KAJIAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP Salmonella ... · Ayam Kampung merupakan salah satu rumpun...

KAJIAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP Salmonella enteritidis MENGGUNAKAN GEN TLR4

SEBAGAI PENCIRI GENETIK

NIKEN ULUPI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Kajian Ketahanan

Ayam Kampung terhadap Salmonella enteritidis Menggunakan Gen TLR4 sebagai Penciri Genetik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Januari 2014

Niken Ulupi NIM D161114011

RINGKASAN

NIKEN ULUPI. Kajian Ketahanan Ayam Kampung terhadap Salmonella enteritidis Menggunakan Gen TLR4 sebagai Penciri Genetik. Dibimbing oleh MULADNO, CECE SUMANTRI dan I WAYAN TEGUH WIBAWAN.

Ayam Kampung merupakan salah satu rumpun ayam lokal Indonesia yang tidak mempunyai ciri yang khas dan tersebar di berbagai wilayah di Indonesia. Telur yang dihasilkan ayam Kampung dipercaya sebagian besar masyarakat Indonesia dapat meningkatkan stamina tubuh dan dapat menyembuhkan penyakit. Oleh sebab itu telur ayam Kampung dimanfaatkan sebagai jamu atau bagian dari ramuan jamu yang dikonsumsi secara langsung tanpa melalui pemasakan.

Keberadaan telur bebas Salmonella, menjadi sangat penting untuk keamanan jamu, agar pengguna telur ayam Kampung terbebas dari salmonellosis. Telur bebas Salmonella hanya diproduksi oleh ayam yang tahan terhadap bakteri tersebut. Salah satu indikator ketahanan ayam terhadap Salmonella sp adalah keaktifan gen Toll-like Receptor 4 (TLR4). Gen TLR4 berasosiasi dengan respons imun non spesifik, karena mentranskripsi protein TLR4. Protein TLR4 merupakan reseptor permukaan sel fagosit dan berperan dalam pengenalan lipopolisakarida (LPS) bakteri gram negatif, termasuk Salmonella sp.

Tujuan penelitian adalah membuktikan ketahanan ayam Kampung terhadap S.enteritidis dengan menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik. Pembuktian dilakukan dengan menganalisis asosiasi antara genotipe gen TLR4 dengan faktor-faktor yang merupakan indikator ketahanan ayam terhadap bakteri S. enteritidis yang diperoleh melalui pengujian secara molekuler dan biologis.

Untuk mengidentifikasi genotipe gen TLR4, 50 ekor ayam Kampung betina dewasa di genotyping menggunakan teknik PCR-RFLP (penelitian tahap pertama). Pada tahap kedua, dilakukan pengujian terhadap beberapa indikator ketahanan ayam terhadap infeksi S. enteritidis yang diperoleh secara alami. Pada tahap ketiga adalah pengujian ketahanan ayam saat ditantang dengan S. enteritidis (dosis ID50 : 105 cfu ml-1), melalui pengujian secara molekuler dan biologis. Hasil pengujian ini kemudian diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4, dan dianalisis dengan Analysis of variance (ANOVA).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan teknik PCR-RFLP pada exon 2 gen TLR4 ayam Kampung teridentifikasi bersifat polimorfik. Pada situs ke 3924 terdeteksi adanya mutasi, yang menyebabkan perubahan basa dari guanin menjadi adenin (GA). Dari pengujian ini ditemukan tiga macam genotipe gen TLR4 yaitu AA, AG dan GG. Genotipe GG mendominasi frekuensi genotipe gen TLR4 ayam Kampung. Genotipe AA hanya ditemukan dari satu individu ayam Kampung, sehingga dalam analisis assosiasi selanjutnya tidak disertakan dalam pengujian secara statistik.

Penelitian tahap kedua diperoleh bahwa pada ketiga genotipe gen TLR4 ayam Kampung yang diteliti tidak ditemukan S. enteritidis di dalam darah dan telur yang dihasilkan. Pada serum darah ayam Kampung positif ditemukan IgY spesifik S. enteritidis (pada semua genotipe). Kuning telur yang dihasilkan ayam Kampung ditemukan mengandung IgY spesifik S. enteritidis dalam konsentrasi yang tinggi (2.47-3.58 mg ml-1). Pada semua genotipe, konsentrasi leukosit dan diferensiasinya berada pada kisaran normal secara fisiologis.

Ayam Kampung yang ditantang dengan S. enteritidis, tidak terjadi gangguan secara fisiologis, hal ini terlihat dari hasil pengujian konsentrasi leukosit dan diferensiasinya yang tetap berada pada kisaran normal. Meskipun ditantang dengan S. enteritidis, pada ketiga genotipe tersebut tidak ditemukan S. enteritidis di dalam darah dan telur yang dihasilkannya. Hal ini disebabkan karena hasil pengujian aktivitas fagositosis (pada ketiga genotipe gen TLR4) diperoleh nilai yang sangat tinggi, sehingga mampu clearence terhadap S. enteritidis yang dipaparkan. Nilai aktifitas makrofag dari genotipe AA, AG dan GG masing-masing 74.00, 74.40 ± 4.39, dan 71.86 ± 3.72%. Nilai kapasitas makrofagnya sebesar 40.96, 40.33 ± 1.26 dan 42.13 ± 3.29 bakteri makrofag-1. Antara genotipe AG dan GG tidak berbeda secara statistik terhadap nilai aktivitas dan kapasitas makrofag yang dihasilkan.

Tingginya nilai aktivitas fagositosis dari sel makrofag ini disebabkan karena ketiga genotipe gen TLR4 termasuk kategori aktif. Hasil pengujian ekspresi gen pada ketiga genotipe tersebut, baik yang diperoleh dari jaringan usus maupun ginjal setelah dipapar dengan S. enteritidis menghasilkan jumlah kopi mRNA yang tinggi. Hasil analisis antara genotipe AG dan GG tidak berbeda terhadap jumlah kopi mRNA. Rataan jumlah kopi mRNA secara keseluruhan berkisar antara 1.12-3.92 x 107.

Konsumsi pakan pada ayam bergenotipe AA, AG, dan GG masing-masing sebesar 91.70, 92.19 ± 4.28, dan 91.20 ± 2.67 g ekor-1 hari-1. Bobot telur yang dihasilkan hampir sama yaitu berkisar antara 40.47-41.00 g butir-1. Produksi telur hen day pada AA, AG, dan GG masing-masing 60.00, 62.23 ± 13.72, dan 34.84 ± 11.86%.

Dari serangkaian penelitian ini diperoleh bahwa gen TLR4 ayam Kampung bersifat polimorfik, dengan ditemukan 3 macam genotipe (AA, AG dan GG). Ketiga genotipe ini tidak berasosiasi dengan ketahanannya terhadap infeksi S. enteritidis, baik secara alami maupun artifisial melalui uji tantang. Ketiga genotipe gen TLR4 ayam Kampung tahan terhadap bakteri S. enteritidis dan telur yang dihasilkan mengandung IgY spesifik S. enteritidis dengan konsentrasi tinggi.

Kata kunci : ayam Kampung, gen TLR4, respons imun non spesifik, S. enteritidis

SUMMARY NIKEN ULUPI. Study of Kampung Chicken Resistance Against Salmonella enteritidis Using TLR4 Gene as Marker. Supervised by MULADNO, CECE SUMANTRI and I WAYAN TEGUH WIBAWAN.

Kampung chicken is a kind of Indonesian local chicken that do not have special characteristic and spread out in various regions of Indonesia. Kampung chicken eggs is trusted by the majority of Indonesian people to increase stamina and to heal diseases. Therefore Kampung chicken eggs was mostly used by Indonesian people as ‘jamu’ (a potion) or as an ingredient of potion that it was directly consumed without cooking.

Salmonella free eggs become significant in producing the safe ‘jamu preparation’ so that the users of Kampung chicken eggs be spared from salmonellosis. Salmonella free eggs might be produced by chickens which have high resistancy to this bacteria. One of excellent markers showing resistance of chicken against Salmonella is an active Toll-like Receptor 4 (TLR4) gene. TLR4 gene was associated with non-specific immune response, because it transcribes TLR4 protein, which is a phagocytes cell surface receptor that plays a role to recognize lipopolysaccaride of gram negative bacteria including Salmonella sp.

The aim of the research was to prove resistance of Kampung chicken against S. enteritidis, using TLR4 gene as marker. The evidence was done by analyzing the association between genotype TLR4 gene with the factors that indicate the resistance to these bacteria that was obtained from molecular and biological assays.

To identify the genotype TLR4 gene, 50 Kampung chickens was genotyped using PCR-RFLP technique (the first stage of these study). The second stage was conducted tests on several chickens resistance indicators against S. enteritidis from natural infection. The third stage in these research was testing resistance of chickens when was challenged with S. enteritidis (ID50 dose : 105 cfu ml-1), through molecular and biological assays. Then the test results were associated with genotype of TLR4 gene, and it was analyzed by ANOVA (analysis of variance).

The results showed that the PCR-RFLP technique in exon 2 of TLR4 gene was identified that this gene on the Kampung chicken was polymorphic. A presence of mutation was detected on site 3924. This mutation caused bases change from guanine to adenine (GA). From this genotyped was found three kinds of genotype TLR4 gene. They were AA, AG and GG. GG genotype dominated the genotype frequencies of TLR4 gene of Kampung chickens. AA genotype was only found on one individual Kampung chicken, so in subsequent association analysis was not included in the statistical test.

The second stage of this study showed that in all of TLR4 gene genotypes of the Kampung chicken was not found S. enteritidis in the blood and eggs produced. In the blood serum of Kampung chicken positive was found IgY specific S. enteritidis (in all genotypes). Egg yolk that produced by Kampung chicken was found specific IgY of S. enteritidis in high concentrations (2.47-3.58 mg ml-1). On all genotypes, the concentration of leucocytes and differentiation of leucocytes were in the range of physiological normal.

Kampung chickens which were challenged with S. enteritidis not impaired physiological, it is seen from the results the concentration of leucocytes and differentiation of leucocytes assays that were still in the normal range. Although the Kampung chicken was challenged with S. enteritidis, in all genotypes were not found S. enteritidis in the blood and eggs were produced. It happened because the results of phagocytic activity assays (on all genotypes of TLR4 gene) was obtained a very high value. The value of macrophage activity of AA, AG and GG genotypes respectively 74.00, 74.40 ± 4.39, and 71.86 ± 3.72%. The value of macrophage capacity of these genotypes were 40.96, 40.33 ± 1.26 dan 42.13 ± 3.29 bacteria macrophage-1. The value of macrophage activity and capacity from AG and GG genotypes were not statistically different.

The high value of the phagocytic activity of macrophage was caused by the all of TLR4 gene genotypes include an active category. The results assay on the TLR4 gene expression of AA, AG, and GG genotypes that obtained from the intestine and kidney tissues after being exposed with S. enteritidis produces a high copy number of mRNA. The number of mRNA copies from AG and GG genotypes were not statistically different. The overall of the mRNA copies number were ranged 1.12-3.92 x 107.

Feed consumption on AA, AG, and GG genotypes was obtained at 91.70, 92.19 ± 4.28, and 91.20 ± 2.67 g bird-1 day-1. Eggs weight that was produced almost the same and it ranged between 40.47-41.00 g egg-1. Egg production (hen day) was obtained at 60.00, 62.23 ± 13.72, and 34.84 ± 11.86%.

From a series of the observations in this study were obtained that the TLR4 gene of Kampung chicken was polymorphic with three kinds of genotypes (AA, AG and GG) found. The three kinds of TLR4 gene genotypes in this study did not associate with resistance to S. enteritidis infection, either natural infection or artificial infection through a challenge test. All of TLR4 gene genotypes on Kampung chicken were category resistant to S. enteritidis bacteria. Eggs were produced by the Kampung chicken with AA, AG, and GG genotypes contained specific antibodies to S. enteritidis with high concentrations.

Key words : Kampung chicken, TLR4 gene, non specific immune response, S.

enteritidis.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan sesuatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KAJIAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP Salmonella enteritidis MENGGUNAKAN GEN TLR4

SEBAGAI PENCIRI GENETIK

NIKEN ULUPI

Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktor pada

Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2014

Penguji pada Ujian Tertutup : Prof Dr Ir Dewi Apri Astuti, MS drh Surachmi Setyaningsih, PhD

Penguji pada Ujian Terbuka : drh Kamaluddin Zarkasie, PhD

Prof (R) Dr Ir Sofyan Iskandar, MSc

Judul Disertasi : Kajian Ketahanan Ayam Kampung terhadap Salmonella enteritidis Menggunakan Gen TLR4 sebagai Penciri Genetik

Nama : Niken Ulupi NIM : D161114011

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Prof Dr Ir Muladno, MSA Ketua

Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc

Prof Dr drh I Wayan Teguh Wibawan, MS Anggota Anggota

Diketahui oleh Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Dr Ir Salundik, MSi Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr Tanggal Ujian : 25 Pebruari 2014 Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak awal bulan April sampai September 2013, adalah “Kajian Ketahanan Ayam Kampung terhadap Salmonella enteritidis Menggunakan Gen TLR4 sebagai Penciri Genetik”. Disertasi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa proses penelitian dan penulisan disertasi ini tidak akan berjalan lancar tanpa dukungan banyak pihak. Oleh sebab itu pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih. Kepada yang terhormat Bapak Prof Dr Ir Muladno, MSA, Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc, Bapak Prof Dr drh I Wayan Teguh Wibawan, MS selaku komisi pembimbing, penulis menghaturkan ucapan terimakasih atas curahan waktu, arahan, bimbingan, dan dorongan semangat mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian hingga penulisan disertasi. Penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Ibu Prof Dr Ir Dewi Apri Astuti, MS dan Ibu drh Surachmi Setiyaningsih, PhD selaku penguji luar komisi pada ujian tertutup dan kepada Bapak drh Kamaluddin Zarkasie PhD dan Bapak Prof Dr Ir Sofyan Iskandar, MSc selaku penguji luar komisi pada ujian terbuka, atas saran dan masukan yang diberikan.

Kepada Dekan Fakultas Peternakan IPB, Bapak Prof Dr Ir Luki Abdullah, MScAgr, penulis sangat berterimakasih atas perhatian dan dorongan semangat yang diberikan. Secara khusus, penulis juga ingin menyampaikan ucapan terimakasih kepada Bapak Prof Dr Ir Ronny Rachman Noor, MRurSc dan Ibu (almh) Dr Ir Rarah Ratih Aji Maheswari, DEA, atas dorongan yang tak henti-henti agar penulis melanjutkan studi. Terimakasih kepada teman-teman staf pengajar di Departemen IPTP khususnya dan di Fakultas Peternakan umumnya, tempat penulis menanyakan banyak hal tentang ilmu yang terkait dengan studi yang sedang penulis jalani.

Kepada ananda Eryk Andreas, SPt MSi, penulis mengucapkan terimakasih atas pendampingannya selama melaksanakan penelitian di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak Molekuler. Kepada Bapak Agus Somantri dan mbak Selyn (teknisi Laboratorium Bakteriologi, FKH-IPB), Ibu Sri dan Ibu Ida (teknisi Laboratorium Fisiologi, FKH-IPB), penulis juga menyampaikan terimakasih atas kesabaran Bapak dan Ibu selama mendampingi pelaksanaan penelitian di laboratorium. Kepada ananda Trubus Tri Ihwantoro, yang dengan tekun membantu pelaksanaan pemeliharaan ayam saat penelitian, penulis mengucapkan terimakasih. Kepada Ibu Prof Dr drh Retno Damayanti, MS, penulis mengucapkan terima kasih atas pengarahannya mengenai pengujian IgY menggunakan metode Indirect ELISA.

Kepada Dr Ir Salundik, MSi selaku Ketua Program Studi ITP dan jajarannya (Ibu Ade dan mbak Okta) di Sekretariat Pasca ITP, penulis menyampaikan terimakasih atas pelayanan prima selama penulis menempuh studi. Kepada teman-teman seperjuangan di Program Studi ITP angkatan tahun 2011 dan 2012, khususnya Pak Amru dan Bu Yayuk, terimakasih atas kebersamaannya dalam diskusi-diskusi selama ini. Semoga persahabatan dan kerjasama ini tetap terjalin pada waktu-waktu mendatang. Kepada semua pihak yang telah membantu, yang tidak dapat disebutkan satu persatu penulis juga mengucapkan terima kasih.

Terima kasih kepada Direktorat Jendral Perguruan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia atas beasiswa BPPS dan didanainya Penelitian Hibah Pasca (Nomor : 63/IT3.41.2/SPK/2013), sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dengan lancar.

Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada suami (Tjiptadi) dan anak-anak (Anggi Kusumadewi-Muhammad Darun Najat, Laras Ratih Maheswari dan Sarah Rahmania Hanif), cucu tersayang (Aliyah Izar Azalia), Ibu, dan seluruh keluarga besar atas doa, kasih sayang, kesabaran, dukungan dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Pebruari 2014

Niken Ulupi

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

ix

DAFTAR GAMBAR x 1 PENDAHULUAN

Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Hipotesis Ruang Lingkup penelitian

1 3 4 4 4 5

2 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN TLR4 AYAM LOKAL MENGGUNAKAN TEKNIK PCR-RFLP

Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Simpulan

6 9

12 17

3 ASOSIASI GENOTIPE GEN TLR4 DENGAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP INFEKSI S. enteritidis SECARA ALAMI


18 21 24 30

4 ASOSIASI GENOTIPE GEN TLR4 DENGAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG SAAT DITANTANG S. enteritidis


31 31 35 41

5 PEMBAHASAN UMUM

42

6 SIMPULAN DAN SARAN

46

DAFTAR PUSTAKA 47

LAMPIRAN 51

DAFTAR TABEL

1.1 Beberapa gen yang mengontrol ketahanan ayam terhadap S. enteritidis

2

1.2 Tahapan penelitian dan tujuan yang hendak dicapai 5 2.1 Struktur gen TLR4 pada ayam dan ukurannya 8

2.2 Total sampel DNA ayam lokal yang digunakan dalam penelitian 10 2.3 Nilai frekuensi alel dan frekuensi genotipe gen TLR4 pada ayam

lokal 14

2.4 Hasil uji chi-square (x2) gen TLR4 ayam lokal 15

2.5 Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) serta nilai PIC gen TLR4 pada ayam lokal

16

3.1 Pengelompokan Salmonella berdasarkan target sasarannya 19 3.2 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan konsentrasi

leukosit dan diferensiasinya 25

3.3 Kisaran suhu harian di dalam kandang ayam selama penelitian 26

3.4 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darah dan kuning telur

28

3.5 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan keberadaan S. enteritidis dalam darah dan telur

29

4.1 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan ekspresinya saat ditantang dengan S. enteritidis

35

4.2 Asosiasi genotipe gen TLR4 dengan konsentrasi leukosit dan diferensiasinya pada ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis

37

4.3 Respons pembentukan limfosit sebelum dan sesudah pelaksanaan uji tantang

37

4.4 Asosiasi genotipe gen TLR4 dengan aktivitas dan kapasitas makrofag ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis

38

4.5 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan keberadaan S. enteritidis dalam darah dan telur saat pelaksanaan uji tantang

39

4.6 Konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur sebelum dan setelah ayam Kampung ditantang dengan S. enteritidis

39

4.7 Asosiasi genotipe gen TLR4 dengan parameter aspek produksi ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis

41

DAFTAR GAMBAR

1.1 Bagan kerangka pemikiran penelitian 3

2.1 Beberapa jenis ayam lokal Indonesia : ayam Kampung (a), ayam Pelung (b), ayam Sentul (c), ayam Tolaki (d)

7

2.2 Struktur gen TLR4 pada ayam. P = wilayah promotor. E1,2,3 = wilayah exon 1,2,3. I1,2 = wilayah intron 1,2 (GenBank, A Y064697.1).

8

2.3 Sekuen gen TLR4 yang diamplifikasi (GenBank, A Y064697.1). Posisi primer menempel pada nukleutida yang bergaris bawah

13

2.4 Produk PCR-RFLP gen TLR4 pada exon 2 (dipotong oleh MscI). M : marker 100 pb. N : fragmen gen TLR4 (220 pb). AA, AG dan GG : genotipe gen TLR4

13

3.1 Hasil pengujian AGPT serum darah ayam Kampung dengan gen TLR4 bergenotipe AA, AG dan GG

27

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bakteri Salmonella sp. merupakan salah satu emerging pathogen dalam

foodborne disease, yang banyak dijumpai mengkontaminasi telur ayam. Isolasi kejadian salmonellosis pada manusia karena mengkonsumsi telur ayam, sebagian besar disebabkan oleh bakteri Salmonella enteritidis (Velge et al. 2005). Telur bisa terkontaminasi sejak mulai dari proses pembentukan di dalam tubuh induk yang terinfeksi Salmonella sp. Telur juga bisa tercemar Salmonella sp. dari lingkungan sekitar, sejak telur dikeluarkan dari induk ayam sampai ke tangan konsumen (Gantois et al. 2009).

Nugroho (2005), menyatakan bahwa 1,40% sampel telur segar yang berasal dari 35 peternakan ayam ras petelur di Kabupaten Sleman diketahui positif tercemar Salmonella sp. Pengujian serupa juga dilakukan di Kabupaten Bogor, menemukan bahwa telur ayam ras yang positif tercemar S. enteritidis sebesar 3.12% (Ulupi et al. 2009). Oleh sebab itu, sangat dianjurkan mengkonsumsi telur dalam keadaan benar-benar matang, agar terhindar dari salmonellosis.

Sebagai kearifan lokal, telur ayam Kampung dipercaya oleh masyarakat Indonesia dapat meningkatkan daya tahan tubuh dan menyembuhkan penyakit. Sebagian besar telur ayam Kampung, terutama bagian kuning telurnya, selama ini dimanfaatkan masyarakat sebagai jamu atau bagian dari ramuan jamu yang dikonsumsi secara langsung tanpa melalui pemasakan. Dengan demikian peluang masyarakat yang mengkonsumsi telur ayam Kampung terkena salmonellosis menjadi sangat besar. Meskipun demikian, sejauh ini belum ditemukan laporan mengenai kasus salmonellosis yang diakibatkan karena mengkonsumsi telur ayam Kampung mentah.

Kenyataan tersebut menimbulkan pertanyaaan apakah ayam Kampung secara genetik memiliki ketahanan yang lebih besar terhadap infeksi Salmonella sp. dari pada ayam ras, seperti ketahanannya terhadap infeksi Avian Influenza (AI). Maeda (2005), dari hasil penelitiannya menyatakan bahwa 63% ayam lokal Indonesia, termasuk ayam Kampung, berada pada kategori tahan dan hanya 37% dari ayam lokal ini yang termasuk kategori peka terhadap infeksi virus AI. Hasil pengamatan terhadap ayam ras, 100% termasuk kategori tidak tahan (peka) terhadap infeksi AI.

Secara umum, sistem ketahanan tubuh terdiri atas komponen genetik, molekuler dan seluler yang saling berinteraksi membentuk jaringan komunikasi yang rumit dan luas (Baratawidjaja dan Rengganis 2012). Sebagai komponen genetik, sistem ketahanan tubuh dikontrol oleh banyak gen.

Beberapa gen yang berperan dalam mengontrol ketahanan ayam terhadap Salmonella sp adalah TLRs genes, cytokines genes, apoptosis genes, antimicrobial peptides genes dan cell-surface antigens genes (Susan 2011). Beberapa gen yang merupakan anggota dari kelompok gen tersebut disajikan dalam Tabel 1.1.

Toll-like Receptors (TLRs) genes merupakan kelompok gen yang mentranskripsi protein TLRs (Calenge et al. 2010). Peran protein TLRs adalah sebagai reseptor pada permukaan sel fagosit untuk mengenali pola molekul dari komponen mikroba patogen (Pathogen Associated Molecular Patterns).

