58

Lampiran 1. Prosedur analisa laboratorium

1. Kadar air

Botol timbang dikeringkan terlebih dahulu selama 1 jam dalam oven pada suhu

105°C, lalu didinginkan dalam eksikator dan kemudian beratnya ditimbang (x). Sampel

ditimbang seberat 5 gram (y), dimasukkan ke dalam botol timbang, kemudian

dimasukkan ke dalam oven selama 4 – 6 jam pada suhu 105°C, lalu didinginkan dalam

eksikator dan ditimbang kembali. Pekerjaan ini diulang sampai 3 kali, hingga dicapai

berat konstan (z). Adapun rumus penentuan kadar air sebagai berikut:

(x + y – z)

Kadar Air = x 100%

y

Kadar bahan kering sampel dapat diketahui dengan rumus :

Bahan kering (BK) = (100 – Kadar Air) %

2. Kadar abu

Cawan porselin dikeringkan dalam oven 105°C selama beberapa jam, kemudian

didinginkan dalam eksikator dan berat awal ditimbang (x). Sampel bahan ditimbang

dengan berat kira-kira 5 gram (y) dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Sampel

tersebut dipijarkan di atas nyala api pembakar bunsen sampai titik berasap lagi,

kemudian dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan suhu 400 - 600°C. Sesudah sampel

abu berwarna putih, seluruh sampel diangkat dan didinginkan dalam eksikator. Setelah

kira-kira 1 jam sampel ditimbang kembali (z). Adapun rumus penentuan kadar abu

menggunakan rumus sebagai berikut:

( z – x )

Kadar Abu = ______ x 100%

y

Kadar bahan organik dapat diketahui dengan rumus sebagai berikut :

Bahan Organik (BO) = ( Bahan Kering (BK) – Abu ) %

3. Kadar protein kasar

Prinsip analisa adalah pengukuran kadar nitrogen (N) dari sampel dengan

menggunakan Metode makro Kjeldahl.

Ada 3 tahap analisa protein yaitu :

1. Tahap Destruksi

2. Tahap Destilasi

59

3. Tahap Titrasi

Cara Kerja :

1. Kira-kira sebanyak 0.3 g sampel (X) ditimbang dengan menggunakan timbangan

analitik, setelah itu sampel dimasukkan ke dalam labu destruksi. Kedalam labu

ditambahkan kira-kira 3 sendok kecil katalis campuran ( selenium 4 gr +

CuSO4.5H2O 3 g + Na2SO4 190 g ) serta 20 ml H2SO4 pekat teknis secara

homogen. Campuran tersebut dipanaskan dengan alat destruksi mula-mula pada

posisi low selama 10 menit, kemudian pada posisi medium selama 5 menit dan

high sampai larutan menjadi jernih dan berwarna hijau kekuningan; proses ini

berlangsung di dalam ruang asam.

2. Setelah itu labu destruksi didinginkan dan larutan tersebut di masukkan ke

dalam labu penyuling dan diencerkan dengan 300 ml aquadest yang tidak

mengandung N. Tambahkan beberapa butir batu didih dan larutan dijadikan

basa dengan menambahkan kira-kira 100 ml NaOH 33%. Kemudian labu

penyuling dipasang dengan cepat di atas alat penyuling. Proses penyulingan ini

diteruskan hingga semua N telah tertangkap oleh H2SO4 yang ada di dalam

erlenmeyer atau bila 2/3 dari cairan dalam labu penyuling telah menguap (Tahap

Destilasi).

3. Labu erlenmeyer yang berisi hasil sulingan tersebut diambil dan kelebihan

H2SO4 dititer kembali dengan menggunakan larutan NaOH 0.3 N. Proses titrasi

berhenti setelah terjadi perubahan warna dari biru kehijauan yang menandakan

titik akhir titrasi. Volume NaOH dicatat ( z ml ), kemudian dibandingkan

dengan titar blanko ( y ml). (Tahap Titrasi). Adapun rumus penentuan kadar

protein kasar sebagai berikut:

( y – z ) x titar NaOH x 0,014 x 6,25

Protein Kasar = ______________________________ x 100%

Berat Sampel ( x ) g

4. Kadar lemak kasar (Metode Sochlet)

Prinsip : Ekstraksi lemak dengan menggunakan pelarut organik.

Cara Kerja :

60

1. Sebuah labu lemak dengan menggunakan beberapa butir batu didih di dalamnya,

dikeringkan di dalam oven dengan suhu 105 - 110°C selama 1 jam. Labu

didinginkan dalam eksikator selama 1 jam dan ditimbang ( a gram).

2. Sampel ditimbang kira-kira 1 g ( x gram) dengan catatan jumlah sampel juga

tergantung dengan kadar lemak bahan. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam

selongsong yang terbuat dari kertas saring dan ditutup dengan kapas yang bebas

lemak.

