KULTIVASI MIKROORGANISME

Organisme Waktu Penggandaan sel

Bakteri dan khamirKapang dan AlgaRumput AyamBabiSapi mudaManusia (muda)

20-120 menit2-6 jam1-2 minggu2-4 mingu4-6 mingu1-2 bulan3-6 bulan

Skema Umum Proses Kultivasi

Bioreaktor

Pengembangan Inokulum

Kultur Stok

LabuKocok

BioreaktorInokulum

Sterilisasi Media

Formulasi Media

Bahan Baku Media

Cairan Fermentasi

Biomassa

PemisahanSel

SupernatanBebas Sel

Ekstraksi Produk

Pemurnian Produk

Pengemasan produk

PenangananLimbah Cair

CONTOH KULTIVASI PADA SUATU BIOINDUSTRI

Metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor : - nir sinambung/curah (batch)- sinambung (continuous) - semi sinambung (fed- batch)

METODE KULTIVASI

Continuous

CONTOH BIOREAKTOR

Pelaksanaan kultivasi :

Bioreaktor steril diisi dengan media segar steril lalu diinokulasi dengan inokulum KULTIVASI (merupakan sistem tertutup)

Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk dilakukan pemanenan produk (proses hilir)

Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk digunakan pada kultivasi berikutnya

Penyiapan/pembersihan bioreaktor repot

KULTUR CURAH/NIR SINAMBUNG

Kultur Curah :

1. Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika kultivasi

2. Resiko kontaminasi rendah3. Konsentrasi produk akhir lebih tinggi4. Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi krn waktu

kultivasinya pendek5. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor

yang sama (Contoh : pertumbuhan sel pd fase eksponensial & pembentukan produk pd fase stasioner = metabolit sekunder

6. Pada industri farmasi, semua bahan-bahan yang digunakan harus diketahui dengan tepat, sehingga lebih praktis dengan proses curah

7. Dari aspek rekayasa bioproses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil

8. Kelemahan : Terakumulasi produk yang dapat menghambat pertumbuhan

Kurva Pertumbuhan

Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian

Lag Eksponensial Stasioner Kematian

Waktu

Log

Jml S

el/m

lLn

X (g

/l)

‘Viable cell count’ dg lisis sel

Lisis sel, diikuti pertumbuhan kriptik

Fase Eksponensial :

Keterangan : X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot

kering)µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1)t = waktu (jam)

Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai Model Pertumbuhan Eksponensial

Plot antara ln[Sel] vs waktuakan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase eksponensial (ingat pembelahan biner)

(slope untuk menentukan μ)

Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ?Perhatikan sel tunggal di dalam bioreaktor Sel ini membelah diri tiap jam (pembelahan biner). Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb.

Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel 2 4 8 …. dst1 21 22 23 24 ………….. 2n = N (jumlah sel)

Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi

Laju pertumbuhan spesifik(µ) :- Menggambarkan kecepatan reproduksi sel. - Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. - Pada saat sel tidak tumbuh, maka laju spesifik pertumbuhan

= 0

Model Pertumb Eksponensial

Pada saat fase eksponensial, laju spesifik pertumbuhan relatif tetap

Hasil integrasi :

Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensialantara konsentrasi biomassa vs waktu

Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik :

Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurusSlope = μ

Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = tD) dengan laju spesifik pertumbuhan (μ)

td menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan populasi sel menggambarkan laju pertumbuhan sel

Selama fase eksponensial tD relatif konstan

Hubungan antara tD dengan laju pertumbuhan spesifikbila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X0 menjadi X1 selama waktu penggandaan tD (= t 1- t0) :

td = 0,693 μ

Aplikasi Kultur Curah :

• Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder

• Untuk produksi biomassa digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimal

• Untuk prodiksi metabolit primer kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesis produk

• Untuk produksi metabolit sekunder kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjangfase stasioner

KULTUR SINAMBUNG

Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan (Sistem Terbuka)

Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor volume tetap

Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah.

Dapat menggunakan Sel mikroba imobil untuk memaksimumkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya.