Komponen tersebut bisa berasal dari bakteri atau virus yang berfungsi sebagai signaling respons imun bawaan atau innate immunity. Tabel 1.1 Beberapa gen yang mengontrol ketahanan ayam terhadap S. enteritidis

No Kelompok gen Gen

1 Toll-like receptors MD2, TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 2 Cytokines Ah294, Il2, Il4, Il6, Il10, Il18, IFNG, K60,

MIP1B, RANTES, SOCS3, TGFB2, TGFB3, TGFB4

3 Apoptosis Bcl-x, CASP1, Fas, IAP, TRAIL, TNF-R1 4 Antimicrobial peptides AvBD2, AvBD3, AvBD5, AvBD11, AvBD12,

AvBD13 5 Cell-surfase antigens CD3, CD40, MHC2A, MHC2B Sumber : Susan 2011

Komponen bakteri yang berperan sebagai stimulating innate immunity, antara lain : lipopolisakarida (LPS), peptidoglikan, lipoprotein (lipopeptida), dan DNA bakteri (Emertcan et al. 2011). Komponen-komponen ini disebut sebagai ligand, yang kemudian berikatan dengan reseptor TLRs (Kabelitz 2007).

Salah satu anggota dari TLRs genes adalah gen TLR4, yang mentranskripsi reseptor TLR4. Ligand dari reseptor TLR4 adalah LPS dari bakteri gram negatif, termasuk Salmonella sp. (Akashi et al. 2001; Akira dan Takeda 2004). Pada bakteri, LPS adalah indotoksin. Apabila bakteri ini berhasil menginfeksi tubuh, maka komponen inilah yang menyebabkan inflamasi atau peradangan (Gantois et al. 2009). Dengan demikian peran reseptor TLR4 adalah sangat penting untuk mengontrol sejak awal terjadinya peradangan akibat infeksi bakteri Salmonella sp.

Singkatnya, gen TLR4 berperan mentranskripsi protein TLR4. Protein ini berfungsi sebagai reseptor pada permukaan sel fagosit yang dapat mengenali LPS bakteri Salmonella sp. Adanya protein reseptor TLR4 pada permukaan sel fagosit, akan memudahkan sel tersebut dalam menangkap Salmonella sp. yang berhasil menembus dinding usus dan mukosa usus. Hal ini merupakan awal proses fagositosis dari sel fagosit, termasuk makrofag. Selanjutnya makrofag akan menghancurkan Salmonella sp. menjadi partikel-partikel kecil yang kemudian ditampilkan pada permukaan selnya. Pada saat yang demikian sel makrofag berperan sebagai Antigen Presenting Cells (APC). Peran makrofag ini merupakan respons imun non spesifik atau imun bawaan atau innate immunity. Reaksi tersebut selanjutnya akan menginduksi terjadinya respons imun spesifik yang diperantarai oleh sel T helper dan sel B untuk memproduksi antibodi spesifik.

Zhongyong et al. (2012) dalam penelitiannya melaporkan bahwa pada ayam yang termasuk dalam kategori rentan, ditemukan peningkatan jumlah bakteri S. enteritidis di dalam darahnya. Selain itu, juga ditemukan penurunan ekspresi gen TLR4 pada leukositnya. Dengan kata lain, penurunan ekspresi gen TLR4 berdampak pada peningkatan jumlah S. enteritidis di dalam darahnya. Pada kondisi tersebut berarti makrofag dan heterofil kurang mampu melakukan fungsinya sebagai sel fagosit dan clearence terhadap Salmonella sp.

Pada manusia dan tikus, telah dibuktikan bahwa terjadinya mutasi pada gen

TLR4, berdampak terhadap penurunan kemampuan individu dalam mengenali LPS dari bakteri Salmonella sp. Individu tersebut akan menjadi peka dan mudah terinfeksi bakteri Salmonella sp. (Lorenz et al. 2002). Pada ayam ras petelur coklat komersial, gen TLR4 (exon 2, pada situs ke 3924) terdeteksi adanya mutasi. Terjadinya mutasi pada gen TLR4 tersebut menyebabkan terbentuknya variasi genotipe (Beaumont et al. 2003).

Berdasarkan uraian diatas maka gen TLR4 dapat dipergunakan sebagai penciri genetik dalam mengkaji ketahanan tubuh terhadap S. enteritidis. Apakah gen TLR4 juga dapat digunakan sebagai penciri genetik sifat ketahanan terhadap S. enteritidis pada ayam Kampung? Apakah genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung berasosiasi dengan ketahanannya terhadap bakteri tersebut? Apakah ayam Kampung dapat dinyatakan sebagai ternak resisten terhadap bakteri S. enteritidis? Hal-hal tersebut merupakan kajian yang perlu diteliti dan dibuktikan lebih lanjut.

Perumusan Masalah

Sebelum membuat perumusan masalah dalam penelitian ini, terlebih dahulu

disampaikan kerangka pemikiran yang disarikan dari uraian dalam latar belakang tersebut diatas. Bagan kerangka pemikiran ini disajikan dalam Gambar 1.1.

Gambar 1.1 Bagan kerangka pemikiran penelitian

Masalah utama yang ingin diteliti adalah seberapa besar ketahanan ayam Kampung terhadap S. enteritidis, agar pengguna telur ayam Kampung terbebas dari salmonellosis. Ketahanan ayam Kampung terhadap S. enteritidis adalah fenotipik, yang merupakan ekspresi dari faktor genetik, yang dipengaruhi oleh lingkungan. Oleh sebab itu dalam penelitian ini dilakukan pengujian terhadap faktor genetik dan fenotipik yang diekspresikannya.

Pengujian terhadap faktor genetik dilakukan pada gen TLR4 yang berperan sebagai penciri genetik untuk aspek ketahanan. Pengujian terhadap faktor genetik bertujuan untuk mengetahui keragaman genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung. Pengujian terhadap fenotipik (aspek ketahanan ayam) dilakukan secara molekuler dan secara biologis. Kedua hasil pengujian ini kemudian diasosiasikan dengan hasil genotyping gen TLR4 untuk menjawab beberapa pertanyaan berikut :

1. Ada berapa macam genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung? 2. Apakah masing-masing genotipe gen TLR4 ayam Kampung menghasilkan

ketahanan terhadap S. enteritidis yang berbeda pada kondisi normal (alami)? 3. Bagaimana ekspresi masing-masing genotipe gen TLR4 ayam Kampung

terhadap S. enteritidis saat diinfeksi (ditantang) dengan bakteri tersebut?

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian adalah membuktikan ketahanan ayam Kampung terhadap

S. enteritidis menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik. Pembuktian dilakukan dengan menganalisis asosiasi antara genotipe gen TLR4 dengan faktor-faktor yang merupakan indikator ketahanan ayam terhadap bakteri tersebut yang diperoleh melalui pengujian secara molekuler dan biologis.

Manfaat Penelitian

Keluaran dari penelitian ini adalah :

1. Ditemukannya kandidat marka genetik yang merupakan salah satu signaling respons imun bawaan sebagai Marker Assisted Selection (MAS) dalam menghasilkan ayam Kampung yang tahan terhadap infeksi S. enteritidis.

2. Meminimalkan potensi salmonellosis bagi pengguna telur ayam Kampung melalui program seleksi.

Hipotesis

Ayam Kampung dikatagorikan tahan terhadap infeksi bakteri S. enteritidis apabila gen TLR4 dalam keadaan aktif, dan sebagai indikatornya ialah :

1. Menghasilkan ekspresi gen tinggi saat mendapat paparan bakteri tersebut 2. Menghasilkan aktivitas fagositosis yang tinggi 3. Konsentrasi S. enteritidis dalam darah dan telur rendah 4. Konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam serum dan kuning telur tinggi.

Ruang Lingkup Penelitian

Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Penelitian tahap pertama bertujuan mengidentifikasi genotipe gen TLR4 pada beberapa rumpun ayam lokal Indonesia, termasuk ayam Kampung. Penelitian tahap kedua dilakukan pengujian secara biologis terhadap faktor-faktor yang merupakan indikator ketahanan ayam Kampung terhadap S. enteritidis yang diperoleh secara alami. Faktor-faktor tersebut adalah konsentrasi leukosit dan diferensiasinya, konsentrasi S. enteritidis dalam darah dan telur serta pengujian keberadaan IgY spesifik S. enteritidis secara kualitatif dalam serum dan secara kuantitatif dalam kuning telur ayam Kampung.

Tahap ketiga dilakukan pengujian (secara moleluler dan biologis) terhadap faktor-faktor ketahanan ayam Kampung setelah ditantang dengan S. enteritidis. Pengujian secara molekuler dilakukan untuk menganalisis ekspresi gen TLR4 yang dicerminkan dengan jumlah kopi mRNA yang dihasilkan. Pengujian secara biologis pada aspek ketahanan meliputi : konsentrasi leukosit dan diferensiasinya, aktivitas makrofag, kapasitas makrofag, konsentrasi S. enteritidis dalam darah dan telur, serta konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur. Pada aspek produksi dilakukan pengamatan terhadap performanya.

Hasil penelitian pada tahap kedua dan ketiga kemudian diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4. Tujuan dari setiap tahap penelitian ini disajikan pada Tabel 1.2. Ketiga tahap penelitian ini sebenarnya merupakan pengujian terhadap hipotesis yang diajukan, sehingga diharapkan dapat menjawab tujuan secara keseluruhan dari penelitian ini.

Tabel 1.2 Tahapan penelitian dan tujuan yang hendak dicapai

Tahapan penelitian Tujuan

Penelitian 1 Mengidentifikasi genotipe gen TLR4 pada ayam lokal Indonesia.

Penelitian 2 Membuktikan ketahanan ayam Kampung terhadap infeksi S. enteritidis secara alami menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik

Penelitian 3 Membuktikan ketahanan ayam kampung saat ditantang dengan S. enteritidis menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik

2 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN TLR4 AYAM LOKAL MENGGUNAKAN TEKNIK PCR-RFLP

Pendahuluan

Ayam Lokal Indonesia

Perkembangan ayam lokal Indonesia dimulai semenjak proses domestikasi, sehingga dikenal sebagai ayam asli atau native chicken. Proses domestikasi ayam lokal Indonesia sampai saat ini belum terdokumentasi dengan baik, meskipun demikian Sulandari et al. (2007) sudah memulai mendokumentasikannya berdasarkan penemuan arkeologi maupun berdasarkan penelusuran teknik DNA molekuler. Berdasarkan analisis variasi sekuen D-loop mitokondria diketahui bahwa ayam lokal Indonesia merupakan hasil domestikasi ayam hutan merah (Gallus gallus) yang dilakukan oleh penduduk setempat dan memiliki ciri-ciri yang sangat berbeda dengan ayam lokal dari negara lain.

Klasifikasi taksonomi ayam lokal Indonesia adalah sebagai berikut : Dunia : Animalia Filum : Chordata Subfilum : Vertebrata Kelas : Aves Ordo : Galliformes Famili : Phasianidae Genus : Gallus Spesies Subspesies

: :

Gallus gallus Gallus gallus domestikus (Sulandari et al. 2007).

Ayam lokal Indonesia memiliki banyak keragaman, dengan karakteristik morfologis yang berbeda. Ayam lokal yang telah teridentifikasi sedikitnya ada 31 rumpun. Ayam lokal ini merupakan aset yang berharga dalam pembentukan bibit unggul, karena ayam lokal terbukti mampu beradaptasi dengan baik terhadap lingkungan setempat (Nataamijaya 2010). Ayam lokal memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai penghasil daging, penghasil telur, sebagai hobi, atau dikembangkan untuk memenuhi fungsi sosial budaya yang berlaku di berbagai wilayah di Indonesia.

Ayam lokal ini ada yang spesifik, yaitu ayam lokal yang mempunyai ciri khas, dan hanya ditemukan dan berkembang di wilayah tertentu. Sebagai contoh dari ayam lokal yang spesifik antara lain adalah ayam Pelung (memiliki bobot badan besar dan suara khas yang indah), berkembang di Kabupaten Cianjur. Ayam Merawang (memiliki warna bulu dominan columbian, ceker berwarna putih, dan produksi telur tinggi), berkembang di Kecamatan Merawang, Sumatera Selatan. Ayam Kedu Hitam (memiliki warna bulu dan warna kulit hitam, dengan jenger merah), berkembang di Kabupaten Temanggung. Ayam Sentul (memiliki beberapa varietas warna bulu, produksi telur tinggi dan laju pertumbuhan yang cepat), berkembang di Kabupaten Ciamis, dan ayam Tolaki (memiliki bobot yang relatif kecil, tangkas dan agresif), berkembang di Kabupaten Konawe dan

Kabupaten Konawe Selatan, Sulawesi Tenggara. Ayam lokal yang tidak memiliki ciri atau karakteristik khusus dan tersebar

di berbagai wilayah Indonesia disebut sebagai ayam Kampung. Pada Gambar 2.1 dapat dilihat tampilan beberapa rumpun ayam lokal Indonesia.

Gambar 2.1 Beberapa jenis ayam lokal Indonesia : ayam Kampung (a), ayam Pelung (b), ayam Sentul (c), dan ayam Tolaki (d)

Ayam lokal, disatu sisi dikenal sebagai ayam yang memiliki tingkat

produktivitas (pertumbuhan dan produksi telur) yang rendah. Pada sisi yang lain, ayam lokal Indonesia, yang sebagian besar dipelihara pada lingkungan marginal ternyata memiliki beberapa keunggulan. Keunggulan tersebut antara lain adalah mampu beradaptasi dengan sangat baik pada suhu lingkungan tropis, mampu memanfaatkan sumber pakan berkualitas rendah dan relatif tahan terhadap beberapa penyakit.

Penanganan beberapa penyakit berbahaya seperti AI, ND dan infeksi beberapa bakteri, termasuk bakteri Salmonella sp. pada ternak unggas terutama pada ayam ras, selama ini diatasi dengan penerapan biosekuriti yang ketat dan pelaksanaan vaksinasi secara teratur. Perlakuan tersebut hampir tidak pernah dilaksanakan pada ayam lokal. Meskipun demikian populasi ayam lokal Indonesia, termasuk ayam Kampung dari tahun 2000 sampai dengan tahun 2012, secara nasional tetap menunjukkan peningkatan sebesar 5.90% (dari 259.25 juta menjadi 274.56 juta) (Direktorat Jendral Peternakan 2013).

Kenyataan ini bisa dimaknai bahwa meskipun ayam lokal Indonesia hampir tidak tersentuh oleh teknologi vaksinasi maupun biosekuriti yang memadai, tetapi keberadaan ayam lokal Indonesia tetap exist, dan hal yang sebaliknya bila dibandingkan dengan ayam ras. Hal ini kemungkinan karena ayam lokal memang memiliki keunggulan yaitu tahan terhadap beberapa penyakit.

Gen TLR4

Gen TLR4 merupakan anggota dari TLRs genes. Gen TLR4 berperan dalam mentranskripsi protein TLR4. Protein ini merupakan reseptor pada permukaan sel fagosit. Protein reseptor TLR4 memiliki kemampuan mengenali LPS dari bakteri gram negatif, termasuk Salmonella. Selanjutnya reseptor TLR4 ini berperan sebagai signaling respons imun bawaan (Akira dan Takeda 2004).

Data dari GenBank dengan nomer akses A Y064697.1 diperoleh bahwa coding sequence complete gen TLR4 berukuran 11698 pb. Pada ayam, gen TLR4 berada di kromosom 17. Data tersebut bersumber dari darah ayam betina White Leghorn. Berdasarkan strukturnya, gen TLR4 terdiri dari wilayah promotor, exon

(exon 1, exon 2 dan exon 3), intron (intron 1 dan intron 2) dan flanking region. Struktur gen TLR4 pada ayam dapat dilihat pada Gambar 2.2, dan ukuran gen TLR4 disajikan pada Tabel 2.1.

Gambar 2.2 Struktur gen TLR4 pada ayam. P = wilayah promotor. E1,2,3 = wilayah exon 1,2,3. I1,2 = wilayah intron 1,2. FR = wilayah flanking region (GenBank, A Y064697.1)

Tabel 2.1 Struktur gen TLR4 pada ayam dan ukurannya

No Struktur gen TLR4 Ukuran (pb) 1 Promotor 2743 2 Exon 1 105 3 Intron 1 934 4 Exon 2 167 5 Intron 2 984 6 Exon 3 3260 7 Flanking region 3505

Sumber : GenBank (A Y064697.1)

Ruan et al. (2012) meneliti keragaman TLR4 pada bangsa ayam yang berbeda. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ditemukan sembilan keragaman asam amino, delapan diantaranya berlokasi di ekstraseluler dan yang satu berada di sitoplasma. Dari penelitian ini teridentifikasi adanya keragaman gen TLR4 pada bangsa yang berbeda.

Beaumont et al. (2003), melakukan genotyping pada ayam ras petelur coklat (petelur tipe medium) menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik. Pada exon 2, berhasil diamplifikasi fragmen gen TLR4 sepanjang 257 pb. Pada situs ke 3924 terdapat perubahan basa, dari guanin menjadi adenin (GA). Perubahan nukleotida tersebut mengubah asam amino, dari asam glutamat (GAA) menjadi lisina (AAA) Hasil genotyping dengan metoda RCR-SSCP ini, teridentifikasi dua alel, yaitu alel A dan alel G.

Malek et al. (2004) melaporkan bahwa dengan metode PCR-RFLP, terdapat polimorfisme gen TLR4 pada anak ayam broiler. Pada situs ke 3954 (intron 2), terjadi perubahan basa yaitu dari guanin menjadi sitosin (GC). Perubahan nukleotida tersebut tidak mengubah asam amino.

Gary et al. (2003), pada ayam White Leghorn (petelur tipe ringan), mendapatkan sekuens TLR4 dengan 14 variasi, sembilan diantaranya termasuk silent mutations, tidak merubah asam amino, dan yang lima terjadi perubahan asam amino. Kelima perubahan tersebut terjadi pada posisi ke-225 (glisina asam glutamat), pada posisi 301 (asam glutamat asam aspartat), pada posisi 343 (arginina lisina), pada posisi 383 (tirosina histidina) dan pada posisi 611

(glutamina arginina). Perubahan ini menyebabkan protein yang dtranskripsi gen TLR4 juga mengalami perubahan dan menjadi protein yang tidak dikenali.

Berdasarkan uraian diatas dapat dikatakan bahwa gen TLR4 pada ayam ras, baik pada ayam pedaging (broiler) maupun ayam petelur (tipe ringan dan tipe medium), ditemukan adanya mutasi, sehingga menyebabkan terbentuknya variasi genotipe gen TLR4. Pada ayam lokal Indonesia, sejauh ini belum diketahui variasi genotipe gen TLR4.

Oleh sebab itu tujuan dari penelitian tahap ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman genotipe gen TLR4 pada beberapa rumpun ayam lokal Indonesia menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Rumpun ayam tersebut meliputi ayam Kampung, ayam persilangan Kampung-Pelung, ayam Sentul dan ayam Tolaki.

PCR-RFLP

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro yang digunakan untuk menggandakan jumlah molekul Deoxyribonucleic Acid (DNA) pada target tertentu. Penggandaan ini terjadi dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan DNA target melalui bantuan enzim dan oligonukleutida sebagai primer dalam suatu thermocycler (Muladno 2010). Teknik PCR terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama adalah denaturasi, yang merupakan pemisahan DNA untai ganda menjadi untai tunggal. Proses ini terjadi pada suhu sekitar 95 oC. Pada tahap kedua adalah annealing, merupakan penempelan primer pada DNA untai tunggal. Annealing ini terjadi pada suhu sekitar 50-60 oC. Tahap ketiga adalah ekstensi atau perpanjangan. Tahap ini mensintesis DNA baru yang berkomplemen dengan DNA target. Proses PCR biasanya berlangsung 35-40 siklus.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan metode penandaan dengan menggunakan enzim endonuklease untuk memotong DNA pada situs tertentu. Metode ini sangat berguna untuk penyusunan peta genetik pada beberapa spesies ternak. Restriksi endonuklease (RE) adalah enzim yang memisahkan pita DNA (Sironi et al. 2010). Hasil dari pemotongan tersebut berupa fragmen-fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran. Keragaman ukuran potongan DNA yang didapat akibat aktivitas enzim restriksi merupakan akibat adanya variasi dalam jumlah dan distribusi situs restriksi yang ada pada DNA. Dengan kata lain, PCR-RFLP dapat berfungsi sebagai penduga variasi sekuens DNA.

Bahan dan Metode

Penelitian dilakukan dari awal bulan April sampai akhir bulan Mei tahun

2013. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Lapang Divisi Unggas dan Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak Molekuler, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.

Identifikasi keragaman gen TLR4 pada ayam lokal Indonesia dilakukan dalam tiga tahap. Tahap pertama adalah ekstraksi DNA sampel. Tahap berikutnya adalah amplifikasi PCR gen TLR4. Tahap ketiga adalah penentuan genotipe gen TLR4 menggunakan metode RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Total Sampel Sebagian dari penelitian ini menggunakan sampel DNA yang merupakan

koleksi dari Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak Molekuler. Sampel tersebut adalah DNA ayam Sentul dan DNA ayam persilangan Kampung-Pelung. DNA tersebut adalah hasil ekstraksi DNA yang berasal dari darah ayam Sentul dan ayam persilangan Kampung-Pelung. Kedua rumpun ayam tersebut merupakan koleksi dari Divisi Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB.

Selain itu, pada penelitian ini juga menggunakan sampel darah dari ayam Kampung dan ayam Tolaki. Ayam Kampung berasal dari pemeliharaan masyarakat di Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Ayam Tolaki berasal dari pemeliharaan masyarakat di Kecamatan Palangga, Kabupaten Konawe Selatan, Sulawesi Tenggara. Dari sampel darah kedua rumpun ayam ini kemudian dilakukan ekstraksi DNA genom menggunakan metode phenol-chloroform (Sambrook et al. 1989). Total sampel DNA yang digunakan dalam penelitian ini disajikan dalam Tabel 2.2.

Tabel 2.2 Total sampel DNA ayam lokal yang digunakan dalam penelitian

Rumpun ayam lokal Total sampel Kampung 50 Persilangan Kampung-Pelung 36 Sentul 18 Tolaki 32 Total sampel DNA 136

Ekstraksi DNA

Diawali dengan pengambilan sampel darah pada ayam Kampung (50 ekor) dan ayam Tolaki (32 ekor) dari vena brachialis, kemudian dimasukkan ke tabung EDTA 5 ml. Sebanyak 50 µl sampel darah dimasukkan ke dalam tabung ependorf (1.5 ml). Ditambah dengan 1000 µl NaCl 0.2%. Setelah didiamkan 5 menit, di sentrifugase pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit, kemudian dibuang bagian supernatan.

Setelah supernatan dibuang, larutan ditambah 20 µl proteinase K 5 mg ml-1, 40 µl sodium dodesil sulfat (SDS) 10% dan 300 µl 1 x STE (sodium tris EDTA). Campuran larutan dikocok pelan di dalam inkubator pada suhu 55 oC, selama 2 jam. Selanjutnya campuran larutan ini ditambah 400 µl phenol, 400 µl CIAA (Chloroform : Iso Amil Alkohol = 24 : 1), dan 40 µl 5 M NaCl, sambil digoyang pelan selama 1 jam pada suhu ruang. Campuran ini kemudian disentrifugase pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.

Bagian bening (DNA) sebanyak 400 µl dipindahkan menggunakan pipet ke tabung baru (1.5 ml). Tabung yang sudah berisi DNA (bagian bening), ditambah 800 µl etanol absolut dan 40 µl 5 M NaCl, kemudian disimpan dalam freezer selama semalam.

Setelah disimpan satu malam, larutan disentrifugase pada kecepatan 12000

rpm selama 5 menit, lalu bagian supernatan dibuang dan didiamkan dalam keadaan terbuka pada suhu ruang sampai etanol hilang. Ke dalam tabung ini selanjutnya ditambah 100 µl TE 80%. DNA yang diperoleh kemudian disimpan dalam freezer sampai siap dipergunakan.

Amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) gen TLR4

Reaksi PCR menggunakan disain primer sebagai berikut : primer forward (F) : 5’-GCT CAA ATT ATT TTT CAT CAG Tgg CC-3’ dan primer reverse (R) : 5’-ATC TGG ACT GAA AGC TGC AC-3’. Primer ini didisain sendiri dengan menggunakan bantuan dari Primer Designing Tools Program (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast

xi = (2𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 + ∑ 𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 )𝑛𝑛≠1

(2N)

xi = frekuensi alel ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N = total sampel

). Amplifikasi DNA dilakukan pada total volume 25 µl, terdiri dari 2 µl DNA,

15.75 µl air bebas ion steril, 2.5 µl 10 x buffer tanpa Mg2+, 2 µl MgCl2, 0.5 µl 10 mM dNTP, 0.25 µl Taq polimerase, 2 µl primer. Tahap pertama dilakukan satu siklus, meliputi proses denaturasi awal pada 94 oC selama 4 menit. Tahap kedua dilakukan 30 siklus. Setiap siklusnya terdiri dari denaturasi (94 oC, selama 10 detik), annealing (60 oC, selama 1 menit) dan ekstensi (72 oC, selama 2 menit). Tahap ketiga adalah ekstensi akhir (72 oC, 7 menit). Tahap berikutnya diinkubasi pada suhu 4 oC hingga digunakan untuk analisis lebih lanjut. Proses amplifikasi ini memggunakan GeneAmp PCR system 9700 Applied Byosistem.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) gen TLR4

Penentuan genotipe menggunakan metode RFLP. Fragmen gen TLR4 yang merupakan produk PCR, sebanyak 4 µl dipotong dengan restriction endonuclease mix, yang terdiri dari 2 µl : dH2O (1 µl), buffer (0.7 µl), dan 0.3 µl MscI selama 16 jam pada suhu 37 oC. Produk PCR yang sudah dipotong dengan enzim restriksi, kemudian divisualisasikan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 2% dengan buffer 0.5 TBE (Tris Borat EDTA) yang dijalankan pada tegangan 100 V selama 40 menit di bawah UV trans iluminator. Enzim pemotong (MscI), mengenali situs potong TGG|CCA

Analisis Data

Nilai frekuensi alel dan frekuensi genotipe, nilai heterozigositas pengamatan

(Ho) dan heterozigositas harapan (He), nilai keseimbangan Hardy-Weinberg dan nilai Polymorphic Informative Content (PIC) dihitung berdasarkan rumus berikut :

Frekuensi alel (Nei 1987)

Frekuensi genotipe (Nei 1987)

𝑥𝑥𝑛𝑛𝑛𝑛 = ∑ 𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛=1𝑁𝑁

xii = frekuensi genotipe ii ni = jumlah individu bergenotipe ii N = total sampel

Keseimbangan Hardy-Weinberg (H-W) (Hartl & Clark 1997)

x2 = nilai uji chi-squqre O = jumlah pengamatan genotipe ke-i E = jumlah harapan genotipe ke-i

Heterozigositas (Nei 1987)

Ho = heterozigositas pengamatan N1ij = jumlah individu heterozigot pada lokus ke 1 N = jumlah individu yang diamati He = heterozigositas harapan P1i = frekuensi alel ke-i pada lokus-1

Polymorphic Informative Content (PIC) (Bostein et al. 1980)

PIC = Polymorphic Informative Content pi = frekuensi alel ke-i pj = frekuensi alel ke-j n = jumlah alel per penciri

Hasil dan Pembahasan

Genotipe Gen TLR4 Ayam Lokal

Gen TLR4 pada ternak ayam berada pada kromosom 17. Berdasarkan data

yang diperoleh dari GenBank (dengan nomor akses : A Y064697.1), gen TLR4 ini berukuran 11698 pb. Struktur dari gen TLR4, diawali oleh wilayah promotor yang berukuran 2743 pb. Gen TLR4 memiliki tiga exon dan dua intron. Ketiga exon

∑ ∑∑=

−

= +=

−−=n

i

n

i

n

ijjii pppPIC

1

1

1 1

222 21

∑≠

=ji

ijo N

NH 1 ∑

=

−=n

ie pH11

211

tersebut adalah exon 1, 2, dan 3, yang masing-masing berukuran 105 pb, 167 pb, dan 3260 pb. Intron 1 dan intron 2, masing-masing berukuran 934 pb dan 984 pb. Struktur gen TLR4 diakhiri oleh flanking region yang berukuran 3505 pb.

Genotyping gen TLR4 pada ayam lokal ini dilakukan pada exon 2 (dari basa ke 3898-4117), dengan produk PCR berukuran 220 pb, seperti terlihat pada Gambar 2.3. Adapun hasil penelitian ini disajikan dalam Gambar 2.4.

Gambar 2.3 Sekuen gen TLR4 yang diamplifikasi (GenBank, A Y064697.1).

Posisi primer menempel pada nukleotida yang bergaris bawah

Gambar 2.4 Produk PCR-RFLP gen TLR4 pada exon 2 (dipotong oleh MscI).

M : marker 100 pb. N : fragmen gen TLR4 (220 pb). AA, AG dan GG : genotipe gen TLR4

Gambar 2.3 adalah fragmen gen TLR4 yang diamplifikasi (berukuran 220

pb) pada exon 2. Fragmen ini selanjutnya dipotong oleh enzim restriksi MscI, pada situs ke 3924 dengan posisi titik potong TGG|CCA. Dalam Gambar 2.4 diatas, N adalah visualisasi fragmen gen TLR4 yang merupakan produk PCR yang berhasil diamplifikasi pada exon 2 menggunakan primer (F) : 5’-GCT CAA ATT ATT TTT CAT CAG Tgg CC-3’ and (R) : 5’-ATC TGG ACT GAA AGC TGC AC-3’. Pemotongan oleh enzim MscI menghasilkan alel A dan alel G. Alel A berukuran 24 pb dan 196 pb, sedangkan alel G berukuran 220 pb. Adapun AA, AG dan GG adalah genotipe gen TLR4 dari beberapa rumpun ayam lokal yang diidentifikasi.

Dari hasil genotyping ini, terdeteksi adanya mutasi pada situs ke 3924. Mutasi ini menyebabkan terjadinya perubahan basa dari guanin menjadi adenin (GA). Perubahan nukleotida ini menyebabkan terjadinya perubahan asam amino, dari asam glutamat (GAA) menjadi lisina (AAA). Mutasi ini termasuk tipe

transisi, yaitu perubahan basa dalam kelompok yang sama, dalam hal ini adalah purin. Berdasarkan efeknya, maka mutasi ini termasuk missense mutation, yaitu mutasi yang menyebabkan perubahan asam amino, dan dapat menyebabkan perubahan fenotipik (Brown 2007). Hasil penelitian ini serupa dengan yang dilaporkan oleh Beaumont et al. (2003), yang melakukan genotyping pada ayam petelur coklat komersial (commercial brown laying hens).

Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotipe

Alel adalah bentuk alternatif dari gen, yaitu gen yang menempati lokus-

lokus yang sama pada kromosom yang homolog, tetapi memiliki pengaruh yang berbeda. Adapun yang dimaksud dengan genotipe adalah komposisi gen dalam suatu individu. Nilai frekuensi alel dan nilai frekuensi genotipe gen TLR4 pada lokus MscI pada beberapa rumpun ayam lokal Indonesia yang dianalisis dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 2.3.

Tabel 2.3 Nilai frekuensi alel dan frekuensi genotipe gen TLR4 pada ayam lokal

Rumpun ayam lokal

Jumlah sampel

Frekuensi alel Frekuensi genotipe A G AA AG GG

Kampung 50 0.20 0.80 0.02 (1) 0.36 (18) 0.62 (31) Kampung-Pelung 36 0.08 0.92 - 0.17 (6) 0.83 (30) Sentul 18 0.06 0.94 - 0.11 (2) 0.89 (16) Tolaki 32 0.23 0.77 0.03 (1) 0.41 (13) 0.56 (18) Total 136 0.16 0.84 0.01 (2) 0.29 (39) 0.70 (95) Keterangan : (..) jumlah individu

Alel G pada keempat rumpun ayam lokal tersebut mendominasi frekuensi alel pada gen TLR4. Nilai frekuensi alel G pada keempat rumpun ayam lokal berkisar antara 0.77-0.94. Nilai frekuensi alel A berkisar antara 0.02-0.23. Secara keseluruhan, frekuensi alel A dan G adalah 0.16 dan 0.84. Hasil genotyping ini dapat diartikan bahwa gen TLR4 pada lokus MscI bersifat polimorfik (beragam). Hal ini sesuai dengan Nei dan Kumar (2000), yang menyatakan bahwa : jika terdapat dua alel atau lebih dengan nilai frekuensi relatif dalam populasi lebih dari 0.01 (1%), maka disebut polimorfik.

Keragaman gen TLR4 pada ayam telah dilaporkan oleh beberapa peneliti terdahulu. Keragaman gen TLR4 terdapat pada beberapa bangsa ayam komersial (Ruan et al. 2012), pada ayam ras petelur coklat (Beaumont et al. 2003), pada ayam pedaging atau ayam broiler (Malek et al. 2004), dan pada ayam lokal Cina dilaporkan oleh Li et al. (2013) dan Liu et al. (2011).

Genotipe GG mendominasi frekuensi genotipe gen TLR4. Nilai frekuensi genotipe GG pada beberapa ayam lokal berkisar antara 0.56-0.89. Frekuensi genotipe AG pada keempat ayam lokal tersebut berada pada kisaran yang lebih rendah, yaitu sebesar 0.11-0.41. Frekuensi genotipe gen TLR4 yang terendah adalah AA, yaitu 0.02-0.03.

Pada ayam persilangan Kampung-Pelung dan pada ayam Sentul tidak ditemukan genotipe AA. Rendahnya frekuensi genotipe AA disebabkan karena

pada ayam jantan maupun ayam betina didominasi oleh genotipe GG. Hasil pengamatan dalam penelitian ini, ada 88.89% ayam jantan yang bergenotipe GG, dan pada ayam betina yang dianalisis, sekitar 66.95% juga bergenotipe GG. Hal ini merupakan penyebab genotipe AA ditemukan langka.

Keseimbangan Genotipe Gen TLR4 dalam Populasi

Keseimbangan genotipe gen TLR4 dalam populasi (keseimbangan Hardy-

Weinberg), dianalisis dengan chi-square (x2). Hasil pengujian terhadap keseimbangan genotipe gen TLR4 pada lokus MscI disajikan pada Tabel 2.4. Hasil tersebut menujukkan bahwa frekuensi genotipe dan frekuensi alel dari gen TLR4 ayam lokal berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg.

Tabel 2.4 Hasil uji chi-square (x2) frekuensi genotipe gen TLR4 ayam lokal

Rumpun ayam lokal Nilai x2 Kampung 0.78tn Kampung-Pelung 0.10td Sentul 0.21td Tolaki 0.58tn Keterangan : tn tidak berbeda nyata, x2

(0.05,1) = 3.84 td tidak dianalisis karena db = 0

Nilai x2 pada ayam persilangan Kampung-Pelung dan ayam Sentul tidak

dianalisis. Hal ini disebabkan karena jumlah genotipe gen TLR4 ditemukan dua macam yaitu AG dan GG, dan jumlah alel juga ada dua (alel A dan alel G). Setelah dihitung berdasarkan rumus dari Allendorf et al. (2007), yang menyatakan bahwa : derajat bebas = (∑genotipe – 1) – (∑alel – 1), maka nilai derajat bebas yang diperoleh adalah nol. Hal tersebut menyebabkan nilai x2 yang diperoleh tidak dapat dianalisis.

Suatu populasi dinyatakan dalam keadaan keseimbangan Hardy-Weinberg, apabila frekuensi genotipe (p2, 2pq, q2) dan frekuensi alel (p dan q) adalah konstan dari generasi ke generasi, akibat penggabungan gamet yang terjadi secara acak dalam populasi yang besar (Vasconcellos et al. 2003).

Keseimbangan genotipe dalam populasi yang cukup besar terjadi jika tidak ada seleksi, mutasi, migrasi dan genetic drift. Genetic drift adalah perubahan frekuensi genotipe yang diakibatkan oleh fluktuasi acak akibat adanya peluang dalam pola perkawinan, kesalahan pengambilan sampel, dan perubahan frekuensi mendadak akibat faktor lingkungan. Sebaliknya jika terjadi akumulasi genotipe, populasi yang terbagi, mutasi, seleksi, migrasi dan perkawinan dalam kelompok yang sama, dapat menimbulkan ketidakseimbangan frekuensi genotipe atau frekuensi alel dalam populasi tersebut (Falconer dan Mackay 1996; Noor 2010).

Keseimbangan genotipe gen TLR4 lokus MscI pada beberapa rumpun ayam lokal (ayam Kampung dan ayam Tolaki) ini, memperlihatkan bahwa intensitas kejadian mutasi, endogami, seleksi yang intensif serta migrasi pada kedua rumpun ayam lokal tersebut bisa dikatakan sangat rendah. Ayam Kampung dan ayam Tolaki oleh masyarakat Indonesia dipelihara secara ekstensif (diumbar), hal ini memungkinkan terjadinya perkawinan secara acak dari generasi ke generasi.

Nilai Heterozigositas dan Polymorphic Informative Content

Hasil analisis pendugaan nilai heterozigositas harapan (He) dan nilai heterozigositas pengamatan (Ho), serta nilai Polymorphic Informative Content (PIC) gen TLR4|MscI pada ayam Kampung, ayam persilangan Kampung-Pelung, ayam Sentul, dan ayam Tolaki disajikan pada Tabel 2.5.

Tabel 2.5 Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan

(He) serta nilai Polymorphic Informative Content (PIC) genotipe gen TLR4 pada ayam lokal

Rumpun ayam lokal Jumlah sampel Ho He PIC Kampung 50 0.36 0.32 0.27 Kampung-Pelung 36 0.17 0.15 0.14 Sentul 18 0.11 0.11 0.10 Tolaki 32 0.41 0.35 0.29

Nilai heterozigositas merupakan rataan persentase lokus heterozigot tiap

individu atau rataan persentase individu heterozigot dalam populasi (Nei dan Kumar 2000). Nilai heterozigositas tinggi menunjukkan tingginya keragaman genetik dalam suatu populasi, dan nilai heterozigositas rendah adalah sebaliknya.

Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) lokus TLR4|MscI pada masing-masing rumpun ayam lokal yang dianalisis berkisar antara 0.11-0.41. Nilai heterozigositas pengamatan pada ayam Tolaki dan ayam Kampung (0.41 dan 0.36) lebih tinggi dari nilai heterozigositas pengamatan pada ayam persilangan Kampung-Pelung dan ayam Sentul (0.17 dan 0.11). Hal ini bisa dipahami, karena intensitas seleksi yang dilakukan masyarakat terhadap ayam Pelung dan ayam Sentul lebih tinggi dari pada ayam Kampung maupun ayam Tolaki. Ayam Pelung diseleksi untuk sifat pertumbuhan yang cepat dan suara yang indah. Ayam Sentul diseleksi untuk memperoleh bobot tubuh yang besar dan terhadap sifat produksi telur yang tinggi. Adapun ayam Kampung sebagian besar masih dipelihara masyarakat secara ekstensif, sehingga hampir tidak ada campur tangan peternak untuk menseleksi ternaknya. Ayam Tolaki masih sulit dibudidayakan karena sifat liarnya. Dengan demikian pada ayam Kampung dan ayam Tolaki, seleksi yang terjadi sebatas pada seleksi alam.

Nilai Heterozigisitas harapan (He) pada keempat rumpun ayam lokal ini berkisar antara 0.11-0.35. Dari data tersebut terlihat bahwa antara nilai heterozigositas pengamatan dan heterozigositas harapan genotipe gen TLR4|MscI pada semua rumpun ayam lokal yang dianalisis, tidak mengindikasikan adanya perbedaan yang besar. Nilai Ho dalam penelitian ini lebih tinggi daripada nilai He. Apabila nilai heterozigositas pengamatan (Ho) lebih rendah dibandingkan dengan nilai heterozigositas harapan (He), maka dalam populasi tersebut telah terjadi indogami yang sangat intensif, yang ditujukan untuk keperluan seleksi (Tambasco et al. 2003). Pendugaan nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) ini dapat digunakan untuk menduga nilai koefisien inbreeding pada suatu kelompok ternak.

Nilai Polymorphic Informative Content (PIC) merupakan salah satu parameter yang menunjukkan tingkat informatifnya suatu penciri (marker). Hasil

pendugaan nilai PIC gen TLR4 lokus MscI pada ayam lokal yang dianalisis, berkisar antara 0.1-0.29. Botstein et al. (1980) menyatakan bahwa kriteria PIC termasuk dalam kelompok rendah jika nilai PIC ≤ 0.25, nilai PIC termasuk katagori sedang adalah antara 0.25 < PIC < 0.5, dan termasuk kategori tinggi bila nilai PIC ≥ 0.5.

Berdasarkan pernyataan tersebut maka nilai PIC gen TLR4|MscI pada ayam Kampung dan ayam Tolaki termasuk kategori sedang. Adapun nilai PIC pada ayam persilangan Kampung-Pelung dan ayam Sentul termasuk kategori rendah. Dengan demikian gen TLR4|MscI pada ayam Kampung dan ayam Tolaki dalam penelitian ini mempunyai tingkat informasi genetik yang lebih tinggi dari pada ayam Sentul maupun ayam persilangan Kampung-Pelung.

Simpulan

Berdasarkan keragaman genotipe dari hasil penelitian ini, gen TLR4|MscI dapat digunakan sebagai penciri genetik.

3 ASOSIASI GENOTIPE GEN TLR4 DENGAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP INFEKSI

S. enteritidis SECARA ALAMI

Pendahuluan

Salmonella

Salmonella adalah bakteri yang mudah tumbuh dan dapat menyesuaikan diri dengan berbagai bentuk keadaan lingkungan. Salmonella dapat hidup pada suhu yang berkisar antara 6-46 oC dan pada pH antara 4.4-9.4 tetapi pertumbuhan optimal terjadi pada kisaran suhu 35-37 oC dan pada pH mendekati netral. Menurut Wray dan Wray (2000), klasifikasi ilmiah Salmonella adalah sebagai berikut :

Dunia : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Salmonella Spesies : Salmonella enterica

Salmonella bongori

Dua spesies yang dimiliki oleh genus Salmonella adalah S. enterica dan S. bongori. Spesies S. enterica terdiri dari 6 subspesies (yaitu : subspesies enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenea dan subspesies indica), sedangkan pada spesies S. bongori hanya satu subspesies. Ditemukan sekitar 2443 serotipe dari S. enterica, dan pada S. bongori ditemukan sekitar 20 serotipe.

Berdasarkan sasaran infeksinya, bakteri Salmonella dikelompokkan menjadi tiga kelompok serotipe. Kelompok pertama adalah serotipe yang hanya menginfeksi manusia, yaitu S.enterica typi dan S.enterica paratypi. Kelompok kedua adalah serotipe yang menginfeksi inang pada hewan tertentu, contohnya S. enterica pullorum dan S. enterica gallinarum pada unggas (ayam), S. enterica dublin pada sapi, dan S. enterica choleraesuis pada babi. Kelompok ketiga adalah serotipe yang memiliki inang yang luas, bisa menginfeksi manusia dan hewan, contohnya adalah S. enterica typhimurium dan S. enterica enteritidis (Bhunia 2008). Agar lebih jelas uraian diatas disajikan pada Tabel 3.1.

Dari uraian ini dapat disimpulkan bahwa S. enterica enteritidis maupun S. enterica typhimurium adalah bakteri patogen yang sangat berbahaya, karena bersifat zoonosis. S. enterica enteritidis dan S. enterica typhimurium merupakan foodborne disease yang masuk ke dalam saluran pencernaan manusia melalui makanan yang berasal dari hewan, seperti telur, daging dan susu. Ayam yang terinfeksi oleh kedua bakteri ini akan menghasilkan telur yang juga tercemar oleh bakteri tersebut. Telur yang tercemar ini apabila dikonsumsi, maka manusia yang mengkonsumsinya dapat terinfeksi oleh bakteri tersebut.

Tabel 3.1 Pengelompokan Salmonella berdasarkan target sasarannya

No Inang atau target sasaran Serotipe Salmonella 1 Manusia S. enterica typhi

S. enterica paratyphi 2 Manusia dan hewan S. enterica typhimurium

S. enterica enteritidis 3 Unggas S. enterica pullorum

S. enterica gallinarum 4 Babi S. enterica choleraesuis 5 Sapi S. enterica dublin

Sumber : Bhunia 2008 Salmonellosis

Penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Salmonella sp. disebut salmonellosis. Kejadian salmonellosis terutama pada manusia, bersifat endemis hampir disemua kota di wilayah Indonesia. Kejadian tersebut terus meningkat dari tahun ke tahun.

Indonesia dikategorikan sebagai salah satu negara dengan kejadian endemik salmonellosis tinggi di Asia, dan berada pada urutan ke tiga setelah Pakistan dan India. Insiden infeksi Salmonella sp. yang menyebabkan demam pada anak usia 2-5 tahun dilaporkan sebanyak 573.2 di Pakistan, 340.1 di India, dan 148.7 di Indonesia per 100000 orang setiap tahunnya. Kejadian salmonellosis pada semua kelompok umur mencapai 33.1 kejadian setiap 1000 penduduk Indonesia (Ochiai 2008). Dengan demikian, kejadian salmonellosis ini bukan merupakan kejadian yang langka di Indonesia.

Lebih dari 44% wabah salmonellosis di seluruh dunia yang menyerang manusia, ternyata disebabkan karena mengkonsumsi telur ayam. Isolasi kejadian salmonellosis pada manusia yang disebabkan karena mengkonsumsi telur ayam ini, sebagian besar ditemukan S. enteritidis (Velge et al. 2005). Telur bisa terkontaminasi S. enteritidis sejak mulai dari proses pembentukan di dalam tubuh induk yang terinfeksi. Telur juga dapat terkontaminasi bakteri tersebut dari lingkungan sekitar.

Mekanisme Pertahanan Tubuh

Infeksi S. enteritidis pada induk ayam diawali dengan tertelannya bakteri ini melalui pakan atau air minum. Selanjutnya bakteri tersebut masuk dan memperbanyak diri dalam saluran pencernaan. Salmonella akan menembus dinding usus dan mukosa usus, sehingga menimbulkan reaksi inflamasi. Bakteri ini kemudian masuk ke dalam sistem pertahanan limfatik dan dapat mencapai pembuluh darah. Selanjutnya menyebar ke organ lain seperti organ reproduksi, dan bersarang di ovari (Gantois et al. 2009).

Bila ada benda asing (antigen) yang masuk ke dalam tubuh, termasuk bakteri S. enteritidis, maka secara otomatis tubuh akan merespons dengan berupaya menonaktifkan atau menghancurkan benda asing tersebut. Respons ini

dinamakan respons imun. Tubuh mampu merespons antigen karena tubuh mempunyai sistem khusus untuk bertahan dari bermacam-macam agen yang menginfeksi. Sistem ini terdiri atas leukosit darah (sel darah putih) dan sel-sel dalam jaringan yang berasal dari diferensiasi leukosit (Baratawidjaja dan Rengganis 2012).

Respons imun ini terdiri dari respons imun non spesifik atau innate immunity dan respons imun spesifik atau acquired immunity. Respons imun non spesifik diperantarai secara struktur oleh kulit dan mukosa, dan secara seluler oleh sel-sel fagosit, seperti makrofag dan heterofil. Makrofag jaringan adalah garis pertahanan pertama untuk melawan infeksi, karena dalam waktu beberapa menit setelah terjadi peradangan telah berada di jaringan yang meradang. Beberapa jam kemudian, baru terjadi penyerbuan heterofil ke dalam jaringan yang mengalami peradangan, dan ini merupakan pertahanan kedua (Ganong 2008). Sebagai pertahanan ketiga adalah invasi monosit menuju area yang mengalami peradangan. Monosit ini dengan cepat akan mengalami perubahan bentuk dan struktur sehingga menjadi sel makrofag, yang segera dapat berfungsi sebagai sel fagosit. Fungsi dari sel-sel fagosit ini adalah menangkap, menelan, membunuh dan menghancurkan antigen. Selanjutnya menyajikan partikel-partikel antigen tersebut ke permukaan selnya. Pada saat demikian, sel fagosit/makrofag berperan sebagai Antigen Presenting Cell (APC).