3. Selongsong dimasukkan ke dalam alat FATEX-S dan ditambahkan larutan

petroleum Ether sebagai larutan pengekstrak.

4. Alat FATEX-S diatur suhunya pada 60°C dan waktu selama 25 menit. Proses

ekstraksi dilakukan sampai alat berbunyi, kemudian larutan petroleum ether

diturunkan bersama lemak yang telah larut. Lakukan proses evaporasi dengan

merubah suhu pada 105°C sampai alat FATEX-S berbunyi. Proses ekstraksi dan

evaporasi dilakukan sebanyak 2 kali.

5. Selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam alat pengering oven dengan suhu

105°C selama kira-kira 1 jam. Setelah itu didinginkan di dalam eksikator

selama 1 jam dan ditimbang kembali ( b gram ). Adapun rumus penentuan

kadar lemak kasar sebagai berikut:

( b – a )

Kadar Lemak Kasar = _______ x 100%

x

5. Kadar serat kasar

Prinsip : Serat kasar adalah semua zat-zat organik yang tidak dapat larut dalam

H2SO4 0.3 N dan dalam NaOH 1.5 N yang berturut-turut dipanaskan selama 30 menit.

Serat kasar terdiri dari sellulosa, hemisellulosa, lignin dan silika serta sebagian

pentosan-pentosan.

Cara Kerja :

1. Sampel ditimbang seberat 1 gram (x) dan dimasukkan ke dalam gelas piala 500

ml. Sampel ditambahkan 50 ml H2SO4 0.3 N dan dipanaskan hingga mendidih

selama 30 menit.

2. Setelah itu ke dalam gelas piala ditambahkan pula 25 ml NaOH 1.5 N dan terus

dididihkan kembali selama 30 menit kedua. Waktu pendidihan diperhatikan

agar api tidak terlalu besar dan cairan tidak meluap dan tumpah.

61

3. Sebuah kertas saring ditimbang seberat ( a ) gram.

4. Cairan tersebut disaring dengan menggunakan kertas saring yang sudah

ditimbang sebelumnya dan dilakukan penyaringan dengan menggunakan corong

Buchner. Proses penyaringan berturut-turut dicuci dengan :

- 50 ml air panas

- 50 ml H2SO4 0.3 N

- 50 ml air panas

- 25 ml Aceton

5. Kertas saring dan isinya dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dikeringkan

di dalam oven dengan suhu 105°C.

6. Kertas saring dan isisnya yang telah dikerngkan didinginkan dalam eksikator

selama 1 jam dan timbang ( y ) gram.

7. Setelah itu kertas saring dan isinya dipijarkan di dalam tanur sampai menjadi

putih dan dinginkan kembali serta timbang ( z ) gram. Adapun rumus penentuan

kadar serat kasar sebagai berikut:

( y – z – a )

Kadar Serat Kasar = _________ x 100%

x

Penetapan Ca dengan Metode Titrasi KMnO4 (Apriyantono et al. 1989)

Prinsip : Kalsium diendapkan sebagai kalsium oksalat. Endapan dilarutkan

dalam H2SO4 encer panas dan dititrasi dengan KMnO4.

Cara Kerja:

1. Sebanyak 20 – 100 ml larutan abu hasil pengabuan kering dimasukkan ke dalam

gelas piala 250 ml. Jika perlu ditambahkan 25 – 50 ml akuades.

2. Selanjutnya 10 ml larutan amonium oksalat jenuh dan 2 tetes indikator metil

merah ditambahkan ke dalam larutan abu tersebut

3. Amonia encer ditambahkan untuk membuat larutan menjadi sedikit basa,

kemudian larutan ditambahkan beberapa tetes asam asetat sampai warna larutan

merah muda (pH 5.0) dan bersifat sedikit asam.

4. Larutan dipanaskan sampai mendidih, kemudian didiamkan selama minimum 4

jam atau semalam pada suhu kamar.

62

5. Penyaringan dilakukan menggunakan kertas saring Whatman No. 42 dan

dilakukan pembilasan dengan akuades sampai filtrat bebas oksalat (jika

digunakan HCl dalam pembuatan larutan abu, filtrat hasil saringan terakhir harus

bebas Cl dengan mengujinya menggunakan AgNO3).

6. Ujung kertas saring dilubangi dengan menggunakan batang gelas, kemudian

dilakukan pembilasan dan endapan dipindahkan dengan H2SO4 encer (1 + 4)

panas ke dalam gelas piala bekas tempat mengendapkan kalsium. Kemudian

dilakukan pembilasan satu kali lagi dengan air panas.

7. Selagi panas (70 - 80°C) dilakukan titrasi dengan larutan KMnO4 0,01N sampai

larutan berwarna merah jambu permanen yang pertama.

8. Kertas saring dimasukkan dan titrasi dilakukan sampai terjadi warna merah

jambu permanen yang kedua.

