Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.

Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yanguncomplicatedwaktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu :1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.

Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yanguncomplicatedwaktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu :1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

222222222222222222222222222222222Kromatografi(dasar)OKT 23Posted bydenikrisnangik ngok tiba-tiba dapet kejutan listrik untuk menulis ini. walau sebenarnya juga masih pemula tentang kromatografi yang baru didapat di semester ini, tp sekalian belajarlah.:)Apa itu Kromatografi?Kalau bicara tentang kromatografi pasti ada beberapa definisi dengan kata-kata yang beda. Salah satunya menyebutkan bahwa,Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak.Dari pengertian di atas dapat diketahui kalo ada dua komponen penting dalam kromatografi yaitu fase diam dan fase gerak. Dan perlu dicatat bahwa hasil pemisahan kromatografi yang baik bukan lagi berbentuk senyawa melainkan berbentuktunggal.Fase diam (Stationary phase)Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.Fase gerak (Mobile phase)Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagaicarrier gassenyawa mudah menguap (volatil)Pemisahan dengan kromatografiPemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi. kenapa? Karena sering diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu permukaan antar fase pada kromatografi lebih besar.Lalu apa yang menyebabkan senyawa tersebut dapat dipisahkan?Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya kalo pemisahan senyawa-senyawa dapat diamati dengan perbedaan waktu retensi (tR) pada kromatogram.Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke detektorSemakin lama analit berinteraksi dengan fase diam > semakin lama ia keluar > tR semakin besarSehingga ada suatu konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam. Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerakDari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam besar dan migrasinya semakin lambat.Parameter kinetika pemisahanFaktor Selektifitas ()Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam campuranuntuk mendapat selektifitas yang maksimum maka harus dicari interaksi yang sesuai (apakah partisi, adsorpsi,size exclusion,atauion exchange). Faktor selektifitas () dapat dicari dengan: = k2/k1 = (tR2-tm)/(tR1-tm)Apabila kedua senyawa memiliki nilai K yang sama / = 1 maka kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. karena waktu retensinya identik.Faktor Spesifisitas (Kd)Sifat spesifisitas dari kromatografi didasarkan pada sifat dari senyawa yang spesifik. Senyawa memiliki sifat spesifik karena memiliki Kd yang spesifik.Kapasitas Kolom (K)Menunjukkan kemampuan kolom menampung analit. Semakin lama analit berada dalam kolom, akan semakinb esar nilai kapasitasnya. Nilai K yang bagus antara 1-10. Jika k terlalu kecil, kemungkinan pemisahannya belum sempurna dan jika terlalu besar maka akan terjadi pelebaran puncak.Resolusi (Rs)Untuk taraf kepercayaan 95%, harga Rs yang baik adalah>1,5. Jika kurang dari ini maka puncak dari masing2 analit akan saling tumpang tindihJumlah Lempeng Teoritis (Neff)Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi.Interaksi Analit dan Fase diamSetelah tahu tentang konsep pemisahan nyambung kesini. Sebenarnya secara sederhana mekanisme pemisahan analit dibedakan menjadi 4, hal ini yang mengakibatkan perbedaan waktu retensi karena perbedaan interaksi analit dengan fase diamnya.1. AdsorbsiFase diam: PadatanFase gerak: Cair (bisa juga gas pada Kromatografi padat-gas)Dasar pemisahan: Stereokimia

2. PartisiFase diam: CairFase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas)Dasar pemisahan: Partisi-konseplike dissolves likeUntuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam > tR lebih besarSebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu (kaya praktikum HPLC hehe) dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar. maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam. sedangkan parasetamol bisa terlarut dikit tp cuma sebentar.

3. Penukar ion (bahasa kerennya:ion exchange)mekanisme pemisahan karena interaksiionikantara fase diam dan solut. biasanya dipake di pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion (sori lupa namanya haha). berdasarkan muatan yang dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:a. Penukar anion: Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik fase diamb. Penukar kation: Fase diamnya bermuatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan ketarik fase diam

4. Ekslusi ukuran (bahasa kerennya:Size Exclusion Chromatography)Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori berukuran tertentu.Jadi ntar saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka dapat masuk semakin dalam. sedangkan molekul yg besar dia g bisa masuk ke pori sehingga langsung terelusi.Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada partikel dengan ukuran kecil (BM kecil)