Respons imun spesifik diperantarai oleh limfosit T (sel T) dan limfosit B (sel B), yang menghasilkan kekebalan spesifik. Kekebalan sepesifik ini bisa bersifat humoral dan seluler. Pada kekebalan spesifik humoral (Humoral Mediated Immunity/HMI), yang berperan adalah sel B. Produk dari HMI adalah antibodi (imunoglobulin), yang bersifat khas terhadap setiap epitop antigen. Pada kekebalan spesifik seluler (Cellular Mediated Immunity/CMI), yang berperan adalah sel T cytoytoxic (Tc). Sel Tc adalah sel T yang menghasilkan sitotoksik untuk menghancurkan sel yang terinfeksi agen penyakit (Nicholas 2004).

Ketahanan tubuh ayam dapat diperoleh secara aktif dan pasif. Vaksinasi atau ayam yang terinfeksi kuman/virus tertentu adalah contoh cara memperoleh ketahanan tubuh secara aktif, sedangkan maternal immunity adalah salah satu cara memperoleh ketahanan tubuh secara pasif. Maternal immunity pada ayam diperoleh melalui aliran darah saat pembentukan dan perkembangan ovum di ovari, sehingga ditemukan Imunoglobulin Y (IgY) dalam konsentrasi yang tinggi pada kuning telur yang dihasilkan.

IgY merupakan antibodi melawan patogen yang menginfeksi, seperti virus dan bakteri (Jeong dan Hoon 2006). Lee et al. (2002) dalam penelitiannya mengenai antibodi yang berasal dari kuning telur ayam (IgY), menyatakan bahwa secara in vitro, antibodi tersebut mampu menghambat pertumbuhan S. enteritidis dan S. typhimurium. Secara mikroskopis terlihat adanya perubahan struktur dari permukaan sel bakteri yang diikat oleh IgY. Hal tersebut merupakan masa kritis bagi pertumbuhan bakteri dan keadaan ini dapat merusak atau memperlemah fungsi komponen sel bakteri yang menginfeksi.

Beberapa penelitian mengenai isolasi bakteri S. enteritidis dari telur ayam Kampung pada berbagai kondisi, dari berbagai daerah, tidak menemukan adanya bakteri tersebut (Aditya et al. 2012). Kenyataan tersebut menimbulkan pertanyaan apakah ayam Kampung secara genetik memiliki ketahanan terhadap S. enteritidis.

Berdasarkan uraian tersebut diatas maka penelitian ini bertujuan untuk

membuktikan ketahanan ayam Kampung terhadap infeksi S. enteritidis yang diperoleh secara alami menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik. Pembuktian dilakukan dengan menganalisis asosiasi genotipe gen TLR4 dengan ketahanan ayam Kampung terhadap bakteri S. enteritidis. Ketahanan ayam Kampung diperoleh dari pengujian secara biologis pada beberapa faktor yang merupakan indikator ketahanan tubuh.

Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan dari awal bulan April sampai akhir Juli, tahun 2013.

Pemeliharaan ayam Kampung dilakukan di Laboratorium Lapang Divisi Unggas, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Pengujian secara biologis mengenai parameter ketahanan dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Laboratorium Bakteriologi, dan Laboratorium Imunologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Hewan Percobaan, Pakan dan Kandang

Ternak yang digunakan sebagai hewan percobaan adalah ayam Kampung betina yang sudah bertelur, berumur 8 bulan sebanyak 50 ekor. Bobot badan ayam tersebut adalah 1100-1800 g ekor-1, dengan rataan sebesar 1492 ± 278 g ekor-1 dan koefisien keragaman bobot badan sebesar 18%. Ayam tersebut diperoleh dengan cara membeli dari masyarakat di sekitar Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor.

Jenis pakan yang diberikan adalah pakan komersial untuk ayam petelur periode produksi. Pakan tersebut mengandung protein kasar antara 14-17% dan energi metabolis sebesar 2850 kkal kg-1 pakan.

Kandang yang digunakan adalah kandang individu (sangkar) terbuat dari bilah-bilah bambu. Sangkar tersebut diberi nomor (nomor 1-50), sesuai dengan jumlah ayam. Ukuran sangkar sekitar 35 x 45 x 50 cm3. Sangkar tersebut ditempatkan dalam kandang yang berukuran 7 x 10 m2.

Pada setiap bagian luar dari sangkar diberi tempat pakan dan tempat air minum plastik. Kandang juga dilengkapi 2 lampu neon berdaya 18 Watt sebagai penerangan pada malam hari.

Pemeliharaan

Begitu ayam datang, diberi nomor pada kakinya, dari nomor 1-50. Secara acak ayam Kampung tersebut ditempatkan dalam sangkar (cage) individu yang sudah disediakan. Selama satu minggu ayam dipelihara untuk beradaptasi. Pakan dan air minum yang diberikan tidak dibatasi (ad libitum). Selanjutnya pemeliharaan dilakukan selama empat minggu, dari tanggal 2-29 April 2013.

Pada hari pertama dan kedua (minggu pertama pemeliharaan) seluruh telur dinomori sesuai dengan nomor ayam yang menghasilkan, dimasukkan ke dalam kantong plastik bersih, kemudian dibawa ke laboratorium untuk dianalisis secara kuantitatif jumlah bakteri S.enteritidis. Koleksi telur kembali dilakukan (pada hari pertama dan kedua, minggu kedua pemeliharaan), untuk dianalisis konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis di laboratorium.

Pada akhir minggu kedua dilakukan pengambilan darah pada vena brachialis di daerah sayap. Pengambilan darah ini digunakan sebagai sampel untuk pengujian konsentrasi S. enteritidis dalam darah, untuk pengujian konsentrasi leukosit dan diferensiasi leukosit (heterofil, monosit dan limfosit). Pada serum darah juga dilakukan pengujian keberadaan IgY spesifik S. enteritidis. Ayam masih dipelihara untuk tahap penelitian selanjutnya.

Uji Ketahanan

Pada tahap ini dilakukan pengujian secara biologis terhadap beberapa indikator yang mencerminkan ketahanan ayam Kampung terhadap infeksi S. enteritidis secara alami. Indikator-indikator tersebut antara lain adalah konsentrasi leukosit dan diferensiasinya, keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum, konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur, dan konsentrasi S. enteritidis di dalam darah dan telur.

Pengujian Konsentrasi Leukosit dan Diferensiasinya

Pengujian konsentrasi leukosit dan diferensiasinya dilakukan dengan metoda Giemsa (Sastradipradja et al. 1989), seperti berikut : 20 µl darah ber EDTA diencerkan dalam 380 µl larutan Turk (campuran dari larutan gentianviolet 1% dalam air 1 ml, asam asetat glasial 1 ml, aquadest ad 100 ml) dengan menggunakan mikropipet. Selanjutnya dihomogenkan dengan gerakan tangan membentuk pola angka delapan. Cairan yang tidak terkocok dibuang. Setelah itu sampel darah diteteskan dalam hemocytometer neubeur, dibiarkan beberapa saat hingga cairan mengendap. Jumlah leukosit dihitung dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Leukosit dihitung pada empat bidang yang terletak di empat sudut kamar hitung. Jumlah leukosit kemudian dikalikan dengan 50 untuk mengetahui konsentrasinya setiap mm3.

Diferensiasi leukosit (heterofil, monosit dan limfosit) dihitung dengan cara, membuat preparat ulas pada gelas objek. Preparat ulas difiksasi dengan metil alkohol selama 5 menit kemudian diangkat sampai kering udara. Ulasan darah direndam dalam zat warna Giemsa selama 30 menit, diangkat dan dicuci dengan air kran yang mengalir untuk menghilangkan zat warna yang berlebihan. Preparat ulas diamati dengan mikroskop pada pembesaran 1000 kali (dengan bantuan minyak emersi). Kemudian dihitung jumlah heterofil, monosit, limfosit, eosinofil, dan basofil sampai jumlah total 100 butir leukosit (dengan bantuan hand counter). Selanjutnya dihitung persentase heterofil, monosit dan limfositnya.

Pengujian Keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam Serum

Pengujian keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum dilakukan secara kualitatif menggunakan teknik Agar Gel Presipitation Test (AGPT), dengan prosedur sebagai berikut : Agarose 0.502 g, 1.2 g PEG 6000 dalam 20 ml PBS (pH 7.2) dan 20 ml Aquades dicampurkan ke dalam tabung erlenmeyer. Kemudian Na-azide ditambahkan untuk mencegah kontaminasi oleh jamur. Campuran tersebut kemudian dipanaskan sampai terbentuk larutan jernih. Selanjutnya campuran dituangkan ke dalam gelas objek sebanyak 4 ml dan

ditunggu sampai membeku menjadi agar. Setelah menjadi agar dibuat lubang dengan puncher. Antigen (S. enteritidis) dimasukkan kedalam lubang tengah dan serum darah yang diuji ke dalam lubang sisi dengan mikropet, kemudian disimpan pada nampan yang di bawahnya diisi tissue basah. Hasil uji tersebut positif bila muncul garis presipitasi di antara lubang yang diisi serum yang diuji.

Pengujian Konsentrasi IgY Spesifik S. enteritidis dalam Kuning Telur

Prosedur pengujian konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dari kuning telur menggunakan Indirect ELISA protocol : sumur (well) pada plate ELISA dilapisi dengan antigen (S. enteritidis) 10 µg ml-1 PBS pH 9.6. Plate diinkubasi selama semalam (pada suhu 4 oC), kemudian dicuci tiga kali dengan 200 µl PBST. Selanjutnya dilakukan blocking dengan menambahkan 200 µl/well protein binding sites (5% susu skim dalam PBS), diinkubasi pada suhu ruang (2 jam), kemudian dicuci empat kali dengan PBST.

Larutan kemudian di tambahkan sebanyak 100 µl/well sampel antibodi (kuning telur, dengan pengenceran tertentu). Plate diinkubasi selama 1-2 jam pada suhu ruang, kemudian dicuci empat kali dengan PBST. Selanjutnya di tambahkan dengan 100 µl/well conjugate antibodi sekunder (dengan pengenceran tertentu dengan blocking buffer). Plate diinkubasi 1-2 jam pada suhu ruang, kemudian dicuci empat kali dengan PBST.

Ke dalam larutan tersebut kemudian di tambahkan substrat peroksidase 100 µl/well (larutan TMB dari buffer sitrat : TMB : H2O2 = 10 ml : 100 ml : 4 µl). Plate diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, di tambah 2 M H2SO4 100 µl/well sebagai penghenti reaksi. Selanjutnya dibaca absorbsinya dengan ELISA reader (pada panjang gelombang 450 nm). Absorbance reference kemudian dibandingkan dengan absorbance sampel menggunakan kinetical calculation.

Pengujian Keberadaan S. enteritidis dalam Darah dan Telur

Pengujian ini mengacu pada Bacteriological Analitical Manual (BAM) tahun 2007, yang terdiri dari empat tahap yaitu : prapengayaan di media Lactose Broth (LB), pengayaan di media Tetrathionate Broth (TTB), uji biokimia awal di media Hektoen Eteric Agar (HEA), Xylose Lysine Desoxycolate Agar (XLDA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), dan uji biokimia di media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA). Secara lengkap prosedurnya adalah sebagai berikut :

Sebanyak 10 g sampel di masukkan ke dalam 90 ml LB steril dan dihomogenkan. Sampel yang telah homogen diinkubasi pada suhu 37 oC, selama 24 jam. Selanjutnya diambil 1 ml di campurkan ke dalam 9 ml TTB dan RV (Rappaport Vassiliadis), kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC, selama 24 jam. Sejumlah 1 lup inokulasi sampel yang telah dihangatkan di inkubator pada masing-masing media selektif diambil dan digoreskan secara kuadran pada media HEA, XLDA dan BSA. Ketiga media selektif tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 35 oC, selama 24 jam. Setelah itu dilihat keberadaan koloni tipikal yang tumbuh pada masing-masing agar. Apabila terdapat koloni tipikal yang tumbuh, maka analisis dilanjutkan dengan uji biokimia menggunakan TSIA miring dan LIA miring. Koloni tipikal yang tumbuh pada ketiga media selektif tersebut,

diinokulasikan menggunakan jarum lup inokulasi steril pada TSIA dan LIA. Pada TSIA miring, jarum lup digores dan ditusuk. Pada LIA miring jarum lup inokulasi ditusuk dan digores. Reaksi spesifik Salmonella pada TSA miring adalah ditemukannya warna merah/alkalin (reaksi basa) pada bagian permukaan miring dan warna kehitaman pada agar (dengan atau tanpa produksi gas H2S). Reaksi spesifik Salmonella pada LIA miring ditandai dengan warna ungu/alkalin (reaksi basa) pada bagian permukaan miring, warna ungu/alkalin pada bagian agar dasar (reaksi memproduksi H2S, kehitaman pada agar dasar). Bila reaksi positif dilanjutkan dengan uji serologis untuk menentukan serotipe S. enteritidis kemudian dilakukan perhitungan. Analisis Data

Data dianalisis dengan analysis of varian (ANOVA), dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Genotipe gen TLR4 ayam Kampung dari hasil penelitian tahap pertama, sebagai perlakuan dan data hasil pengujian secara biologis pada penelitian tahap kedua, sebagai respons. Model statistik yang digunakan adalah :

Yij = μ + Pi + εij (Mattjik dan Sumertajaya 2002)

Keterangan :

Yij = nilai pengamatan µ = nilai tengah umum Pi = pengaruh perlakuan pada taraf ke i ɛij = pengaruh galat percobaan dari perlakuan ke i pada ulangan ke j


Pada penelitian tahap pertama dilakukan identifikasi genotipe gen TLR4

pada empat rumpun ayam lokal, yaitu ayam Kampung, ayam persilangan Kampung-Pelung, ayam Sentul dan ayam Tolaki. Pada penelitian tahap kedua ini hanya genotipe ayam Kampung yang diasosiasikan dengan ketahanannya terhadap S. enteritidis yang diperoleh secara alami.

Pemilihan ayam Kampung pada penelitian tahap ini didasarkan pada dua pertimbangan. Pertama, ayam Kampung menyebar di seluruh wilayah Indonesia, dengan demikian populasinya diasumsikan lebih tinggi dari pada rumpun ayam lokal yang lain. Hal ini berarti bahwa potensi telur yang dihasilkan dan yang dikonsumsi sebagai jamu adalah yang terbanyak. Selain hal tersebut pemilihan ayam Kampung ini karena tampilannya yang tidak mempunyai ciri atau karakteristik yang khas. Kenyataan ini berarti bahwa fenotipik ayam Kampung sangat beragam, dan hal tersebut sangat memungkinkan untuk tujuan seleksi.

Pada penelitian tahap pertama, genotipe gen TLR4 dianalisis dari 50 ekor ayam Kampung. Dari pengujian tersebut diperoleh tiga macam genotipe gen TLR4, yaitu AA, AG, dan GG. Genotipe AA hanya ditemukan dari satu ekor ayam. Genotipe AG diperoleh dari 18 ekor dan genotipe GG dari 31 ekor ayam Kampung. Dengan demikian pada perhitungan analisis asosiasinya, genotipe AA tidak dianalisis secara statistik, karena tidak mempunyai ulangan.

Aspek ketahanan ayam Kampung terhadap infeksi S.enteritidis ini diperoleh dari pengujian secara biologis. Pengujian tersebut dilakukan pada beberapa parameter yang merupakan indikator ketahanan tubuh. Parameter tersebut antara lain adalah konsentrasi leukosit dan diferensiasinya, keberadaan IgY spesifik S.enteritidis dalam serum darah dan konsentrasinya dalam kuning telur serta keberadaan S. enteritidis dalam darah dan telur yang dihasilkan. Hasil pengujian tersebut selanjutnya diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4.

Konsentrasi Leukosit dan Diferensiasinya

Leukosit atau sel darah putih merupakan bagian dari sistem pertahanan tubuh yang dapat bergerak. Setelah pembentukannya, sel darah putih masuk ke dalam peredaran darah dan menuju ke bagian tubuh yang membutuhkan. Berdasarkan morfologinya, ada yang bergranula dan ada yang tidak. Leukosit yang bergranula terdiri atas heterofil, eosinofil dan basofil. Leukosit yang tidak bergranula adalah monosit dan limfosit (Ganong 2008).

Asosiasi genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung dengan konsentrasi leukosit dan diferensiasinya disajikan pada Tabel 3.2.

Tabel 3.2 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan konsentrasi

leukosit dan diferensiasinya

Fenotipik yang diuji Genotipe gen TLR4

AA*(1) AG (18) GG (31) Leukosit (103 sel mm-3) 22.20 18.85 ± 7.03 21.04 ± 7.73

Heterofil (%) 39.00 42.79 ±10.49 48.93 ±17.16 Monosit (%) 5.00 5.79 ± 4.18 5.07 ± 2.91 Limfosit (%) 54.00 50.00 ±10.89 44.47 ±16.54

Keterangan : *) Genotipe AA tidak disertakan dalam pengujian secara statistik (..) : jumlah sampel

Konsentrasi leukosit ayam Kampung yang memiliki gen TLR4 bergenotipe

AG dan GG tidak berbeda secara statistik. Nilai konsentrasi leukosit pada ayam yang bergenotipe AA, AG dan GG, termasuk dalam kisaran normal. Kisaran normal konsentrasi leukosit adalah 12-30 x 103 sel mm-3 (Jain 1993). Hasil tersebut mengindikasikan bahwa ayam Kampung dengan ketiga genotipe gen TLR4 tersebut tidak sedang terinfeksi agen penyakit.

Diferensiasi leukosit yang diamati dalam penelitian ini adalah heterofil, monosit dan limfosit. Heterofil merupakan sel fagosit, berfungsi memfagositosis kuman dan virus. Monosit adalah prekursor makrofag dalam darah sirkulasi. Begitu ada infeksi agen patogen, maka monosit akan segera bermigrasi ke jaringan, dan berubah menjadi sel makrofag. Makrofag ini merupakan sel fagosit yang potensial, karena ukurannya lebih besar, umurnya lebih panjang dan kemampuannya menelan bakteri lebih banyak dari pada heterofil. Limfosit terdiri dari sel B dan sel T, merupakan sel imun yang berperan dalam respons imun spesifik dan memediasi terbentuknya kekebalan humoral dan kekebalan seluler.

Kisaran normal untuk heterofil, monosit dan limfosit masing-masing adalah 9-56%, 0-30% dan 24-84%. Dengan demikian persentase diferensiasi leukosit

ayam Kampung pada ketiga genotipe tersebut dalam penelitian ini juga berada dalam kisaran normal secara fisiologis. Persentase diferensiasi leukosit (heterofil, monosit dan limfosit), hampir sama dengan hasil penelitian Yusriani (2012), yang melaporkan bahwa pada ayam Kampung berumur 10 minggu memiliki persentase heterofil, monosit dan limfosit, masing-masing 38.20%, 5.67% dan 56.80%.

Dari persentase diferensiasi leukosit ini, dapat dihitung nilai rasio antara persentase heterofil dan limfosit (H/L). Hasil perhitungan rasio H/L dalam penelitian ini : 0.72 (genotipe AA), 0.86 ± 0,26 (genotipe AG), dan 1.10 ± 0.43 (genotipe GG). Rasio antara persentase heterofil dan limfosit ini merupakan indikator tingkat stres yang dialami dan dirasa oleh ternak. Menurut Swenson (1993), pada ayam, kisaran ideal rasio persentase heterofil dan limfosit adalah 0.45-0.50. Rasio persentase H/L yang berada diluar kisaran tersebut, menandakan ternak dalam kondisi stres.

Rasio persentase H/L dalam penelitian ini menunjukkan bahwa ayam Kampung yang diteliti dalam kondisi stres. Penyebab utama terjadinya stres adalah suhu lingkungan pemeliharaan yang tinggi seperti disajikan pada Tabel 3.3. Thermoneutral zone untuk ternak unggas adalah 20-24 oC (Bell dan Weaver 2002). Jadi idealnya pada kisaran thermoneutral zone tersebut ayam Kampung hidup nyaman.

Tabel 3.3 Kisaran suhu harian di dalam kandang ayam selama penelitian

Waktu Pengamatan Suhu (oC) Pagi (06.00 WIB) 24.4 – 25.2 Siang (12.00 WIB) 34.1 – 35.0 Sore (18.00 WIB) 29.7 – 30.2 Malam (24.00 WIB) 23.0 – 24.3

Tingginya suhu pemeliharaan ini merupakan salah satu faktor penyebab

stres yang pengaruhnya sangat signifikan (Yousef, 1985). Panas yang berasal dari lingkungan pemeliharaan akan sampai ke kulit ayam. Selanjutnya panas tersebut direspons oleh termoreseptor periferal, dan sebagai feedback signal, hal ini disampaikan ke hipotalamus melalui signaling by neurotransmitters. Hipotalamus meresponsnya dengan mensekresikan corticotrophin releasing factor (CRF). CRF ini selanjutnya akan menggertak kelenjar hipofisa anterior agar mensintesis adrinocorticotropin hormon (ACTH).

ACTH yang disekresikan oleh hipofisa anterior, melalui pembuluh darah akan menuju ke organ target yaitu kelenjar adrenal, tepatnya adalah sel-sel jaringan korteks pada kelenjar adrenal. Sel-sel jaringan korteks pada kelenjar adrenal ini setelah dirangsang oleh ACTH akan memproduksi hormon kortikosteroid. Tingginya hormon kortikosteroid dalam darah, dapat menghambat pembentukan limfosit, dan dapat menurunkan kekebalan tubuh (Davis et al. 2008). Penurunan kadar limfosit dalam darah menyebabkan persentase heterofil meningkat, sehingga nilai rasio persentase H/L juga meningkat. Dengan demikian suhu lingkungan pemeliharaan yang tinggi menyebabkan stres, dan hal tersebut dapat dilihat dari meningkatnya rasio persentase H/L. Jadi rasio persentase H/L ini tepatnya adalah indikator heat stress.

Keberadaan IgY dalam Serum dan Kuning Telur

Pengujian keberadaan IgY spesifik S. enteritidis pada serum darah dilakukan secara kualitatif dengan menggunakan metode AGPT. Hasil yang diperoleh disajikan pada Gambar 3.1.

Gambar 3.1 Hasil pengujian AGPT serum darah pada ayam Kampung dengan gen TLR4 bergenotipe AA, AG dan GG

Pada gambar diatas terlihat bahwa pada serum darah ayam Kampung yang

gen TLR4 nya bergenotipe AA, AG, dan GG setelah ditantang dengan S. enteritidis secara in vitro (metode AGPT), menghasilkan garis presipitat. Hal ini menandakan bahwa di dalam serum darah ayam tersebut terdapat antibodi spesifik S. enteritidis. Hal ini menunjukkan bahwa ayam Kampung yang dipergunakan dalam penelitian, meskipun tidak diberi perlakuan vaksinasi atau ditantang dengan bakteri S. enteritidis, tetapi di dalam serum darahnya terdapat antibodi spesifik terhadap bakteri tersebut.

Terbentuknya antibodi spesifik S. enteritidis ini, karena ayam Kampung terinduksi dari paparan S. enteritidis secara alami, yang berasal dari lingkungan pemeliharaan. Ayam Kampung dapat terinfeksi S. enteritidis secara alami karena ayam Kampung sehari-hari dipelihara oleh masyarakat secara tradisional, dan hampir bisa dikatakan dalam kondisi sanitasi yang buruk. Kondisi tersebut memungkinkan ayam Kampung secara alami sering memperoleh paparan dari agen-agen penyakit, termasuk dari bakteri S. enteritidis.

Paparan S. enteritidis secara alami ini akan meningkatkan aktivitas gen TLR4 pada semua genotipe. Peningkatan aktivitas gen TLR4 menyebabkan peningkatan aktifitas fagositosis dari sel makrofag. Dengan demikian adanya paparan alami dari lingkungan pemeliharaan, dapat meningkatkan respons imun non spesifik.

