Pemeriksaan kwantitatif Jamur

Oleh :Novitasari (A.103.06.020)

Nurhidayati (A.103.06.021)Okky Shenny (A.103.06.022)

Macam Teknik Perhitungan Mikroba1. Menghitung Langsung

Dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dll).

2. Menghitung Tidak Langsung Pada Cawan

Membrane filtration, spread plate, pour plate dll.

Dalam ulasan ini, akan lebih ditekankan pada metode TidakLangsung

1. Membrane filtration/ Filter Membran

Prinsip teknik ini adalah dengan melewatkan sejumlah volume sampel pada saringan dengan diameter pori lebih kecil dari pada sel mikroba. Hal inilah yang menjadi keterbatasan teknik filtrasi membran, dan dapat berpengaruh kepada jenis sampel dan ukuran sampel yang akan dianalisa.

Menghitung Tidak Langsung

2. Pour Plate

Teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar.

Teknik penanaman ini lebih tepat untuk jenis sampel yang tidak dapat untuk difiltrasi dan sulituntuk diratakan di permukaan agar seperti jus buah.

Menghitung Tidak Langsung

Pour Plate

Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml.

3. Spread plate

Teknik penanaman ini didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan agar.

Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan dengan diameter +/-9 cm.

Menghitung Tidak Langsung Pada Cawan

Prosedur PemeriksaanA. Persiapan Alat-alat

Sterilisasi semua peralatan yang digunakan, erlenmeyer, petri dish, pipet, tabung reaksidengan menggunakan sterilisasi kering pada suhu 180 derajat C selama 2 jam.

Prosedur PemeriksaanB. Persiapan Sampel

1. Membersihkan dan mendesinfektifikasi area yang akandigunakan sebelum melakukan analisis.

2. Memberi tanda petridish yang digunakan dengantanggal, contoh dan tipe medium.

3. Menimbang / mengukur sampel secara aseptis.

4. Melakukan pengenceran sampel dengan NaCl fisiologis/ Larutan Buffer Pepton.

5. Inokulasi ke media Sukrose Dekstrosa Agar (SGA) AtauPotato Dextrose Agar (PDA) dari berbagaipengenceran.(Sesuai metode yang digunakan).

6. Inkubasi selama 3 hari pada suhu 300 C.

Cara Melakukan Pengenceran

Persiapan Sampel

Jika sampel berbentuk padat maka :Ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan ke dalam 45 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian.

Prosedur PemeriksaanD. Perhitungan Hasil

1. Menghitung semua koloni dalam petri-petri.

2. Memilih koloni yang masuk dalam batas atas danbatas bawah.

3. Menghitung koloni per gram atau per ml denganmemasukkan ke dalam Rumus sesuai petunjuk padaCOLONY FORMING UNITS (CFU)

COLONY FORMING UNITS (CFU)

Pengertian

CFU adalah singkatan dari Colony Forming Units yaitu unit-unit / satuan pembentuk koloni.

Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal.

Colony Formating Unit dapat dilaporkan sebagai CFU per satuan berat, CFU per satuan luas, atau CFU per satuan volume tergantung pada jenis sampel diuji.

Pengertian Koloni Koloni bakteri, koloni khamir/ragi adalah massa sel

individu organisme yang sama, dan tumbuh bersama.

Koloni kapang adalah sekelompok hifa (filamen) dari cetakan yang sama dan tumbuh bersama.

Kisaran Hitung Kisaran hitung merupakan batas jumlah koloni yang

diperbolehkan tumbuh pada media/cawan.

USP (United States Pharmacopoeial)

merekomendasikan untuk menggunakan kisaran hitung antara :

* 25 dan 250 koloni/cawan untuk bakteri pada umumnya dan Candida albicans.

* 8-80 koloni / cawan untuk Aspergillus niger.

PRINSIP PERHITUNGAN

ASTM (American Standard Testing and Methods) menyarankan untuk menggunakan kisaran hitung:

* 20-80 koloni/membran jika menggunakan teknik filtrasi membran.

* 20-200 koloni/cawan untuk spread plate, dan

* 30-300 koloni/cawan untuk pour plate.

FDA BAM (Food and Drug Administration, Bacteriological Analytical Manual) merekomendasikan 25-250 koloni/cawan sebagai kisaran hitung secara keseluruhan.

PRINSIP PERHITUNGAN

Kisaran Hitung

Batas Atas Kisaran Hitung

Istilah untuk menggambarkan jumlah koloni yang melebihi batas atas kisaran hitung adalah TNTC (Too Numerous To Count). ASTM menyarankan untuk melaporkan TNTC sebagai lebih besar dari batas atas.