Pelebaran puncak kromatogramSelesai dipisahkan di kolom, dibawa ke detektor dan dicetak oleh rekorder maka kita dapat yang namanyakromatogram. Secara resmi yg ada di buku B) kromatogram merupakan profil konsentrasi yang simetri dalam arah aliran fase gerak (?)gampangnya sih yang sumbu x itu waktu, sumbu y signal yg diterima detektorKromatogram yang ideal alias yg bagus yaitu yang tinggi, ramping dan tidak saling tindih antar satu puncak dengan lain. Namun kadang (bahkan sering sih) terjadi pelebaran puncak kromatogram. Apa aja penyebabnya:1.Eddy diffusionKolom kan dikemas pake partikel fase diam yang kecil. Trus fase gerak lewat sambil bawa analit. Nah ada beberapa analit yang bisa lewat dengan mudah trus sampe detektor daripada beberapa partikel yang mengalami pengalihan (diversi) karena jalannya belok2. Buat lebih jelasnya liat di gambar:

Di gambar di atas kan bisa dilihat bahwa partikel B beruntung jalan yg dilewati tiada hambatan. ia tinggal lurus tanpa susah-susah. Beda dengan A dan C. Mereka berdua harus susah payah nglewatin halangan rintangan partikel fase diam. Partikel C halangannya lebih sedikit dari partikel B sehingga nyampe ke detektor setelah A. Sedangkan A harus belok jauh nyari jalan baru bisa nyampe.Untuk meminimalkannya dengan pake kolom dengan partikel yang homogen densitasnya.2.Longitudinal diffusionBiasanya terjadi jika kecepatan alir fase gerak lambat. Pada keadaan tersebut, aliran fase gerak dengan analit di yang dekat dengan fase diam akan lambat karena adanya Vander walls force sedangkan yang berada di tengah lebih cepat alirannya namun konsentrasinya lebih kecil daripada yang samping. Karenanya analit yang semula tertahan oleh gaya Vanderwalls di samping akan berdifusi ke tengah sesuai dengan hukum Ficks.Cara meminimalkannya: mempercepat laju alir dan menurunkan temperatur.3.Mass transfer equilibrumKalo yang ini biasanya terjadi kalo laju alir terlalu cepat dan pemisahan pada kolom belum tercapai sempurna.Cara meminimalkannya:a. pake partikel kecil, karena luas permukaan besar sehingga kesetimbangan cepat tercapaib. Menaikkan temperaturc. Laju alir diperlambatJika faktor-faktor tersebut dibuat suatu kurva dengan H(tinggi lempeng teoritis) sebagai sumbu y dan V (kecepatan alir) sebagai sumbu x, maka akan didapat kecepatan alir optimum. Kurva ini disebut dengan kurva Van deemter.Kurva van deemter ini didapat dari persamaan van deemter:H = A+B/u+Cudimana A merupakan konstanta difusi eddy, B merupakan konstanta difusi longitudinal, C merupakan konstanta transfer massa, dan u merupakan laju alir fase gerak.Dari persamaan tersebut dapat dilihat bahwa efisiensipemisahan pada kromatografi bergantung pada ketiga faktor diatas, dan pelebaran puncak yang disebabkan oleh difusi longitudinal dan transfer massa bergantung pada laju alir fase gerak (seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya). Karenanya dari kurva van deemter dapat diperoleh laju alir fase gerak yang optimum.

Dari kedua gambar di atas kurva paling atas (yg ada tulisan HETP) merupakan resultan dari ketiga gaya tsb. Semakin tinggi resultan > HETP semakin tinggi berarti efisiensi kolom lebih jelek.Sedangkan makin rendah resultan > HETP makin rendah efisiensi kolom lebih baik.Kenapa?Karena ada rumus lagi yaitu:Jumlah lempeng teoritis = Panjang kolom / HETP (lebar lempeng teoritis)atauN = L / HETPEfisiensi kolom meningkat jika N / jumlah lempeng teoritis meningkat. Kenapa? Karena semakin banyak lempeng teoritis maka pemisahan semakin baik (diumpamakan semakin banyak pula corong pisahnya ekstraksinya lebih baik). Semakin panjang L (panjang kolom) maka semakin banyak jumlah lempeng teoritis dan efisiensi semakin bagus.Namun bila HETP lebih besar efisiensi kolom jelek. kenapa? Karena berarti lebar untuk 1 kolom teoritis lebih besar sehingga dalam kolom yg panjangnya sama, jumlah lempeng teoritisnya lebih sedikit. Misalnya ada dua kolom, dimana panjang kolom (L) nya sama2 100 cm. Kolom 1 HETPnya 5 cm sedangkan kolom 2 HETPnya 10 cm. Berarti dalam kolom 1 ada 20 lempeng teoritis kan (dari 100/5) ? lebih besar daripada di kolom 2 yg lempeng teoritisnya cuma 10 (100/10)2222222222222222222222222222