Secara tidak langsung terjadinya respons imun non spesifik ini akan menginduksi terbentuknya respons imun spesifik yang diperantarai oleh sel T helper dan sel B melalui peran makrofag sebagai APC. Setiap epitop yang ditampilkan oleh makrofag akan menginduksi terbentuknya satu antibodi spesifik. Melalui mekanisme inilah di dalam serum darah ayam Kampung yang terpapar S. enteritidis secara alami ditemukan positif mengandung IgY spesifik terhadap bakteri tersebut.

Keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darah ayam Kampung ini, memungkinkan IgY spesifik S. enteritidis tersebut ditranfer ke kuning telur pada saat proses pembentukan telur. Untuk mengetahui konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis yang terkandung dalam kuning telur ayam yang dihasilkan, maka

dilakukan pengujian menggunakan teknik indirect ELISA. Hasil pengujian IgY spesifik terhadap S. enteritidis dalam serum darah dan kuning telur setelah diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4, disajikan pada Tabel 3.4.

Tabel 3.4 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan keberadaan IgY

spesifik S. enteritidis dalam serum darah dan kuning telur


AA*(1) AG (18) GG (31) IgY spesifik S. enteritidis dalam serum

Positif (1) Positif (18) Positif (31)

IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur (mg ml-1)

2.47 (1) 3.52 ± 1.18 (10)

3.58 ± 1.67 (13)

Keterangan : *) Genotipe AA tidak disertakan dalam pengujian secara statistik (..) : jumlah sampel yang dianalisis.

Rataan konsentrasi IgY spesifik terhadap S. enteritidis dalam kuning telur

yang dihasilkan ayam Kampung bergenotipe AG (3.52 mg ml-1 ) dan GG (3.58 mg ml-1) secara statistik tidak berbeda. Konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis ayam yang bergenotipe AA sebesar 2.47 mg ml-1.

Menurut Schade dan Hlinak (1996), dalam setiap butir telur ayam ras, secara rata-rata mempunyai volume kuning telur 15 ml, dan mengandung IgY sebesar 50-100 mg. Dari nilai tersebut, kandungan antibodi spesifiknya berkisar dari 2-10%. Berdasarkan hal tersebut dapat dinyatakan bahwa kandungan total antibodi kuning telur adalah sebesar 3.33-6.67 mg ml-1, dengan kandungan antibodi spesifiknya berkisar antara 0.07-0.67 mg ml-1 kuning telur. Rose et al. (1974), dalam penelitiannya menemukan bahwa konsentrasi IgY total dalam kuning telur ayam ras : 10-20 mg ml-1. Berdasarkan hasil ini maka konsentrasi IgY spesifik yang terkandung dalam kuning telur adalah sekitar 0.2-2.0 mg ml-1.

Rataan konsentrasi antibodi spesifik S. enteritidis dari kuning telur ayam Kampung yang dihasilkan dari penelitian ini berkisar antara 2.47-3.58 mg ml-1. Bila dibandingkan dengan nilai IgY spesifik ayam ras dari kedua peneliti diatas, maka konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur ayam Kampung jauh lebih tinggi. Dengan demikian telur ayam Kampung memiliki perlindungan yang tinggi terhadap bakteri S. enteritidis.

Uraian diatas merupakan jawaban, mengapa telur ayam Kampung dengan berbagai kondisi (baik yang baru diambil dari kandang, yang beredar di pasar maupun yang berada di tingkat konsumen), yang berasal dari berbagai daerah dalam penelitian terdahulu tidak pernah ditemukan keberadaan bakteri S. enteritidis dalam telur ayam Kampung (Aditya et al. 2012).

Keberadaan S. enteritidis dalam Darah dan Telur

Meskipun berdasarkan rasio persentase H/L, ayam Kampung dalam kondisi stres, tetapi dalam pengujian keberadaan bakteri S. enteritidis di dalam darah, tidak ditemukan bakteri tersebut pada semua genotipe gen TLR4. Pengujian serupa yang dilakukan pada telur yang diproduksi oleh ayam tersebut, juga tidak ditemukan adanya S. enteritidis.

Jumlah ayam Kampung yang diteliti ada 50 ekor (AA = 1 ekor, AG = 18 ekor, dan GG = 31 ekor). Pada saat dilakukan koleksi telur untuk pengujian konsentrasi S. enteritidis, ada beberapa ekor ayam yang sedang dalam masa istirahat bertelur, sehingga jumlah telur yang diuji hanya 24 butir. Telur tersebut dihasilkan oleh ayam dengan genotipe AA sebanyak satu butir, dari genotipe AG dan GG masing-masing diperoleh telur sebanyak 10 dan 13 butir. Jumlah ayam yang sendang istirahat bertelur sebanyak 8 ekor (44.44%) dari genotipe AG dan 18 ekor (58.06%) dari genotipe GG.

Asosiasi genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung dengan keberadaan S. enteritidis dalam darah dan telur disajikan dalam Tabel 3.5.

Tabel 3.5 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan keberadaan S.

enteritidis dalam darah dan telur


AA* (1) AG (18) GG (31) S. enteritidis dalam darah negatif (1) negatif (18) negatif (31) S. enteritidis dalam telur negatif (1) negatif (10) negatif (13) Keterrangan : (..) : jumlah sampel

Hasil pengujian S. enteritidis dalam darah ayam Kampung pada ketiga genotipe gen TLR4 yang negatif seperti disajikan pada tabel diatas bukan berarti bahwa ayam tersebut tidak pernah terinfeksi S. enteritidis. Hal ini terlihat dari hasil yang positif pada pengujian keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darah, seperti disajikan pada Tabel 3.4. Keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darah ayam Kampung ini berarti bahwa secara alami ayam Kampung pernah terpapar oleh bakteri tersebut.

Ketidakberadaan S. enteritidis dalam darah pada semua genotipe gen TLR4 ayam Kampung, berarti bahwa sel-sel fagosit (baik makrofag maupun heterofil), berfungsi sangat baik, sehingga mampu mengeliminasi bakteri S. enteritidis. Ketidakberadaan S. enteritidis di dalam darah ayam Kampung berdampak pada pengujian keberadaan bakteri tersebut di dalam telur, yang hasilnya juga negatif.

Menurut Zhongyong et al. (2012), tingginya aktivitas fagositosis ini berkorelasi positif dengan aktivitas gen TLR4, dan berkorelasi negatif dengan konsentrasi S. enteritidis dalam darah. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa semua genotipe gen TLR4 ayam Kampung (AA, AG dan GG) dalam penelitian ini mempunyai aktivitas gen TLR4 yang tinggi. Aktivitas gen TLR4 yang tinggi, berarti gen tersebut dapat mentranskripsi protein reseptor dalam jumlah yang banyak. Protein reseptor TLR4 dalam jumlah banyak pada permukaan sel fagosit akan memudahkan makrofag dalam menangkap S. enteritidis, karena reseptor ini mampu mengenali LPS dari bakteri tersebut.

Dari uraian dalam bahasan diatas, secara ringkas dapat dikatakan bahwa ayam Kampung yang berada dalam keadaan normal sehari-hari, ketahanannya terhadap S. enteritidis yang merupakan fenotipik atau ekspresi yang ditampilkan oleh ketiga genotipe gen TLR4 (AA, AG, dan GG), tidak berbeda. Fenotipik yang tidak berbeda dari ketiga genotipe gen TLR4 ini disebabkan karena adanya pengaruh dari faktor lingkungan dan interaksinya antara faktor genetik (genotipe) dengan faktor lingkungan yang terjadi secara terus menerus. Hal tersebut sesuai

dengan hasil penelitian Li et al. (2013), yang menyatakan bahwa pada ayam lokal Cina ditemukan adanya variasi genotipe gen TLR4, yang ekspresinya dipengaruhi oleh interaksi antara faktor genetik dan berbagai faktor lain.

Simpulan

Berdasarkan hasil analisis asosiasi gen TLR4 pada ayam Kampung dengan

aspek ketahanannya dari pengujian secara biologis dalam penelitian ini, ayam Kampung pada semua genotipe tahan terhadap infeksi S. enteritidis yang diperoleh secara alami. Telur yang dihasilkan ayam Kampung mengandung antibodi spesifik terhadap bakteri S. enteritidis dalam konsentrasi yang tinggi.

4 ASOSIASI GENOTIPE GEN TLR4 DENGAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG SAAT DITANTANG S. enteritidis

Pendahuluan

Penelitian tahap kedua membuktikan bahwa pada kondisi normal, ketiga

genotipe gen TLR4 menghasilkan fenotipik dalam aspek ketahanan yang hampir sama. Dengan demikian ayam Kampung meskipun secara alami dipelihara dalam kondisi lingkungan yang tidak higiene, tetapi justru karena itu menjadikan ketiga genotipe gen TLR4 (AA, AG, dan GG) tahan atau resisten terhadap infeksi S. enteritidis. Kata kunci kategori tahan dalam penelitian tahap kedua adalah hasil negatif pada pengujian S. enteritidis dalam darah dan telur. Hasil positif mengenai keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darahnya dan ditemukannya IgY spesifik S. enteritidis dalam konsentrasi yang tinggi pada kuning telur yang dihasilkan ayam Kampung.

Ayam Kampung memperlihatkan hasil seperti pada penelitian tahap kedua ini, bisa disebabkan karena ayam memang benar-benar tahan atau bisa juga disebabkan karena jumlah pemapar yang diperoleh secara alami konsentrasinya rendah. Untuk mempertegas ketahanan ayam Kampung ini, maka penelitian tahap ke tiga diperlukan. Pada penelitian tahap ketiga, seluruh ayam Kampung diinfeksi (ditantang) dengan S. enteritidis.

Setelah ditantang dengan bakteri tersebut, dilakukan pengujian secara molekuler untuk mengetahui ekspresi gen dari ketiga genotipe gen TLR4. Selain itu, dilakukan pengujian secara biologis mengenai beberapa parameter yang merupakan indikator ketahanan tubuh terhadap infeksi S. enteritidis.

Pengujian ekspresi gen TLR4 setelah dipapar dengan S. enteritidis bertujuan untuk mengetahui keaktifan gen tersebut. Semakin tinggi ekspresi gen TLR4, berarti semakin aktif gen tersebut dalam menstranskripsi mRNA. Semakin tinggi ekspresi gen, maka semakin rendah konsentrasi S. enteritidis dalam darah, dan ayam tersebut dikategorikan tahan (resisten). Sebaliknya, semakin rendah ekspresinya, individu tersebut termasuk kategori peka (Zhongyong et al. 2012).

Jumlah kopi mRNA yang diekspresikan oleh gen TLR4 dapat dianalisis dari berbagai jaringan, seperti usus (duodenum, yeyenum, ileum, sekum dan colon), thymus, bursa fabrisius, limpa, paru-paru, hati, ginjal, otak, jantung, dan sumsum tulang. Pengujian ekspresi gen TLR4 juga dapat dilakukan pada sel imun (Iqbal et al. 2004). Pengujian ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan metode Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Penelitian tahap ketiga ini bertujuan untuk membuktikan ketahanan ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis. Pembuktian dilakukan dengan menganalisis asosiasi genotipe gen TLR4 dengan fenotipik yang merupakan ekspresi gen tersebut. Pengujian fenotipik ayam Kampung akibat ditantang dengan S. enteritidis dilakukan secara molekuler dan biologis.

Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan dari bulan April sampai September, tahun 2013. Pemeliharaan ayam Kampung dilakukan di Laboratorium Lapang Divisi Unggas,

Pengujian ekspresi gen TLR4 dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak Molekuler, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pengujian secara biologis mengenai parameter aspek ketahanan dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Laboratorium Bakteriologi, dan Laboratorium Imunologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

Hewan Percobaan dan Pemeliharaan

Dalam penelitian ini digunakan ayam Kampung betina berumur delapan bulan sebanyak 50 ekor. Jenis pakan yang diberikan adalah pakan komersial untuk ayam petelur periode produksi dengan kandungan protein kasar 14-17% dan energi metabolis sekitar 2850 kkal kg-1 pakan.

Ayam secara acak ditempatkan dalam sangkar individu yang sudah diberi nomor sesuai dengan nomor ayam. Sangkar tersebut berukuran 35 x 45 x 50 cm3. Bagian luar dari setiap sangkar diberi tempat pakan dan tempat air minum plastik. Seluruh sangkar berada dalam kandang yang berukuran 7 x 10 m2. Kandang juga dilengkapi dengan dua lampu neon berdaya 18 Watt sebagai penerangan.

Sebelum penelitian dimulai, ayam dipelihara satu minggu untuk beradaptasi. Selanjutnya, ayam dipelihara selama empat minggu (2-29 April 2013). Pakan dan air minum yang diberikan tidak dibatasi (ad libitum). Selama pemeliharaan dilakukan penimbangan pakan dan telur, serta pencatatan produksi telurnya.

Pelaksanaan Uji Tantang

Uji tantang dilakukan pada hari ketiga sampai ketujuh (pada minggu keempat) pemeliharaan ayam Kampung. Selama lima hari tersebut, setiap harinya (pada pukul 07.00), setiap ayam diinfeksi dengan S. enteritidis melalui pencekokan, dengan dosis 105 cfu ml-1 (ID50) (Harvey et al. 2007). Pada hari terakhir pelaksanaan infeksi, secara sampling untuk genotipe AG dan GG (sebanyak enam ekor untuk masing-masing genotipe tersebut) dan satu ekor bergenotipe AA dilakukan pengujian terhadap fenotipik ayam tersebut akibat pelaksanaan uji tantang.

Pengujian diawali dengan mengkoleksi telur dan pengambilan sampel darah. Telur tersebut merupakan sampel untuk pengujian keberadaan S. enteritidis dan pengujian konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur. Sampel darah digunakan untuk pengujian S enteritidis dan konsentrasi leukosit serta diferensiasinya. Selanjutnya ayam dipotong, untuk pengujian ekspresi gen TLR4 yang dicerminkan dari jumlah kopi mRNA dari jaringan usus dan ginjal serta pengujian aktivitas fagositosisnya. Selain itu selama pelaksanaan uji tantang juga dilakukan pengamatan aspek produksinya.

Pengujian Ekspresi gen TLR4.

Ekspresi gen TLR4 merupakan fenotipik yang pengujiannya dilakukan secara molekuler. Pengujian ekspresi gen TLR4 ini dilakukan pada jaringan usus dan jaringan ginjal. Pemilihan jaringan usus dalam pengujian ini berdasarkan pada kenyataan bahwa infeksi S. enteritidis diawali dengan menembus dinding usus

dan mukosa usus. Semestinya ekspresi gen TLR4 pada jaringan usus ini lebih tinggi dibandingkan dengan ekspresinya pada jaringan lain, yang dalam penelitian ini pengujiannya diwakili oleh jaringan ginjal. Pengujian ini terdiri dari 3 tahap yaitu 1) ekstraksi RNA, 2) reaksi reverse transkriptase (mensistesis cDNA utas tunggal), dan 3) RT-PCR.

Ekstraksi RNA dilakukan pada sampel yang berasal dari jaringan usus dan dari jaringan ginjal. Sampel yang berasal dari jaringan usus merupakan campuran dari seluruh bagian dari usus yang meliputi duodenum, yeyenum, ileum, seka dan colon (usus besar). Ekstraksi ini untuk mendapatkan total RNA, menggunakan GeneJET Purification Kit (Thermo Scientific), dengan prosedur sebagai berikut : Sebanyak 30 mg sampel dimasukkan dalam tabung 1.5 ml, dihancurkan dengan mikropestle, kemudian ditambah dengan 300 µl lysis buffer. Campuran ini selanjutnya divorteks sampai homogen. Selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Campuran ini lalu disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Bagian supernatan dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambah 450 µl etanol absolut, dan dimasukkan ke dalam RB column. Lalu disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm, selama 1 menit. Kedalam supernatan ini ditambahkan 700 µl wash buffer 1, dan disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm, selama 1 menit. Selanjutnya ditambahkan 600 µl wash buffer 2, dan disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm, selama 1 menit. Kedalam campuran ini ditambah 250 µl wash buffer 2, lalu disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm, selama 2 menit. Jika masih ada cairan, disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm, selama 1 menit. Selanjutnya dipindahkan column ke tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya ditambahkan 100 µl RNase free water, lalu disentrifugase dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. RNA siap digunakan, dan sebelumnya dilakukan perhitungan konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer.

Reverse transcriptase adalah reaksi mensintesis cDNA utas tunggal dari total RNA yang dihasilkan. Reaksi ini juga menggunakan GeneJET Purification Kit (Thermo Scientific), dengan prosedur sebagai berikut : Membuat larutan yang terdiri dari 1 µg total RNA, 1 µl oligo(dt) dan nuclease free water sampai mencapai volume 12 µl. Selanjutnya larutan diinkubasi dalam suhu 65 oC selama 5 menit, kemudian segera dimasukkan ke ice bath. Larutan kemudian ditambahkan 5 x reaction buffer 4 µl, 1 µl RNase inhibitor, 2 µl dNTP mix dan 1 µl reverse transcriptase, sampai mencapi total volume 20 µl. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 42 oC selama 60 menit. Sebagai tahap akhir dipanaskan pada suhu 70 oC selama 5 menit. Kemudian diperoleh cDNA yang siap digunakan.

Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), menggunakan cDNA dari hasil reaksi reverse transcriptase untuk memperoleh mRNA. Pada reaksi ini menggunakan primer (F) : 5’-GTC CCT GCT GGC AGG AT-3’, dan primer (R) : 5’-TGT CCT GTG CAT CTG AAA GCT-3’ (MacKinnon et al. 2006). Pada reaksi ini juga digunakan SYBR Green Super Mix. Untuk menentukan standar kurva gen TLR4 digunakan kontrol gen GAPDH (Anne et al. 2011). Alat yang digunakan adalah qTower.

Pengujian Konsentrasi Leukosit, S. enteritidis dan IgY Spesifik

Pengujian konsentrasi leukosit dan diferensiasinya (heterofil, monosit, dan limfosit) dilakukan dengan menggunakan metode Giemsa (Sastradipradja et al. 1989). Adapun pengujian S. enteritidis dalam sampel darah dan telur mengacu pada BAM (2007). Pengujian konsentrasi IgY spesifik terhadap S. enteritidis dari kuning telur dilakukan dengan menggunakan teknik Indirect ELISA.

Pengujian Aktivitas Fagositosis

Pengujian aktivitas fagositosis dilakukan dengan pengujian terhadap aktivitas dan kapasitas makrofag yang meliputi preparasi sel makrofag, preparasi bakteri (S. enteritidis) dan assay fagositosis (Utama et al. 2000), seperti diuraikan berikut :

Tahap preparasi makrofag, menggunakan makrofag yang berasal dari cairan intra peritonium ayam. Sebelumnya ayam dipotong, selanjutnya ayam di nekropsi dan bagian peritonial diberi NaCl fisiologis sebanyak 5 ml melalui penyemprotan menggunakan alat suntik. Beberapa saat kemudian dilakukan pemanenan cairan intraperitenium dengan menggunakan mikropipet. Cairan intra peritenium yang berisi makrofag dibuat preparat ulas, selanjutnya dilakukan pewarnaan Giemsa. Jumlah makrofag dihitung (menggunakan hemositometer). Jumlah makrofag yang digunakan untuk assay fagositosis ini setara 105 sel ml-1.

Tahap preparasi S. enteritidis, menggunakan isolat bakteri S. enteritidis dibiakan ke dalam medium Braint Heart Infusion Broth sebanyak 50 ml. Selanjutnya diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 oC. Medium tersebut disentrifugase dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit, kemudian bagian supernatan dibuang. Bagian pelet dicuci dengan PBS, lalu divorteks, kemudian disentrifugase lagi dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit, hal ini dilakukan 3 kali, dengan tujuan untuk menghilangkan sisa medium. Pelet selanjutnya dibuat suspensi dengan ditambahkan larutan NaCl fisiologis, kemudian distandarkan dengan larutan Mac. Farland I setara dengan 300 x 106 cfu ml-1 atau 3.0 x 108 cfu ml-1, suspensi yang dibuat diperkirakan mengandung bakteri 3.0 x 108 cfu ml-1, dan suspensi ini siap untuk digunakan.

Tahap assay fagositosis, dilakukan dengan cara : suspensi makrofag 0.5 x 105 sel ml-1 dan 0.5 x 108 sel ml-1 bakteri S. enteritidis ditempatkan ke dalam tabung mikro, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, lalu pada bagian pelet ditambahkan dengan 0.5 ml PBS. Selanjutnya dibuat preparat ulas yang difiksasi dengan metanol selama 15 menit, dan diwarnai dengan pewarna Giemsa selama 60 menit. Kemudian dilihat dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000 kali. Nilai aktivitas fagositosis dihitung dengan rumus berikut :

Nilai kapasitas makrofag merupakan rata-rata jumlah bakteri yang ditelan oleh 50 makrofag yang aktif (Atlas 1984). Pengamatan Aspek Produksi

Selama pelaksanaan uji tantang dilakukan pengamatan terhadap aspek produksi yang meliputi : konsumsi pakan, produksi telur, bobot telur. Dari data konsumsi pakan dan bobot total telur dapat dihitung besarnya nilai konversi pakan.

Analisis Data

Data dianalisis ragam (ANOVA) dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Genotipe gen TLR4 sebagai perlakuan dan data hasil pengujian selama pelaksanaan uji tantang sebagai respon. Model statistik yang digunakan Yij = μ + Pi + εij (Mattjik dan Sumertajaya 2002).

Yij = nilai pengamatan µ = nilai tengah umum Pi = pengaruh perlakuan pada taraf ke i ɛij = pengaruh galat percobaan dari perlakuan ke i pada ulangan ke j


Hasil pengujian fenotipik, baik secara molekuler maupun secara biologis

pada ayam Kampung setelah diinfeksi (ditantang) dengan S. enteritidis selama lima hari berturut-turut dengan dosis infeksi (ID50 : 105 cfu ml-1) kemudian diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4.

Ekspresi gen TLR4

Tingkat ekspresi gen TLR4 adalah salah satu fenotipik, yang dicerminkan oleh jumlah kopi mRNA. Pada penelitian ini dianalisis dari jaringan usus dan dari jaringan ginjal. Ekspresi gen tersebut setelah diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4, disajikan pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan ekspresinya saat

ditantang dengan S. enteritidis


AA*(1) AG (6) GG (6) mRNA usus (x 107) mRNA ginjal (x 107)

3.92 2.58

1.61 ± 0.87 1.12 ± 0.88

2.36 ± 1.62 1.43 ± 0.91

Keterangan : * Genotipe AA tidak disertakan dalam pengujian secara statistik (..) : jumlah sampel

Pada tabel diatas dapat dilihat bahwa rataan jumlah kopi mRNA dari jaringan ginjal (baik pada genotipe AA, AG maupun GG) lebih rendah dari pada jumlah kopi mRNA dari jaringan usus. Hasil ini sesuai dengan Iqbal et al. (2005), yang menyatakan bahwa secara umum, ekspresi gen TLR4 pada jaringan usus adalah tertinggi, selanjutnya diikuti oleh jaringan hati dan limpa. Jumlah kopi mRNA yang terendah adalah dari jaringan ginjal, otak, jantung dan otot.

Bila dilihat dari besarnya nilai rataan jumlah kopi mRNA dari jaringan usus maupun ginjal pada semua genotipe (1.12-3.92 x 107), maka paparan S. enteritidis yang sengaja diberikan mampu menghasilkan ekspresi gen yang tinggi. Hal ini berarti bahwa semua genotipe gen TLR4 setelah dipapar mampu berekspresi secara kuat. Hasil penelitian ini sesuai dengan hasil penelitian Jia et al. (2012) yang menyatakan bahwa gen TLR4 pada itik terekspresi secara kuat baik pada jaringan hati, ginjal, limpa maupun usus.

Jumlah kopi mRNA gen TLR4 dari jaringan usus pada ayam Kampung yang bergenotipe AG dan GG secara statistik tidak berbeda. Demikian juga jumlah kopi mRNA yang berasal dari jaringan ginjal. Hasil ini memberi makna bahwa genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung yang berbeda (AG dan GG), mempunyai potensi yang sama dalam mentranskripsi protein reseptor permukaan sel fagosit. Protein reseptor ini berfungsi mengenali LPS dari S. enteritidis.