9. Adapun rumus perhitungan kadar Ca dalam sampel sebagai berikut:

ml titrasi x 0,2 x total volume larutan abu

mgCa/100g sampel = _________________________________ x 100

vol larutan abu x berat sampel

Jika normalitas KMnO4 tidak sama dengan 0,01 N, maka:

ml titrasi x N.KMnO4 x 20 x vol. total lar. abu

mgCa/100g sampel = _____________________________________ x 100

vol larutan abu x berat sampel

Penetapan Fosfor Metode Molibdat-Vanadat (Apriyantono et al. 1989)

Prinsip : Sampel diperlakukan dengan asam nitrat untuk mengubah semua

metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat, kemudian sampel diperlakukan dengan

asam molibdat dan asam vanadat sehingga ortofosfat yang ada di dalam sampel akan

bereaksi dengan pereaksi-pereaksi tersebut dan membentuk kompleks asam

vanadimolibdifosfat yang berwarna kuning orange. Intensitas warna dari senyawa

kompleks tersebut dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400

nm dan dibandingkan dengan standar fosfor yang telah diketahui konsentrasinya.

Persiapan Pereaksi :

1. Persiapan Vanadat-Molibdat

+ Sebanyak 20 g amonium molibdat dilarutkan ke dalam 400 ml akuades hangat

(50°C), lalu didinginkan.

63

+ Selanjutnya 1 g amonium vanadat (amonium meta vanadat) dilarutkan ke

dalam 300 ml akuades mendidih, kemudian didinginkan. Perlahan-lahan 140

ml asam nitrat pekat ditambahkan sambil diaduk.

+ Larutan molibdat dimasukkan ke dalam larutan vanadat dan di aduk.

Kemudian diencerkan sampai volume 1 liter dengan akuades.

2. Larutan fosfat standar :

+ Potasium dihidrogen fosfat kering ditimbang sebanyak 3.834 g

+ Kemudian dilarutkan ke dalam akuades dan diencerkan sampai volume 1 liter.

+ Selanjutnya larutan diambil sebanyak 25 ml, dimasukkan ke dalam labu takar

250 ml dan diencerkan sampai tanda tera (1 ml = 0,2 mg P2O5).

Cara Kerja :

Pembuatan Kurva Standar :

1. Larutan fosfat standar masing-masing sebanyak: 0;2.5;5;10;20;30;40 dan 50 ml

dimasukkan ke dalam satu seri labu takar 100 ml.

2. Kemudian diencerkan masing-masing alikuot sampai volume 50 – 60 ml dengan

akuades.

3. Sebanyak 25 ml pereaksi vanadat-molibdat ditambahkan ke dalam masing-

masing labu takar dan diencerkan sampai volume 100 ml dengan akuades.

4. Larutan didiamkan selama 10 menit, kemudian diukur absorbansi masing-

masing larutan di dalam kuvet gelas dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 400 nm.

5. Masing-masing larutan tersebut mengandung : 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 dan

10 mg P2O5/100 ml, selanjutnya dibuat kurva absorbansi vs mg P2O5/100 ml.

Tahapan Sampel

Tahapan sampel terdiri dari tahapan a atau b. Tahapan b dilakukan apabila tidak

tersedia sampel bentuk abu.

Tahapan a:

1. Sebanyak 10 ml HCl 5 M ditambahkan pada sejumlah abu dari hasil pengabuan

kering, lalu didinginkan.

2. Larutan disaring dengan kertas saring No. 1 dan filtrat dimasukkan ke dalam

labu takar 250 ml.

64

3. Cawan dibilas dengan akuades, kemudian dicampurkan air pembilas yang telah

disaring dengan filtrat di dalam labu takar.

4. Endapan dicuci di dalam kertas saring sebanyak 2 kali masing-masing dengan

20 ml akuades.

5. Selanjutnya filtrat diencerkan sampai tanda tera.

Tahapan b:

1. Sampel sebanyak 5 g ditimbang dan dimasukkan ke dalam gelas piala 150 ml.

2. Lalu ditambahkan 20 ml asam nitrat pekat, kemudian dididihkan selama 5 menit.

3. Larutan didinginkan dan ditambahkan 5 ml asam sulfat pekat.

4. Selanjutnya dipanaskan dan disempurnakan ‘digestion’ dengan penambahan

HNO3 setetes demi setetes sampai larutan tidak berwarna.

5. Larutan dipanaskan sampai timbul asap putih, kemudian didinginkan.

6. Akuades ditambahkan sebanyak 15 ml dan dididihkan lagi selama 10 menit.

7. Larutan didinginkan dan dipindahkan ke dalam labu takar 250 ml.

8. Gelas piala dibilas sampai bersih, bilasan dimasukkan ke dalam labu takar.

9. Larutan diencerkan di dalam labu takar sampai tanda tera dengan akuades.

Penetapan Sampel:

1. Larutan yang dihasilkan dengan cara a atau b diambil sebanyak 10 ml, kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.

