KROMATOGRAFIKROMATOGRAFI

WIWIN R KUNUSA S.Pd, M.SiWIWIN R KUNUSA S.Pd, M.Si

Kromatografi…………………Kromatografi…………………

• “CHROMA” dan “GRAPHEIN”

WARNA MENULIS

MICHAELTSWE (1960) AHLI BOTANI RUSIA

Penetapan Kadar (Analsis Kuantitatif)

Pemurnian suatu senyawa

(Keperluan preparatif)

Keperluan Identifikasi (Analisis Kualitatif)

KEGUNAANKROMATOGRAFI

A. Keperluan Identifikasi A. Keperluan Identifikasi (Analisis Kualitatif)(Analisis Kualitatif)

1.Mengungkapkan ada tidaknya senyawa tertentu dalam cuplikanContoh : pada KLT dilakukan dengan membandingkan senyawa murni dengan campuran

2. Memberi informasi mengenai kerumitan suatu campuran atau jumlah minimum komponen

3. Kemurnian suatu senyawa dapat dikaji

B. Penetapan Kadar B. Penetapan Kadar (Analisis Kuantitatif)(Analisis Kuantitatif)

• Berapa banyak komponen yang ada

• Penetapan kadar cuplikan

Contoh : secara rutin, (pengendalian mutu industri dan pemantauan lingkungan) serta kimia klinik

C. Pemurnian suatu senyawa C. Pemurnian suatu senyawa (Keperluan preparatif)(Keperluan preparatif)

• Untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah yang memadai dalam keadaan murni sehingga dapat dipakai untuk reaksi berikutnya

Metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel

diantara dua fasa yaitu fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobil phase)

PENGERTIAN KROMATOGRAFI

• FASA DIAM….. “ Dapat berupa padatan atau cairan yang terikat

pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben) yang berfungsi sebagai penyangga”

• FASA GERAK…..“ Dapat berupa cairan disebut eluen atau pelarut atau gas pembawa yang inert”

• Gerakan fasa gerak mengakibatkan terjadinya migrasi diferensial komponen-komponen dalam sampel

FASA DIAM :FASA DIAM :Merupakan fasa yang tidak bergerak. Merupakan fasa yang tidak bergerak. Umumnya senyawa yang digunakan adalah Umumnya senyawa yang digunakan adalah

silica gel (SiOsilica gel (SiO22) dan alumina (Al) dan alumina (Al22OO33).).

• FASA GERAK

• Merupakan fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen yang akan dipisahkan.

• Fasa gerak adalah suatu pelarut organik atau campuran beberapa pelarut organik.

• KROMATOGRAFI adalah :“ Suatu teknik/metode pemisahan fisik campuran komponen berdasarkan perbedaan migrasi dari masing-masing komponen pada fasa diam dibawah pengaruh fasa gerak”

DASAR KROMATOGRAFIDASAR KROMATOGRAFI

“ Pemisahan berdasarkan perbedaan laju perpindahan (migrasi) zat-zat yang menyusun suatu sampel”

MEKANISME SAMPEL ???

Kecenderungan molekul-molekulkomponen untuk bereaksi secara kimia

(penukar ion)

Kecenderungan molekul tereksklusi pada pori-pori fasa diam

Kecenderungan molekul komponen untuk melarut dalam cairan (fasa gerak)

Azas

partisi

Azas

partisi

Azas Pertukaran Ion

Azas Pertukaran Ion

Azas Size Exlusion

Azas Size Exlusion

SAMPEL

Azas Adsorpsi

Azas Adsorpsi

Kecenderungan molekul-molekul

Komponen untuk melekat pada

permukaan padatan halus

Keuntungan Pemisahan Menggunakan Keuntungan Pemisahan Menggunakan Metode KromatografiMetode Kromatografi

Sampel

semi mikro dan makro)

Cukup selektif

waktu yang relatif singkat

Murah dan sederhana

HASILHASIL

PERKEMBANGAN TEKNIK PERKEMBANGAN TEKNIK KROMATOGRAFIKROMATOGRAFI

• Tahun 1903,,Tswet,,

memisahkan pigmen dari hijau daun menggunakan CaCO3 (istilah kromatografi)

• Tahun 1967,,Huber,

memperkenalkan “Kromatografi cair Kinerja Tinggi (KCKT) “

KLASIFIKASI KLASIFIKASI KROMATOGRAFIKROMATOGRAFI

KLASIFIKASI KROMATOGRAFI

Klasifikasi Kromatografi Berdasarkan Fasa Gerak

Klasifikasi Kromatografi Berdasarkan Fasa Gerak

1. KROMATOGRAFI CAIR (Liquid Chromatography)

2. KROMATOGRAFI GAS (Gas Chromatography)

ZAT CAIR GAS

ZAT PADAT Kromatografi cair-padat (KCP)