Tingkat ekspresi gen TLR4 yang tidak berbeda, disebabkan karena pada umumnya kondisi pemeliharaan ayam Kampung oleh masyarakat dilakukan secara tradisional dan dalam keadaan kurang higiene. Kondisi ini memungkinkan terjadinya paparan S. enteritidis terus menerus secara alami. Paparan tersebut akan menginduksi peningkatan aktivitas gen TLR4 pada seluruh genotipe, sehingga ekspresi yang ditampilkan oleh gen TLR4 juga dipengaruhi oleh interaksi antara faktor genetik dan lingkungan secara terus menerus.

Gen TLR4 yang bergenotipe AA dalam penelitian ini hanya ditemukan dari satu ekor ayam. Hasil pengujian jumlah kopi mRNA dari genotipe tersebut adalah sebesar 3.92 x 107 (dari jaringan usus) dan 2.58 x 107 (dari jaringan ginjal). Setidaknya hasil pengujian jumlah kopi mRNA pada genotipe AA ini tidak lebih rendah dari rataan jumlah mRNA dari genotipe AG dan GG.

Konsentrasi Leukosit dan Diferensiasi Leukosit

Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung saat ditantang S. enteritidis (dosis ID50 : 105 cfu ml-1) dengan konsentrasi leukosit dan diferensiasinya disajikan pada Tabel 4.2. Konsentrasi leukosit dan persentase heterofil, monosit, dan limfosit, antara genotipe AG dan genotipe GG secara statistik tidak berbeda.

Dari tabel ini dapat dilihat bahwa konsentrasi leukosit maupun persentase diferensiasinya pada ketiga genotipe gen TLR4 ayam Kampung (AA, AG, dan GG) berada pada kisaran normal secara fisiologis. Konsentrasi leukosit pada kondisi ini hampir sama dengan hasil penelitian pada tahap kedua. Dengan demikian perlakuan uji tantang dengan S.enteritidis pada dosis infeksi (ID50), tidak menyebabkan gangguan secara fisiologis pada ayam Kampung. Hal ini berarti bahwa meskipun ayam Kampung diinfeksi dengan S. enteritidis, namun secara klinis tidak memperlihatkan gangguan.

Tabel 4.2 Asosiasi genotipe gen TLR4 dengan konsentrasi leukosit dan diferensiasinya pada ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis


AA*(1) AG (6) GG (6) Leukosit (103 sel mm-3) 22.16 19.50 ± 3.83 22.69 ± 9.11

Heterofil (%) 37.00 39.00 ± 3.94 41.43 ± 9.05 Monosit (%) 5.00 5.20 ± 1.79 4.71 ± 1.11 Limfosit (%) 57.00 54.00 ± 4.06 52.43 ± 9.25


Perlakuan uji tantang, selain dapat meningkatkan respons imun non spesifik,

juga diharapkan dapat meningkatkan respons imun spesifik. Limfosit adalah bagian dari leukosit yang terdiri dari limfosit T (sel T) dan limfosit B (sel B), yang berperan dalam pembentukan respons imun spesifik. Dari penelitian tahap kedua, persentase limfosit ayam Kampung pada kondisi normal berkisar antara 44.47-54%. Konsentrasi riil dari limfosit tersebut adalah 9.33-11.98 x 103 sel mm-3. Setelah pelaksanaan uji tantang pada penelitian tahap ketiga ini, persentase limfosit dalam darah sirkulasi meningkat menjadi 52.43-57.00% dengan konsentrasi riilnya sebesar 10.53-12.63 x 103 sel mm-3. Hal ini berarti bahwa perlakuan uji tantang menyebabkan terjadinya proliferasi limfosit, sehingga konsentrasi riil dan persentasenya meningkat.

Untuk mengetahui genotipe yang menghasilkan respons tertinggi dalam pembentukan limfosit, antara sebelum dipapar S. enteritidis dengan setelah pelaksanaan uji tantang, disajikan pada Tabel 4.3. Dari tabel ini terlihat bahwa genotipe GG memperlihatkan respons yang lebih tinggi dalam pembentukan limfosit setelah dipapar dengan S. enteritidis, baik dalam persentase maupun konsentrasi riilnya daripada genotipe AG dan AA. Tabel 4.3 Respons pembentukan limfosit antara sebelum dan sesudah pelaksanaan

uji tantang

Genotipe Sebelum uji tantang Setelah uji tantang Respons

% 103 sel mm-3 % 103 sel mm-3 % 103 sel mm-3 AA 54.00 11.98 57.00 12.63 3.00 0.65 AG 50.00 9.43 54.00 10.53 4.00 1.10 GG 44.47 9.36 52.43 11.89 7.96 2.53

Rasio antara persentase heterofil dan limfosit (H/L) ayam Kampung saat

ditantang dengan S. enteritidis adalah 0.79 ± 0.28. Setelah diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4, maka diperoleh hasil : rasio H/L untuk genotipe AA adalah 0.65, untuk genotipe AG dan GG masing-masing mempunyai rasio H/L sebesar 0.73 ± 0.12 dan 0.85 ± 0.38. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ayam dalam kondisi tercekam. Terjadinya cekaman ini disebabkan karena ayam sedang diinfeksi dengan S. enteritidis. Selain itu, suhu lingkungan pemeliharaan yang

jauh dari kondisi nyaman bagi ayam memperparah tingkat stres yang terjadi. Aktivitas Fagositosis

Aktivitas fagositosis dalam penelitian ini diperoleh dari pengujian aktivitas dan kapasitas makrofag sebagai sel fagosit. Secara keseluruhan ayam Kampung yang sedang ditantang dengan S. enteritidis memperlihatkan rataan nilai aktivitas makrofag sebesar 72.92 ± 4.03%. Enny et al. (2013) dari hasil penelitiannya melaporkan bahwa sel makrofag pada ayam broiler berumur 5 minggu (dalam kondisi normal, tanpa perlakuan tertentu), memperlihatkan jumlah makrofag yang aktif sebesar 10.96%. Dengan demikian ayam Kampung yang ditantang dengan S. enteritidis dalam penelitian ini menghasilkan aktivitas makrofag yang sangat tinggi.

Tingginya aktivitas makrofag pada ayam Kampung akibat paparan S. enteritidis ini juga diikuti dengan peningkatan kapasitasnya. Rataan kapasitas makrofag dari seluruh sampel ayam Kampung yang diuji dalam penelitian ini adalah sebesar 41.38 ± 2.71 bakteri makrofag-1. Nilai kapasitas makrofag hasil penelitian ini sangat tinggi dibandingkan dengan hasil penelitian Okti et al. (2008), yang menyatakan bahwa kapasitas makrofag ayam petelur komersial (Single Comb Brown Leghorn) berumur 24 minggu adalah sebesar 1.60 bakteri makrofag-1.

Nilai aktivitas dan kapasitas makrofag dalam penelitian ini setelah diasosiasikan dengan genotipe gen TLR4 ayam Kampung, diperoleh hasil seperti disajikan pada Tabel 4.4. Secara statistik nilai aktivitas dan kapasitas makrofag dari ayam Kampung yang gen TLR4 nya bergenotipe AG dan GG tidak berbeda.

Tabel 4.4 Asosiasi genotipe gen TLR4 dengan aktivitas dan kapasitas makrofag

ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis


AA*(1) AG (6) GG (6) Aktivitas makrofag (%) 74.00 74.40 ± 4.39 71.86 ± 3.72 Kapasitas makrofag (bakteri makrofag-1) 40.96 40.33 ± 1.26 42.13 ± 3.29


Ayam Kampung dengan gen TLR4 bergenotipe AA memperlihatkan nilai

aktivitas dan kapasitas makrofag yang hampir sama dengan AG maupun GG. Hal ini memperlihatkan bahwa ketiga genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis menghasilkan aktifitas fagositosis yang tinggi dan hampir sama antara ketiganya. Tingginya aktivitas fagositosis ini sejalan dengan tingginya hasil pengujian ekspresi gen TLR4 pada ketiga genotipe (AA, AG, dan GG). Dengan tingkat ekspresi gen TLR4 yang tinggi, maka protein TLR4 yang ditranskripsi juga tinggi. Protein ini merupakan reseptor permukaan sel fagosit yang berperan dalam mengenali LPS dari bakteri S. enteritidis yang dipaparkan. Makrofag, yang pada permukaan selnya terdapat reseptor TLR4 dalam jumlah banyak akan mampu meningkatkan aktivitas fagositosisnya terhadap S. enteritidis.

Tingginya nilai aktifitas dan kapasitas makrofag ini juga disebabkan karena

di dalam tubuh ayam Kampung sudah terdapat zat kebal (antibodi) yang spesifik terhadap S. enteritidis, seperti yang telah dibuktikan pada penelitian tahap kedua. Keberadaan antibodi spesifik dalam serum darah dapat meningkatkan aktivitas fagositosis dari sel fagosit, karena salah satu fungsi dari antibodi adalah sebagai opsonin. Hal tersebut telah dibuktikan oleh Okti et al. (2008), yang menyatakan bahwa kapasitas makrofag ayam petelur periode produksi setelah dipreinkubasi dengan IgY kuning telur, meningkat dari 1.60-5.18 bakteri makrofag-1.

Keberadaan S. enteritidis dalam Darah dan Telur

Hasil pengujian S. enteritidis dalam darah dan telur ayam Kampung yang dipapar dengan bakteri tersebut disajikan dalam Tabel 4.5.

Tabel 4.5 Asosiasi genotipe gen TLR4 ayam Kampung dengan keberadaan S.

enteritidis dalam darah dan telur saat pelaksanaan uji tantang


AA*(1) AG (6) GG (6) S. enteritidis dalam darah negatif negatif negatif S. enteritidis dalam telur negatif negatif negatif Keterangan : (..) : jumlah sampel

Meskipun ayam dalam penelitian ini diinfeksi dengan S. enteritidis, tetapi dalam pengujian keberadaan bakteri tersebut di dalam darah ayam Kampung dari ketiga genotipe gen TLR4 (AA, AG, dan GG), hasilnya negatif. Ketidakberadaan bakteri tersebut dalam darah menyebabkan pengujian keberadaan S. enteritidis dalam telur yang dihasilkan ayam tersebut juga negatif. Hal ini disebabkan karena ayam tersebut memiliki nilai aktivitas dan kapasitas makrofag yang tinggi. Tingginya nilai aktivitas fagositosis ini berarti bahwa makrofag mampu berfungsi dengan sangat baik dan clearence terhadap bakteri S. enteritidis yang dipaparkan.

Konsentrasi IgY Spesifik S. enteritidis dalam Kuning Telur

Sebelum ditantang dengan S. enteritidis, kuning telur ayam Kampung mengandung IgY spesifik S. enteritidis dalam konsentrasi yang tinggi. Setelah dipapar dengan bakteri tersebut konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis disajikan dalam Tabel 4.6.

Tabel 4.6 Konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur setelah ayam

Kampung ditantang dengan S. enteritidis

Genotipe gen TLR4 IgY spesifik S. enteritidis (mg ml-1)

AA*(1) 2.94 AG (6) 3.69 ± 0.68 GG (6) 3.89 ± 0.83 Keterangan : * Genotipe AA tidak disertakan dalam pengujian secara statistik

(..) : jumlah sampel

Pelaksanaan uji tantang ini seharusnya meningkatkan konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darahnya, sehingga konsentrasinya yang ditransfer ke kuning telur semestinya juga signifikan lebih tinggi. Hasil pengujian konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis pada tahap ini berkisar antara 2.94-3.89 mg ml-1. Hasil tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan saat sebelum dilakukan uji tantang yaitu sebesar 2.47-3.58 mg ml-1.

Pembentukan antibodi bila di dalam tubuh sudah terdapat sel B memori bisa berlangsung lebih cepat dengan konsentrasi lebih tinggi. Meskipun demikian, karena pengujian terhadap IgY spesifik S. enteritidis pada penelitian tahap ini dilakukan pada hari terakhir pelaksanaan uji tantang, maka hal tersebut menyebabkan konsentrasi IgY spesifik yang diperoleh belum tampak signifikan dibandingkan saat sebelum ditantang.

Antara kuning telur yang dihasilkan ayam bergenotipe AG dan GG memiliki konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis yang tidak berbeda. Meskipun demikian, bila diperhatikan dari respons pembentukan IgY spesifik S. enteritidis antara sebelum dan setelah ditantang dengan bakteri tersebut, genotipe GG memperlihatkan respons yang lebih tinggi (0.31 mg ml-1) daripada genotipe AG (0.17 mg ml-1).

Aspek Produksi

Pengamatan aspek produksi pada penelitian ini dilakukan dalam 28 hari pemeliharaan, yaitu selama 23 hari sebelum pelaksanaan uji tantang dan 5 hari saat uji tantang. Parameter yang diamati adalah konsumsi pakan, produksi telur (hen day), bobot telur dan nilai konversi pakan.

Ayam Kampung seperti telah disampaikan diawal, adalah ayam lokal Indonesia yang tidak mempunyai ciri spesifik, dengan keragaman fenotipik yang sangat besar. Keragaman ini terutama pada warna bulu dan produktifitasnya. Setelah memasuki dewasa kelamin, rata-rata ayam Kampung yang dipelihara masyarakat secara tradisional bertelur 4 periode/tahun. Pada pemeliharaan secara intensif yang dimulai sejak anak ayam umur sehari, frekuensi bertelur bisa ditingkatkan menjadi 7-8 periode/tahun. Setiap periode, menghasilkan telur sekitar 10-12 butir (Masjoer 1985, Sinurat et al. 1992).

Berdasarkan karakter tersebut maka hasil pengamatan aspek produksi, khususnya mengenai produksi telur hen day dalam penelitian ini, belum mencerminkan respons sesungguhnya dari perlakuan yang ingin diketahui. Oleh sebab itu data yang disajikan pada Tabel 4.7 ini hanya merupakan gambaran saat penelitian berlangsung. Data tersebut tidak dianalisis secara statistik, untuk menghindari kesalahan dalam menyimpulkannya.

Rataan konsumsi pakan ayam Kampung yang sedang ditantang dengan S. enteritidis secara keseluruhan berkisar 91.61 ± 3.29 g ekor-1 hari-1. Rataan konsumsi pakan antara genotipe AA, AG, dan GG dari tabel tersebut tampak hampir sama. Tingginya konsumsi pakan dalam penelitian ini disebabkan karena ayam sedang diinfeksi, sehingga memerlukan nutrisi yang lebih untuk bertahan. Sebelum dilakukan uji tantang rataan konsumsi pakan ayam adalah 88.63 ± 3.11 g ekor-1 hari-1. Rataan konsumsi pakan ayam Kampung sebelum pelaksanaan uji tantang ini hampir sama dengan pernyataan Iskandar (2007), yang melaporkan bahwa rataan konsumsi pakan ayam Kampung dewasa adalah 88 g ekor-1 hari-1.

Tabel 4.7 Asosiasi genotipe gen TLR4 dengan parameter aspek produksi ayam Kampung saat ditantang dengan S. enteritidis

Aspek Produksi Genotipe gen TLR4

AA*(1) AG (18) GG (31) Konsumsi pakan (g ekor-1 hari-1) Produksi telur hen day (%) Bobot telur (g butir-1) Konversi pakan

91.70 60.00 41.00 3.73

92.19 ± 4.28 62.23 ±13.72 40.47 ± 1.94 3.67 ± 1.37

91.20 ± 2.67 34.84 ±11.86 40.55 ± 2.46 6.46 ± 3.21

Keterangan : (..) : jumlah sampel

Dari tabel tersebut dapat dilihat bahwa produksi telur hen day yang dihasilkan ayam begenotipe GG sepertinya lebih rendah dari pada AG maupun AA. Sejak memasuki minggu kedua pemeliharaan, ayam Kampung dalam penelitian ini mulai banyak yang memasuki periode interval (istirahat produksi). Genotipe GG yang istirahat bertelur sebesar 58.06% (18 ekor), sedangkan genotipe AG sebesar 44.44% (8 ekor). Selama 23 hari pemeliharaan (sebelum pelaksanaan uji tantang) diperoleh rataan produksi telur (hen day) sebesar 47.62% (AA), 50.53 ± 12.07% (AG) dan 38.25 ± 9.23% (GG). Kondisi ini ternyata masih berlangsung sampai memasuki pelaksanan uji tantang.

Rendahnya produksi telur hen day pada genotipe GG ini belum tentu merupakan akibat dari pelaksanaan uji tantang, yang terkait dengan ketahanan tubuhnya. Hal ini lebih disebabkan karena kemungkinan ketiga genotipe ayam tersebut tidak berbarengan dalam memasuki periode produksi dan periode istirahat produksinya.

Dengan demikian untuk mengetahui apakah genotipe gen TLR4 berasosiasi dengan aspek produksi khususnya produksi telur hen day pada ayam Kampung, diperlukan penelitian lanjutan dengan lama pengamatan sedikitnya satu tahun setelah ayam mencapai dewasa kelamin.

Rataan bobot telur antara ketiga genotipe gen TLR4 tersebut hampir sama, berkisar antara 40.47-41.00 g butir-1. Rataan bobot hasil penelitian ini sedikit lebih rendah dari pada hasil penelitian Iskandar (2007), yang menyatakan bahwa rataan bobot telur ayam Kampung adalah 43.6 g butir-1.

Pada ayam bergenotipe AG, dengan tingkat produksi yang lebih tinggi berdampak pada nilai konversinya. Nilai konversi yang diperoleh juga lebih baik dari pada ayam yang bergenotipe GG.

Simpulan

Ayam Kampung (pada ketiga genotipe gen TLR4 : AA, AG, dan GG) saat

ditantang dengan S. enteritidis pada dosis infeksi (ID50), tahan terhadap bakteri S. enteritidis. Berdasarkan respons fisiologis, genotipe GG lebih baik dari pada AG. Berdasarkan aspek produksinya sepertinya genotipe GG lebih rendah dari pada genotipe AG.

5 PEMBAHASAN UMUM

Sebagai kearifan lokal, telur ayam Kampung dipercaya oleh masyarakat

Indonesia dapat meningkatkan daya tahan tubuh dan menyembuhkan berbagai macam penyakit. Oleh sebab itu sebagian besar telur ayam Kampung, selama ini dimanfaatkan masyarakat sebagai jamu atau bagian dari ramuan jamu yang dikonsumsi secara langsung tanpa melalui pemasakan. Kepercayaan tersebut dipelihara oleh masyarakat dan menurun dari geneasi ke generasi berikutnya. Hal tersebut terjadi karena selama ini tidak ditemukan kejadian salmonellosis yang diakibatkan karena mengkonsumsi telur ayam Kampung mentah.

Ayam Kampung tidak memiliki ciri yang khas, sangat beragam sifatnya, dan tersebar di berbagai wilayah Indonesia. Masyarakat menganggap bahwa ayam Kampung merupakan ayam yang tahan terhadap penyakit. Ayam Kampung dipelihara oleh masyarakat secara tradisional dalam kondisi lingkungan marginal. Dengan pakan berkualitas rendah, dalam lingkungan pemeliharaan yang tidak higiene, tetapi keberadaan ayam Kampung tetap exist, dan tetap mengalami peningkatan populasi, meskipun peningkatan tersebut tidak terlalu tinggi (dari tahun 2000-2012, populasi meningkat sekitar 5.90%).

Berdasarkan kedua hal tersebut diatas, ide penelitian ini berawal. Penelitian ini mengkaji ketahanan tubuh ayam Kampung terhadap infeksi S. enteritidis. Bakteri S. enteritidis di dalam manajemen pemeliharaan ternak unggas tidak merupakan agen penyakit yang diperhitungkan, karena sifatnya tidak mematikan. Dari segi keamanan pangan, S. enteritidis merupakan salah satu bakteri yang sangat penting, karena dua alasan. Yang pertama, S. enteritidis selain patogen, juga bersifat zoonosis, dan sebagai inangnya adalah manusia dan hewan (terutama adalah ayam). Alasan kedua adalah, sebagaimana bakteri Salmonella yang lain, yaitu mudah menyebar. Oleh sebab itu kasus salmonellosis yang dilaporkan, sebagian besar adalah karena infeksi S. enteritidis yang disebabkan karena mengkonsumsi telur mentah atau telur yang tidak matang secara sempurna.

Ketahanan tubuh merupakan sifat yang selain dipengaruhi oleh lingkungan, juga dikontrol oleh gen. Salah satu gen yang telah dibuktikan berasosiasi kuat dengan ketahanan tubuh terhadap S. enteritidis adalah gen TLR4. Gen ini menstrankripsi protein yang berperan sebagai reseptor permukaan sel fagosit, baik makrofag maupun heterofil. Reseptor TLR4 mampu mengenali lipopolisakarida (LPS), yang merupakan salah satu komponen bakteri S. enteritidis. Semakin aktif gen TLR4 berarti semakin banyak reseptor TLR4 yang ditranskripsi. Semakin banyak reseptor TLR4 pada permukaan sel fagosit maka kemampuan fagositosis sel tersebut terhadap S. enteritidis akan meningkat. Respons tubuh yang diperantarai oleh sel fagosit disebut respons imun non spesifik. Dengan demikian keaktifan gen TLR4 ini berpengaruh secara langsung terhadap respons imun non spesifik yang ditimbulkan.

Oleh sebab itu tujuan penelitian ini adalah membuktikan ketahanan ayam Kampung terhadap S. enteritidis menggunakan gen TLR4 sebagai penciri genetik. Pembuktian dilakukan dengan mengasosiasikan genotipe gen TLR4 pada ayam Kampung dengan ketahanannya yang diekspresikan oleh gen tersebut terhadap S. enteritidis. Pembuktian ini dilakukan melalui serangkaian pengujian secara molekuler dan secara biologis.

Dari genotyping gen TLR4 yang dilakukan pada ayam Kampung menggunakan teknik PCR-RFLP pada exon 2 (basa ke 3898-4117), dengan enzim restriksi MscI, teridentifikasi tiga macam genotipe gen TLR4, yaitu AA, AG dan GG. Genotipe GG mendominasi frekuensi genotipe gen TLR4. Ketiga genotipe ini selanjutnya diasosiasikan dengan aspek ketahanan ayam.

Pada kondisi lingkungan pemeliharaan ayam Kampung yang normal, di dalam darah maupun telurnya tidak ditemukan keberadaan S. enteritidis, baik pada AA, AG, maupun GG. Kenyataan ini tidak berarti bahwa dalam keadaan sehari-hari ayam Kampung tidak pernah terpapar oleh bakteri tersebut. Hal ini dibuktikan dari hasil pengujian IgY spesifik S. enteritidis secara kualitatif dalam serum darahnya. Ketiga macam genotipe gen TLR4 di dalam serum darahnya positif ditemukan antibodi (IgY) spesifik S. enteritidis. Keberadaan IgY spesifik ini membuktikan bahwa dalam keadaan normal ayam dapat terinfeksi bakteri ini secara alami dari lingkungan.

Antibodi spesifik yang terdapat dalam serum darah ayam Kampung ini selanjutnya dalam proses pembentukan telur, ditransfer ke kuning telur, sehingga kekebalan yang terdapat dalam kuning telur ini diperoleh secara pasif dari induknya (maternal immunity). Yang mengejutkan adalah kenyataan bahwa konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur ini sangat tinggi. Pada ketiga genotipe gen TLR4 ayam Kampung, konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam kuning telur berkisar antara 2.47-3.58 mg ml-1.

Konsentrasi IgY spesifik yang terkandung dalam kuning telur ayam ras adalah 0.07-0.67 mg ml-1 (Schade dan Hlinak 1996) atau berkisar antara 0.2-2.0 mg ml-1 (Rose et al. 1974). Meskipun keberadaan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum tidak diuji secara kuantitatif, tetapi berdasarkan tingginya konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis yang ditransfer ke kuning telur, menunjukkan bahwa konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darah ayam Kampung tentunya juga sangat tinggi. Kenyataan diatas adalah kunci jawaban mengapa tidak pernah ditemukan kasus salmonellosis karena mengkonsumsi telur ayam Kampung mentah. Telur ayam Kampung mempunyai konsentrasi IgY spesifik S. enteritidis yang sangat tinggi, sehingga mampu melindungi dari terjadinya kontaminasi bakteri tersebut yang berasal dari lingkungan sekitarnya.