2. Lalu ditambahkan 40 ml akuades dan 25 ml pereaksi vanadat molibdat.

3. Diencerkan dengan akuades sampai tanda tera.

4. Larutan didiamkan selama 10 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm.

5. Konsentrasi fosfor dicatat dari kurva standar berdasarkan absorban yang terbaca.

Perhitungan:

C x 2.5

% Fosfor dalam sampel (P2O5) = _______ x 100%

W

C = Konsentrasi fosfor dalam sampel (mg/100 ml) yang terbaca

W = Berat sampel yang digunakan

65

Penetapan Magnesium (Apriyantono et al. 1989)

Prinsip : Di dalam larutan alkali yang telah dihilangkan kalsium dan besinya,

magnesium diendapkan sebagai magnesium amonium fosfat. Endapan dilarutkan di

dalam larutan asam dan jumlah fosfor dapat ditentukan secara kolorimetrik, dengan

demikian jumlah magnesium juga dapat ditentukan.

Cara Kerja:

1. Sebanyak 10 ml larutan abu dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse 15 ml

berskala dan ditambahkan 1 tetes indikator metil merah.

2. Larutan dinetralkan dengan NH4OH.

3. Selanjutnya larutan ditambahkan 1 ml amonium oksalat dan larutan diencerkan

menjadi 13 ml dengan menggunakan akuades.

4. Kemudian diaduk dan didiamkan semalam.

5. Larutan disentrifuse selama 10 menit dan endapannya dibuang.

6. Selanjutnya 1 ml larutan supernatan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam

tabung sentrifuse 15 ml.

7. Sebanyak 3 ml air, 1 ml amonium fosfat dan 2 ml NH4OH ditambahkan ke

dalam larutan supernatan, kemudian diaduk dan didiamkan semalam.

8. Selanjutnya larutan disentrifuse selama 7 menit, kemudian larutan supernatan

dibuang dan ditambahkan 5 ml NH4OH encer.

9. Kemudian larutan disentrifuse lagi selama 7 menit dan larutan supernatan

dibuang.

10. Endapan dikeringkan dengan meletakkan tabung ke dalam wadah berisi air

panas.

11. Sebanyak 1 ml HCl encer dan 5 ml air ditambahkan untuk melarutkan endapan.

12. Sebanyak 1 ml asam molibdat, 0,5 ml hidrokuinon dan 0,5 ml Na-sulfit

ditambahkan, diaduk dan didiamkan selama 30 menit.

13. Larutan dipindahkan ke dalam kuvet dan dibaca absorbansinya pada kolorimeter

dengan menggunakan filter merah No. 66.

14. Skala pada alat diatur pada angka 0 dengan menggunakan air.

Kurva Standar

1. Sebanyak 0,4389 g potasium dihidrogen fosfat dilarutkan di dalam air dan

diencerkan sampai volume 1 liter (1 ml = 0,1 mg, P = 0,0784 mg Mg).

66

2. Untuk menyiapkan kurva standar, digunakan alikuot dari larutan standar dari 0,1

sampai 0,5 ml.

3. Setiap standar dikerjakan seperti langkah 1 – 14 di atas.

Penetapan Fe dan Zn menggunakan AAS (Apriyantono et al. 1989)

Prinsip : Sesudah menghilangkan bahan-bahan organik dengan pengabuan kering

atau basah, residu dilarutkan dalam asam encer. Larutan disebarkan dalam nyala api

yang ada di dalam alat AAS sehingga absorpsi atau emisi logam dapat dianalisis dan

diukur pada panjang gelombang tertentu.

Zat pereaksi yang dibutuhkan antara lain:

1. HCl 6N, 3N, dan 0.3N

2. Lantanum klorida 10%

3. Akuades mutu tinggi atau air bebas ion

4. Kertas saring Whatman No. 541 atau Schleicher and Schull No. 589-1. Cuci

kertas saring sebelum digunakan dengan HCl 3N untuk menghilangkan

“tracemetal”.

5. Larutan stock standar 1000 mg/L. Timbang sejumlah pereaksi, seperti pada tabel

1 di bawah. Larutkan garam tersebut dalam 25 ml HCl 3N kemudian encerkan

menjadi 250 ml dengan air.

Tabel Berat garam yang diperlukan untuk membuat larutan standar logam

Logam Pereaksi Berat pereaksi (g) per

250 ml larutan

Besi (Fe)

Seng (Zn)

Fe2(SO4) 3(NH4)2 SO4.24H2O

ZnSO4.7H2O

2.158

1.100

6. Larutan standar

Larutan stock standar diencerkan dengan air (jika persiapan sampel dilakukan

dengan pengabuan basah) atau HCl 0.3N (pengabuan kering) sampai

konsentrasinya berada dalam kisaran kerja, masing-masing logam.

