.4. Inkubator (Incubator)Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC. Suhu di dalam inkubator konstan dan dapat diatur sesuai dengan tujuan inkubasi. Bentuk inkubator yang dikenal ada yang berupa shaker dan water bath. Di dalam laboratorium mikrobiologi digunakan untuk menumbuhkan bakteri pada suhu tertentu, menumbuhkan ragi dan jamur, menyimpan biakan murni mikroorganisme I pada suhu rendah. Inkubator biasanya hanya dapat diatur di atas suhu kamar, sedangkan cooled inkubator dapat diatur baik pada suhu di bawah maupun diatas suhu kamar. Prinsip kerjanya yaitu mengubah energi listrik menjadi energi panas. Kawat nikelin akan menghambat aliran elektron yang mengalir sehingga mengakibatkan peningkatan suhu kawat (Taiyeb, 2001).Cara penggunaan inkubator adalah semua medium yang sudah dimasukan ke dalam cawan petri dan terbungkus kertas dimasukan ke dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu konstan sesuai dengan yang diinginkan.

BAB IVALAT DAN BAHAN1. Microsentrifuge tube 1,5 ml

2. Micropipet 0,5 ul, 10-100ul, 100-1000 ul + tip

3. Vortex

4. Microsentrifugator

BAB VCARA KERJA

Masukkan 900 ul cell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril1. tambahkan 300 ul hepar ayam yg sudh dihncurkn dan tabung diputar bolak balik 5- 6 kali untuk homogenasi2. Inkubasi campuran diatas selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak-balik 2- 3 kali selama inkubasi)3. sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit.4. buang supernatan tanpa mengganggu pellet.5. tambahkan 600 ul cell lysis solution ke pellet dan vortex .6. ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih.7. tambahkan 300 ul nuclei lysis solution ke pellet. Pipet larutan 5- 6 kali untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental.8. optional. Tambahkan 1,5 ul Rnase solution dan campurkan dengan cara membolak-balikan tabung, inkubasi campuran pada suhu 37c selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang.9. tambahkan 100 ul protein precipitation solution ke dalam lisate dan vortex selama 20 detik, setelah divortex akan terlihat butiran-butiran protein halus.10. sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selam 4 menit pada suhu ruang. Akan terlihat pellet dengan warna coklat terang. Bila supernatant masih berwarna coklat, ambil supernatant tersebut, pindahkan ke tabung microsentrifuge bersih, ulangi langkah 10 dan 11.11. pindahkan supernatant ke dalam tabung microsentrifuge bersih yang sudah berisi 300 ul isopropanol.12. bolak- balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).13. untuk optimalisasi, simpan tabung pada suhu -20C selama 1jam.14. sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 3 menit. Akan terlihat pellet putih.15. buang supernatant, cuci dengan 400 ul alkohol 70% dingin16. sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang, sampai Dna berubah menjadi transparan.17. Buang supernatant, kering anginkan DNA pada suhu ruang.18. Larutkan DNA dengan 100 ul rehydration solution.19. Rehidrasi DNA pada suhu 65 oC selama 1 jam atau pada suhu 4 oC overnight.20. Simpan DNA pada suhu -20 oC.

BAB VIIKESIMPULAN

Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA, sampel dapat diambil dalam isolasi dna bisa dari sel mukosa pipi (Saliva) dan darah vena, maupun dari hepar. Isolasi DNA digunakan untuk pengindentifikasian maupun sebagai bahan untuk PCR, sehingga dalam pembuatannya haruslah teliti agar hasil yang didapatkan bisa akurat.

28

DAFTAR PUSTAKAGuyton and Hall.2007.Buku Ajar Fisiologi Kedokteran.Jakarta: EGC.Murray, Robert K.2009.Biokimia Harper.Jakarta:EGCSadikin,Mohamad. 2002.Biokimia Enzim.Jakarta : Widya Medika.Soewoto,Hafiz, dkk. 2000.Biokimia Eksperimen Laboratorium.Jakarta: Widya Medika.Staf Pengajar Kimia Organik. 2005. Penuntun Praktikum Kimia Organik untuk Mahasiswa Program D3 Analisis Kimia.Departemen Kimia FMIPA-IPB.Yusminah, Oslan Jumadi.2009.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: BambatangHala.Arhan. 2009.Laporan Pratikum isolasi DNA.Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak NanasAnanas Comusus. terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi.