I 0907165

Keragaman Genetik Spesies Penicillium yang diisolasi dari Berbagai

Sumber di Sarawak, Malaysia

Jamur dan bakteri adalah dekomposer utama pendegradasi karbon, nitrogen dan unsur-

unsur lainnya yang nantinya akan terikat pada materi organik (Carlile et al., 2001). Jamur

banyak ditemukan sebagai sumber dari penyakit dan perusak pada tanaman. Namun, jamur

juga memiliki sejumlah kegunaan praktis untuk manusia. Aspergillus niger digunakan untuk

menghasilkan asam sitrat pada industri minuman ringan. Selain itu, keluarga jamur

uniseluler, Saccharomyces cerevisiae adalah jamur yang paling penting yang digunakan

dalam industri makanan seperti dalam pembuatan roti, bir, alkohol dan pembuatan anggur.

Selain industri makanan, jamur juga sangat berguna secara medis sebagai produsen antibiotik

yang digunakan untuk mengobati infeksi (Thom, 1945).

Penicillium sp. adalah spesies yang paling sering ditemukan dan merupakan salah satu

anggota yang paling ekonomis dan penting dalam keluarga mikrofungi. Meskipun banyak

yang sudah diketahui tentang fisiologi dan kimia mikotoksin Penicillium, namun penelitian

mengenai identifikasi Penicillium dengan cepat dan tepat belum sepenuhnya berkembang

pesat dalam banyak bidang termasuk perawatan kesehatan masyarakat dan keamanan pangan

(Scott, 1977; Cruz-Perez et al, 2001;. Meklin et al, 2004;. Portnoy et al, 2004). Sarawak

merupakan salah satu pusat dari daerah yang memiliki banyak keanekaragaman spesies dan

memiliki potensi besar dalam hal organisme yang belum ditemukan termasuk Penicillium sp.

Dua puluh isolat Penicillium diperoleh dari koleksi kultur Universiti Malaysia Sarawak

(UNIMAS). koleksi Jamur telah diisolasi dari berbagai sumber di Sarawak seperti dari tanah

bakau, sampah daun, tanah gambut, kecap, karas dan rambutan. Jamur yang diambil dari

penyimpanan kultur telah dikulturkan kembali pada medium Agar Ekstrak Malt (MEA) dan

Czapek Yeast Agar (CYA) dalam cawan Petri. Setiap isolat diinokulasi pada tiga titik di

setiap media dalam cawan Petri kemudian diinkubasi pada suhu kamar (22-25 º C) selama

tujuh hari. Metode yang digunakan untuk melihat hubungan kekerabatan spesies Pencillium

sp. dalam penelitian ini adalah dengan studi morfologi dan studi molekuler. Pada studi

morfologi, bagian dari miselium dan konidiofor diambil dari koloni. Identifikasi jamur

didasarkan pada karakteristik kultur dan struktur konidiofor. Karakteristik kultur yang

diamati adalah warna koloni, tekstur, pertumbuhan koloni, eksudat, bau, zonasi dan

pigmentasi. Struktur konidiofor yang diamati meliputi panjang, percabangan dan konidia.

I 0907165

Gambar diambil dengan menggunakan kamera digital Nikon. Catatan dari International

Mycological Institute (IMI) digunakan sebagai referensi untuk identifikasi.

Pada studi molekuler, tahap awal yang dilakukan adalah isolasi DNA. DNA diekstraksi

dengan menggunakan metode ekstraksi yang diperkenalkan oleh Taylor dan Natvig (1987).

Bahan-bahan genetik juga diambil langsung dari miselia yang tumbuh pada CYA

menggunakan tips autoklaf steril. Bahan-bahan genetik kemudian dicampur dengan 25-30μl

dari Tris-EDTA (TE) buffer dan kemudian divortex. DNA disimpan di suhu -20 º C sampai

diperlukan. Setelah DNA diisolasi, tahap kedua dilakukan amplifikasi RAPD-PCR. Dua PCR

primer, M13 (5'-TTATGTAAACGACGGCCAGT -3 ') dan OPD10 (5'-GTGATCGCAG-3 '),

digunakan untuk memperkuat 20 isolat Penicillium. PCR Campuran yang digunakan untuk

RAPD dalam penelitian ini terdiri dari 2.5μl buffer PCR 10X (Vivantis), 2.5μl dari 2mm

dNTP (Vivantis), 10 pmol / ml M13 atau 5 pmol / ml OPD-10, 2 U Taq polimerase (Vivantis)

dan template 2.5μl DNA. Air suling steril ditambahkan untuk volume total PCR reaksi 25 ml.

Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan Biometra Tgradient (Biometra). Tahap ketiga

adalah Pemisahan fragmen DNA dengan gel elektroforesis. Amplikon hasil amplifikasi

dipisahkan menggunakan 1,3% (b / v) gel agarosa elektroforesis di 1X buffer TAE (Tris-

asetat acid-EDTA). Elektroforesis dilakukan pada 100V selama 90 menit. Gel

divisualisasikan menggunakan etidium bromida di bawah UV Transilluminator dan Gel

didokumentasikan menggunakan Sistem Dokumentasi (BioRad). Untuk kostruksi hubungan

filogenetik, pola band hasil RAPD diubah menjadi tabel biner. Data dianalisis dengan

menggunakan software analisis data genetik, Taksonomi Numerical dan Multivariate Analisis

Sistem (NTSYSpc) versi 2.2. Data dihitung dengan indeks kesamaan, Jij = Cij / (ni + nj -

Cij), di mana Jij = jumlah individu i dan j, ni = jumlah band di i individu, nj = jumlah band di

j individu. Dendogram A dihasilkan dengan menggunakan Unweighted Pair-Group

Method with Averages Arimethrical (UPGMA) seperti yang dijelaskan oleh Sneath dan

Sokal (1973).

Hasil penelitian menunjukkan diantara 20 isolat, Empat isolat dikelompokkan sebagai

Clade 1 yaitu P1,P7,P14 dan P16 dengan warna abu-abu dikelilingi zona putih di sekitar

koloni, struktur konidiofor Bi-Asymmetrical dan konidia berbentuk bulat. Dua isolat

dikelompokkan sebagai Clade 2 yaitu P2 dan P12 dengan struktur konidiofor

Monoverticillata dan konidia berbentuk bulat, berwarna putih pada medium CYA. Tiga

isolat dikelompokkan sebagai Clade 3 yaitu P3,P9 dan P15 dengan struktur konidiofor

I 0907165

Monoverticillata dan konidia berbentuk bulat, berwarna kuning pekat pada medium CYA.

Dua isolat dikelompokkan sebagai Clade 4 yaitu P4 dan P13 dengan warna putih kehijauan

dikelilingi zona putih di sekitar koloni, struktur konidiofor Bi-Asymmetrical dan konidia

berbentuk bulat, Empat isolat dikelompokkan sebagai Clade 5 yaitu P5,P8,P17 dan P19

dengan koloni berwarna putih dikelilingi zona putih yang lebih besar, struktur konidiofor Bi-

Asymmetrical dan konidia berbentuk bulat. Dua isolat dikelompokkan sebagai Clade 6 yaitu

P6 dan P20 dengan struktur konidiofor Terverticillata dan konidia berbentuk elips. Dan

masing-masing satu isolat untuk Clade 7, Clade 8 dan Clade 9.

Pada pengelompokan molekul, enam isolat diabaikan karena tidak menghasilkan

DNA. Setiap sampel diulang setidaknya dua kali pengulangan untuk menentukan

reproduktifitas dan konsistensi. Penelitian tersebut membandingkan hasil klasifikasi dari data

morfologi dan molekuler. Perbandingan dari kedua data menunjukkan bahwa pola pita RAPD

umumnya konsisten dengan data morfologi. Kombinasi morfologi dan molekuler dapat

digunakan untuk meningkatkan keyakinan bahwa isolat dikelompokkan dengan benar.

Sebelumnya penelitian dilakukan oleh Lutzoni dan Vilgalys (1995) mengenai gabungan dari

data molekul dan morfologi untuk memperkirakan filogeni jamur lichen dan nonlichen pada

spesies Omphalina. Mereka menemukan bahwa homogenitas pengujian urutan subunit besar

28S ribosomal DNA dan karakter morfologi menunjukkan bahwa kedua set data

memiliki filogenetik yang sama. Dalam penelitian ini, dendrogram yang dihasilkan dari

amplifikasi dengan primer M13 memberikan korelasi sekitar 79% dengan data morfologi 11

dari 14 isolat yang diamati. Pada OPD10, ada sekitar 69% korelasi dengan data morfologi 9

dari 13 isolat yang diamati. Analisis Molekuler menunjukkan bahwa dua isolat yang awalnya

dikelompokkan dalam cluster yang berbeda berdasarkan pada karakterisasi morfologi,

tampaknya identik pada tingkat genetik ketika ditandai dengan analisis RAPD. Dendogram

menunjukkan terdapat sedikit korelasi antara isolat yang diisolasi dari jenis tanah yang sama.

Selain itu asal geografis juga menunjukkan korelasi yang kecil antara masing-masing clade.

Hal ini menunjukkan variasi yang besar dari spesies Penicillium yang dapat ditemukan di

seluruh area sampling dari area yang luas di Sarawak.

I 0907165