KROMATOGRAFI LAPIS TIPISKromatografi Lapis TipisKromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini.Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatanperambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akanmelarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fasediam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akanbergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan,atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalamcampuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda Proseskromatografi juga digunakan dalam metode pemisahan komponen gula dari komponennon gula dan abu dalam tetes menjadi fraksi-fraksi terpisah yang diakibatkanolehperbedaan adsorpsi, difusi dan eksklusi komponen gula dan non gula tersebutterhadap adsorbent dan eluent yang digunakan. (Sudjadi, 2007).

FASE DIAMPelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silica (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinarultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silica kemudian digunakan serupa untuk alumina. (Hendayana, 2010).

FASE GERAK Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal iniyang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika). (Hendayana, 2010).Peralatan Teknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca, lembaran aluminium, atau fiberglass. Khusus jika kertas yang digunakan, maka kertas berfungsi ganda, yaitu sebagai pelat sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas merupakan selulosa yang dapat menyerap eluen sehingga sistem yang terjadi adalah partisi. Meskipun demikian peristiwa adsorpsi juga terjadi pada kromatografi kertas. Jenis kertas yang digunakan pada umumnya adalah kertas Whatman No.4, 54, 540, 31, dan No.17, atau jenis kertas lainnya yang semacam. Perlu diketahui bahwa kerapatan dan ketebalan kertas akan berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. Ukuran kertas yang umum digunakan adalah 20 x 20 cm atau 10 x 20 cm. Pada kromatografi lapis tipis, bahan penyangga dilapiskan pada pelat kaca, logam, atau fiberglass. Bahan penyangga dapat berupa oksida, oksida hidrat atau bentuk garam. Sebagai bahan penyangga yang populer digunakan pada kromatografi lapis tipis adalah golongan aluminium oksida, gel silika, kieselguhr, dan selulosa. Cara preparasinya adalah mula-mula dengan membuat sluri yaitu mencampur bahan penyangga dengan aquades. Setelah itu dengan alat khusus sluri dilapiskan pada permukaan pelat sehingga mempunyai ketebalan yang sama. Sebelum digunakan lapis tipis harus dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 120C selama 60 menit untuk aktivasi. Kini telah banyak lapis tipis yang diperjual belikan dalam keadaan siap untuk digunakan, baik yang dilapiskan pada pelat kaca, aluminium mau pun fiberglass. [1]Gerakan dan pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen) yang diguriakan. Eluen dapat terdiri atas satu macam pelarut atau campuran dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak campuran pelarut akan sulit menjenuhkan lingkungan pelat. Juga perlu diingat bahwa campuran pelarut harus saling tidak melarutkan atau bersifat immisibel, tetapi sampel harus mempunyai kelarutan yang tinggi pada eluen. Eluen yang mudah menguap dan tidak meninggalkan noda pada kertas pada umumnya lebih baik digunakan. [1]Contoh beberapa pelarut yang sering digunakan pada kromatografi kertas dan lapis tipis adalah: 1. Untuk pemisahan asam amino digunakan pelarut campuran fenol dan air (larutan jenuh), campuran n-butanol, asam cuka dan air (4: 1 :5 atau 12:3:5), campuran n-butanol, piridin dan air (1:1:1).2. Untuk pemisahan golongan karbohidrat digunakan pelarut campuran dan etilasetat, piridin, dan air (2 : 1 :2), campuran etilasetat, propanol dan air (6: 1:3), campuran etilasetat, asam cuka dan air (3:1:3).3. Untuk pemisahan asam lemak digunakan campuran n-butanol dan larutan 1,5M ammonia (larutan jenuh). [1]

Pemuatan Sampel Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau lapis tipis harus dibuat larutan dahulu. Larutan sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada salah satu tepinya dengan jarak kurang lebih 2,5cm dan tepi. Tetesan sampel diusahakan sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa kapiler, pipet mikro, atau siring (spet, jarum suntik berukuran mikro). Sebelum dielusi tetesan sampel dikering anginkan, jika perlu dapat dikerjakan dengan menghembuskan udara dengan kipas angin atau alat pengering rambut (hair drier). Yang perlu dijaga adalah selama pengeringan tidak terjadi perubahan sifat sampel, oleh karena itu sebaiknya pengeringan dilakukan pada suhu kamar. [1]

Teknik Elusi (Pengembangan) Ada tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan secara ascending, descending, dan radial atau horizontal. Teknik ascending merupakan cara yang paling sederhana. Kertas atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 2,5cm dicelupkan pada eluen yang ditempatkan di dalam bejana. Eluen akan meresap pada kertas atau bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang dikehendaki. Teknik descending merupakan kebalikan dari teknik ascending. Eluen dialirkan dari tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen akan bergerak mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan penyangga secara perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki. Jika dibanding dengan teknik ascending, maka teknik descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor gravitasi berpengaruh pada kecepatan aliran eluen dan gerakan komponen yang memisah. Ada satu hal yang perlu mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas ke bawah. ini dapat ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas saring yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen. Pada teknik radial atau horizontal, sampel diteteskan di sekitar pusat kertas atau lapis tipis. Eluen dialirkan tepat melalui tengah-tengah kertas sehingga peresapan atau gerakan eluen akan menyebar ke arah radial. [1]