Kromatografi Gas - Padat (KGP)

ZAT CAIR Kromatografi cair-Cair (KCC)

Kromatografi Gas – cair (KGC)

FASA GERAK

FASA

DIAM

TEKNIK ANALISIS

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi KolomKromatografi Kolom

Kromatografi Cair ( HPLC)

Kromatografi Cair ( HPLC)

Kromatografi Gas(GC)

Kromatografi Gas(GC)

Kromatografi Superkritik (SFC)

Kromatografi Superkritik (SFC)

Kromatografi Kertas

Kromatografi Berdasarkan Bentuk Kromatografi Berdasarkan Bentuk TempatTempat

1. Komatografi Kolom : Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan di mana tempat stasioner dalam tabung.

2. Kromatografi Planar yaitu kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis

Gas ChromatographyDigunakan untuk menentukan komposisi kimia zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh tiap-tiap puncak dalam grafik di bawah ini.

Paper ChromatographyDapat digunakan untuk memisahkan komponen-komponen tinta, pewarna, senyawa tumbuhan (klorofil), make-up, dan banyak zat lain

Liquid Chromatographydigunakan untuk identifikasi pigmen tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer ChromatographyMenggunakan lapisan tipis atau gelas kaca untuk memisahkan komponen kimia dan bahan lainnya

Contoh Chromatography

KROMATOGRAFI PENUKAR ION(Kromatografi Cairan-Padatan)

KROMATOGRAFI EKSKLUSI(Kromatografi Cairan Padatan)

KROMATOGRAFI PARTISI(Kromatografi Cair-cair)

KROMATOGRAFI ADSORPSI(Kromatografi Cair - padat)

BERDASARKANBERDASARKAN MEKANISME PEMISAHANMEKANISME PEMISAHAN

BERDASARKANBERDASARKAN MEKANISME PEMISAHANMEKANISME PEMISAHAN

A.A. KROMATOGRAFI ADSORPSIKROMATOGRAFI ADSORPSI(Kromatografi Cair – Padat)(Kromatografi Cair – Padat)

Fasa diam berupa Fasa diam berupa padatan dan fasa padatan dan fasa gerak berupa cairan gerak berupa cairan atau gasatau gas

Zat terlarut Zat terlarut diadsorpsi oleh diadsorpsi oleh permukaan permukaan partikel padatanpartikel padatan

Contoh :Contoh : KLT)KLT)

Proses AdsorpsiProses Adsorpsi• Adsorpsi adalah penyerapan pada

permukaan dan bukan penyerapan secara keseluruhan

• Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol dan penarikan yang diinduksi oleh dipol-dipol

• Contoh : silika gel adanya gugus Si-O-Si dan Si-OH

Mekanisme….Mekanisme….• Kepolaran zat/analit yang dipisahkan terhadap

fasa diam mempengaruhi kecepatan laju analit melalui permukaan fasa diam dalam kolom

• Solut akan bersaing dengan fasa gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan adsorben

• Solut-solut polar, akan terikat kuat pada adsorben karenanya butuh fasa gerak yang cukup polar untuk mengelusinya

• Urutan polaritas solut-solut organik : alkana<alkena<alkena<aromatis<eter<ester<keton dan aldehid<tiol<amin dan amida<alkohol<fenol<asam-asam organik

Adsorpsi solut oleh fasa diam atw Adsorpsi solut oleh fasa diam atw adsorben sangat tergantung pada :adsorben sangat tergantung pada :

1. Struktur kimia solut atau gugus kimia aktif yg dapat berinteraksi dengan solut

2. Ukuran partikel adsorben3. Kelarutan solut pada fasa gerak. Solut

yang semakin mudah larut dalam fasa gerak akan semakin mudah lepas dari fasa diam

Kekurangan Metode KCPKekurangan Metode KCP

• Pilihan fasa diam terbatas

(Alumina, Selulosa, Silika gel, Karbon aktif, Magnesium silikat, resin2 polimerik)

• Koefisien distribusi untuk serapan seringkali tergantung pada kadar total, sehingga pemisahannya kurang sempurna

KROMATOGRAFI PARTISIKROMATOGRAFI PARTISI(Kromatografi Cair-Cair)(Kromatografi Cair-Cair)