Imobilisasi sel : penempatan mikroba pada ruang/daerah tertentu, sehingga dapat mempertahankan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang (contoh : menumbuhkan/melekatkan mikroba pada carrier)

Kultur Sinambung Kelebihan : 1. Produktivitas lebih tinggi, penyebab :

- lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor per satuan produkyang dihasilkan

- laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol dengan mengatur laju dilusi

- pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diaturDengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru)

2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama3. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah

(contohnya penanganan limbah cair) & produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan

4. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana5. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat

Kultur Sinambung

Dengan mengontrol laju dilusi dimungkinkan untuk mempertahankan laju pertumbuhan spesifik yang optimal untuk pembentukan produk

Kelemahan :Aliran umpan yang lama resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik)Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus bisa tetap bekerja baik untuk waktu yang lamaMemerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunakan pada waktu yang lama

Terjadinya degenerasi galur mikroba yang digunakan akibat mutasi spontan menyebabkan penurunan produk yang

dihasilkan Sebaiknya ada konsumen/permintaan yang tetap terhadap produk spy efisien

NERACA MASSA PADA KULTUR SINAMBUNG

Biomassa :Akumulasi = Sel masuk – Sel keluar + Pertumbuhan – Sel mati

( )XDμDXμX

XVFμX

dtdX

−=−=

−=

αXμXXVFX

VF

dtdX

0 −+−=

0=dtdX

Bila suplai medium steril (X0 = 0) dan μ >> α, maka

Dalam keadaan setimbang (staedy state),

Dcrit ≈ μmaxD mendekati Dcrit ⇒ tidak stabilD > μmax ⇒ wash out

dan μ = D

Substrat :Akumulasi = nutrisi masuk – nutrisi keluar – konsumsi untuk tumbuh

– konsumsi untuk pemeliharaan – konsumsi untuk sintesis produk

( )

( )SS f −==

−−=

<<

SX

SX

f

SX

Yxsehingga ,0dtdS setimbang,Saat

YμXSSD

dtdS

maka produk,n pembentuka adadan tidak ,YμX mX Bila

SP

p

SX

f YXq

mXYμXS

VFS

VF

dtdS

−−−−=

Kultur Sinambung :Start-Up

Kultivasi sinambung diawali dengan kultivasi curahSetelah kultur mencapai fase eksponensial, lalu umpan dimasukkanBila komposisi media saat start-up sama dengan umpan, perubahan dari curah ke sinambung menyebabkan konsentrasi sel atau produk berosilasi (A) penyebab : kultur mikroba mengalami hambatan oleh substrat)

dicegah dengan komposisi media saat start-up 1/2 umpan (B)Penambahan umpan dilakukan kira-kira setelah kons sel ½ kons sel saat “steady-state” (biomassa, substrat & produk tidak berubah dan laju metabolisme sel kontan)

A B

Waktu Waktu

KonsSel

KonsSel

Dimulai kultivasi sinambung

Kultur Sinambung :

Model hubungan laju pertumbuhan sel dgn konsentrasi substrat pada kultivasi sinambung Model MONOD

µ = Sµmaks KS + S

Keterangan :µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1)µmaks = laju pertumbuhan spesifik maksimum (jam-1)S = konsentrasi substrat pembatas (g/l)KS = kons substrat (g/l) pada saat ½ laju pertumbuhan spesifik

maksimum menggambarkan efisiensi mikroba dalam mengkonsumsi substrat

Model yang menghubungkan X, S dan D

( )

XDSK

.Sμ

XDμdtdX

s

max⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

+=

−=

SK.Sμμ

s

max

+=

( )

( ) ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

−−=

−−=

SK.Sμ

YXSSD

YμXSSD

dtdS

S

max

SX

f

SX

f

Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State)Biomassa

Substrat

DμDKS maka ,0

dtdS Bila

max

S

−==

SKS.μD

D

S

max

+=

= μ

( )

f

max

Sf

SX

fS

X

Sdan D dari fungsi X

D dari fungsi S

DμDKSY

SSYX

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

−=

−=

Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State)

Substrat

Biomassa

D kritisD kritis ⇒ D terendah saat mana wash out terjadi

fS

fmaxC

fmaxC

SKSμD

SSdan μD

+=

==

DC fungsi dari Sf . Bila Sf >> KS, maka DC = μmax

Aplikasi Kultur Sinambung :

Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambung

Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan media diperkaya

Untuk produksi biomassa, contoh ICI (Imperial Chemical Industries, kapasitas bioreaktor 3000 m3, substrat metanol)

Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower bioreactor)

KULTUR SEMI SINAMBUNG (FED-BATCH)

Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor.

