KEPUTUSAN KEPALA BADAN KARANTINA PERTANIAN NOMOR :...

1 MANUAL PENGUJIAN RESIDU HORMON PADA PANGAN SEGAR ASAL HEWAN

KEPUTUSAN KEPALA BADAN KARANTINA PERTANIAN

NOMOR : 513.a/Kpts/OT.210/L/12/2008

TENTANG

MANUAL PENGUJIAN RESIDU HORMON

PADA PANGAN SEGAR ASAL HEWAN

DENGAN RAHMAT TUHAN YANG MAHA ESA

KEPALA BADAN KARANTINA PERTANIAN,

Menimbang : a. bahwa untuk tujuan peningkatan berat badan

hewan sering digunakan hormon

pertumbuhan (hormone growth promotors);

b. bahwa penggunaan hormon yang tidak sesuai

dengan aturan pemakaiannnya serta

pengelolaan yang tidak benar dalam proses

produksi pangan segar asal hewan dapat

mengakibatkan adanya residu hormon;

c. Bahwa residu hormon dapat menyebabkan

gangguan kesehatan dan fisiologis terhadap

konsumen;

d. Sehubungan dengan hal tersebut maka

dipandang perlu menetapkan pengujian

residu hormon pada pangan segar asal

hewan.

Mengingat : 1. Undang-Undang Nomor 6 tahun 1967

tentang Ketentuan-Ketentuan Pokok

Peternakan Dan Kesehatan Hewan


((Lembaran Negara Tahun 1967 Nomor 10,

Tambahan Lembaran Nomor 2824);

2. Undang-Undang Nomor 16 tahun 1992

tentang Karantina Hewan, Ikan dan

Tumbuhan (Lembaran Negara Tahun 1992

Nomor 56, Tambahan Lembaran Negara

Nomor 3482);

3. Undang-Undang Nomor 7 Tahun 1994

Agreement Estabilishing the World Trade

Organisasi Perdagangan Dunia (Lembaran

Negara Tahun 1994 Nomor 57, Tambahan

Lembaran Negara Nomor 3656);


tentang Pangan (Lembaran Negara Tahun

1996 Nomor 99, Tambahan Lembaran

Negara Nomor 3556);


tentang Perlindungan Konsumen (Lembaran

Negara Tahun 1999 Nomor 42, Tambahan


6. Peraturan Pemerintah Nomor 22 Tahun 1983

tentang Kesehatan Masyarakat Veteriner

(Lembaran Negara Tahun 1983 Nomor 28,

Tambahan Lembaran Negara Republik

Indonesia Nomor 3253);

7. Peraturan Pemerintah Nomor 82 tahun 2000

tentang Karantina Hewan (Lembaran Negara


Tahun 2000 Nomor 161, Tambahan



tentang Kewenangan Pemerintah dan

Kewenagan propinsi sebagai daerah Otonom


tentang Keamanan, Mutu dan Giji Pangan

(Lembaran Negara Tahun 2004 Nomor 107,

Tambahan Lembaran Negara Nomor 4424);

10. Peraturan Menteri Pertanian Nomor

299/Kpts/OT.140/7/2005 tentang Organisasi

dan Tata Kerja Departemen Pertanian;

11. Peraturan Menteri Pertanian Nomor

341/Kpts/OT.140/9/2005 tentang Kengkapan

dan Tata Kerja Departemen Pertanian.

Memperhatikan : Hasil Rapat-Rapat Pembahasan Manual Pengujian

Residu Hormon pada Pangan Segar Asal Hewan

tanggal 28 – 30 Juli 2008.

MEMUTUSKAN

Menetapkan :

KESATU : Manual Pengujian Residu Hormon pada Pangan

Segar Asal Hewan Sebagaimana tercantum dalam

lampiran Keputusan ini.

KEDUA : Manual Pengujian Residu Hormon pada Pangan

Segar Asal Hewan tersebut merupakan acuan bagi


petugas karantina hewan dalam melaksanakan

tugas dan fungsi pengawasan keamanan pangan.

KETIGA : Manual Pengujian Residu Hormon pada Pangan

Segar Asal Hewan ini bersifat dinamis, akan

disempurnakan mengikuti perkembangan

kebutuhan dan ilmu pengetahuan.

KEEMPAT : Keputusan ini mulai berlaku pada tanggal

ditetapkan.

Ditetapkan di : Jakarta

Pada tanggal : 15 Desember 2008

Kepala Badan Karantina Pertanian,

Ir. Syukur Iwantoro, MS, MBA

NIP. 080.069.615

Tembusan disampaikan kepada Yth.:

1. Menteri Pertanian RI;

2. Para Pejabat Eselon I Departemen Pertanian;

3. Para Pejabat Eselon II Badan Karantina Pertanian;

4. Para Kepala Balai Besar, Balai dan Stasiun Karantina Pertanian

seluruh Indonesia.


Lampiran : Keputusan Kepala Badan Karantina

Pertanian

Nomor : 513.a/Kpts/OT.210/L/12/2008

Tanggal : 15 Desember 2008

Tentang : Manual Pengujian Residu Hormon

pada Pangan Segar Asal Hewan


KATA PENGANTAR

Puji dan Syukur kami panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha

Esa atas berkah dan rahmat-Nya sehingga penyusunan manual

Pengujian Residu Hormon pada Pangan Segar Asal Hewan ini dapat

diselesaikan.