Pada ayam Kampung meskipun terinfeksi S. enteritidis secara alami, tetapi di dalam darah tidak ditemukan bakteri tersebut. Hal ini berarti bahwa makrofag dan heterofil, sebagai sel fagosit berfungsi dengan sangat baik dan clearence terhadap bakteri tersebut. Ketidakberadaan S. enteritidis dalam darah ayam Kampung pada ketiga genotipe gen TLR4 ini menyebabkan pada telur yang dihasilkan ayam tersebut juga tidak ditemukan S. enteritidis.

Makrofag dan heterofil mampu memfagositosis S. enteritidis yang menginfeksi secara alami, disebabkan karena dipermukaan sel fagosit tersebut banyak terdapat reseptor TLR4. Tingginya reseptor TLR4 ini memudahkan makrofag dalam menangkap S. enteritidis. Reseptor TLR4 ini merupakan protein yang ditranskripsi oleh gen TLR4. Apabila gen TLR4 ini aktif maka reseptor TLR4 yang hasilkan adalah banyak, dan ayam yang demikian termasuk dalam kategori tahan terhadap S. enteritidis.

Hal tersebut dibuktikan pada pengujian tingkat ekspresi gen TLR4 saat ditantang dengan S. enteritidis dengan dosis infeksi. Setelah dipapar dengan S. enteritidis, ekspresi gen TLR4 pada ketiga genotipe, dianalisis secara molekuler

dengan teknik RT-PCR. Tingkat ekspresi gen TLR4, yang dicerminkan oleh jumlah kopi mRNA, merupakan indikator keaktifan dari gen TLR4. Ekspresi gen TLR4 dianalisis dari jaringan usus (gabungan dari duodenum, yeyenum, ileum, seka dan colon), serta dari jaringan ginjal. Baik yang berasal dari jaringan usus maupun ginjal, jumlah kopi mRNA yang dihasilkan oleh ketiga genotipe gen TLR4 (AA, AG, dan GG) termasuk kategori tinggi yaitu berkisar antara 1.12 - 3.92 x 107.

Tingginya jumlah kopi mRNA ini menandakan ketiga genotipe gen TLR4 dalam kondisi aktif. Dengan demikian jumlah protein TLR4 yang ditranskripsi sebagai reseptor permukaan sel fagosit adalah tinggi. Jumlah reseptor TLR4 yang banyak pada permukaan sel fagosit ini berkorelasi positif dengan aktifitas fagositosis, dan berkorelasi negatif dengan konsentrasi S. enteritidis dalam darah dan telur ayam.

Pengujian secara biologis terhadap aktifitas fagositosis ayam Kampung setelah dipapar dengan S. enteritidis diperoleh nilai yang sangat tinggi. Makrofag yang aktif dari ketiga genotipe gen TLR4 ayam Kampung berkisar antara 71.86-74.40%, dengan kapasitas makrofag sebesar 40.33-42.13 bakteri makrofag-1. Nilai aktivitas makrofag dan kapasitas makrofag yang tinggi tersebut, terbukti mampu mengeliminasi atau clearence terhadap S. enteritidis yang dipaparkan, sehingga dalam pengujian keberadaan bakteri tersebut di dalam darah maupun dalam telur hasilnya negatif.

Paparan S. enteritidis yang diberikan pada ayam Kampung meningkatkan aktivitas gen TLR4 pada semua genotipe (AA, AG dan GG). Peningkatan ini berdampak pada peningkatan aktivitas fagositosis. Dengan demikian paparan S. enteritidis ini secara langsung meningkatkan respons imun non spesifik yang diperantarai oleh sel fagosit, khususnya makrofag. Secara tidak langsung paparan ini juga akan meningkatkan respons imun spesifik, melalui peran makrofag sebagai Antigen Presenting Cell (APC).

Pembentukan respons imun spesifik diperantarai oleh sel T helper dan sel B. Produk dari respons imun spesifik ini adalah antibodi spesifik. Pembentukan IgY spesifik akibat paparan S. enteritidis pada ayam Kampung dalam penelitian ini akan lebih cepat dengan konsentrasi yang lebih tinggi. Asumsi ini berdasarkan kenyataan bahwa sebelum ditantang dengan S. enteritidis, ayam Kampung yang digunakan dalam penelitian ini sudah pernah terpapar secara alami oleh bakteri tersebut dari lingkungan pemeliharaan. Dengan demikian di dalam tubuh ayam Kampung tersebut sudah terbentuk sel B memori spesifik S. enteritidis.

Bahasan umum yang diuraikan diatas menjawab seluruh hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini. Ayam Kampung pada semua genotipe gen TLR4 saat dipapar dengan S. enteritidis pada dosis infeksi (ID50 : 105 cfu ml-1), menghasilkan ekspresi gen tinggi, menghasilkan aktivitas fagositosis yang juga tinggi, tidak ditemukan S. enteritidis dalam darah dan telur, serta positif ditemukan IgY spesifik S. enteritidis dalam serum darahnya dan konsentrasinya dalam kuning telur sangat tinggi. Selain itu ayam Kampung saat dipapar dengan S. enteritidis dengan dosis tersebut, tidak mengalami gangguan secara fisiologis. Hal ini dibuktikan bahwa pada ketiga genotipe gen TLR4 (AA, AG, dan GG), dari hasil pengujian konsentrasi leukosit dan diferensiasinya tetap berada pada kisaran normal. Dengan demikian ayam Kampung dengan ketiga genotipe gen TLR4 ini termasuk tahan terhadap S. enteritidis.

Bila dilihat dari respons fisiologis (pada persentase limfosit dan konsentrasi riilnya serta IgY spesifik), antara sebelum dan setelah ditantang dengan S. enteritidis, genotipe GG memperlihatkan respons yang lebih tinggi daripada AG. Berdasarkan aspek produksinya (persentase produksi telur hen day), sepertinya genotipe GG lebih rendah daripada AG.

Genotipe GG pada ayam Kampung ini menarik untuk dicermati. Genotipe tersebut frekuensinya tinggi, memperlihatkan respon fisiologis yang tinggi pada aspek ketahanan, tetapi pada pengamatan aspek produksi yang singkat diperoleh rataan produksi telur rendah. Perlu waktu pengamatan yang panjang untuk memastikan apakah genotipe GG ini berkorelasi positif atau sebaliknya dengan produksi telur hen day yang dihasilkan.

Setidaknya dengan dibuktikannya bahwa ayam Kampung pada semua genotipe tahan terhadap S. enteritidis, maka kedepan pengembangan ayam Kampung benar-benar bisa diarahkan pada peningkatan produkstivitasnya, terutama peningkatan produksi telur hen day. Selama ini upaya peningkatan produksi ayam Kampung lebih banyak pada peningkatan managemen pemeliharaan dan perbaikan mutu pakan. Hasil yang diperoleh akan lebih baik bila upaya tersebut disinergikan dengan pendekatan genetik, melalui program seleksi yang dilakukan secara terus menerus.

6 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Gen TLR4|MscI dapat digunakan sebagai penciri genetik untuk sifat ketahanan terhadap infeksi bakteri Salmonella sp. pada ayam lokal Indonesia. Berdasarkan pengujian secara molekuler maupun secara biologis, ayam Kampung pada semua genotipe (AA, AG, dan GG) tahan terhadap S. enteritidis. Telur yang dihasilkan ayam Kampung memiliki antibodi spesifik S. enteritidis dengan konsentrasi yang tinggi. Genotipe GG memperlihatkan respons fisiologis lebih baik dari pada AG saat ditantang dengan S. enteritidis. Pengamatan terhadap aspek produksi khususnya pada produksi telur hen day, sepertinya genotipe GG lebih rendah dari pada AG.

Saran

Perlu sampel yang lebih banyak untuk identifikasi keragaman gen TLR4

pada ayam Kampung dan untuk pengujian asosiasinya. Perlu waktu pengamatan yang lebih lama terhadap performa produksinya, mulai dari periode anakan sampai dengan periode produksi, karena aspek produksi khususnya produksi telur hen day dipengaruhi oleh banyak faktor.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya N, Swacita IBN, Ketut TPG. 2012. Deteksi bakteri Salmonella sp dan pengujian kualitas telur ayam buras. Indonesia Medicus Veterinus 1(3):320-329.

Akashi SY, Nagai H, Ogata M, Oikawa K, Fukase S, Kusumoto K, Kawasaki M, Nishijima S, Hayashi M, Kimoto, Miyake K. 2001. Human MD-2 confers on mouse Toll-like receptor 4 species-specific lipopolysaccharide recognition. Int. Immunol. 13:1595-1599.

Akira S, Takeda K. 2004. TLR signaling pathways. Nature Reviews Immunology 4:499-511.

Allendorf FW, Luikart G. 2007. Conservation and The Genetic of Population. Blackwell Publishing.

Anne MC, Olivier G, Elisabeth B, Yves LV, Pierrette M, Jerome T, Vincent R, Zhiguang W, Dominique K, Catherine B, Philippe V. 2011. Expression of Toll-like receptor 4 and downstream effectors in selected cecal cell subpopulations of chicks resistant or susceptible to Salmonella carrier state. Infection and Immunity 79 (8):3445-3454.

Atlas RM. 1984. Phagocytosis In Microbiology Fundamentals and Application, New York. Macmillan Company. Hlm. 476-88.

Bacteriological Analitical Manual. 2007. Salmonella. http://www.fda.gov/Science Research/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnaliticalManual/B

Enny YW Y, Widya A,Wayan TA, Charles RT. 2013. Virgin Coconut Oil

[06/03/2011] Baratawidjaja KG, Rengganis I. 2012. Imunologi Dasar. Edisi ke-10. Badan

Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta. Beaumont C, Protais J, Pitel F, Leveque G, Malo D, Lantier F, Plisson-Petit F,

Colin P, Protais M, Roy PL, Elsen JM, Milan D, Lantier I, Neau A, Salvat G, Vignal A. 2003. Effect of two candidate genes on Salmonella carier state in fowl. Poultry Sci. 82:721-726.

Bell DD, Weaver WD. 2002. Commercial Chicken Meat and Egg Production. 5th Ed. New York. USA. Springer Science and Business Media Inc.

Bhunia AK. 2008. Foodborne Microbial Pathogen : Mechanisms And Pathogenesis. New York. Springer.

Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. 1980. Construction of genetik linkage map in human using restriction fragmen length polymorphisms. Amer. J. Hum. Genet. 32:314-331.

Brown TA. 2007. Genomes 3. 3rd Ed. New York. Garland Science Publishing. Calenge F, Kaiser P, Vignal A, Beaumont C. 2010. Genetic control of resistance

to salmonellosis and to Salmonella carrier-state in fowl : a review. Genetics Selection Evolution 42:1-11.

Davis AK, Maney DL, Maerz JC. 2008. The use of leucocyte profiles to measure stress in vertebrates : a review for ecologists. Func. Ecol. 22:760-772

Direktorat Jendral Peternakan. 2013. Statistik Peternakan dan Kesehatan Hewan. Kementerian Pertanian RI. Jakarta.

Emertcan A, Ozturk F, Gunduz K. 2011. Toll-like receptors and skin. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 11:1-7

http://www.fda.gov/Science�

meningkatkan aktivitas fagositosis makrofag ayam pedaging pasca vaksinasi flu burung. Jurnal Veteriner 14(2):190-196.

Falconer, DS, Mackay, TFC. 1996. Introduction to Quantitative Genetic. 4th. Ed. New York. Longman Inc.

Ganong WF. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed 22. Terjemahan. Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Gantois I, Ducatelle R, Pasmans F, Haesebrouck, Gast R, Humpre TJ, Immerseel V. 2009. Mechanisms of egg contamination by Salmonella enteritidis : in Federation of European microbiological Societies. Belgium. Blackwell Publishing.

Gary L, Vincenzo F, Shaun M, Adrian LS, Nat B, Paul B, Loredo-Osti JC, Morgan K, Danielle M. 2003. Allelic Variation in TLR4 is lingked to susceptibility to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection in chicken. Infection and Immunity. 71(3): 1116-1124.

Hartl DL, Clark AG. 1997. Principle of Population Genetik. Sinauer Associates, Sunderland, MA.

Harvey RA, Champe PC, Fisher BD, Strohl WA. 2007. Microbiology. Philadelphia : Williams & Wilkin.

Iqbal M, Victoria JP, Adrian LS. 2005. Expression patterns of chicken Toll-like receptor mRNA in tissues, immune cell subsets and cell lines. Veterinary Immunology and Immunopathology 104:117-127.

Iskandar S. 2007. Tatalaksana Pemeliharaan Ayam Lokal dalam

Liu Y, Chang GB, Bao WB, Wang KH, Zhang XY, Chen GH. 2011. Polymorphism of Exon 2 of TLR4 Gene and Its Correlation with Some Commercial Traits in Anka Chicken. African Journal of Biotechnology 10(42):8260-8266.

Keanekaragaman Sumber Daya Hayati Ayam Lokal Indonesia : Manfaat dan Potensi. Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Bogor. LIPI-Press.

Jain NC. 1993. Essential of Veterinary Hematology. Philadelphia. Lea & Febiger. Jeong SS, Hoon HH. 2006. The Amazing Egg. Department of Agricultural, Food

and Nutritional Science. University of Alberta. Edmonton. Alberta. Canada. Jia H, Li G, Li J, Tian Y, Wang D, Shen J, Tao Z, Xu J, Lu L. 2012. Cloning

expression and bioinformatics analysis of duct TLR4 gene. Br. Poult. Sci. 53 (2):190-197.

Kabelitz D. 2007. Expression and function of Toll-like receptors in T lymphocytes. Curr Opin Immunol. 19:39-45.

Lee EN, Sunwo H, Menninen K, Sim JS. 2002. In vitro studies of chicken egg yolkantibody (IgY) against Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium. Poult. Sci. 81:632-641.

Li HF, Hu Y, Hu H, Song C, Shu JT, Zhu CH, Zhang SJ, Fan JH, Chen WW. 2013. Genetic differ in TLR4 gene polymorphisms and expression involved in Salmonella natural and artificial infection respectively in Chinese native chicken breeds. Mol. Biol. Rep. DOI : 10.1007/s11033-013-2601-8.

Lorenz E, Mira JP, Frees KL, Schwartz DA. 2002. Relevance of mutations in the TLR4 receptor in patients with gram-negative septic shock. Arch Intern Med. 162:1028-1032.

MacKinnon KM, He H, Narren JR, Swagerty CL, Genovese KJ, Kogut MH. 2009. Expression profile of toll-like receptors within the gastrointestinal

tract of 2-day-old Salmonella enteritidis-infected broiler chickens. Veterinary Microbiology 137:313-319

Maeda. 2005. Polymorphism of Mx gene in Asia indigenous chicken population. Makalah dipresentasikan pada Seminar Nasional Tentang Unggas Lokal III. Universitas Diponegoro. 25 Agustus 2005.

Malek M, Hasenstein JR, Lamont SJ. 2004. Analysis of chicken TLR4, CD28, MIF, MD2 and LITAF genes in a Salmonella enteritidis Resource Population. Poultry Sci. 83:544-549.

Mansjoer SS. 1985. Pengkajian sifat-sifat produksi ayam Kampung serta persilangannya dengan ayam Rhode Island. Disertasi. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor.

Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Ed ke-2. Bogor : IPB Press.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed 2. Bogor. IPB Press. Nataamijaya AG. 2010. Pengembangan potensi ayam lokal untuk menunjang

peningkatan kesejahteraan petani. J Litbang Pertanian 29(4):131-138. Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Geneticcs. New York. Columbia University

Press. Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York.

Oxford Univ Pr. Nicholas FW. 2004. Pengantar Genetika Veteriner. Bogor. Pustaka Wira Usaha

Muda. Noor RR. 2010. Genetika Ternak. Jakarta. Penebar Swadaya. Nugroho WS. 2005. Tingkat cemaran Salmonella sp. pada telur ayam ras di

tinngkat peternakan kabupaten Sleman Yogyakarta. Prosiding Lokakarya Nasional Keamanan Pangan Produk Peternakan. Puslitbang Peternakan. Bogor.

Ochiai RL, Acosta CJ, Danovaro-Holliday MC. 2008. A Study of Typhoid Fever in Five Asian Countries: Disease Burden and Implications for Controls. Bulletin of the World Health Organization 86:260-268.

Okti NP, Retno DS, Agustin I, Wibawan IWT. 2008. Peran antibodi kuning telur (IgY) sebagai opsonion untuk pencegahan serangan mutan Streptococcus serotipe D (Streptococcus sobrinus). Berkala Penelitian Hayati 13:129-134.

Rose ME, Orlans E, Buttress N. 1974. Immunoglobulin classes in the hen’s egg : their segregation in yolk and white. Eur J Immunol. 4:521-523.

Ruan WK, Wu JH, An J, Zheng SJ. 2012. Polymorphisms of chicken TLR4, 5, 21 in different breeds. Poultry Sci. 91 : 2512-2516.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning : a Laboratory Manual. United State of America : CSH Lab Pr.

Sastradipraja D, Sri Hartini SS, Reviany W, Tonny U, Achmad M, Hamdani N, Regina S, Razak H. 1989. Penuntun Praktikum Fisiologi Veteriner. Bogor. Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat IPB.

Schade R., Hlinak A. 1996. Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects. ALTEX. 13(1):5-9.

Sinurat AP, Santoso , Juarini E, Sumanto, Murtisari T, Wibowo B. 1992. Peningkatan produktivitas ayam Kampung melalui pendekatan sistem usaha tani pada peternak kecil. Ilmu dan Pet 5(2): 73-77.

Sironi L, Ramelli P, Williams JL, Mariani P. 2010. PCR-RFLP genotyping

protocol for chicken Mx gene G/A polymorphism associated with the S631N mutation. Genet. Mol. Res. 9 (2): 1104-1108.

Sulandari S, Zein, MSA, Paryanti S, Sartika T, Astuti M, Widjastuti T, Sujana E, Darana S, Setiawan I, dan Garnida D. 2007. Sumberdaya genetik ayam lokal Indonesia. Keanekaragaman Sumber Daya Hayati Ayam Lokal Indonesia : Manfaat dan Potensi. Pusat Penelitian Biologi. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Bogor. Hlm 45-104.

Susan Jl. 2011. Salmonella in Chicken : Breeding for Disease Resistance in Farm Animal. 3 rd Edition. Cambridge. USA. CAB International.

Swenson MJ. 1993. Physiological Properties and Cellular and Chemical Constituents of Blood. In Dukes Physiology of Domestic Animals. 11th. Edition. London. Cornell University Press.

Tambasco DD, Pas CCP, Tambasco SM, Pereira AP, Alencar MM, Freitas AR, Coutinho LL, Packer IU, Regitano LCA. 2003. Candidate genes for growth traits in beef cattle cosses Bos Taurus x Bos indicus. J. An. Breed. Genet. 120:51-56

Ulupi N, Anita ST, Bram B. 2009. Paket teknologi probiotik sebagai agen biokontrol dalam upaya pencegahan infeksi Salmonella enteritidis transovarian pada ayam petelur. Seminar hasil-hasil penelitian LPPM IPB. Bogor.

Utama IH, Aisjah G, Fachriyan HP, Wibawan IWT, Endhie DS, Gatut A, Aida LTR. 2000. Respon fagositosis leukosit polimorf babi (in vitro) terhadap Streptococcus equi subsp Zooepidemicus. J. Vet. 1:1

Vasconcellos, LPMK, Talhari DT, Pereira AP, Coutinho LL, Regitano LCA. 2003. Genetic characterization of aberden angus cattle using moleculer markers. Genet Mol Biol. 26:133-137.

Velge P, Cloeckaert A, Barrow P. 2005. Emergence of Salmonella epidemics : the problems related to Salmonella enterica serotype enteritidis and multiple antibiotic resistance in other major serotypes. Vet. Res. 36:267-288.

Wray C, Wray A. 2000. Salmonella in Domestic Animals. 1st Ed. New York. CABI Publishing.

Yousef, MK. 1985. Stress Physiology in Livestoock. Vol. III, 1st Ed. Florida. USA. CRC Press. Inc.

Yusriani Y. 2012. Pemanfaatan bungkil biji jarak pagar sebagai sumber protein pada ayam kampung dan kajian senyawa aktifnya terhadap infeksi Salmonella thypimurium. Disertasi. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor.

Zhongyong G, Ranran L, Guiping Z, Maiqing Z, Peng L, Huihua W, Yun Z, Jilan C, Jie W. 2012. Epigenrtic modification of TLRs in leukocytes is associated with increased susceptibility to Salmonella enteritidis in chickens. PLoS ONE 7(3): e33627.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Gallus gallus Toll-like Receptor 4 (TLR4) gene, complete cds.