Pada kultur fed batch, media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor secara kontinyu.

Harus disediakan ruang dalam bioreaktor untuk penambahan media

Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali.

Dapat mengurangi efek represif sumber karbon akibat penggunaan kons substrat yang tinggi dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor

Dapat mencegah efek toksik komponen media

Aplikasi Kultur Semi Sinambung (Fed-Batch)

Untuk produksi antibiotika penisilin (metabolit sekunder)- kultivasi 2 tahap : fase pertumbuhan sel cepat dan fase produksi yang diatur dengan mengatur umpan substrat glukosa

- Na-fenilasetat (prekursor) toksik thd Penicillium chrysogenumpengumpanan harus diatur

Untuk memproduksi enzim yang rentan thd represi katabolitContohnya : selulase oleh Trichoderma reesei

Kultur Curah Semi Sinambung

Kultur Sinambung

Aliran masuk (Fin)Aliran keluar (Fout)

Fin = Fout = 0 Fin> 0, Fout = 0 Fin = Fout > 0

Volume kultur Konstan Meningkat Konstan

Pengendalian kons substrat

Tdk mungkin (menurun)

Mungkin (konstan)

Mungkin (konstan)

Konsentrasi Sel Rendah (<5 g/l)

Kons. tertentu(> 100 g/l)

Kons. tertentu

Konsentrasi produk

Meningkat s.d tk rendah

Meningkat s.d tk tinggi

Konstan

Kemudahan bagi pengguna

Mudah Agak mudah Sulit

Bahaya kontaminasi

Tidak serius Tidak serius Serius

Perbandingan Berbagai Metode Kultivasi

CONTOH PERHITUNGAN KINETIKA

Kinetika Curah (Batch)Produksi Etanol oleh bakteri Zymomonas mobilis

Waktu(jam)

Biomassa(g/l)

Glukosa (g/l)

Etanol (g/l)

ln biomassa

5 0,05 247 1,5 -2,995739 0,15 240 5 -1,8971214 0,45 225 12 -0,7985118 1,2 195 22 0,18232222 2,8 130 47 1,02961924 3,4 100 63 1,22377526 3,8 75 74 1,33500130 4,15 40 90 1,42310835 4,2 25 100 1,435085

Fase eksponensial = 5 – 22 jam

kurva pertumbuhan

-4-3-2-1012

5 9 14 18 22 24 26 30 35

Waktu (jam)

ln X

(g/L

)

Laju Pertumb. Spesifik maks (μmaks) = 0,24 Jam-1

Penent Laju Pertumb. Spesifik

y = 0,2355x - 4,0992R2 = 0,9984

-4

-3-2

-1

01

2

0 5 10 15 20 25

Waktu (jam)

Ln B

iom

assa

(g/l)

Waktu(jam) (X-Xo) (So-S) (P-Po)

5 0 0 0

9 0,1 7 3,5

14 0,4 22 10,5

18 1,15 52 20,5

22 2,75 117 45,5

24 3,25 147 61,5

26 3,75 172 72,5

30 4,1 207 88,5

35 4,15 222 98,5

Yp/s = 0,38 g etanol/g substrat

Yp/s

y = 0,3827x + 0,8447R2 = 0,9983

01020304050

0 50 100 150

(So-S) g/l

(P-P

o) g

/l

Yx/s = 0,03 g etanol/g substrat

Yx/s

y = 0,0273x + 0,4472R2 = 0,8583

0

12

3

4

0 50 100 150

(So-S) g/l

(X-X

o) g

/l

Yp/x = 12,047 g etanol/g biomassa

Yp/x

y = 12,047x - 2,4313R2 = 0,8615

-20

0

20

40

60

0 1 2 3 4

(X-Xo) g/l

(P-P

o) g

/l