Obat-obatan untuk pemacu pertumbuhan (growth

promoter/hormon) merupakan salah satu contoh obat-obatan yang jika

digunakan tidak sesuai dengan petunjuk atau label, misalnya waktu

henti obat (withdrawal time) yang tidak dipatuhi menjelang hewan akan

dipotong dapat menimbulkan residu pada saat dipotong. Keberadaan

residu hormon pada pangan segar asal hewan yang melampaui ambang

batas yang telah ditentukan dapat menyebabkan pangan segar asal

hewan tersebut menjadi tidak aman dan tidak layak untuk dikonsumsi

karena dapat merugikan, mengganggu dan membahayakan kesehatan

manusia..

Dengan terbitnya Keputusan Menteri Pertanian Nomor

299/Kpts/OT.140/7/2005, fungsi pengawasan keamanan hayati

terhadap hewan dan tumbuhan beserta produknya yang diimpor, ekspor

dan antar area berada pada Badan Karantina Pertanian, termasuk

didalamnya pengawasan keamanan pangan segar asal hewan terhadap

adanya residu hormon yang dapat membahayakan kesehatan manusia.

Untuk melaksanakan fungsi tersebut maka diperlukan persiapan yang

memadai, antara lain adanya pedoman atau manual yang dibutuhkan.

Buku Manual Pengujian Residu Hormon pada Pangan Segar Asal

Hewan merupakan salah satu dari petunjuk yang akan digunakan


sebagai dasar dalam pengawasan keamanan hayati terhadap pangan

segar asal segar hewan.

Kami mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang

telah memberikan kontribusi dalam penyusunan buku ini, semoga buku

ini dapat bermanfaat dalam upaya peningkatan penyelenggaraan

perkarantinaan di Indonesia.

Kepala Badan Karantina Pertanian,

Ir. Syukur Iwantoro, MS, MBA

NIP. 080.069.615


DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.................................................................... i

DAFTAR ISI................................................................................... iii

BAB I . PENDAHULUAN........................................................... 1

1.1. Latar Belakang........................................................ 1

1.2. Maksud dan Tujuan................................................. 3

1.3. Ruang Lingkup........................................................ 3

BAB II. DEFINISI DAN SINGKATAN...................................... 4

2.1. Definisi.................................................................... 4

2.2. Singkatan................................................................. 5

BAB III. SIFAT DAN KARAKTERISTIK HORMON............... 7

3.1. Trenbolone acetate................................................... 7

3.2. Diethylstilbestrol (DES).......................................... 7

3.3. Melengestrol Acetate (MGA).................................. 8

3.4. Ractopamin.............................................................. 9

BAB IV. METODE PENGUJIAN RESIDU HORMON................ 10

4.1. Prosedur pengujian hormon DES dan TBA............. 10

4.2. Prosedur pengujian hormon MGA dan

Ractopamin dengan metode ELISA........................ 20

PENUTUP........................................................................................ 28

DAFTAR PUSTAKA


BAB I

PENDAHULUAN

1.4. Latar Belakang

Sejak awal tahun 1970-an, penggunaan hormon

pertumbuhan (Hormone Growth Promotors/ HGPs) telah dikenal

secara luas baik pada peternakan sapi potong maupun peternakan

sapi perah yang diberikan untuk mempercepat peningkatkan berat

badan dan efisiensi pakan termasuk menghindari pakan yang

berlebihan (overfeeding). Penggunaan hormon sebagai pemacu

pertumbuhan telah banyak digunakan di USA, Australia, New

Zealand dan Canada.

Berdasarkan sifatnya, hormon pertumbuhan ini ada dua

macam yaitu yang bersifat natural dan sintetik. Hormon yang

bersifat natural artinya hormon ini secara alami diproduksi oleh

tubuh dan mempunyai peranan yang sangat penting dalam fungsi

reproduksi baik pada manusia maupun hewan, misalnya 17

estradiol, progesteron dan testosteron.

Sedangkan hormon sintetik adalah hormon yang tidak

diproduksi oleh tubuh, namun mempunyai sifat sebagaimana

hormon natural yang digunakan sebagai pemacu pertumbuhan,

misalnya trenbolon asetat (TBA), melengesterol (MGA),

diethylstilbestrol (DES), dan zeranol. Pemberian hormon ini

mampu meningkatkan efisiensi pakan, dan memperbaiki kualitas

daging dengan menurunkan deposit lemak sehingga memperbaiki

marbling. (kandungan dan struktur lemak dalam daging). Hormon

ini biasanya diberikan secara iimplantasi atau injeksi. Pada


industri sapi perah dikenal juga penggunaan hormon Bovine

somato tropin (BST) yang mampu meningkatkan 12% dari

produksi susu.

Penggunaan hormon baik pada peternakan sapi potong

maupun sapi perah dilarang / belum diperbolehkan dibeberapa

negara terutama di Uni Eropa. Food and Drug Administration

(Badan Pengawasan Obat dan Makanan USA) menyetujui

penggunaan 6 HGPs yaitu: 3 jenis hormon natural (Estradiol,

Progesteron, Testosteron) dan 3 jenis hormon sintetik (Zeranol,

Trenbolon, Melengestrol).

Di Indonesia sendiri penggunaan HGPs pada hewan

ternak dilarang sejak tahun 1983, dan penggunaan hormon

diizinkan hanya untuk penanganan gangguan reproduksi dan

tujuan terapi, dengan pengawasan dokter hewan termasuk

pengontrolan masa henti obat (withdaraltime). Negara-negara

yang melarang penggunaan HGP mengkhawatirkan resiko yang

dapat ditimbulkan akibat mengkonsumsi produk hewan yang

mengandung residu hormon seperti pemicu kanker, infertilitas

dan pubertas dini yang pernah terjadi pada tahun 80-an di Italia

pada anak sekolah yang mengalami pubertas dini akibat

penggunaan hormon DES.

Pada saat ini penggunaan hormon pemacu pertumbuhan di

Indonesia hanya diizinkan untuk hormon yang bersifat natural

saja.

Sebagai upaya untuk menjamin keamanan pangan di

tempat pemasukan dan pengeluaran khususnya pangan segar asal

hewan dari kemungkinan adanya residu hormon, diperlukan suatu


pengujian secara laboratoris untuk mendeteksi ada/tidaknya

residu hormon dalam pangan segar asal hewan. Untuk itu perlu

disusun suatu panduan bagi petugas karantina hewan yang

bertugas di laboratorium dalam melakukan pengujian terhadap

kemungkinan adanya residu hormon dalam suatu produk

peternakan. Manual Pengujian Residu Hormon pada Pangan

Segar Asal Hewan sebagai langkah pengawasan terhadap

keamanan hayati hewani khususnya keamanan pangan segar asal

hewan.

1.5. Maksud dan Tujuan

Manual Pengujian Residu Hormon pada Pangan Segar

Asal Hewan ini dimaksudkan untuk memberikan pedoman dan

arahan bagi petugas karantina hewan dalam melaksanakan fungsi

pengawasan keamanan pangan, khususnya dalam melakukan

pengujian pangan segar asal hewan terhadap kemungkinan

adanya residu hormon.

Sedangkan tujuan dari Manual Pengujian Residu Hormon

pada Pangan Segar Asal Hewan adalah menyeragamkan metoda

pengujian pangan segar asal hewan terhadap kemungkinan

adanya residu hormon di UPT Karantina Hewan lingkup Badan

Karantina Pertanian.

1.6. Ruang Lingkup

Ruang lingkup manual ini meliputi pengujian residu hormon

anabolik steroid sintetik yaitu trenbolone acetate (TBA) pada

daging/ jeroan/susu, darah (serum) sapi dan Diethylstilbestrol

pada daging ayam, Ractopamin, dan MGA.


BAB II

DEFINISI DAN SINGKATAN

2.3. Definisi yang digunakan dalam manual ini antara lain:

1. Pangan Segar Asal Hewan adalah pangan asal hewan yang

belum mengalami pengolahan yang dapat dikonsumsi

langsung dan/atau dapat menjadi bahan baku pengolahan

pangan.

2. Pengawasan Pangan Segar Asal Hewan adalah syarat dan tata

cara yang dilakukan untuk mencegah cemaran biologi, residu

antibiotika, obat hewan, hormon dan logam berat serta

cemaran fisik pada pangan asal hewan yang dimaksudkan

untuk diedarkan.

3. Daging adalah bagian dari karkas yang didapatkan dari ternak

yang disembelih secara halal (kecuali babi) dan benar serta

lazim, layak, dan aman dikonsumsi manusia yang terdiri dari

potongan daging bertulang atau daging tanpa tulang lainnya

kecuali yang telah diawetkan dengan dengan cara lain dari

pada pendinginan.

4. Jeroan (edible offal) adalah bagian dari dalam tubuh hewan

yang berasal dari ternak ruminansia yang disembelih secara

halal dan benar serta dapat, layak, dan aman dikonsumsi oleh

manusia, kecuali yang telah diawetkan dengan cara lain

daripada pendinginan.

5. Susu segar adalah cairan yang berasal dari ambing ternak

perah yang sehat dan bersih, yang diperoleh dengan cara

pemerahan yang baik, yang kandungan alaminya tidak


dikurangi atau ditambah sesuatu apapun, tidak mengandung

residu air yang ditambahkan, bahkan tambahan makanan yang

diperbolehkan, atau bahan makanan lainnya serta tidak

mendapat perlakuan pemanasan, irradiasi atau perlakuan fisik

lainnya kecuali proses pendinginan.

6. Susu pasteurisasi adalah susu segar, susu rekonstitusi atau

susu rekombinasi yang telah mengalami proses pemanasan

pada temperatur 63° - 66oC minimum selama 30 menit atau

pada pemanasan 72°C minimum selama 15 detik, kemudian

segera didinginkan sampai 10oC, selanjutnya diperlakukan

secara aseptis dan disimpan pada suhu maksimum 4,4oC.

7. Hormon adalah pembawa pesan kimiawi antar sel atau antar

kelompok sel yang berfungsi memberikan sinyal ke sel target

yang selanjutnya akan melakukan suatu tindakan atau

aktivitas tertentu. (wikipedia).

8. Anabolik steroid adalah sejenis hormon steroid yang

berhubungan dengan hormon testosteron contohnya hormon

TBA.

9. Residu hormon adalah hormon baik senyawa induknya

maupun metabolit atau turunannya yang terkandung dalam

daging, jeroan, susu, darah atau serum baik sebagai akibat

langsung maupun tidak langsung dari penggunaan hormon.

10. KCKT/HPLC adalah metode analisis secara fisikokimia

dengan menggunakan gas kromatografi yang mampu

memisahkan komponen-komponen dan mengukur kadar

komponen tersebut dengan suatu detektor.


11. ELISA (Enzyme Link Immuno Sorbent Assay) adalah suatu

metode analisis secara imunokimia yang berdasarkan pada

reaksi antigen-antibodi.

12. Contoh (sampel) adalah satu atau lebih satuan (unit) hasil

yang dipilih dari suatu kumpulan (populasi) satuan, atau

bagian terpilih dari hasil dengan jumlah yang lebih besar.

13. Petugas pengambil contoh adalah tenaga terlatih dan

kompeten dalam kegiatan pengambilan contoh/sampel sesuai

dengan prosedur.

14. Petugas penguji laboratorium adalah petugas medik,

paramedik veteriner dan petugas karantina yang memiliki

kompetensi dalam melakukan pengujian laboratorium.

2.4. Singkatan yang digunakan dalam manual ini antara lain:

1. GLP : Good Laboratory Practices

2. KCKT/HPLC : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/

High Performance Liquid Chromatography

3. TBA : Trenbolone acetate

4. MGA : Melengastrol Asetat

5. DES : Diethylstilbestrol

6. p.a : Pro Analysis

7. DW : Destilled Water

8. CH3COOH : Asam Acetate

9. CH3COONa : Natrium Acetate

10. NaHCO3 : Natrium Hidrogen Karbonat

11. Na2CO3 : Natrium Karbonat

12. HCL : Asam Klorida

BAB III

SIFAT DAN KARAKTERISTIK HORMON

3.1. Trenbolone acetate

Sifat fisik dan kimia

TBA memiliki rumus kimia C20H24O3 (17 beta-

hidrosyestra-4,9,11-tien-3-one asetat), merupakan anabolik

sintetik steroid. Berupa bubuk kristal berwarna putih, harus

disimpan dalam freezer dengan suhu -4 C dalam wadah

tertutup. Biasanya hormon ini digunakan untuk meningkatkan

berat badan dan efisiensi pakan.

Ikatan residu TBA ini dapat diekstraksi dengan pelarut organik.

Metabolisme

Setelah masuk kedalam sirkulasi tubuh TBA segera

dihidrolisis menjadi 17 OH trenbolon yang merupakan

androgen sintetik yang potensial. Metabolit ini terdapat pada

hati, empedu dan ginjal dan jaringan otot, dan hampir 80% dari

hasil metabolisme ini kemudian dikeluarkan melalui feses.

Konsentrasi residu terbanyak terdapat pada hati dan ginjal, dan

jika selama produksi diberikan dosis besar melebihi normal

konsentrasi residu terbanyak juga terdapat pada lemak. Selain itu

konsentrasi metabolit ini juga terdapat pada serum darah.

3.4. Diethylstilbestrol (DES)

DES merupakan komponen estrogen sintetik non steroid

yang memiliki efek anabolis. Berupa bubuk kristal berwarna

putih, mempunyai titik leleh pada suhu 169-175o C. Tidak larut

16

dalam air, larut dalam alkohol dan minyak. Harus disimpan pada

suhu ruang (15-30oC) dalam wadah tertutup.

Farmakokinetik

Mempunyai peranan dalam pertumbuhan dan

pengembangan organ sex wanita dan mempunyai efek pada

sistem kerangka tulang. DES diserap dengan baik oleh usus,

kemudian dimetabolisme oleh hati kemudian membentuk

glokoronide dan kemudian dieksresikan melalui urin dan feses.

Hormon berperan untuk laju pertumbuhan dengan

meningkatkan kualitas pakan yang dicerna. Namun karena

bersifat karsinogenik, penggunaannya di peternakan dilarang di

Eropa. Dalam suatu penelitian pada mencit yang diberikan DES

pada masa perinatal, setelah dewasa mencit tersebut terkena

tumor testikular.

3.5. Melengestrol Acetate (MGA)

MGA merupakan hormon sintetik anabolik steroid. Yang

dipakai untuk meningkatkan efisiensi pakan, pemacu

pertumbuhan, menekan estrus/birahi pada penggemukan sapi

betina di peternakan. Hormon ini juga biasa dipakai untuk

sinkronisasi estrus pada sapi. MGA efektif diberikan secara oral

oleh karena itu MGA ini biasanya merupakan feed additive

(bahan tambahan pakan) yang diberikan melalui pakan. Hormon

ini digunakan pada penggemukan sapi dengan dosis 0.25-0.50

mg/ekor per hari selama waktu yang tidak ditentukan dengan

withdrawal time 48 jam setelah pemberian terakhir. Hasil

metabolismenya 86% dikeluarkan bersama feses. Suatu studi

17

pada ternak menunjukkan residu MGA terbanyak terdapat pada

hati dan lemak (80%) kemudian otot (45%).

3.5. Ractopamin

Ractopamin adalah -agonis yang biasanya digunakan

sebagai bronchodilator, pemacu jantung. Dalam peternakan

biasanya dipakai sebagai obat untuk meningkatkan performa

hewan dan kualitas karkas. Hormon ini biasanya dipakai pada

babi, biasanya berpengaruh pada peningkatan asupan pakan,

meningkatkan efisiensi pakan, mempercepat pertumbuhan

badan, dan mempercepat waktu reproduksi.

BAB IV

18

METODE PENGUJIAN RESIDU HORMON

Setiap laboratorium yang hendak melakukan pengujian harus

melakukan validasi/verifikasi metode untuk mengetahui kinerja

(performa) suatu metode, diantaranya: akurasi dan presisi, angka

recovery, limit deteksi, limit kuantifikasi. Setiap pengujian akan

dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, personel, bahan yang digunakan,

jenis contoh, alat yang digunakan dan metode yang dipilih. Dalam

melaksanakan setiap pengujian harus memperhatikan tatalaksana

laboratorium yang baik (GLP/Good Laboratory Practices).

Pada pengujian berikut akan dibahas metode pengujian untuk

hormon TBA DES, Ractopamin, dan MGA. Untuk TBA dan DES

menggunakan metode HPLC sedangkan untuk ractopamnin dan MGA

menggunakan ELISA

4.2. Prosedur pengujian hormon DES dan TBA

Prinsip Uji

Residu Hormon diekstraksi dari bahan pangan asal

hewan dengan menggunakan pelarut organik kemudian

dibersihkan (clean-up) dengan menggunakan kolom

kromatografi. Identifikasi dan Penetapan kadar dilakukan

dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT) yang dilengkapi dengan Detector UV-vis.

4.1.1. Bahan

4.1.1.1. Bahan Standar/baku pembanding:

• Standar/baku Hormon Trenbolone

Acetate/TBA;

19

• Standar/baku Diethylstilbestrol /DES.

4.1.1.2. Bahan Kimia

• Methanol untuk HPLC (Methanol LC);

• Methanol Pro Analysis (p.a);

• Khloroform Pro Analysis (p.a);

• N-Hexan Pro Analysis (p.a);

• Diethyl ether Pro Analysis (p.a);

• Distilled Water (DW);

• CH3COOH 96%;

• CH3COONa;

• Tris HCl;

• NaOH;

• Na2CO3;

• NaHCO3;

• HCl;

• Glukoronidase.

4.1.2. Alat

4.1.2.1. Alat

• Tabung reaksi;

• Pipet volumetrik (pipet gondok);

• Gelas Ukur;

• Tabung sentrifuse;

• Labu evaporator;

• Labu kocok (labu pisah);

• Labu ukur;

20

• Gelas beaker;

• Botol timbang;

• Kolom catridge C18;

• Syringe 10 cc, 2,5 cc, 1 cc;

• filter 0,45 µm;

• Sentrifuse 3000 rpm;

• Timbangan analitik;

• Homogenizer/blender;

• Sonicator;

• Vaccum Rotary Evaporator/Nitrogen

Evaporator;

• Mikropipet 200 µl;

• Magnetic Stirer;

• Water bath / penangas air ( 60C dan 90C);

• pH meter.

4.1.2.2. KCKT

satu set Alat KCKT/HPLC yang terdiri dari:

Pompa, injector (auto injector atau manual

micro syring), kolom, detektor, recorder,

printer.

4.1.3. Cara Kerja

4.1.3.1. Persiapan larutan standar

• Timbang masing-masing baku pembanding

hormon (standar hormon Trenbolone acetate

21

atau standar hormon Diethylstilbestrol)

dalam botol timbang;

• Tambahkan pelarut (fase gerak yaitu

metanol : DW = 80 : 20) untuk memperoleh

larutan standar dengan kadar/konsentrasi

tertentu.

Misalnya:

Untuk mendapatkan larutan TBA dengan

kadar 1000 ppm: timbang dengan tepat

standar TBA sebanyak (misalnya) 5 mg dan

apabila potensi = 98% maka diperlukan

pelarut sebanyak 4,9 ml.

Contoh perhitungannya:

1. Potensi TBA yang ditimbang

5.000 µg x 98/100 = 4900 µg

2. Jumlah pelarut yang diperlukan

4900 µg/1000 µg/ml = 4,9 ml

4.1.3.2. Pembuatan Larutan Dapar

• Cara pembuatan dapar Na-Acetate 0,04 M

pH 5,2:

- Buat larutan CH3COOH 0,04 M, dengan

cara melarutkan 2,2876 ml larutan

CH3COOH 100% ke dalam 1000 ml

DW;

22

- Buat larutan CH3COONa 0,04 M,

dengan cara melarutkan 3,2812 gram ke

dalam 1000 ml DW;

- Campurkan 25 ml larutan CH3COOH

0,04 M dengan 75 ml larutan

CH3COONa 0,04 M, dan kondisikan pH

pada 5,2 0,1 dengan penambahan

NaOH atau HCl.

• Cara pembuatan dapar Na-Acetate 0,05 M

pH 4,8:

- Buat larutan CH3COOH 0,05 M, dengan

cara melarutkan 2,8595 ml larutan

CH3COOH 100% ke dalam 1000 ml

DW;

- Buat larutan CH3COONa 0,05 M,

dengan cara melarutkan 4,1015 gram ke

dalam 1000 ml DW;

- Campurkan 25 ml larutan CH3COOH

0,05 M dengan 75 ml larutan

CH3COONa 0,05 M, dan kondisikan pH

pada 4,8 0,1 dengan penambahan

NaOH atau HCl.

• Cara pembuatan dapar karbonat pH 10,25:

- Buat larutan NaHCO3 10 % , dengan

cara melarutkan 10 gram NaHCO3 ke

dalam 100 ml DW;

23

- Buat larutan Na2CO3 10 %, dengan cara

melarutkan 50 gram Na2CO3 dalam 500

ml DW;

- Campurkan 100 ml Larutan NaHCO3 10

% + 500 ml Larutan Na2CO310 %, dan

kondisikan pH pada 10,25 0,1 dengan

penambahan NaOH atau HCl.

• Cara pembuatan dapar Tris 20 mM:

Larutkan tris 4,8 gram ke dalam 500 ml

DW. Kemudian ambil 50 ml Larutan tris

dan tambahkan 9 ml HCl 0,1 N.

Selanjutnya tambahkan DW sampai dengan

200 ml di dalam labu ukur dan kondisikan

pH pada pH 8,5 0,1 dengan penambahan

NaOH atau HCl.

• Cara pembuatan dapar Tris : Methanol

(80 : 20):

Campurkan 80 ml larutan dapar tris

20 mM dengan 20 ml Methanol.