67

Tabel Kondisi yang direkomendasikan untuk analisis logam dengan sistem nyala

asetilen-udara

Logam Panjang

Gelombang

( A” )

Absorpsi (A)

Atau

Emisi (E)

Limit

Deteksi

(µ logam/ml)

Kisaran

Kerja

(µ logam/ml)

Besi (Fe)

Seng (Zn)

248.3

213.9

A

A

0.03

0.004

0.05 – 5

0.1 – 2 (1)

Keterangan : Nilai di dalam kurung menyatakan bahwa kurva kalibrasi linier sampai

nilai ini.

Cara Kerja :

1. Larutan abu berasal dari pengabuan basah

a. Larutan abu dipindahkan ke dalam labu takar, dipilih labu takar yang sesuai

sehingga diperoleh konsentrasi logam yang sesuai dengan kisaran kerjanya.

b. Larutan ditepatkan sampai tanda tera dengan air, kemudian dicampur secara

merata.

2. Abu berasal dari pengabuan kering

a. Sebanyak 5 – 6 ml HCl 6Nditambahkan ke dalam cawan/pinggan berisi abu,

kemudian dengan hati-hati dipanaskan di atas hot plate (pemanas) dengan

pemanasan rendah sampai kering.

b. Lalu ditambahkan 15 ml HCl 3N, cawan dipanaskan di atas pemanas sampai

mulai mendidih.

c. Setelah itu didinginkan dan disaring melalui kertas saring, dimasukkan filtrat ke

dalam labu takar yang sesuai. Diusahakan padatan tertinggi sebanyak mungkin

dalam cawan.

d. Kemudian ditambahkan 10 ml HCl 3N ke dalam cawan, dipanaskan sampai

larutan mulai mendidih.

e. Lalu didinginkan, disaring, dan dimasukkan filtrat ke dalam labu takar.

f. Cawan dicuci dengan air sedikitnya tiga kali, kemudian disaring dan air cucian

lalu dimasukkan ke dalam labu takar.

g. Kertas saring dicuci dan air cucian dimasukkan ke dalam labu takar.

h. Jika akan menentukan kadar kalsium, ditambahkan 5 ml larutan lantanum

klorida untuk setiap 100 ml larutan.

i. Lalu didinginkan dan isi labu diencerkan sampai tanda tera dengan air.

68

j. Blanko disiapkan dengan menggunakan sejumlah pereaksi yang sama, kemudian

tahap 1 sampai dengan 9 dilakukan.

3. Kalibrasi Alat dan Penetapan Sampel

a. Alat AAS diatur sesuai dengan instruksi dalam manual alat tersebut.

b. Larutan standar logam dan blanko diukur.

c. Larutan sampel diukur. Selama penetapan sampel, diperiksa secara periodik

apakah nilai standar tetap konstan.

d. Kurva standar dibuat untuk masing-masing logam (nilai absorpsi/emisi vs

konsentrasi logam dalam µ g/ml).

4. Perhitungan:

Penentuan konsentrasi logam dalam sampel dari kurva standar yang diperoleh

adalah:

Berat sampel (g) = W

Volume ekstrak = V

Konsentrasi larutan sampel (µ g/ml) = a

Konsentrasi larutan blanko µ g/ml) = b

( a – b ) x V

Kadar logam (mg/100 g) = __________

10 W

( a – b ) x V

Kadar logam (mg/1000 g) = __________

W

Penentuan β-Karoten: Metode II (Apriyantono, et al. 1989)

Prinsip : Pigmen diekstrak dari bahan dengan menggunakan pelarut aseton-

heksana. Pigmen dipisahkan dari pigmen lainnya dengan menggunakan kolom adsorpsi

Magnesium oksida-Supercel, kemudian diukur adsorbansinya pada 436 nm.

Pereaksi:

1. Aseton dengan sejumlah Na2SO4 anhydrous, disaring dan ditambahkan

beberapa potong seng berbentuk granular (10 mesh) kemudian didestilasi

sehingga didapat aseton murni.

2. Heksana, titik didih 60 - 70°C

3. Adsorben : campuran Magnesium oksida + supercel 1 : 1

69

Peralatan:

1. Kolom adsorpsi : tinggi 17 cm, diameter 2 cm.

2. Penyodok : panjang 25 cm, terbuat dari gelas, salah satu ujungnya rata.

3. Pompa vakum

Cara Kerja:

a. Ekstraksi buah dan sayuran kering:

1. Sampel digiling sampai lolos ayakan 40 mesh

2. Kemudian ditimbang tepat 1 – 4 g sampel, ditempatkan dalam timbel dan

dimasukkan ke dalam Soxhlet extractor.