Misal :

Pada metode spread plate, ditemukan >200 CFU pada cawan dari pengenceran 1/10.

Cara pelaporan >2000 CFU/ml(g).

PRINSIP PERHITUNGAN

Mengapa Harus Ada Batas Atas?

Jumlah koloni yang tumbuh diberi batas maximal, karena semakin banyak koloni yang tumbuh pada permukaan agar, maka antar koloni dapat saling mempengaruhi baik menekan atau menstimulus pertumbuhan koloni tetangganya dan juga perebutan nutrisi dan tempat yang semakin ketat. Oleh karena itulah banyak koloni yang “hilang” sehingga menampakkan pengurangan koloni yang muncul pada cawan.

PRINSIP PERHITUNGAN

Mengapa Harus Ada Batas Atas?

Batas Bawah Kisaran Hitung

Titik konsentrasi pada batas bawah kisaran hitung ini berada pada pelaporan :

* Limit of detection / LOD (1 CFU) dan

* Limit of Quantification / LOQ (<25 CFU atau <30CFU).

LOD adalah jumlah minimum koloni yang dapat dibedakan dari ketidakadaan.

LOQ adalah suatu batas jumlah koloni yang cukup/pantas untuk dapat dihitung dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima.

PRINSIP PERHITUNGAN

Cara Pelaporan Jika JumlahKoloni di Bawah Kisara Hitung Jika Tidak Ada Pertumbuhan

Dilaporkan < 1 CFU/ml jika tidak ada pertumbuhan pada cawan dalam suatu pengenceran.Misalnya <10 CFU/ml untuk pengenceran 1/10.angka <1 didapatkan dari LOD yaitu 1 CFU.

Jika jumlah koloni di bawah batas bawah kisaran hitung.

Derajat Kesalahan Pada JumlahKoloni Yang Rendah

Jika kita melaporkan perhitungan cawan yang memiliki jumlah koloni <25, maka analisa ini mempunyai tingkat akurasi yang rendah. Secara teoretis jika jumlah koloni /cawan dibawah 25 maka kesalahan statistik yang digambarkan dalam persentase mean akan meningkat pesat karena estimasi kesalahan (error) adalah akar kuadrat dari mean sehingga nilai persentase mean akan seperti pada grafik diatas (grafik derajat kesalahan pada jumlah koloni yang rendah).

Cara MenghitungKhusus untuk spread plate (aerobic plate count)

1. Dipilih cawan yang mempunyai koloni 25-250 koloniatau 30-300 koloni. Lalu dihitung dengan rumus :

Contoh Perhitunganspread plate (aerobic plate count)

Pada contoh 2 ini tidak dapat dimasukkan ke dalam rumus karena terdapat kesalahan dalam teknisi menganalisanya. Pada rumus terdapat n1 dan n2. kenapa tidak ada n3? Karena setiap pengenceran diencerkan 1/10-nya sedangkan kisarannya adalah 25-250 koloni. Pada kasus diatas pada pengenceran 1/100 (250) diencerkan 1/10-nya didapat 181. seharusnya sekitar 25 koloni, sehingga tidak mungkin ada n3.

spread plate (aerobic plate count)

2. Jika dijumpai cawan yang memiliki koloni diluar kisaran 25-250 maka dipilih cawan yang mempunyai jumlah koloni yang paling mendekati.

3. Semua cawan yang memiliki pertumbuhan koloni yang menyebar di permukaan agar dilaporkan sebagai koloni menyebar (spreader/ SPR) atau kecelakaan laboratorium (Lab Accident/ LA).

Tata cara diatas digunakan khusus untuk plate count dengan teknik spread plate atau yang disebut Aerobic Plate

Count. Untuk teknik plating dengan pour plate atau filtrasi membran pada dasarnya prinsip-prinsip mengenai

perhitungannya adalah sama, hanya disesuaikan dengan kisaran hitung yang telah dipersyaratkan.

spread plate (aerobic plate count)

Pembulatan dan merata-ratakan.Pembulatan diperlukan jika dijumpai hasil perhitungandengan tiga digit angka signifikan.

1. Menurut USP dan ASTPembulatan dibulatkan keatas jika digit ketiga adalah ≥5 dan pembulatan dibulatkan ke bawah jika digit ketiga adalah <5.

2. Menurut BAMdibulatkan ke atas jika digit ketiga ≥6 (6,7,8,9) dan dibulatkan ke bawah jika ≤4 (4,3,2,1). Bila digit ketiga adalah 5 maka dibulatkan ke atas jika digit kedua adalah ganjil dan dibulatkan ke bawah jika digit kedua adalah genap.

Contoh Pembulatan

Terima Kasih !!