KORELASI ANTARA AKTMTAS ENZIM GSH-Px DAN SERAP­AN RADIOSELENIUM DALAM DARAH

Bintara Her Sasangka*

ABSTRAK - ABSTRACT

KORELASI ANTARA AKTIVITAS ENZIM GSH-Px DAN SERAPAN RADIOSELE­NlUM DALAM DARAH. Percobaan untuk mengetahui kordasi antara aktivitas enzim GSH-Pxdengan serapan radiOlldenium dalam darah tdah dilakukan. Sampc:l yang digunakan di dalampenc:litian ini berupa darah dari gO ekor sapi perah dengan berbagai kondisi tubuh. Pengambilandarah dilakukan dengan menggunakan vacutainer ~ (Becton, Dickson) yang mengandungEDTA sebagai antikoagulan. Pengukuran aktivitas enzim GSH-Px dilakukan pada temperatur

rendah ~ - g0C), kemudian diikuti dengan pengukuran serapan radiosdenium de'ngan menggu­nakan 7 Se (18 muCi/g ml sampc:l) yang diinkubasi sdama g jam. Hasi! penc:litian menunjuk­lean adanya kordasi yang negatif antara aktivitas GSH-Px dan nilai serapan radiOlldenium(r·0,91).

CORRELATION BE1WEEN GSH-Px ~C-:gvITY. AND UPTAKE OF RADIOSELE­NIUM IN BLOOD. An experiment to study the correlation between GSH-Px activity anduptake of radiOlldenium in bovine blood has been carried out. Sampds used in this experimentwere from gO herds of cattle blood, of different condition. Blood was collected by vacutainertubes (Becton, Dickson) contained EDTA as anticoagulant. Detection of GSH-Px was assayedat low temperatures (2 - g0C), and followed by radiOldenium uptake using 75Se (18 muCi{g ml sample), after g hours being incubated. The result of this experiment showed a negativecorrdation (r = 0.91) between GSH-Px activity and the uptake of radioSdenium.

PENDAHULUAN

Pada tahun 1957, SCHWARTZ (1) te1ah membuktikan bahwa selenium mem­pakan nutritional factor yang esensial untuk mencegah terjadinya kematian se1-selhati pada tikus. Necrosis pada hati tikus dapat dicegah dengan pemberian 0,1 ppmSe dalam ransumnya.

Ternak sapi clan domba yang memakan rumput pada tanah-tanah yang kan­

dungan seleniumnya (Se) rendah, sering teIjadi muscular dystrophy dan whitemuscle ~ (2). Pemberian Se dalam dosis yang tepat di dalam ransumnya dapatmencegah timbulnya gejala-geja1a tersebut.

Beberapa kasus timbulnya retained placenta pada sapi-sapi yang baru melahir­kan diduga akibat kandungan Se di dalam ransumnya kurang (3). Penelitian yangtelah dilakukan pada beberapa hewan menunjukkan bahwa Se merupakan unsuryang penting di dalam sistem enzim glutathione peroxidase (GSH-Px).

* Pusat Aplikasi Isotop clan Radiasi, BATAN

619

Aktivitas GSH-Px ••

Pemeriksaan nilai aktivitas enzim GSH-Px pada temak yang di duga mengalamideflsiensi Se merupakan salah satu cara yang banyak dipakai di beberapa negara (4).

WRIGHT dan BELL (5) dengan menggunakan teknilc radioisotop, telah melalculcanpene1itian pada domba yang diberi makan berbagai tingkat konsentrasi ·Se. Hasilpercobaan dfiaporkan bahwa pada domba yang diberi makan dengan konsentrasiSe tinggi, nilai serapan radioselenium di dalam darah lebih rendah bila dibandingkanyang diberi makan dengan konsentrasi Se rendah.

Berdasarkan data terse but diatas, maka dalam penelitian ini akan diamatisejauh mana hubungan/korelasi antara aktivitas enzim GSH-Px dengan nilai serapradioselenium di dalam darah.