3. Lalu ditambahkan 30 ml campuran aseton komersil dan heksana (3 + 7) ke

dalam labu soxhlet, refluks selama 1 jam atau lebih dengan kecepatan 1 – 3 tetes

per detik sampai tidak ada lagi warna yang terekstrak, didinginkan pada suhu

ruang dan ditepatkan volume hasil ekstraksi menjadi 100 ml dengan heksana.

4. Alternatif lain, ditambahkan pelarut ke dalam sampel yang sudah digiling halus

dan dibiarkan di dalam tempat gelap semalam pada suhu ruang. Kemudian

ekstrak didekantasi atau disaring, dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml,

residu dicuci, kemudian ditepatkan sampai tanda tera dengan heksana. Larutan

ini sekarang mengandung aseton 9%.

b. Ekstraksi buah dan sayuran segar atau olahan:

1. Sejumlah sampel dihancurkan di dalam blender (untuk bahan segar, jika analisa

tidak segera dilakukan, bahan diblansir dalam air mendidih selama 5 – 10 menit,

disimpan dalam keadaan beku).

2. Sampel sebanyak 5 – 10 g diekstrak dengan campuran 40 ml aseton dan 60 ml

heksana dan 0.1 g MgCO3 di dalam blender selama 5 menit.

3. Residu dibiarkan mengendap, kemudian didekantasi dalam labu pemisah

(ekstrak dikeluarkan).

4. Residu dicuci dua kali masing-masing dengan 25 ml aseton, kemudian dicuci

lagi dengan 25 ml heksana.

5. Seluruh ekstraksi yang diperoleh digabungkan.

6. Kemudian dipisahkan dan aseton diambil/dibuang dari ekstrak dengan pencucian

menggunakan air berkali-kali.

70

7. Lapisan atas dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml yang telah berisi 9 ml

aseton dan diencerkan sampai tanda tera dengan heksana (jika didinginkan

alkohol dapat digunakan untuk menggantikan aseton dalam tahap ekstraksi).

Pemisahan pigmen secara kromatografi

1. Kolom kromatografi disiapkan dengan adsorben campuran magnesia aktif dan

supercel ( 1 + 1 ) seperti pada Metode I.

2. Lapisan Na2SO4 anhydrous ditempatkan setinggi 1 cm di atas lapisan adsorben.

3. Dengan menggunakan vakum secara kontinyu pada kolom, dimasukkan 50 ml

ekstrak pigmen ke dalam kolom.

4. Elusi dilakukan dengan menggunakan pelarut aseton heksana. Lapisan atas

dijaga agar selalu terisi dengan pelarut selama operasi.

5. Karoten akan melewati kolom secara cepat. ‘Band’ (pita) xantofil, produk

oksidasi karoten dan klorofil akan teradsorpsi dalam kolom.

6. Hasil elusi dikumpulkan, jika warna larutan terang, dipekatkan dengan tekanan

rendah (vakum), ditepatkan sampai volume tertentu dengan menggunakan

aseton 9% dalam heksana.

7. Warna diukur pada 436 nm. Alat diatur pada 100% T dengan menggunakan

aseton 9% dalam heksana.

8. Konsentrasi karoten ditentukan dalam sampel berdasarkan kurva standar yang

dibuat.

Pembuatan Kurva Standar

1. Sebanyak 25 mg β-karoten murni ditimbang dengan teliti. Kemudian dilarutkan

dalam 2.5 ml kloroform dan dibuat menjadi 250 ml dengan petroleum eter (1 ml

= 0.1 mg atau 100 µg).

2. Larutan sebanyak 10 ml diencerkan menjadi 100 ml dengan petroleum eter (1 ml

= 0.01 mg atau 10 µg).

3. Sebanyak 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 ml larutan ini dimasukkan ke dalam labu

ukur 100 ml yang terpisah. Masing-masing labu ukur diisi dengan 3 ml aseton.

4. Kemudian diencerkan sampai tanda tera dengan petroleum eter, sehingga

konsentrasinya akan menjadi 0.5, 1.0, 2.0, 2.5, dan 3.0 µg per ml.

5. Optikal density (OD) larutan ini diukur pada 452 nm dengan menggunakan

aseton 3% dalam petroleum eter sebagai blanko.

71

6. Setelah itu dibuat grafik hubungan antara optical density dengan konsentrasi β-

karoten.

Perhitungan:

µg karoten per ml x pengenceran x 100

yang terbaca dari

kurva standar

Mg β-karoten = ________________________________

per 100 g Berat sampel x 1000

Penetapan Vitamin C Metode Titrasi Iodium (Jacobs) (Sudarmadji et al. 1984)

1. Sebanyak 200 – 300 g bahan ditimbang dan dihancurkan dalam waring blender

sampai diperoleh slurry. Kemudian 10 – 30 g slurry ditimbang dan dimasukkan

ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuades sampai tanda, lalu disaring

dengan Krus Gooch atau dengan sentrifuse untuk memisahkan filtratnya.