• Cara pembuatan larutan methanol 40%

Pipet methanol 40 ml kedalam labu ukur

100 ml kemudian tambahkan DW

sampai dengan 100 ml.

4.1.3.3. Timbang sampel sebanyak 20 gram

(daging),atau 20 ml (susu, darah), kemudian

tambahkan 20 ml dapar Na-Acetate 0,04 pH 5,2

24

dan 15 µl glukoronidase serta 3 tetes

chloroform.

4.1.3.4. Sampel dihomogenkan dengan homogenizer.

4.1.3.5. Inkubasikan dalam waterbath pada suhu 60oC

selama 3 jam. Suhu 600 C untuk memicu kerja

enzim.

4.1.3.6. Tambahkan methanol p.a sebanyak 50 ml

kemudian masukkan ke dalam waterbath

dengan suhu 90 oC selama 10 menit. 90

0 C

untuk menghentikan kerja enzim.

4.1.3.7. Pindahkan sampel ke dalam tabung sentrifuse

kemudian sentrifuse pada kecepatan 3000 rpm

selama 30 menit.

4.1.3.8. Ambil lapisan supernatan dan masukkan ke

dalam labu pisah/labu kocok dan tambahkan

20 ml n-Hexan p.a kemudian dikocok sampai

homogen. Diamkan labu kocok sampai larutan

terpisah menjadi 2 lapisan. Tampung lapisan

bawah (fase air) kedalam labu kocok lain dan

tambahkan 20 ml n-Hexan kemudian dikocok

dan lakukan seperti langkah sebelumnya.

4.1.3.9. Hasil tampungan (fase air) dimasukkan kembali

ke dalam labu pisah/labu kocok lainnya dan

tambahkan 20 ml air suling (DW) serta

30 ml Diethylether. Kocok sampai homogen

25

kemudian diamkan sampai larutan terpisah

menjadi 2 lapisan. Tampung lapisan bawah

(fase air) kedalam labu kocok lain sedangkan

lapisan atas (fase ether) biarkan didalam labu

kocok tersebut.

4.1.3.10. Tambahkan 30 ml Diethyl ether kedalam labu

kocok yang berisi fase air, kocok sampai

homogen dan diamkan sampai larutan terpisah

menjadi 2 lapisan.Kemudian buang lapisan

bawah (fase air) dan pindahkan lapisan atas

(fase ether) kedalam labu kocok yang berisi

larutan fase ether hasil pengocokan

sebelumnya.

4.1.3.11. Tambahkan 40 ml air suling (DW) dan 40 ml

Dapar Karbonat, kemudian kocok sampai

homogen dan diamkan sampai larutan terpisah

menjadi 2 lapisan.

4.1.3.12. Buang lapisan bawah (fase air) dan tampung

lapisan atas (fase ether) kedalam labu

evaporator.

4.1.3.13. Evaporasikan sampai kering, kemudian residu

yang dihasilkan dilarutkan dengan 3 ml Dapar

Na-Karbonat 0,05 M pH 4,8.

4.1.3.14. Siapkan sep-pack cartridge silica C-18 dengan

melewatkan larutan Dapar Tris:Methanol

26

(80:20) sebanyak 10 ml dan diteruskan dengan

larutan methanol 40% sebanyak 20 ml.

4.1.3.15. Masukkan sampel residu dari labu evaporator

ke dalam kolom sep-pack cartridge silica C-18

dengan mengunakan syring.

4.1.3.16. Elusi kolom dengan menggunakan methanol p.a

sebanyak 1 ml perlahan-lahan (0,5 ml/menit)

kemudian ditampung dalam labu evaporator.

4.1.3.17. Residu dievaporasi sampai kering.

4.1.3.18. Residu dilarutkan dengan 200 µl methanol p.a

dan siap diinjeksi ke HPLC/KCKT sebanyak

20 µl.

4.1.4. Kondisi Alat KCKT/HPLC

(1). Kecepatan alir : 1 ml/menit

(2). Fase Gerak : Methanol:DW = 80:20

(3). Detektor : UV 360 – 365 nm

(4). Kolom : Silica C-18

4.1.5. Jalankan KCKT/HPLC sesuai dengan kondisi yang telah

ditentukan sampai stabil yang ditandai dengan base line

yang rata dan mendatar, serta tekanan (pressure) pump

yang stabil. Injeksikan larutan standar hormon TBA

kedalam sistem KCKT/HPLC dengan kadar tertentu

(tinggi sampai rendah) sekurang-kurangnya 3 konsentrasi

(misalnya 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm dst) untuk

memperoleh data kurva kalibrasi (kurva linier). Amati

27

dan catat waktu retensi dari puncak kurva yang terbentuk

oleh standar hormon TBA. Lakukan juga terhadap

larutan standar hormon DES. Waktu retensi merupakan

identitas dari standar hormon yang akan dijadikan

patokan untuk melakukan identifikasi terhadap hormon

yang terkandung dalam sampel.

4.1.6. Injeksikan sampel residu hasil ekstraksi ke dalam

KCKT/HPLC kemudian amati waktu retensi dari puncak

kurva yang terbentuk sesuai dengan waktu retensi dari

puncak kurva yang dihasilkan oleh standar.

4.1.7. Catat data luas area dibawah kurva yang dihasilkan baik

oleh standar maupun oleh sampel untuk perhitungan

selanjutnya.

4.1.8. Pembacaan Hasil

Penghitungan konsentrasi sampel didapat dengan

membandingkan tinggi atau luas kurva sampel dengan

tinggi atau luas kurva baku, dengan memperhitungkan

volume sampel maupun volume baku yang disuntikkan

ke HPLC/KCKT serta berat dari sampel.