TATA KERJA

Dalarn penelitian ini digunakan sarnpel darah sapi perah yang diperoleh daripara 'peternak disekitar Ithaca, New York, dengan berbagai macam kondisi tubuh.Dengan menggunakan vacutainer tubes (Becton, Dickson) yang mengandung EDTAsebagai antikoagulan, darah diambil melalui vina jugularis baik pada sapi-sapi yangnormal, maupun yang diduga mengalami deflsiensi Se. Tabung-tabung yang telahberisi darah kemudian disimpan ditempat yang dingin (2 - 3°C) dengan maksuduntuk mencegah terjadinya kerusakkan/hemolisis selarna pengangkutan dari lapanganke laboratorium.

Penyiapan Sampel Untuk Analisis Aktivitas EnzimGSH-Px. Analisis aktivitasenzim GSH-Px di dalam darah dilakukan berdasarkan metode PAGLIA dan VA·

LENTINE (6) yang telah dimodiflkasikan. Dalam penelitian ini pencucian sel darahmerah untuk menghilangkan plasma tidak dilakukan karena kandungan GSH-Pxdi dalam plasma sangat rendah.

Darah yang akan dianalisis dibuat lisat terlebih dahulu yaitu dengan cara men­carnpurkan 0,2 ml darah dengan 0,8 ml air suling. Untuk mengubah hemoglobinmenjadi cyanometglobin, lisat tersebut ditambah dengan 1 ml larutan Drabkin.Sejumlah 20 ul hemolisat tersebut selanjutnya ditarnbahkan dengan 2,35 ml carn­puran ·reagen di dalam cuvet berukuran 1,0 x 1,0 em. Campuran reagen tersebutterdiri dari : 300 mIl M KP04 buffer (pH 7),60 m1 0,25 M EDTA, 30 ul 0,2 MNa azida, 60 ul 0,05 M GSH dan 1,9 ml H202' Selanjutnya cuvet yang telah berisihemolisate dan campuran reagen tersebut, ditambahkan 0,3 ml 2mM NADPH,

0,3 ml GR (10 unit/ml) dan 30 ul 25 mM H202'Oleh karena reagen-reagen tersebut sangat peka terhadap perubahan tempera­

tur, maka selama persiapan sampel dan reagen, dan selama pembacaan, sampel danreagen harus diletakkan pada tempat yang dingin (ice bath).

Dengan menggunakan spektrofotometer (Backman) kerapan optik (KO)dihitung pada panjang gelombang 340 nm. Selanjutnya dihitung pula konsentrasihaemoglobin (Hb) dalam darah dengan menggunakan panjang gelombang 540 nm.Aktivitas enzim GSH-Px dalarn darah dihitung dengan rurnus sebagai berikut :

Pi KO NADPH x 24.000Konsentrasi Hb dalam darah

620

Pemapan Sampel Untuk Serapan Rildioselenium Dalam Darah. Dengan meng­gunakan sampel yang sarna, serapan radioselenium dalam darah dihitung denganmenggunakan metode WRIGHT dan BELL (5). Sejurnlah 3 ml sampel darah (wholeblood), diinkubasi dengan 18 muCi radioselenium eSSe) dalam bentuk sodiumselenit selama 3 jam. Pada akhir inkubasi sejurnlah 500 ul darah terse but dipipetkanke dalam 2 tabung. Salah satu dari tabung tersebut darahnya dicuci dengan 2 mllarutan garam siologis sebanyak 2 kali, sedang tabung yang lain tidak mengalamipencucian dan diperlakukan sebagai standar. Sampel-sampel tersebut selanjutnyadicegah dengan menggunakan alat pencacah gamma. Denganmenggunakan alatmicro haemotocryt centrifuge, dihitung pula persentase Packed Cell ~ (pCY)untuk masing-masing sampel. Nilai serapan radioselenium dalam darah dihitungdengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Nilai serapan =

Cacahan sampel/satuan waktu x 0,4

PVC satp.pel

Cacahan standar/satuan waktux 100 %

HASIL DAN PEMBAHASAN

Studi pendahuluan tentang pengukuran aktivitas enzim GSH-Px di dalamdarah, menunjukkan bahwa sam pel darah yang berumur 1 - 7 hari tidak menun­jukkan adanya perubahan di dalam aktivitasnya, akan tetapi setelah darah tersebutberumur 7 hari aktivitas GSH-Pxnya menurun. Penyimpanan darah dalam tempera­tur dingin (2 - 30C) aktivitas enzim tetap konstan dalam waktu yang cukup lama,yaitu sekitar 3 minggu (7). Sebaliknya nilai serap radioselenium di dalam darahakan meningkat dengan bertambahnya umur sampel. Pada umur 1 - 5 hari, nilaiserapan tidak menunjukkan adanya perbedaan, akan tetapi mulai hari ke 6 nilaiserap cenderung meningkat.

