KULIAH PVMA FARMASI 9

CONTOH UJI VALIDASI

VALIDASI MAK PENENTUAN KADAR PIOGLITAZON OBAT MENURUNKAN KADAR GULA DARAH ATAU OBAT BIABETES TYPE 2, DENGAN MENGGUNAKAN METODA KCKT (KHROMATOGRAFI CAIR KINERJATINGGI) DIMANA METODA INI DIKEMBANGKAN DI AMERIKA DAN AKAN DICOBA MENERAPKAN DI INDONESIA. TERNYATA MODIFIKASI DILAKUKAN PADA INSTRUMEN ATAU PENGEMBANGAN PADA ALAT UKURNYA. SAMPEL BERUPA BERUPA BIO JADI MAKNYA DISEBUT BIOANALISIS PROSES NYA BISA INI VIVO ATAU IN VITRO, VALIDASI MENGUKUR PARAMETER SELEKTIVITAS, LINIERITAS NILAI LOD DAN LOQ, RECOVERY (AKURASI), SEPERTI TABEL DIBAWAH INI :

MODIFIKASI ALAT UKUR KCKT MODIFIKASI

SPESIFIKASI SEBELUM SESUDAH1.KOLOM APPOLO C18,

250x4,6 nm, Ø 5 umC8. 250x4,6mm, Ø 5 um

2. FASA DIAM WATERS SPHERISHORB

WATERS SPHERISHORB

3. FASA GERAK

BUFER PHOSFAT 10 M pH 2,6, METANOL, ACETONITRIL, (48:12:40)

BUFFER PHOSFAT 0,01 M pH 2,6 – METANOL- ACETONITRIL (50 :25 :25)

3.KEC ALIR 1,2 ml/menit 1,2 ml/menit4.PENDEKTEKSI UV PADA 269 nm UV PADA 269 nm5.STANDAR IN TERNAL

ROSIGLITASON ROSIGLITASON

1

2

LANGKAH PROSEDUR MAK

1. PENYIAPAN SAMPEL SIAP DI UKUR2. PEMBUATAN LARUTAN STANDAR 3. PENGKONDISIAN 4. PENGUKURAN 5. EVALUASI (ANALISA DATA).

1.PENYIAPAN SAMPEL SIAP DI UKUR

SAMPEL SENYAWA PIOGLITAZONE MURNI, DENGAN STRUKTUR MOLEKUL PIOGLITAZONEBERDASARKAN TATA NAMA IUPAC ADALAH (rs)-5-(4-[2-(5-ethylpyridin-2)ethoxy]benzyl)thiazolidine-2,4-dionePIOGLITAZONE ADALAH OBAT YANG TERMASUK DALAM GOLONGAN THIAZOLIDINEDIONE (tzd) DENGAN CARA KERJANYA MENURUNKAN KADAR GULA.

Struktur Pioglitazone

PEMBUATAN LARUTAN MURNI PIOGLITAZONE

3

a.LARUTAN INDUK PIOGLITAZONE

SEBANYAK 10 mg SERBUK PIOGLITAZONE DIMASUK KAN KE DALAM LABU UKUR 10 ml DAN DILARUTKAN DENGAN METANOL HINGGA TANDA BATAS. LARU TAN INI DISEBUT SEBAGAISTOK PIOGLITAZONE DALAM METANOL DENGAN KONSENTRASI 1000 µg/ml.

b.LARUTAN PIOGLITAZON SIAP DIUKUR

LARUTAN STOK PIOGLITAZONE DIENCERKAN HINGGA DIPEROLEH KONSENTRASI MASING-MASING 20000, 10000, 5000, 2000, 1000, 500, 250, 100 μg/ml DALAM METANOL.