2. Sebanyak 5 – 25 filtrat diambil dengan pipet dan dimasukkan ke dalam

erlenmeyer 125 ml, kemudian ditambahkan 2 ml larutan amilum 1 % (soluble

starch) dan ditambahkan 20 ml akuades bila perlu.

3. Kemudian dititrasi dengan 0,01 N standard iodium

4. Perhitungan :

1 ml 0,01N Iodium = 0,88 mg asam askorbat

Lampiran 2. Penetapan mineral Fe dan Zn dari plasma perkutut

Metoda pengukuran Fe adalah sebagai berikut :

Peralatan

1. Atome Absorbtion Spektrophatometer merek GBC Type 906-AA dengan kondisi

Wavelength : 248,3 nm

Skit : 0,2 nm

Lamp current : 5,0 mA

Flame type : Air Acetylene (oxidizing)

2. Labu ukur 1000 ml terkalibrasi

3. Labu ukur 100 ml terkalibrasi

4. Pipet 1 ml terkalibrasi

5. Pipet 2 ml terkalibrasi

6. Syringe 100 µl

72

Pereaksi yang digunakan

1. Standar Fe 1000 µg/ml, masukkan standar Fe yang mengandung 1,0 µg/ml (tritisal)

kedalam labu ukur 1000 ml, kemudian encerkan dengan larutan HCl 0,1 M hingga

tanda tera, kocok hingga homogen.

2. Standar Fe 100 µg/ml, pipet 10 ml larutan standar Standar Fe 1000 µg/ml masukkan

kedalam labu ukur 100 ml dan tera hingga tanda garis dengan aquades, kocok

hingga homogen.

3. Standar Fe 2 µg/ml - 10 µg/ml, pipet larutan Standar Fe 100 µg/ml sebanyak 2 ml,

4 ml, 6 ml, 8 ml. masing-masing masukkan kedalam labu ukur 100 ml kemudian

encerkan hingga tanda tera dengan aquades, kocok hingga homogen.

Metoda pengukuran Zn adalah sebagai berikut :

1. Atome Absorbtion Spektrophatometer merek GBC Type 906-AA dengan kondisi

Wavelength : 213,9 nm

Skit : 0,5 nm

Lamp current : 5,0 mA

Flame type : Air Acetylene (oxidizing)

2. Labu ukur 1000 ml terkalibrasi

3. Labu ukur 100 ml terkalibrasi

4. Pipet 1 ml terkalibrasi

5. Pipet 2 ml terkalibrasi

6. Syringe 100 µl

Pereaksi yang digunakan

1. Standar Zn 1000 µg/ml, masukkan standar zn yang mengandung 1,0 µg/ml (tritisal)

kedalam labu ukur 1000 ml, kemudian encerkan dengan larutan HCl 0,1 M hingga

tanda tera, kocok hingga homogen.

2. Standar Zn 10 µg/ml, pipet 1 ml larutan standar Zn 1000 µg/ml, masukkan kedalam

labu ukur 100 ml, encerkan hingga tanda tera dengan aquades.

3. buat larutan deret standar Zn 0,4 µg/ml – 1,6 µg/ml, pipet Standar 0,4 ml, 0,8 ml,

1,2 ml dan 1,6 ml masukkan masing-masing kedalam labu ukur 100 ml, kemudian

encerkan hingga tanda tera dengan aquades.

4. HCl 0,1 M

5 Aquabides

73

Cara Kerja

Pipet 100 µl plasma darah dengan menggunakan syringe masukkan dalam vial 1 ml,

kemudian encerkan hingga tanda tera dengan aquades kocok hingga homogen, larutan

siap untuk dibaca dengan kondisi AAS seperti diatas.

Lampiran 3. Kandungan nutrien daun segar tanaman saga, sambiloto, dan pare

hutan (As fed)

Komponen

Daun Saga

Daun Sambiloto

Daun Pare Hutan

Kadar Air (%)

Bahan Kering (%)

Kadar Abu (%)

Protein Kasar (%)

Lemak Kasar (%)

Serat Kasar (%)

Ca (mg/100 g)

P (mg/100 g)

Vit. A (mg/100 g)

83.39

16.61

1.49

4.28

0.75

3.00

1.47

94.90

1.08

79.50

20.50

3.01

3.38

0.26

1.65

73.00

96.00

0.93

83.25

16.75

2.14

4.03

0.11

1.37

100.00

121.00

0.95

Lampiran 4. Hasil anova heterofil perkutut

Analysis of Variance for Heterofil

Source DF SS MS F P Perlakua 4 377 94 0.36 0.830 Error 10 2604 260 Total 14 2982 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--- 1 2 53.50 0.71 (------------*-----------) 2 4 46.75 15.35 (--------*--------) 3 2 43.50 24.75 (------------*-----------) 4 4 57.00 18.40 (--------*-------) 5 3 54.67 11.59 (---------*----------) -+---------+---------+---------+--- Pooled StDev = 16.14 20 40 60 80