Zat terlarut akan akan terdistribusi ke dalam dua pelarut yang tidak Saling bercampur

Fasa diam berupa cairanFasa gerak berupa zat cair atau gas

Contoh :

Kromatografi Kertas

Proses PartisiProses Partisi

• Partisi merupakan proses yang analog dengan ekstraksi pelarut

• Fasa diam cair diikatkan pada padatan lapis tipis yang lemban (inert)

• Fase diam berada dalam kolom disebut kromatografi kolom

Keuntungan Metode PartisiKeuntungan Metode Partisi(Kromatografi cair-cair)(Kromatografi cair-cair)

• Pilihan kombinasi cairan cukup banyak

• Koefisien distribusinya tidak tergantung pada konsentrasi, sehingga hasil-hasil pemisahannya lebih tajam.

KROMATOGRAFI PENUKAR IONKROMATOGRAFI PENUKAR ION(Kromatografi Cair-Padat)(Kromatografi Cair-Padat)

Fasa Diam berupa padatan polimer (resin organik) dg gugus2 tetapFasa gerak berupa cairan

Mekanisme pemisahan berdasarkan Kesetimbangan pertukaran ion

Contoh : proses pembuatanAir minum

Mekanisme PemisahanMekanisme Pemisahan

• Metode ini kebanyakan digunakan pada pemisahan bahan-bahan anorganik,baik anion2 atau kation2, dan pemisahan asam-asam amino

• Pemisahan terjadi karena pertukaran ion-ion dalam fasa diam

• Solut-solut ion dalam fasa gerak dapat bertukar dengan ion-ion yang bermuatan sama pada fasa diam

• Mekanisme pemisahan didasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resin

1.Resin penukar kation1.Resin penukar kationasam kuat mengandung gugus fungsi asam asam kuat mengandung gugus fungsi asam teradisi pada cincin aromatik dr resin. Penukar teradisi pada cincin aromatik dr resin. Penukar kation mengandung gugus asam sulfonat kation mengandung gugus asam sulfonat (-SO(-SO33H)H)

2.Resin penukar Anion :

Prinsipnya anion hidroksil ditukarkan dgn anion lain.

Jenis resin memiliki gugus basa kuat dan basa lemah

PERTUKARAN ION

KROMATOGRAFi EKSKLUSIKROMATOGRAFi EKSKLUSI1. Teknik pemisahan

didasarkan atas ukuran molekul zat

terlarut

2. Molekul-molekul zat terlarut

dengan ukuran lebih besar dari pori-pori fasa diam akan

tertahan

Contoh : Kromatografi filtrasi gel

Mekanisme PemisahanMekanisme Pemisahan

• Pemisahan didasarkan atas ukuran molekul dari fasa diam, berupa (penyaring molekul) suatu gel dengan permukaan berpori kecil yang inert.

• Fasa gerak : cairan

• Kromatografi ini dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul.

BENTUK MOLEKUL FASA DIAM GEL

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

TEORI DASAR KROMATOGRAFI

Beberapa Pengertian UmumBeberapa Pengertian Umum Pada Kromatografi Pada Kromatografi

• Koefisien Distribusi• Migrasi dan Retensi Solut• Waktu Retensi (tg)• Volume Retensi (VR)• Faktor kapasitas (k’)• Faktor selektifitas• Bentuk pita dan pelebaran pita• Teori Plat• Difusi Eddy

KOEFISIEN DISTRIBUSIKOEFISIEN DISTRIBUSI

• Distribusi dari molekul-molekul sampel diantara dua fase ditentukan oleh tetapan kesetimbangan yang dikenal “Koefisien Distribusi”

K = koefisien partisiCs =konsentrasi sampel dalam fase diamCm = konsentrasi sampel dalam fase gerak

m

s

C

CK

LAJU MIGRASI KOMPONENLAJU MIGRASI KOMPONEN

• Keefektifan proses kromatografi dlm memisahkan campuran tergantung pada laju migrasi komponen dalam koefisien distribusi dua fasa

m

s

V

VK

uk

uikomponenlajuMigras

1

1

1

11

Laju Migrasi ditentukan oleh : Laju Migrasi ditentukan oleh :

1.Kecepatan fasa gerak

2.Perbandingan volum fasa diam dan fasa gerak

3.Koefisien distribusi

Waktu Retensi (tWaktu Retensi (tRR))

Merupakan waktu yang diperlukan solut Merupakan waktu yang diperlukan solut untuk keluar dari kolom dan mencapai untuk keluar dari kolom dan mencapai detektordetektor