2..PEMBUATAN LARUTAN STANDAR (INTERNAL STANDAR) DAN FASA GERAK

a. LARUTAN STANDAR

STANDAR DIGUNAKAN SENYAWA ROSIGLITAZONE, DENGAN STRUKTUR MOLEKUL rosiglitazone BERDASARKAN TATA NAMA IUPAC 5-[4-(2-[methyl(pyridin-2)amino]ethoxy)benzil] thiazolodine-2,4-dione. RUMUS STRUKTUR ROSIGLITAZONE ADALAH:

Struktur Rosiglitazone

4

RUMUS MOLEKUL C18H19N3O3S ROSIGLITAZONE BM 380,42, BERUPA KRISTAL BERWARNA PUTIH, LARUT DALAM ETANOL DAN TIDAK LARUT DALAM AIR.

PEMBUATAN LARUTAN INTERNAL STANDAR ROSIGLITA ZONE

SEBANYAK 10 mg SERBUK ROSIGLITAZONE DIMASUKAN KE DALAM LABU UKUR 10 ml DAN DILARUTKAN DENGAN METANOL HINGGA TANDA BATAS. LARUTAN INI SEBAGAI LARUTAN STOK INTERNAL STANDAR. ROSIGLITAZONE INI DIAMBIL 625 µL DAN DILARUTKAN DALAM 25 ml METANOL.

b.PENYIAPAN FASA GERAK

a. PENYIAPAN DAPARLARUTAN DAPAR FOSFAT pH 2,6 0,01 M DIBUAT DARI KH2PO4 DENGAN KONSENTRASI LARUTAN 0,01 mol/L DIBUAT DENGAN MELARUTKAN SEJUMLAH 1,3906 g YANG DILARUTKAN DALAM 1L AQUABIDEST DITAMBAHKAN DENGAN ASAM FOSFAT SAMPAI pH 2,6

b. PEMBUATAN QC STANDARDLARUTAN STOK PIOGLITAZONE DAN ROSIGLITA ZONE DALAM METANOL YANG TELAH DIBUAT DI ATAS DENGAN KONSENTRASI 1mg/ml. DIBUAT 3 QC STANDAR YAITU QC LOW (15 NG/ML), QC MEDIUM (800NG/ML) DAN QC HIGH (1850 μg/ml), DENGAN MASING-MASING

5

KONSENTRASI DALAM LABU TAKAR 25 ml PLASMA DAN DIMASUKKAN KE DALAM EPPENDORF, SIMPAN DALAM FREEZER -40 ºC. SIAP DIINJEKSIKAN KEDALAM FASA GERAK