Hasil analisis GSH-Px dalam darah sapi yang barn melahirkan dan mengalamiretained placenta, aktivitas enzim GSH-Px mempunyai nilai yang rendah, begitujuga pada sapi-sapi yang menunjukkan adanya gejala-gejala defisiensi Se. Pad a sapi­sapi dengan kondisi tubuh yang normal nUai aktivitas GSH-Px relatif tinggi. Sapi­sapi yang mempunyai nilai aktivitas GSH-Px di atas 30 EU/g Hb tidak menunjuk­kan adanya gejala klinis. Sedang sapi yang mempunyai nilai GSH-Px di bawah20 EU/g Hb mulai terlihat adanya gejala klinis.Penelitian yang dilakukan oleh WILSON et al (8) pada domba dan sapi ada hubung­

an yang positif antara konsentrasi Se di dalam darah dengan nilai aktivitas en~im

GSH-Px. Adanya hubungan antara Se dengan aktivitas GSH-Px, beberapa penelitimenduga bahwa Se merupakan komponen yang penting bagi enzim GSH-Px.Enzim GSH-Px selain terdapat di dalam darah, juga terdapat pada jaringan laindengan konsentrasi· yang berbeda. Berdasarkan hal terse but beberapa peneliti telahmemanfaatkan hubungan terse but untuk medeteksi hewan ternak apakah mengalamideflSiensi Se atau tidak, yaitu dengan cara mengukur aktivitas enzim GSH-Px didalam jaringan (4, 7,8,9).

621

Data yang diperoleh dalam penelitian ini terlihat adanya nilai serapan radio­selenium yang berbeda antara hewan yang satu dengan lainnYa. Perbedaan tersebut

sesuai dengan gejala klinis yang tampak Ji lapangan. Hewan yang terlihat normal dilapangan, nilai serapan radioseleniumnya lebih rendah dari pada yang menunjukkantanda-tanda klinis. Nilai serapan rendah pada hewan yang normal, kemungkinandisebabkan kandungan Se di dalam darah cukup, sehingga pada waktu darahdiinkubasi dengan radioselenium selama 3 jam, sel darah merahnya banya mampumenangkap Se aktif dalam jumlah sedikit. Sebaliknya pada hewan yang menunjuk­kan adanya gejala klinis, kandungan Se di dalam darah rendah, sehingga pada waktudarah tersebut diinkubasi dengan radioselenium, sel-sel darah merahnya akanmenangkap Se aktif dalam jumlah yang lebih banyak. Hipotesis tersebut didasarkanpada basil penelitian pada domba yang diberi ransum dengan berbagai tingkatkandungan Se. Domba yang diberi ransum dengan kandungan Se tinggi, nilai serap­an radioseleniumnya di dalam darah rendah, sebaliknya domba yang diberi ransumdengan kandungan Se rendah, nilai serapan radioseleniumnya tinggi (5) .

. Hasil perhitungan kedua macam data (aktivitas. GSH-Px dan nilai serapanradioselenium) mempunyai korelasi yang negatif, yaitu nilai r = -0,91 (Grafik 1).Sapi-sapi yang tidak menunjukkan gejala k1inis deflSiensi Se (normal), nilai aktivitasenzim GSH-Px nya tinggi, dan nilai serapan radioseleniumnya di dalam darahrendah. Sebaliknya sapi yang menunjukkan tanda-tanda klinis defisiensi So, aktivi­tas enzim GSH-Px rendah dan nilai serapan radioseleniumnya tinggi.

Meskipun dalam penelitian ini tidak dilakukan pengukuran tingkat konsentrasiSe dalam darah, tetapi adanya unsUr Se di dalam darah sangat penting dalam sistemenzim GSH-Px, begitu pula dengan nilai sera pan radioseleniumnya. Hasil penelitianyang dilakukan oleh SCHOLZ (10) pada sapi perah menunjukkan bahwa nilaikonsentrasi Se dalam darah sangat erat hubungannya dengan aktivitas enzim GSH­Px. Makin tinggi konsentrasi Se dalam darah makin tinggi pula aktivitas enzim GSH­Px-nya (r = 0,958).