Ada pun metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode satu arah (one way direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda satu arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel dimuatkan. Sedangkan pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau lapis tipis (lihat gambar). [1]

Pengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan kaca sepaya tampak dan luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam tangki akan jenuh dengan uap eluen. Kejenuhan ruangan termasuk faktor keberhasilan pemisahan. [1]

Visualisasi Hasil Setelah perrnukaan eluen mencapai batas yang ditentukan, kertas atau lapis tipis diambil (diangkat) dan dikeluarkan dari dalam tangki, kemudian dikeringkan pada suhu kamar sampai semua eluen menguap. Tempat komponen yang memisah dapat diketahui dengan visualisasi. Ada beberapa teknik visualisasi yang dapat dikerjakan tergantung pada jenis dan sifat komponen yang dipisahkan. Visualisasi secara fisik dapat dilakukan dengan sinar ultra violet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi. Visualisasi dengan penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya warna pada komponen. Aflatoksin misalnya akan tampak bersinar putih kehijauan dengan sinar ultra violet. Visualisasi dapat pula secara kimiawi yang dapat dilakukan dengan nyemprotkan suatu larutan atau senyawa yang dapat mengadakan reaksi dengan komponen sehingga timbul wama. Kombinasi visualisasi secara kimiawi dan secara fisik sering kali juga dilakukan, misalnya pada suhu 100oC, maka warna ungu akan timbul. [2]Tabel 3. Reagent kromogenat untuk visualisasi kromatogram pada teknik kromatografi kertas dan lapis tipis

Interpretasi Secara kualitataif dapat dilakukan dengan menghitung faktor retardasinya. R diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak tempuh larutan pengelusi pada kertas atau lapis tipis, yaitu:

Untuk mengetahui jenis komponen yang memisah, Rf sampel dicocokan gan Rf standar yang dielusi dengan cara yang sama. Interpretasi secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui jumlah masing- masing komponen yang memisah. Hal ini dapat dilakukan dengan mengukur atau menghitung luas noda yang terbentuk, menimbang potongan masing- masing noda, menganalisis potongan noda secara kimiawi. [3]

Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf: Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas. Struktur kimia dari senyawa dipisahkan. Kerapan dari satu pasang penyerap. Pelarut (derajat kemurnian) fase bergerak.Syarat-syarat pelarut yang diinginkan dalam KLT : Pelarut yang digunakan tergantung pada sifat zat yang akan dianalisa. Yang polar akan larut pada pelarut polar. Untuk komponen yang lebih polar.Keuntungan KLT : Waktu relatif singkat Menggunakan inestasi yang kecil. Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat. Jumlah cuplikan yang dengan sedikit. Kebutuhaan ruang minimum. Penanganan sederhana. Zat yang bersifat asam/basa kuat dapat dipisahkan dengan KLT.Kelemahan KLT : Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocok dengan pada kromatografi kolom dan noda yang terbetuk belum tentu senyawa murni. [3]

PrinsipKromatografi lapis tipis merupakan penerapan dari kromatografi adsorpsi. Sampel ditotolkan pada pelat TLC, kemudian dikembangkan dalam sebuah bejana pengembang. Eluen bergerak ke atas karena aktivitas kapiler. TLC dapat memberikan informasi mengenai berapa banyak komponen yang terdapat dalam suatu campuran dan juga untuk tujuan identifikasi. Pemilihan adsorben, pelarut, eluen dan pemahaman teori yang mendasari TLC harus dipahami untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik. KLT digunakan secara luas untuk analisis solu-solut organic terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis forensik, baik untuk analisis kualitatif dengan cara membandingkan nilai Rf solute dengan nilai Rf senyawa baku atau untuk analisis kualitatif. Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat. (Rohman, 2009).

Daftar PustakaHendayana, Sumar. 2010. Kimia Pemisahan. Penerbit Rosda. BandungRohman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu. YogyakartaSudjadi. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. YogyakartaRoy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB.Bandung.[1] http://www.unej.ac.id/fakultas/mipa/jid/vol5no1/yahya.pdf[2]http://www.siafif.com/kuliah/sukma/semester%208/SKRIPSI%20KAKAK%20TINGKAT/lumut222/paper-kromatografi-lapis-tipis.pdf [3] http://digilib.its.ac.id/public/ITS-Undergraduate-16544-2407100609-Chapter1.pdf