3.PENGKONDISIAN (PENYIAPAN)KCKT

SKEMA ALAT KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SKEMA ALAT KCKT

3.1 POMPAFASE GERAK DALAM KCKT ADALAH SUATU

CAIRAN YANG BERGERAK MELALUI KOLOM. ADA DUA

TIPE POMPA YANG DIGUNAKAN, YAITU KINERJA

KONSTAN (CONSTANT PRESSURE) DAN PEMINDAHAN

KONSTAN (CONSTANT DISPLACEMENT). PEMINDAHAN

KONSTAN DAPAT DIBAGI MENJADI DUA, YAITU: POMPA

RECIPROCATING DAN POMPA SYRINGE. POMPA

RECIPROCATING MENGHASILKAN SUATU ALIRAN YANG

BERDENYUT TERATUR (PULSATING), OLEH KARENA ITU

6MEMBUTUHKAN PEREDAM PULSA ATAU PEREDAM

ELEKTRONIK UNTUK, MENGHASILKAN GARIS DASAR

(BASE LINE) DETEKTOR YANG STABIL, BILA DETEKTOR

SENSITIF TERHADAPAN ALIRAN. KEUNTUNGAN

UTAMANYA IALAH UKURAN RESERVOIR TIDAK

TERBATAS. POMPA SYRINGE MEMBERIKAN ALIRAN

YANG TIDAK BERDENYUT, TETAPI RESERVOIRNYA

TERBATAS.3.2 INJEKTORSAMPEL YANG AKAN

DIMASUKKAN KE BAGIAN UJUNG KOLOM, HARUS

DENGAN DISTURBANSI YANG MINIMUM DARI MATERIAL

KOLOM. ADA TIGA TIPE DASAR INJEKTOR YANG DAPAT

DIGUNAKAN : INJEKSI STOP-FLOW: ALIRAN PELARUT

DIHENTI KAN SEMENTARA, INJEKSI DILAKUKAN PADA

KINERJA ATMOSFIR, SISTEM TERTUTUP, DAN ALIRAN

DILANJUTKAN LAGI. TEKNIK INI BISA DIGUNAKAN

KARENA DIFUSI DI DALAM CAIRAN KECIL CLAN

RESOLUSI TIDAK DIPENGARUHI

a.INJEKSI SYRINGE: SEPTUM YANG DIGUNAKAN PADA KCKT SAMA DENGAN YANG DIGUNAKAN PADA KROMTOGRAFI GAS. INJEKTOR INI DAPAT DIGUNAKAN PADA KINERJA SAMPAI 60 -70 ATMOSFIR. TETAPI SEPTUM INI TIDAK TAHAN DENGAN SEMUA PELARUT-PELARUT KROMATO GRAFI CAIR. PARTIKEL KECIL DARI SEPTUM YANG TERKOYAK (AKIBAT JARUM INJEKTOR) DAPAT MENYEBABKAN PENYUMBATAN.

7

b.KATUP PUTARAN(LOOP VALVE): TIPE INJEKTOR INI UMUMNYA DIGUNAKAN UNTUK MENGINJEKSI VOLUME LEBIH BESAR DARI 10 U DAN DILAKUKAN

DENGAN CARA AUTOMATIS (DENGAN MENGGU NAKAN ADAPTOR YANG SESUAI, VOLUME YANG LEBIH KECIL DAPAT DIINJEKSIFAN SECARA MANUAL). PADA POSISI LOAD, SAMPEL DIISI KE DALAM LOOP PADA KINERJA ATMOSFIR, BILA VALVE DIFUNGSIKAN, MAKA SAMPEL AKAN MASUK KE DALAM KOLOM.

3.3 KOLOM

KOLOM ADALAH JANTUNG KROMATOGRAFI. BERHASIL ATAU GAGALNYA SUATU ANALISIS TERGANTUNG PADA PEMILIHAN KOLOM DAN

KONDISI PERCOBAAN YANG SESUAI. KOLOM DAPAT DIBAGI MENJADI DUA KELOMPOK:

a. KOLOM ANALITIK: DIAMETER DALAM 2-6 mm. PANJANG KOLOM TERGANTUNG PADA JENIS MATERIAL PENGISI KOLOM. UNTUK KEMASAN PELLICULAR, PANJANG YANG DIGUNAKAN

ADALAH 50-100 cm. UNTUK KEMASAN POROS MIKROPARTIKULAT, 10-30 mm. DEWASA INI ADA YANG 5 mm. b.KOLOM PREPARATIF : UMUMNYA MEMILIKI

DIAMETER 6 mm ATAU LEBIH BESAR DAN PANJANG KOLOM 25-100 mm. KOLOM UMUMNYA DIBUAT DARI STAINLESTEEL

8

DAN BIASANYA DIOPERASIKAN PADA TEMPERATUR KAMAR, TETAPI BISA JUGA DIGUNAKAN TEMPERATUR LEBIH TINGGI, TERUTAMA UNTUK KROMATOGRAFI PENUKAR ION DAN KROMATOGRAFI EKSKLUSI.

