KLONING GEN

Oleh :Yuniar Mulyani

Kloning memungkinkan gen tertentu dapat diseleksi dan dimurnikan dalam jumlah besar yang bebas dari kontaminasi oleh urutan DNA lain.

Prinsip kloning gen :

1. Suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon disisipkan (insersi) pada molekul DNA silkular yg disebut vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan

2. Vektor berfungsi sebagai wahana yg membawa gen ke dlm sel inang yg biasanya berupa bakteri.

3. Di dlm sel inang vektor mengadakan replikasi, menghasilkan bayak kopi atau turunan yg identik

4. Ketika sel inang membelah, kopi molekul DNA rekombinan diwariskan kpd keturunannya dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.

5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel inang yg identik. Tiap sel dlm klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinan; dgn demikian dikatakan bahwa gen yg dibawa oleh molekul rekombinan telah diklon.

Teknik Molekular dasar yg diperlukan untuk melakukan kloning gen :

1. Preparasi sampel DNA murni (Isolasi DNA)

2. Pemotongan molekul DNA

3. Analisis ukuran fragmen DNA

4. Penggabungan molekul-molekul DNA (ligasi)

5. Memasukkan molekul DNA kedlm sel inang (transformasi)

6. Identifikasi sel yg mengandung molekul DNA rekombinan

Pemotongan DNA dikerjakan dengan cara menginkubasikan DNA dengan endonuklease restriksi (dikenal dengan nama ensim restriksi). Endonuklease ini umumnya adalah ensim-ensim bakteri yang mengenali urut-urutan spesifik DNA (Tabel 1) dan memotong DNA pada tapak-tapak tersebut.

Ligasi fragmen DNA ke vektor

Menggunakan vektor pGEM®–T Easy Ligasi fragmen DNA hasil PCR elusi yang diekstraksi

Komponen Ligasi :

- Fragmen DNA 3 μl- pGEM® –T easy (50 ng) 1 μl- 2x ‘rapid buffer’ ligasi 5 μl- Enzim T4 ligase (3U/ μl) 1 μl

TOTAL 10 μl

Komponen di mix, inkubasi di waterbath 4oC;

24 jam, setelah itu disimpan di –20oC

Plasmid rekombinan

Transformasi

Skrining Biru-putih

Hasil Skrining Biru-Putih

Hasil Isolasi Plasmid

� Konsentrasi : 2,8-6,5 µg/ µl

� Kemurnian : 1,75-1,823

Elektroforegram hasil pemotongan dengan EcoRI

DNAInsert

DNA plasmid

Gbr.hasil pemotongan dengan Marker cut HindIII/EcoRI

Gbr.hasil pemotongan dengan Ladder 50 bp.

Isolasi plasmid

Potong dg EcoRI

Sekuensing

Insert

Plasmid

Kloning

Skrining Biru-putih