GenBank: AY064697.1

FASTA Graphics

Go to: LOCUS AY064697 11698 bp DNA linear VRT 15-FEB-2003 DEFINITION Gallus gallus toll-like receptor 4 (TLR4) gene, complete cds. ACCESSION AY064697 VERSION AY064697.1 GI:28394233 KEYWORDS . SOURCE Gallus gallus (chicken) ORGANISM Gallus gallus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Archosauria; Dinosauria; Saurischia; Theropoda; Coelurosauria; Aves; Neognathae; Galliformes; Phasianidae; Phasianinae; Gallus. REFERENCE 1 (bases 1 to 11698) AUTHORS Leveque,G., Forgetta,V., Morroll,S., Smith,A.L., Bumstead,N., Barrow,P., Loredo-Osti,J.C., Morgan,K. and Malo,D. TITLE Allelic variation in TLR4 is linked to susceptibility to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection in chickens JOURNAL Infect. Immun. 71 (3), 1116-1124 (2003) PUBMED 12595422 REFERENCE 2 (bases 1 to 11698) AUTHORS Leveque,G., Forgetta,V., Morroll,S., Smith,A.L., Bumstead,N., Barrow,P., Loredo-Osti,J.C., Morgan,K. and Malo,D. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (30-NOV-2001) McGill University, Department of Human Genetics, Montreal General Hospital Research Institute, Center for the Study of Host Resistance, 1650 Cedar Ave., Montreal, Quebec H3G 1A4, Canada FEATURES Location/Qualifiers source 1..11698 /organism="Gallus gallus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9031" /chromosome="E41W17" /clone="BAC 51o19" /sex="female" /tissue_type="blood" /note="breed: White Leghorn" gene <2744..8193 /gene="TLR4" mRNA join(<2744..2848,3783..3949,4934..8193)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28394233?report=fasta�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28394233?report=graph�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY064697.1#goto28394233_0�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9031�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12595422�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9031�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28394233?from=2744&to=8193�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28394233?itemid=4�

/gene="TLR4" /product="toll-like receptor 4" CDS join(2744..2848,3783..3949,4934..7193) /gene="TLR4" /codon_start=1 /product="toll-like receptor 4" /protein_id="AAL49971.1" /db_xref="GI:28394234" /translation="MPSRAAPTALTLGVLLQLLLVLSLLAGCIPSPCLEVIPSTAFRC TGQNISGVPAEIPNTTLDLDLSFNSLKLLSSNYFSSVPELQFLDLSRCHIHTIEDNSF VDLYNLSTLILTANSLQHLGLAAFHGLTSLKKLVLVETSISSLSDLPIGHLNTLQELN LGHNNIASLKLPKYFANLTSLRHLSFSSNNITYISKGDLDALRETNRLNLTLVLSLNN IKYIQSGSFAKIHLGELILRSSFENLNAMHSSLQGLAGLQVNRLIVGEFTNILKITAF QNGLLSGLCQVQMQEFVLMCFREFENDTDTLFDCIGNVTTIRLVDLNLETLSEVPMFS QVKHLEWKRCKFQELPAEKLSLFKELRVLRITKSKDLNGFEQKFGSLTYLEVVDLSEN RLSFLTCCSPKFPRSPNLKHLNLSFNSDISLTGEFANLRNLLYLDLQHTKLIHHGTYP VFLLLQKLIYLDISYTKTHVMSHLIFHGLNSLQVLKMAGNSFENNTLTNNFENVRRLR ILDISSCKLVWVDQSTFNALSELKELIISNNKLLTFDPVTYKPLQALTALDFSNNQMS FLSDSALEILPDSLVLLDISHNLFECSCTHLNFLKWVKEKQDLLQNKHSMICHTPAYM KNMSLSNFDMSSCHPNPTTVACSVTVLLAAGVFLFLIYKYYFQLYYSLVLLSGCKHSA ERGDIYDAFVIHSSKDQEWVMKELVEPLEEGKPPFQLCLYFRDFLPGVPIVTNIIQEG FLSSRNVIAVISADFLESKWCSFEFDIARSWQLVEGKAGIIMIILGEVDKTLLRQRLG LSRYLRRNTYLEWKNKEISRHIFWRQLTSVLLEGKKWNHEEIKLM" 3'UTR 7194..8193 /gene="TLR4" ORIGIN 1 tgctttgttt tgggtggccc catttgcggt tggccggggc ttggtctgtg ccacacggca 61 tgtacagacc atctctgatc ccaccttcac gtccttacct ggcacttaca gtcacaggca 121 cagcaagaag tctgcaccac tgatgcccct tactttgagc ccagcagtta aatcagctgt 181 aactggaatc aatcattgct ccgacagaga gtggccaatt tttctaaaac cccaaactaa 241 aagcagattg actctcaatg tggacgtagt tctcttcttc agaggtacaa gatgcagaac 301 cgaaggcaag aggtctttca ggctgatctt ccctcacacc cattccacgt gggaaagcat 361 cacaagcacg agctgcaggc acccaagcac tgcagcgagg tccctttcag tgacacccct 421 cctcagcccc ttccccatcc tcagcgcagg gcacagctca gtgctgcctc tcccatggcc 481 agctcagcca gggctgtctg caggaggcac tgactcactg tttccaggaa gtaatgcatt

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28394233?itemid=1�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/28394234�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/28394233?from=7194&to=8193�

541 gcaaggggat cttacggagc catttgtgga ttctgtttct tatttttcgt tgtgattcag 601 atcaattggc gttgatttgt tttcttttcc cagcaaacag ccagtgaaat tcaacgtttt 661 ggatctgaga tgtttccttt tgctttttcc atccactcag acaacctttc cattgcagcc 721 agatgactca gctgtgcaca aggagggacc atgcctcagc tgagcctcaa tgactcaata 781 actgtctaac taacgtaatg tgcaacgtgt tttgttggtc caactatact gtggccatct 841 tatgctgggt aatatctttc ttcagatgac agagattgca tatatgccgt gtgctgctgc 901 gtttactcat attataataa tcaggagaac agagtttacc ctggcaagtg tttttagaaa 961 cactgagatt ttctgttaac acctccttcc taagagatct ttgatgatcc taccagaaaa 1021 ttgccagcgc agtgaatcgt gttttatttt agatgttatt cttgtcactt taaaggattc 1081 aaaataatac ttttgtttct tgtgaactga aagaggaaat tacagaggca ttatgctttc 1141 tacagtcatt gcacattgta tgcaagctga agaatgtgaa gttaactggc attgactttc 1201 taagctggtg gctgggtttc atttgctagc tggtgtgttt tctgcttgtg ccccatccct 1261 cgcaatttct gtgcggtttg ttcttgaacc actgatggtt tgcattgtga aactgtcccc 1321 tgtgagagaa gtggcacatt tcctgaatgc ccttcacacg gtgctttcca cttgacccct 1381 aagcgtggct gttggatgga ttttgtgacg ctcccaaact ctccaacatc ttcagcgggt 1441 ctccattgaa atgttaatgt ctagagcata cttcaggctc atctcagctt tagataaaaa 1501 ttaaaagtgg attgcttcat tctgcatatt gaatgctaaa ggacacactc atttgtcctc 1561 tctgcagact catgatgctc tgccaatttc cttaatccag gcacagaagc agtcagcgat 1621 tgtttccatt cactttcgat tccatctgca aaaggaaata cctgcaatca caagaagctt 1681 ttcagagcag ggattttgtt gaacttgccc aatttcaaca cactttttgt ctgctggctc 1741 aatgggcgct atctggctgc atatcagggc gtcccattta gctcccattg tgcctccacg 1801 tgttttttat cacagcgatc atctgttatt ttaggatttc ctcatccctc agtggccctc 1861 tgctgacctt gctaaagaag tcccatgccc atctcctctc cccgagattt tatctttata 1921 agtgtattgc ttctcacctg gtgtagcagc ttatatttac tatcaatttg cccggtttca 1981 tgattagcca ctctctattc tatctacttc tagactcata tcctgtcctc atttcccatt 2041 cttgccactt ttctgtgtca gtaatattcc ccaactctac agctacatcc tcggtaacaa 2101 cccatggtta tctacagaaa cacacgagta gatacaataa agctctacca tttatcaagg 2161 taaatgaagg caaggagctt gtagaaagct cacagctgaa ttaaattaat actacaaacg 2221 tctcctccag aaacaatagc tgtgtctgcg ctgtgagtta aggatggcat tgagacagcc

2281 ctcaacaaac tcaattttgt agcaaggctt cgaatagagc ccagccagtc ctgggcatcc 2341 cagtcctggg gcagtgctgg agtgtgtgtt catgtgatgg atgtgaaacc tggccttctg 2401 gaaacagggc tcagagtttc accgaaattt cccttttttc actaatttag cctgatctaa 2461 tctgaggcat tcaagtgaca tcacaccgat acaacaccac gcatttcatt acttcctttt 2521 tctccttttt tttttttttt tttttaaatg cacagcgctg ctagaagagc aattcagtgc 2581 aagcatgtct agaaaccggg cagccaccgc tttcacttcc cttcctgccc tgtgcagccc 2641 gcagtgacac gcagtgagga gcaggcgtgg tgaagcatgc agtgctccgg ggggtccttt 2701 cgtccgcatc cctgagtgcc acccatggtg ctttctcctg aagatgccca gcagagcggc 2761 tcccaccgcg ctgactcttg gggtgctgct gcagctgctg ctcgtgctgt ccctgctggc 2821 aggatgcatc cccagtccgt gcctggaggt aagtgatctc tgaacgagca cagaatcctt 2881 tcacttctct ggtgcaactt tctcttctgc ttcaggtttg cgtgtcaaaa ctgtcgtgtg 2941 ttagttttcc taggaaagct cttcttcctt tcaaggctgt taccaaggca attgcaatat 3001 ttgaagtaaa cactggtctc agaagcacct gagaaccaga acaagcagct ttaaccattc 3061 cttattgtta acttatactg ccataaggat ggtgagggac tgcacaggtt gcccagagag 3121 gtggtggtgc cccatccctg cagacagcca aggtcagggg atggggctct gagcactgat 3181 ggagctgtgg gtgtccctgt gcactgcagg gagtgggacc tgatggcctt taaggtccct 3241 tccaactcaa aggattctac ggttctgttc ccttcaggaa gagatccaaa ccctgcctaa 3301 aacttctgca aattacgcag ttttttgccc gattcacagc gtacaccgat ttcaccactg 3361 ccccgaaccc ctgcacccat cagtgcctgt tacaaacttt aattactact ttcagaaatt 3421 tctgttctat ctcctggctt gtctgcaatg tcaccgagct gagagctggt cctgggcaca 3481 gcacacatcc ctacgtgttt gttttgctct ctcagaggtt gctgctgggt cacccttagc 3541 cccagggaac actgccctgt tcaatcaaca agaaatgtag ctctcactgg ggagtaggat 3601 tggtcctatt agaagcagga caggtgctcg ggatatatga gctcatttcc tgaagctcag 3661 ggcagctcat ttagaaacga gctacaaggt tcatttagaa acgagctacg aggttctgct 3721 ccagctcttc tgtatagcag tatgatttcc tgacctttgg tgctgactga gatctgccac 3781 aggtcatccc cagcacagct ttcagatgca caggacagaa catctctgga gttcctgctg 3841 aaatcccaaa caccaccctg gacttggacc tcagtttcaa cagtctgaaa ttgctgagct 3901 caaattattt ttcatcagta cccgaactgc agtttctgga tctttcaagg taatgggcct 3961 ttttatgtgg ttcttggttt gtcttcacca tctgggcctc agcggttcct tattttggag

4021 tctcgtggct cttggctgtt tcctgtttca ctcttgcctc gatccctctg tctctctgca 4081 catgccatgg cagtgatgtg cagctttcag tccagatact gagtgcaaac tccgcagagc 4141 tgggcctgtc agtctgatcc tgtaggacgg ggtgtgagga gaaggaagga agatgttcca 4201 cttctctcta aacaagaaaa acgtcagact tttcaatgtt acaaaaactc ccaagtggag 4261 cacgttgggt gggctgtttt tctaatcacg agtaaaataa aaaaacaaaa atgaaggtac 4321 attaattttt taaaaggttg ctttaaaata tcaacgtatc ctcttttcct ttctactcac 4381 acgtctgggg gaggagatgg gggaggccta tcagcagatt tgaactgata gatagttttc 4441 attcgcatga gacaacaatt tctctgggta aattgtttca ctccatccaa ttacagctct 4501 gaagtgactg agtggcagag caggttggct gtaaggctca ggagttcatt gcagaatgga 4561 tttgggcctc aaattttggg tcttctgtcc ttctgcctgc atgagttccg acctttgccc 4621 tggcttcagg tctcttgctt tgcaattgag cttcagattt agggagggag aaaggggcaa 4681 gagaaggtct cctgttatta tgtagttctt tctgttttgt taatggtgcc ctttcctggg 4741 aaatgaaagt gttcagctgt agtttgaggg gttgggttca ggggcactgg tcagtgcagt 4801 gaagccaaac caaacctcag agtgatgctg agcctgataa cattgtattc gtacttagtg 4861 cggtagtgtt agtgaaggtg gggtgaaagg gacagtgttt catccacatt taccctcttt 4921 tcctgctcaa caggtgccac atccatacaa tagaagataa ctcttttgtg gatctttata 4981 acctttccac cttaatttta actgccaatt cactccagca cctgggtcta gcagccttcc 5041 atggcttaac gtcgctgaaa aaactagtac tggtggaaac aagcatatcc tctctgtctg 5101 acctacccat cggacacttg aataccctgc aggagctgaa tctgggccat aacaacattg 5161 cttcattgaa gcttcctaag tattttgcca acctgacctc tctcaggcac ctgagctttt 5221 cctccaataa tattacatat atctccaaag gagaccttga tgccctgagg gaaacaaaca 5281 ggctcaacct cacgttggta ctttctctga acaatataaa atacatccag tcaggatcct 5341 ttgcaaagat tcaccttggt gaactgattc tgagatcctc ttttgagaac ctcaatgcga 5401 tgcactcttc tcttcagggc ctggcaggtt tacaggtcaa cagactaata gttggagaat 5461 tcactaacat tctgaaaata acggcatttc agaacggact cttgagtgga ctgtgtcagg 5521 tacagatgca ggagtttgtc ttaatgtgtt tcagagagtt tgagaatgac acggacactc 5581 tttttgactg cataggcaac gtcaccacta ttcggttggt ggacctgaat cttgaaacgt 5641 tgtcagaggt tcctatgttt tctcaagtga aacatctgga atggaagaga tgtaagtttc 5701 aggaattgcc tgctgagaag ctgtctcttt ttaaggagtt gagagtgctt cgtattacca

5761 agagcaaaga cctaaatggc ttcgagcaaa agtttgggag tctaacttac ctggaggttg 5821 tagatttgag tgagaatcgt ctctccttcc ttacctgctg ttcccctaag tttcccaggt 5881 ctccaaattt gaaacacttg aatctaagct tcaattctga catcagtttg actggagaat 5941 ttgctaatct gagaaatctg ctatacttgg accttcaaca cacaaagcta attcatcatg 6001 gcacctaccc tgtctttctc ctccttcaga aactcattta ccttgatatc tcctacacca 6061 aaactcatgt tatgtcccat ctcatctttc atggcttgaa ctctttgcaa gtgctgaaga 6121 tggcaggcaa ctcctttgag aacaatacat tgaccaacaa ctttgaaaat gtaaggcggc 6181 tccgcatctt ggatatttca agttgcaaat tagtatgggt ggaccaaagt acatttaatg 6241 ctctctctga actaaaagag ctgatcatca gcaacaacaa gctattgact tttgatcctg 6301 taacatacaa gccactccaa gccctcacag ctctggattt cagcaacaac cagatgagtt 6361 tcctgtcgga ctcagccctg gaaatcctgc ctgacagtct ggtcttgcta gacatttctc 6421 acaacttgtt tgaatgctct tgcacacatt tgaacttcct gaaatgggtc aaggaaaagc 6481 aggatctact gcagaacaag cattcaatga tatgccacac acctgcctac atgaagaaca 6541 tgagcctgtc aaactttgat atgtcctctt gccatcccaa cccaaccaca gtagcatgct 6601 cagtgactgt gttgcttgct gcaggagtgt ttctattcct catttataag tactacttcc 6661 agctatacta ctcattggtg ctgctcagtg ggtgtaaaca ctctgcagaa aggggagata 6721 tctatgatgc ctttgttatc cattccagca aagaccaaga atgggtgatg aaagagctgg 6781 tggaaccctt agaagaagga aaacctccct tccagctttg tctttacttc agggattttt 6841 taccaggggt acccattgtc actaatataa tccaagaagg ttttctgagt agcagaaatg 6901 tcattgcagt catctcagct gactttctgg aaagcaagtg gtgtagcttt gagtttgaca 6961 ttgctcggtc ctggcagctt gttgaaggga aggctggaat aatcatgatc atcctagggg 7021 aagtggataa gaccttgctg aggcagaggc tgggactgtc ccgatatctg aggaggaaca 7081 cttatctgga gtggaaaaac aaggaaataa gcaggcatat cttctggagg cagctgacat 7141 cagtcctgct agaaggcaaa aaatggaatc acgaggagat aaaactcatg taaagagaaa 7201 gaaacatcac ttctgtcctg tctcccaccc tggccttggc tgatgtttgg tgcttggaag 7261 ctggttcttc tgtgcctgta cagggctggg caaagtgaaa agaggcaatg taaaagcact 7321 acagaacacc tactttgatg attgccttcc tccaggcagc tatcaagata aggagtggca 7381 acagctcgaa aaactgcaga tgcatgagct ctgtggttgt ctgtagcagt cagatgaagc 7441 tggtccagca atccacgcag atctggtggg tcagtgaaga gatatgagga tgaacgggct

7501 gttcttacct ctgaaactca gtttgggccc aggggctgtt tgctcagagg ggtttcagtc 7561 taccacttcg agtggactcc ggggtttctg ggggagagtg aaggtccaga actattggct 7621 ttgaactcta aatgtggtag gaaaagaaac aagatttagg tcttcaggtc tgggttagct 7681 aaactaaaag tatctcatca ctactatgag taaaagttta atgccattga atcatagtac 7741 aaagcaattt attgatgtgt tggatattga atactgctga agtattgctc tctatttacg 7801 gaaggctttg gttgggatta atcactgaat tagtctagtc ttaaacttgc aaatccctct 7861 ataatcaatg ccgttctaca gaggtaaaac agaagcaatt gagtggtgaa tcagacctga 7921 tattttctca gaagaaaggg cccgatccat ctcacttttc caagcaccag atagcaacat 7981 ctctgtgaaa gccagcgaca tgtgagattg acttatttgc aaaagaggga aagctaattt 8041 cagggcttgt gctggaaaaa gctgcaccac agtcccctct ctgtgtgttc tgtcagtagt 8101 gtagtgggat aacactaaca aaaacctcac agccctccct aagttcttct gtgacccgtg 8161 agacaaagct ttaataaaac caagctggat gctctgtttg cttgcctgga cagtttgttt 8221 tgcacctgtt gagttttgct gcagtcggtt ccaaagcgca acgctcctca cctctgcttt 8281 gatcaatgta aatgagctct gcacctcaca gcacccccag accctcaccc agggcagggg 8341 atggggatgg gctatgggag gcagtgctgg gacacggggc cagctcttgg ttctttgcct 8401 caaggctaca ggagagcatg gagaaaaagc aaatattagc tcagatatca tcagttacat 8461 cagaaaaaga atgaggaaaa atgaaatggg gtaatactta ctgctcctga gttgagcagt 8521 acgggagcag catttctcca tccctctctg tgtctcttct gcaaacagtt cagtgcgtat 8581 gtatttctgg cacggagtac tgcgtcctat gattcttgat tgtaattgta ataatgggtt 8641 tcagaaagcc tgcaagtagt tctgagcatc acaataaggg tttaggccag tattgtttaa 8701 aaaggaatag tttattgaat atcaaagcaa ccttaggagg acagcagggg tgatgcagag 8761 aagaggttcc cacctgtaca aagtaagcag aaggcagtca cttgggtcct ctttaaacac 8821 acttggggtc tccacagcag aggcagatac gtgaattgcc ctgagcttcc ttgctgccca 8881 agagaaagaa cgaaagccat cacagcttca gggaagggtg aggggggaga gactgtgagg 8941 cagagactgg agcagagacc cttgttcaga aaacaaagga aacgtgaggc tcatcctctg 9001 agcccactca acaccattcc tgtttccctc aatgcattta ggtatttccc ttggccccag 9061 taatagtcag tgcttagaaa atacaatctg gtttatttta ttgccaagat cctcagcatc 9121 agaagcagga tatgctttcc tgcaaggcat gatgctcagc aggacagcgt ggcagcagga 9181 cagcgtggca gaagacaaga acaccccatg ttgctgtgca gtgccaagct gctgtgtgct

9241 gtaggtgtcc acctgtgcac tgcaggctct gctgggtgag atgctcccag ctgtcctccc 9301 ttctcagccc aacctgccac caaaaagtac tctgtggttc atgagctgag gagagaaagg 9361 ctgagaacaa ttgcattttc actatttacc tggcagagaa agagtagatt tggctttcct 9421 agaatcatta atgttggaaa tgacctctga gacccccaag tccaacctca gcccacccca 9481 ccacacccac tgaccacatc caccactccc tgggcagctg tgccaatgca ttaccactct 9541 tctgagatgt gtttcctaat acccaacctg aacctcctct ggcaaaactt aaggccatca 9601 cctcttgtcc tatcactgtt acctgggaga aaaagccaac ccctcctttt cccagaacaa 9661 ctttctttcc ccaataaaat aaaggcaaat cctcctctca aaccaaaata atgctgggtc 9721 aaagggaaac tattgtggct cacacacgtg tatatttgcc cgttactggg aacaaatctc 9781 caaaggaaaa ctgaatgttc tcatatctcc agatgtggtg atgtagtgga aatgctaaga 9841 cacagcttga agcaatgatt gagcacctgg tgggaaggca gggccaaccc agtggagctc 9901 aggtgcatga ccagaaggga tggagccagg atccacccct tcccagacct catttaaggg 9961 ttggcagtgg aggcaatggt attctgctgg agatccctgt gtatctgagg ccttccaaag 10021 gtaagtagct tttttccttt atttctgtgc ccatggctgt tgcatttgag caagtctttg 10081 cttgctgctg tctaggatat tgctgctctg ctgtcgttgc tgtgctttcc atcgtgttat 10141 agttcacatg agtttttgtt ggtcagtgtg cagcaggtag ctttgctatt attatttact 10201 catgtgggtg aatatatgaa cagatctgca ttcattgctc atgtaaggag ccaagcatgt 10261 tccaattatt aaagcaactg tggcctaggt cataaaaaca gatggagatg aagctccaaa 10321 gggctgctgc agccaagata atttcatctc atctgtaaca gggatgtgct ctgttttcac 10381 tatgtgctta atctgaccat gccaagcacc ggcgtagatg gagctctggt cttacttgta 10441 ttgcagatat cagtgtctct gaggaaggct actgggatgt gccagcatca tcactaagat 10501 gtagtttgca atgagggctc tgaacagagc aagccctcat taacacaact gtgtttgtgg 10561 tctctgcgct gcagcaggcg ttctgtaaga aaggggaaaa gccattggtg tgtctgctgc 10621 ctggatctgg gtggctgtgg gagcagcact gcatggggac tccctcggcc tccccaggtg 10681 ttagcacaga cttctggtgt cacaagtaat gatgcagtga ggaaaagcag ctgctctctc 10741 tgggctgaat ggtgtttgac aggaacaggt tgaaacttct caagaggagt gtttgtcctt 10801 tgggagatgc cattttgtag gtggtttatg taacttaatg aagtagagca gagaatctac 10861 agaacagaaa tagtcgtggt ggggtttctg gctccgtatt gcatggggtt gtcatcctgg 10921 agcagatact tcccatggaa acaacaggct tagctatgtt ttggagagaa tggaagaaaa

10981 ggttgatgct gctctacaac atcactctca gtctcaggct gatgtttttc accagggctc 11041 ttcattctga gatttctttc cattgataga acctgcccag ccttccatca cagaagcaag 11101 aagtacaaat gcttccacct acccaaatga aagagcctcg ctttgctttt gtaggaagac 11161 ctgtgatttt tgttttctgt ttagtgccgt gctgagaact tctaacaaaa cagaaatccc 11221 atttccatga cagcgctcac cccgaccctc tgaatgttaa accatcacct ggctgtacca 11281 catgtatgtg tgggctgtga aaaagcactg acagatccac agagtgaatt tcactcagtg 11341 ccttttgcaa aacatctcgt gtaagtgatg tcggtgtaca ctcattgcct gagcctggga 11401 gggagagaag caattccttc tccagttgtc ctagctcatg ttgggcattg tgacaagtga 11461 cagctgatcg tggtttgcag aagagcccat ctacctctgg tactgaccct ctgctccaag 11521 gttgcataga gggtgaagcc aatgttatca gccagccttg gcctccctgt gcagagacag 11581 aaacactgca taactgggga tggctgttga aagctgtgaa aataatggaa aaggaatgga 11641 aaggatagga aagggaaggg tgcagcatcc caaggaatgt ggctgtagct cagttgct //

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kabupaten Lamongan Jawa Timur pada tanggal 29 Januari 1957 sebagai anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Koestaman (alm) dengan Ibu Djumari. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor (IPB), lulus pada tahun 1981. Pada tahun 1986, penulis diterima di Program Studi Ilmu Ternak pada Sekolah Pascasarjana IPB dan menamatkannya pada tahun 1990. Kesempatan untuk melanjutkan studi ke Program Doktor pada Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan IPB diperoleh pada tahun 2012. Beasiswa pendidikan pascasarjana (BPPS) diperoleh dari Direktorat Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan Nasional Republik Indonesia. Penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi, Fakultas Peternakan IPB sejak tahun 1983.

Setelah menyelesaikan penelitian tugas akhir pada program S-3, tiga artikel ilmiah telah berhasil disusun. Artikel pertama berjudul Association of TLR4 Gene Genotype and Resistance Against Salmonella enteritidis Natural Infection in Kampung Chicken diterbitkan pada International Journal of Poultry Science (volume 12, nomer 8, tahun 2013, halaman 445-450). Artikel kedua berjudul Study of Kampung Chicken Resistance Against Salmonella enteritidis Using TLR4 Gene as Marker telah di accepted pada jurnal yang sama. Artikel ketiga berjudul Identifikasi Keragaman Gen TLR4 Ayam Lokal Menggunakan Teknik PCR-RFLP di accepted pada Jurnal Veteriner. Karya-karya tersebut merupakan bagian dari penelitian dan disertasi penulis.

KAJIAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP Salmonella ... · Ayam Kampung merupakan salah satu rumpun...

Documents

Transcript of KAJIAN KETAHANAN AYAM KAMPUNG TERHADAP Salmonella ... · Ayam Kampung merupakan salah satu rumpun...