KESIMPULAN

Beberapa kesimpulan yang dapat diperoleh dari basil penelitian ini antara lain:

1. Nilai aktivitas enzim GSH-Px dalam darah mempunyai korelasi linier negatifdengan serapan radioselenium dalam darah.

2. Seperti balnya dengan metode penentuan aktivitas GSH-Px yang telah dapat

digunakan untuk mendeteksi defisiensi Se pada hewan, maka diharapkanmetode serapan radioselenium dapat digunakanpula untuk mcndeteksi Sedalam darah.

UCAP AN TERIMA KASm

Penulis mengucapkan terima kasih kepada BATAN yang telah memberi izintraining di Amerika, dalam rangka bantuan teknik lAEA.

622

DAFTAR PUSTAKA

1. SCHWARTZ, K., and FOLTZ, CM., Selenium as an integral part of factor 3against dietary necrotic liver degeneration, J. Am. Chern. Soc. 79 (1957)3292.

2. METZLER. DE., Biochemistry, The Chemical Reoction of Living Cells, Acade­mic Press, New York (1977).

3. JULIEN, W.E., CONRAD, H.R., and MOXON, A.L., Selenium and vitamin E

and incidence of retained placenta in parturient dairy cows. II. Preven­tion in commercial herds with prepartum treatment, J. of Dairy Science59 11 (1976) 1960.

4. SEGAL, HJ., SIEGEL, DM., NORMAN, B.B., and OLIVER, M.N., "A rapidscreening blood spot test for selenium responsive desease in cattle", Cali­fornia Veterinarian, Schalm's Lab. Notes, California, Dec. (1977) 10.

5. WRIGHT, P .L., and BELL, M.C., Selenium and vitamin E influence upon thein vitro uptake of Se 75 by ovine blood cells, Proc. Soc. Exp. BioI. Med.144 (1963) 379.

6. PAGILA, DE., and VALENTINE, W.N., Studies on the quantitative andqualitative of erythrocyte glutathione peroxidase, Journal of Laboratoryand Clinical Medicine 70 (1967) 158.

7. KALLFELS, FA., WALLACE, R.J., and SASANGKA, BH., "Glutathione. peroxidase assay and red cell uptake of Se75 for practical assessment of

selenium status in cattle", Proc. Fifth International Conference on Produc­

tion Desease in Farm Animals, Swedish University of Agricultural Sciences(1983)330 ..

8. WILSON, P.E., and JUDSON, GJ., Glutathione peroxidase activity in bovineand ovine erythrocytes in relation to blood selenium concentration,

British Vet~rinary Joumal132 (1976) 428.

9. ALLEN, WM., PARR, WH., ANDERSON,PH., SYLVIA, B., BRADLEY, R.,and PATTERSON, D.s.P., Selenium and the activity of glutathioneperoxidase in bovine erythrocytes, The Veterinary Record, April 19 (1975).

10. SHOLZ, R.W., and HUTCffiNSON,LJ., Distribution of glutathione peroxidaseactivity and selenium in the blood of dairy cows, Am. J. Vet. Res. 40(1979) 245.

623

Tabd 1. Aktivitas enzim GSH-Px dan serapan radioselenium di dalam darah.

-No. urutAktivitas GSH-PxSerapan radio-Tanda klinis

sampel(EU/g Hb)selenium (%)di lapangan

1

1268,89+2

1665,09+*)

32250,66+

42536,83+

51556,19+*)

61751,94+

71962.0 1+

81541,91+

91739,48+

101950,85+

111851,84+*)

121259,65+

133355,82

144210,3 7

154511,56

164414,88

174110,01

185112,36

195612,07

204711,52

21439,26

224313,47

23419,78

244811,35

254910,20

263713,52

27419,79

28478,11

291750,24+*)

301951,47+*)

Keterangan

+

... menunjukkan adanya gejala klinis

*)

..mengalami retained placentatidak menunjukkan gejala klinis

624

60

50I'\

Y0:76,82 - 1,41 X

r=- 0,91,~ 40

e :I'2"-.:1~"6 30os ..