3.4 DETEKTOR

SUATU DETEKTOR DIBUTUHKAN UNTUK MENDETEKSI ADANYA KOMPONEN SAMPEL DI DALAM KOLOM (ANALISIS KUALITATIF) DAN MENGHITUNG KADAR (ANALISIS KUANTITATIF). DETEKTOR YANG BAIK MEMILIKI SENSITIVITAS YANG TINGGI, GANGGUAN (NOISE) YANG RENDAH, KISAR RESPONS LINIER YANG LUAS, DAN MEMBERI RESPONS UNTUK SEMUA TIPE

SENYAWA. KEPEKAAN YANG RENDAH TERHADAP ALIRAN DAN FLUKTUASI TEMPERATUR SANGAT DIINGINKAN, TETAPI TIDAK SELALU DAPAT DIPEROLEH. BEBE RAPA DETEKTOR YANG DIGUNAKAN PADA KCKT :

a. DETEKTOR UV

DETEKTOR INI SIFATNYA SPESIFIK, ARTINYA HANYA DAPAT DIGUNKAN UNTUK ZAT-ZAT YANG MENYERAP SINAR UV. PANJANG GELOMBANG SINAR UV 250-350 nm.

b. DETEKTOR FLOURESENSI

SAMPEL DIKENAI SINAR UV YANG SESUAI, MAKA ZAT INI AKAN BERFLUORESENSI.

9

INTENSITAS SINAR FLUOROSENSI INI AKAN SEBANDING DENGAN KADAR SAMPEL YANG DIAMATI.

c. DETEKTOR INDEKS REFRAKSI/BIAS

DETEKTOR INI BEKERJA ATAS DASAR PERBEDAAN INDEK BIAS/REFRAKSI SAMPEL DENGAN SOLVEN. SEMUA LARUTAN SUATU ZAT MEMPUNYAI INEKSBIAS YANG SPESIFIK, OLEH KARENA ITU DETEK TOR INI DAPAT DIGUNAKAN UNTUK HAMPIR SEMUA ZAT.

d. DETEKTOR KONDUKTIVITAS

DETEKTOR INI BEKERJA ATAS DASAR PERBEDAAN DAYA HANTAR LISTRIK.

3.5 RECORDER

HASIL PEMBACAAN DETEKTOR KEMUDIAN DIOLAH OLEH SUATU PROSESSOR KEMUDIAN DIKIRIM KE REKORDER. REKORDER AKAN MEMBUAT SUATU TAMPILAN : KROMATOGRAM. UNTUK KCKT DILENGKAPI SEPERANGKAT SOFTWARE YANG DAPAT MENGHITUNG LUAS KROMATOGRAM DAN BAHKAN SEKALIGUS MENGHITUNG KADARNYA.

10

4. PENGUKURAN VALIDASI :

PROSEDUR KERJA

1 PEMBUATAN LARUTAN STANDARa. STANDAR ALBENDAZOLEDITIMBANG SEBANYAK 25

mg, KEMUDIAN DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml DAN DILARUTKAN DENGAN ETANOL 95% HINGGA TANDA BATAS.

b. LARUTAN TERSEBUT DIKOCOK DALAM MAGNETIC STIRRER SELAMA 8 MENIT.

c. KEMUDIAN DIPIPET 1 ml, DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml, DAN DIENCERKAN DENGAN ETANOL 95% SAMPAI TANDA BATAS.

2 PEMBUATAN LARUTAN SAMPELa. SAMPEL WZB DIGERUS SAMPAI HALUS MENGGUNA

KAN LUMPANG DAN ALU.b. SAMPEL YANG TELAH HALUS DITIMBANG SEBA

NYAK 230 mg DAN DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml.

c. KEMUDIAN DILARUTKAN DENGAN ETANOL 95% HINGGA TANDA BATAS.

d. LARUTAN TERSEBUT DIKOCOK DALAM MAGNETIC STIRRER SELAMA 8 MENIT.

e. KEMUDIAN DIPIPET 1 ml, DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml, DAN DIENCERKAN DENGAN ETANOL 95% SAMPAI TANDA BATAS.