Lampiran 5. Hasil anova monosit perkutut

74

Analysis of Variance for Monosit

Source DF SS MS F P Perlakua 4 3.48 0.87 0.33 0.850 Error 10 26.25 2.62 Total 14 29.73 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+- 1 2 1.50 0.71 (-----------*------------) 2 4 0.50 0.58 (---------*--------) 3 2 0.00 0.00 (------------*------------) 4 4 1.25 2.50 (--------*--------) 5 3 1.00 1.73 (---------*---------) ---+---------+---------+---------+- Pooled StDev = 1.620 -2.0 0.0 2.0 4.0

Lampiran 6. Hasil anova limfosit perkutut

Analysis of Variance for Limfosit Source DF SS MS F P Perlakua 4 447 112 0.41 0.797 Error 10 2721 272 Total 14 3168 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--- 1 2 45.00 0.00 (------------*-----------) 2 4 52.75 15.37 (--------*---------) 3 2 56.50 24.75 (------------*------------) 4 4 41.75 19.45 (--------*--------) 5 3 44.33 11.50 (---------*----------) -+---------+---------+---------+--- Pooled StDev = 16.49 20 40 60 80

Lampiran 7. Hasil anova zat besi (Fe) perkutut

Analysis of Variance for Zat Besi (Fe)

Source DF SS MS F P Perlakua 4 151.95 37.99 26.64 0.000 Error 8 11.41 1.43 Total 12 163.36 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----------+---------+---------+---- 1 2 4.47 0.40 (-----*----) 2 3 11.04 1.43 (----*---) 3 2 2.26 1.56 (----*-----) 4 3 3.05 1.11 (----*---) 5 3 2.72 1.07 (----*---) ----------+---------+---------+---- Pooled StDev = 1.194 3.5 7.0 10.5

Lampiran 8. Hasil anova seng (Zn) perkutut

Analysis of Variance for Seng (Zn)

75

Source DF SS MS F P Perlakua 4 34.08 8.52 2.05 0.179 Error 8 33.18 4.15 Total 12 67.27 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----------+---------+---------+---- 1 2 6.47 0.94 (-----------*----------) 2 3 2.90 0.78 (--------*--------) 3 2 5.78 0.28 (----------*----------) 4 3 7.17 2.98 (--------*--------) 5 3 6.68 2.57 (--------*--------) ----------+---------+---------+---- Pooled StDev = 2.037 3.0 6.0 9.0

Lampiran 9. Hasil anova testosteron perkutut

Analysis of Variance for Testosteron Source DF SS MS F P Perlakua 4 165.0 41.2 1.62 0.243 Error 10 253.9 25.4 Total 14 418.9 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+-------+ 1 2 11.00 1.41 (-----------*----------) 2 4 13.25 1.55 (-------*-------) 3 2 18.50 4.95 (----------*-----------) 4 4 19.62 8.29 (-------*-------) 5 3 13.00 2.65 (---------*--------) ------+---------+---------+-------+ Pooled StDev = 5.039 7.0 14.0 21.0 28.0

Lampiran 10. Hasil anova durasi silabel

Analysis of Variance for Durasi Syllable

Source DF SS MS F P perlakua 4 0.00356 0.00089 0.60 0.665 Error 17 0.02502 0.00147 Total 21 0.02858 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----------+---------+---------+---- 0 5 0.190 0.026 (-----------*-----------) 1 5 0.192 0.041 (-----------*-----------) 2 4 0.193 0.050 (------------*-------------) 3 5 0.220 0.043 (-----------*-----------) 4 3 0.213 0.015 (--------------*---------------) ----------+---------+---------+---- Pooled StDev = 0.03836 0.180 0.210 0.240

Lampiran 11. Hasil anova durasi antar silabel

Analysis of Variance for Durasi Antar Syllable

Source DF SS MS F P perlakua 4 0.003059 0.000765 0.92 0.477

76

Error 17 0.014200 0.000835 Total 21 0.017259 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+-------+- 0 5 0.090 0.019 (----------*----------) 1 5 0.106 0.015 (----------*----------) 2 4 0.110 0.014 (-----------*-----------) 3 5 0.122 0.053 (----------*----------) 4 3 0.120 0.010 (-------------*-------------) -----+---------+---------+-------+- Pooled StDev = 0.02890 0.075 0.100 0.125 0.150

Lampiran 12. Oscillogram durasi suara (silabel dan antar silabel) perkutut

Oscillogram Perlakuan D (penambahan ekstrak daun pare)

Oscillogram Perlakuan E (kombinasi ekstrak daun saga, sambiloto dan pare)

77

Oscillogram Perlakuan B (penambahan ekstrak daun saga)

Oscillogram Perlakuan A (ransum kontrol)

Oscillogram Perlakuan C (penambahan ekstrak daun sambiloto)