( T ch / T std ) ( C std x V std )

Berat sampel

Keterangan:

T ch = tinggi peak sampel

C std = konsentrasi baku/standar

T std = tinggi peak baku/standar

V std = Volume baku/standar

28

4.2. Prosedur pengujian hormon MGA dan Ractopamin dengan

metode ELISA

4.2.1. Prosedur pengujian hormon MGA dengan metode

ELISA

4.2.1.1. Prinsip uji

Residu MGA yang terdapat dalam lemak

dilarutkan dalam petroleum eter. Larutan ini

kemudian didinginkan dan disentrifuse,

kemudian supernatan ditampung dan

dievaporasi sampai kering lalu dilarutkan

dengan metanol. Larutan ini kemudian

didinginkan kembali dan disentrifuse untuk

mengendapkan lemak. Kemudian supernatan ini

dilarutkan dengan air dan dibersihkan / di clean

–up dengan column Rida® C18. Hasil elusi

metanol dilarutkan dengan air kemudian

dianalisa dengan mengunakan Ridascreen MGA

ELISA.

4.2.1.2. Peralatan

1. Ridascreen MGA ELISA Kit – r Biopharm

No. R6502;

2. Freezer;

3. Waterbath;

4. Refrigerator sentrifuge;

5. Micropipret;

6. Rida C 18 column r Biopharm No. R2002;

29

7. SPE manifold;

8. Tabung sentrifuse;

9. Botol Duran 50, 500, 1000 ml;

10. Labu ukur 10 ml;

11. Timbangan;

12. Evaporator;

13. Parafilm;

14. ELISA Reader.

4.2.1.3. Bahan

1. Tween TM 20 – Fisher Cat No. BP337-100;

2. Methanol 100% HPLC Grade, Fisher Cat

No.A452-4;

3. Petroleum Ether – JT Baker Cat

No.9268-22;

4. Tris-(hidroxymethyl) aminomethane (Tris);

5. Disediakan oleh Ridascreen elisa:

a. MGA enzyme conjugate

b. Anti –MGA antibodi

4.2.1.4. Pembuatan Larutan

1. Larutan 20/80 (v/v MeOH / 20 mM Tris

HCl pH 8,5):

Larutkan 2,42 g Tris-(Hidroxymethyl)

aminomethan dalam 700ml DW dan

200 ml MeOH 100%, kondisikan pH pada

pH 8,5 dengan menambahkan HCl 5 M.

Kemudian tambahkan DW hingga volume

30

1000ml (larutan dapat disimpan tiga bulan

pada suhu 2-8oC);

2. Larutan 40/60 (v/v) MeOH / DW

Tambahkan 400 ml MeOH ke dalam

600 ml DW (larutan dapat disimpan tiga

bulan pada suhu 2 - 8oC);

3. Larutan 80/20 (v/v) MeOH / DW

Tambahkan 800 ml MeOH ke dalam

200 ml MeOH / DW.

4.2.1.5. Preparasi sampel

Panaskan lemak dalam wadah tahan panas

dalam oven 95 - 110o C.

4.2.1.6. Ekstraksi dan clean up

• Timbang 1 gr + 0,1 dari sampel yang telah

dipanahkan tadi ke dalam tabung sentrifuse

50 ml lalu tambahkan 15 ml petroleum

ether. Vortek sampai lemaknya larut;

• Sentrifuse (-15oC) 15 menit 2000-3000 rpm;

• Pindahkan lapisan petroleum ether ke

tabung yang baru, sentrifuse dan evaporasi

(60oC) waterbath hingga kering;

• Larutkan kembali residu dengan 2 ml

MeOH lalu vortek 1 menit;

• Bekukan selama 45 menit untuk

mengendapkan lemak;

• Sentrifuse (-15oC) 5 menit 2000 - 3000 rpm;

31

• Ambil supernathan ke dalam tabung 15 ml

lalu larutkan dengan 5 ml destilate water;

• Masukan sampel ke kolom rida C18 dengan

keceptan 1 tetes per detik, yang sebelumnya

telah dicuci dengan 1 ml (20/80 v/v

MeOH/20 mM Tris-HCl Ph 8,5);

• Setelah sampel masuk kolom cuci kolom

dua kali dengan 1 ml (20/80 v/v MeOH/20

mM Tris-HCl Ph 8,5);

• Cuci kolom dua kali dengan 1 ml 40/60

MeOH / DW. Buang dan keringkan.

• Cuci kolom dengan 1 ml 80/20 MeOH /

DW lalu tampung ke dalam tabung sampai

kolom kering;

• Encerkan eluate 1 : 1 dengan DW;

• Sampel siap dimasukkan ke dalam

mikrotiter plate elisa.

4.2.1.7. Prosedur ELISA

• Masukan 20 ul larutan standar (0 ; 1,35;

4,05; dan 12,15 ppb) duplo dan sampel;

• Tambahkan 50 ul enzim konjugate;

• Tambahkan 50 ul anti MGA antibodi, putar

seperti angka delapan beberapa kali tutup

dan inkubasi 2 jam pada suhu ruang;

• Buang cairan dan cuci dengan wash solution

dua kali dan keringkan;

32

• Tambahkan 50 ul supstrat dan 50 ul

Chromogen, putar seperti angka delapan

beberapa kali tutup dan inkubasi 30 menit

pada suhu ruang dan dalam keadaan gelap;

• Tambahakan 100ul stop solution, baca

dengan absobansi 450 nm;

• Untuk pembacaan hasil tergantung pada

program ridascreen kit yang digunakan.