11

3 PENETAPAN SELEKTIVITASa. LARUTAN STANDAR DIBUAT SESUAI PROSEDUR

DIATASb. LARUTAN SAMPEL DIBUAT SESUAI PROSEDUR

DIATASc. ABSORBANSI LARUTAN STANDAR DIUKUR PADA

PANJANG GELOMBANG 295 nm SEBANYAK TUJUH KALI.

d. ABSORBANSI LARUTAN SAMPEL DIUKUR PADA PANJANG GELOMBANG 295 nm SEBANYAK TUJUH KALI.

e. PERHITUNGAN DILAKUKAN SECARA STATISTIKA. SELEKTIVITAS TERPENUHI JIKA F HITUNG < F TABEL.

4 PENETAPAN LINEARITAS

a. STANDAR ALBENDAZOLE DITIMBANG SEBANYAK 25 mg. DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml. DILARUTKAN DENGAN ETANOL 95% HINGGA TANDA BATAS (KONSENTRASI 500 mg/ml). PENGENCERAN DILAKUKAN HINGGA DIPEROLEH SATU SERI LARUTAN DENGAN KONSENTRASI 7, 8, 10, 12, 13 mg/ml.

b. SAMPEL WZB DITIMBANG SEBANYAK 230 mg. PENGENCERAN DILAKUKAN SEPERTI LANGKAH 1.

c. ABSOBANSI LARUTAN STANDAR DIUKUR PADA PANJANG GELOMBANG 295 nm MASING-MASING SEBANYAK TIGA KALI.

12

d. ABSOBANSI LARUTAN SAMPEL DIUKUR PADA PANJANG GELOMBANG 295 nm MASING-MASING SEBANYAK TIGA KALI.

e. KONSENTRASI DIHITUNG DAN DILAKUKAN PERHI TUNGAN KOEFISIAN KORELASI (R) SECARA STATIS TIKA. LINEARITAS TERPENUHI JIKA R = 0,999-1.

5 PENETAPAN BATAS DETEKSI INSTRUMEN, BATAS KUANTITASI, DAN RIPITABILITAS INSTRUMEN

a. LARUTAN STANDAR DIBUAT SESUAI PROSEDUR DIATAS, KEMUDIAN DILAKUKAN PENGENCERAN SAMPAI SEPULUH KALI.

b. ABSORBANSI LARUTAN STANDAR TERSEBUT DIUKUR SEBANYAK TUJUH KALI.

c. PERHITUNGAN DILAKUKAN SECARA STATISTIKA TERHADAP RESPON INSTRUMEN. INSTRUMEN DIKATAKAN REPEATABLE JIKA %RSD < 2.

6.PENETAPAN BATAS DETEKSI METODE, RIPITA BILITAS SAMPEL DAN RECOVERY

a. LARUTAN SAMPEL DIBUAT SESUAI PROSEDUR DIATAS.

b. LARUTAN SPIKEDSAMPLEDIBUAT DENGAN CARA MENIMBANG 230 mg SAMPEL WZB, DITAMBAH DENGAN 5 mg STANDAR ALBENDAZOLE. KEMUDIAN

13

c DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml, DAN DILARUTKAN DENGAN ETANOL 95% HINGGA TANDA BATAS.d.LARUTAN TERSEBUT DIPIPET 1 ml, DIMASUKKAN KE DALAM LABU UKUR 50 ml., KEMUDIAN DIENCERKAN DENGAN ETANOL 95% SAMPAI TANDA BATAS.e.ABSORBANSI LARUTAN SAMPEL DIUKUR PADA PANJANG GELOMBANG 295 nm MASING-MASING SEBANYAK TUJUH KALI.f.ABSORBANSI LARUTAN SPIKEDSAMPLE DIUKUR PADA PANJANG GELOMBANG 295 nm MASING-MASING SEBANYAK TUJUH KALI.g.PERHITUNGAN DILAKUKAN SECARA STATISTIKA. SAMPEL DINYATAKAN REPEATABLE JIKA C HITUNG

SPIKED SAMPLE BERADA PADA RENTANG BATAS ATAS DAN BATAS BAWAH. BATAS PENERI MAAN RECOVERY ADALAH 80% - 110%.