Coss:>.1!u00

20

10

\..

10 20 30 40 40 50

Aktivitas enzim GSH-Px (EU/g Hb)

Gambar 1. Korelasi antara aktivitas GSH-Px dengan serapan radiosdenium.

625

DISKUSI

LEO BAWBARA :

1. Bagairnana pendapat Anda mengenai pakan di Indonesia, apakah deflSiensi Secukup serius?

2. Apa keuntungan atau kerugian metode yang Anda lakukan dibanding denganmetode pengukuran aktivitas GSH-Px?

BlNTARA H.s. :

1. Mengenai pakan ternak di Indonesia, saya belum mengetahui, apakah kekurang­an Se atau tidak.

2. Keuntungan:a. Pengadaan 75Se relatiflebih mudah dibanding dengan reagen untuk GSH­

Px.

b. Penganalisaan sampel dalam jumlah yang banyak mudah dan cepat dilaku­kan.

Kalau kerugiannya tidak ada, saya cenderung berpendapat, bahwa :a. Untuk beberapa InstitutjLembaga penelltian metode ini belum dapat

dilakukan, karena belum semua lembaga pene1itian mempunyai fasilitaslaboratorium yang menunjang pekerjaan dengan radioisotop. Seperti diketahui bahwa laboratorium untuk radioisotop mempunyai persyaratantertentu.

b. Beberapa lembaga penelitian pada saat sekarang belum memiliki alatpencacah (counter).

SNO SUWANDYASTUTI :

Apakah pengukuran nilai serapan dapat pula digunakan untuk mendeteksi deflSiensiunsur lain (selain Se) ?

BlNTARA H.s. :

Pada prinsipnya dapat, misalnya dengan menggunakan 65Zn dapat dideteksi defi­siensi Zn. Oleh karena penggunaan radioisotop juga ada keterbatasannya, terhadapbeberapa unsur yang mempunyai isotop dengan waktu paruh yang relatif pendektidak dapat dilakukan dengan menggunakan metode ini.

ENDRAWANTO :

1. Berapa idealnya kadar Se yang diperlukan untuk hewan monogastrik maupunruminansia ?

2. Bagaimana kemungkinan aplikasinya di Indonesia untuk mendeteksi deflSiensiSe, karena menurut Anda cara ini telah banyak dilakukan.

626

BINTARA B.S. :

1. Kadar Se yang diperlukan bagi monogastrik maupun ruminansia sangat ber­variasi, bergantung dari jenis ternaknya. Sebagai eontoh kebutuhan Se padadomba dan sapi adalah 0,1 ppm Se.

2. Aplikasinya eukup eerahdi Indonesia.

SUPRIY ATI :

Untuk mendeteksi Se, mana yang lebih sensitif dengan eara mengukur aktivitasenzim GSH-Px atau total Se dalam darah/hati?

BlNTARA 8.s. :

Untuk saat sekarang seperti yang telah dilakukan di beberapa negara maju, pengu­kuran dengan GSH-Px relatif lebih sensitif. Pengukuran total Se dalam hati dandarah untuk beberapa hal masih ada hambatannya, rnisa1nya eara penganalisisannya,karena Se merupakan suatu unsur renik, sehingga memerlukan peralatan yangeukupeanggih untuk penganalisisannya. Pengukuran total Se dalam suatu jaringan,untuk sampel yang banyak memerlukan waktu yang eukup lama.

C. HENDRAlNO :

1. Apakah metode yang Anda lakukan dapat mendeteksi pengaruhmineral terha­dap hewan di lapangan?

2. Dapatkah metode ini diaplikasikan langsung di lapangan?

BINTARA 8.s. :

1. Dapat dilakukan.

2. Untuk beberapa hal, aplikasi langsung di lapangan belum dapat dilakukan.

L.A. SOFY AN :

Penelitlan Anda untuk mendeteksi deflsiensi Se. Apakah ada data ternak-temakIndonesia defisiensi Se ini?

BlNTARA 8.s. :

Untuk saat ini kami belum dapat memberikan data temak-temak di Indonesia yangmengalami defisiensi Se, karena penelitian Se pada ternak-temak di lapangan sedangdilakukan.

627