4.2.2. Prosedur pengujian hormon Ractopamin dengan

metode ELISA

4.2.2.1. Prinsip uji

Tes ini berdasarkan ELISA direct competitive,

jika terdapat ractopamin di dalam sampel maka

ractopamin enzyme conjugate akan

berkompetisi untuk berikatan dengan rabbit anti

ractopamin antibodi pada plate. Setelah

pencucian dan penambahan substrat akan

terbentuk warna biru. Warna biru yang lebih

jelas mengindikasikan banyaknya ikatan

antigen antibodi tersebut. Intensitas warna

inilah yang dibaca dengan ELISA Reader.

4.2.2.2. Peralatan

1. Abraxis Ractopamin ELISA Kit – Nomor

515555;

2. Micropipet dengan plastik tips (10-200 ul

dan 200-1000 ul);

33

3. Multi- chanel pipet dengan pipet tips

(10-200 ul);

4. Botol semprot;

5. ELISA Reader (panjang gelombang

450 um);

6. Homogenizer;

7. Centrifuge;

8. vortex;

9. Tabung centrifuge.

4.2.2.3. Bahan

1. Microtiter plate;

2. Standar (0 ; 0,125 ; 0,25 ; 0,50 ;1 ; 2 ;4 ppb)

3. Antibody Solution (Rabbit anti-

Ractopamin);

4. Ractopamine-HRP Conjugate;

5. Sample Diluent Concentrate;

6. Wash Solution Concetrate;

7. Color Solution (TMB);

8. Stop Solution.

4.2.2.4. Pembuatan Larutan

1. 3% trichloro acetic acid (TCA)1,5 gr TCA

dilarutkan dalam 50 ml DW;

2. 1 M Phosphat e Buffer 14,2 gr sodium

phosphate anhidrous dilarutkan dalan 100

ml DW;

3. PBS pH 7,4

34

Sodium phosphate anhidrous 1,15 gr;

Sodium phosphate monohidrate 0,2 gr;

sodium chloride 8 gr ; potasium chloride 0,2

gr. Semuanya dilarutkan dalam 1 L DW pH

7,2 – 7,4.

4.2.2.5. Preparasi sampel

1. 10 gr sampel ditambah 10 ml PBS lalu

dihomogenisasi 10 menit;

2. pipet 1 ml sampel yang sudah

dihomogenkan ke dalam tabung sentrifuse,

lalu tambahkan 3 ml TCA 3%, vortex

selama 30 menit;

3. Sentrifuse selama 10 menit pada 2500 rpm;

4. Ambil 500 uL supernatan (bagian atas) ke

dalam tabung, lalu tambahkan 200 uL

phosphate buffer 1 M;

5. Sampel siap untuk prosedur ELISA.

Catatan :

untuk sampel dengan kontaminasi tinggi

direkomendasikan untuk dilarutkan dengan PBS

1:10 atau 1:100 (hasil akhir dikalikan dengan

faktor pengenceran)

4.2.2.6. Prosedur ELISA

• Tambahkan 50 ul larutan standar atau

sampel.

• Tambahkan 50 ul enzim konjugate.

35

• Tambahkan 50 ul antibodi solution, putar

seperti angka delapan beberapa kali, tutup

dan inkubasi 1 jam pada suhu ruang.

• Cuci dengan wash solution 4 kali dan

keringkan.

• Tambahkan 150 ul substrat solution,

inkubasi 45 menit pada suhu ruang dan

dalam keadaan gelap.

• Tambahkan 100 ul stop solution, baca

dengan panjang gelombang 450 nm, tidak

lebih dari 15 menit setelah penambahan stop

solution.

• Untuk pembacaan hasil tergantung pada

program abraxis kit yang digunakan.

36

PENUTUP

Ketersediaan pangan segar asal hewan (PSAH) yang

memenuhi standar keamanan pangan dapat terwujud apabila

kerjasama ditiap lini yang terkait dengan pengawasan keamanan

pangan berfungsi dengan baik .

Badan Karantina Pertanian sebagai salah satu otoritas

kompeten keamanan pangan segar asal hewan di pintu-pintu

pemasukan dan pengeluaran berdasarkan tugas dan fungsi berupaya

sebaik mungkin untuk memberikan apresiasinya dalam mewujudkan

jaminan keamanan PSAH. Terkait dengan tugas dan fungsinya

tersebut upaya pengawasan keamanan pangan terhadap PSAH

membutuhkan suatu pedoman teknis pengujian laboratorium. Untuk

itu dengan tersusunnya Manual Pengujian Residu Hormon Pada

Pangan Segar Asal Hewan ini diharapkan dapat menjadi pelengkap

pedoman bagi petugas karantina dalam melaksanakan pengawasan

keamanan pangan PSAH khususnya dalam pengujian residu hormon.

37

Daftar Pustaka

Abraxis, Enzyme-linked I mmunosorbent Assay for the determination

of Ractopamine in Meat and other Contaminanted samples.

USDA, Food safety and Inspection Service office of public health

science. Screen for Melengestrol asetat in Fat using Elisa

.2006.

Wozniak B, et al. Detection of the Metabolic Hormone residue in the

urine and Muscles of Food-producing animals By HPTLC

with Application of Extraction into A Solid Phase. Bull, vet,

Inst. Pulawy 40, 55-59. 1996

-

KEPUTUSAN KEPALA BADAN KARANTINA PERTANIAN NOMOR :...

Documents

Transcript of KEPUTUSAN KEPALA BADAN KARANTINA PERTANIAN NOMOR :...