Volum Retensi (VR)Merupakan volum fasa gerak yang diperlukan untuk mengelusi komponen sampel keluar kolom

Volum = Waktu x Laju AlirV = tg x F

t = L/laju migrasi = L/u( 1 + K’) = tM(1 + K’)

Faktor Kapasitas(kFaktor Kapasitas(k’’))

• Menggambarkan laju migrasi komponen didalam kolom

• Kapasitas(k’) perbandingan mol solut didalam fasa diam terhadap mol solut didalam fasa gerak

m

s

mm

ss

V

VK

CC

VCk '

Faktor Selektivitas (Faktor Selektivitas (αα))

• Faktor yang merupakan ukuran bagi distribusi relatif komponen diantara fasa diam dan fasa gerak

A

B

K

K

Bentuk Pita dan Pelebaran PitaBentuk Pita dan Pelebaran Pita

• Pada kromatografi ideal, bentuk pita (puncak) kromatogram yang diperoleh berupa puncak-puncak yang sangat sempit, terpisah satu sama lain

• Pelebaran pita diperoleh sebagai hasil penjumlahan gerakan acak sejumlah besar partikel2 solut pada saat bergerak sepanjang kolom

Resolusi (R)

• Merupakan ukuran apakah seuatu senyawa terpisah secara baik atau tidak dengan senyawa lain

KROMATOGRAFI KROMATOGRAFI KOLOMKOLOM

Kromatografi KolomKromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.

Prinsip Kerja Prinsip Kerja • Didasarkan pada absorbsi komponen2

campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam.

• Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom.

• Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.

Tujuan …Tujuan …

• Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen sampel dari campurannya.

Cara Penggunaan Cara Penggunaan Kromatografi KolomKromatografi Kolom

1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben (bahan penyerap).

2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom.

3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu macam komponen.

4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.

• Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal.

• Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.

Rangkaian Alat KolomRangkaian Alat Kolom

Pembentukan pita Pembentukan pita

KROMATOGRAFI GASKROMATOGRAFI GAS

Dasar Pemisahan (GC)Dasar Pemisahan (GC)

“ Penyebaran cuplikan diantara dua fasa”

Kromatografi GasKromatografi GasKromatografi gas adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen- komponennya dengan menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam.

Kromatografi Gas adalah teknik untuk memisahkan senyawa atsiri dalam fase gas melalui fase diam.

• Bila fase diam berupa zat padat, kita sebut cara itu sebagai kromatografi gas-padat.

• Bila fase diam berupa zat cair, kita sebut cara itu sebagai kromatografi gas-cair.

Syarat cuplikan:> harus memiliki keatsirian yang cukup (Volatil)> stabil terhadap panas.

Bagian dasar kromatografi gas :1. Sistem gas pembawa2. Sistem pemasukan cuplikan3. Sistem pemanasan kolom4. Kolom5. Sistem deteksi6. Sistem pengolah data

Prinsip Kerja Prinsip Kerja Kromatografi GasKromatografi Gas

• Gas pembawa (biasanya menggunakan helium, argon / nitrogen) dengan tekanan tertentun dialirkan secara konstan melalui kolom yang berisi fase diam.

• Komponen sampel akan terabsorbsi oleh fase dim dengan kecepatan berbeda.

Gambar Kromatografi Gambar Kromatografi gasgas

Colom GCColom GC

Prinsip Kromatografi GasPrinsip Kromatografi Gas

Cara Penggunaan Cara Penggunaan Krromatografi GasKrromatografi Gas

1. Sampel diinjeksikan ke injektor yang suhunya telah diatur.

2. Setelah sampel menjadi uap, akan dibawa oleh aliran gas pembawa menuju kolom.

3. Sehingga komponen akan terabsorbsi oleh fase diam sampai terjadi pemisahan.

4. Komponen yang terpisah menuju detektor akan menghasilkan sinyal listrik yang besarnya proporsional.

5. Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.6. Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa

puncak.

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI = HPLCTINGGI = HPLC

(High Performance Liquid (High Performance Liquid ChromatogrphyChromatogrphy

Fasa Terbalik/SungsangFasa Terbalik/Sungsang(Reversed Phase)(Reversed Phase)

• Fasa Diam Polar

• Fasa Diam Non-Polar

• Prinsip Dasar :

Perbedaan hidrofobisitas dari analit-analit yang dipisahkan pada sistem kesetimbangan fasa diam dan fasa gerak

Normal Phase

Reversed phase