M. Rassam, W. A. Laing / Phytochemistry 65 (2004) 19--30

Tugas Mata Kuliah Teknologi Minyak Atsiri, Rempah, Dan Fitofarmaka

Jurnal Internasional Phytochemistry Dan Terjemahannya

Purifikasi dan Karakterisasi phytocystatins dari korteks kiwi buah dan bijiOleh :

MUHAMMAD RUM SYAFRUDDIN F34080119

2011 DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

M. Rassam, W. A. Laing / Phytochemistry 65 (2004) 19--30

Purifikasi dan Karakterisasi phytocystatins dari korteks kiwi buah dan bijiMaysoon Rassam*, William A. LaingGene Technologies, The Hortikultura dan Makanan Lembaga Penelitian Selandia Baru, PB 92169, Auckland, Selandia Baru

AbstractKiwi inhibitor proteinase sistein (KCPIs) telah dimurnikan dari korteks dan biji buah kiwi setelah inaktivasi dari melimpah actinidain korteks proteinase sistein. Satu utama (KCPI1) dan empat cystatins kecil diidentifikasi dari deliciosa Actinidia korteks buah kiwi matang matang serta biji KCPI dari a.chinensis. yang cystain korteks dominan, KCPI1, menghambat klan CA, keluarga C1 (keluarga papain) priteinase sistein (papain, chymopapain, bromelain, ficin, cathepsins manusia B, H dan L, actinindain dan tungau debu rumah endopeptidase 1), sedangkan proteinase cysteinen milik keluarga lain, [clostripain, (C11), streptopain (C10) dan calpain (C2)] tidak terhambat. konstanta inhibisi (KI) berkisar antara 0,001 nM untuk cathepsin L dan 0,98 nM untuk endopeptidase 1. KI (14 nM) menghambat actinidain KCPI1 minimal 2 lipat lebih tinggi dari tanaman lainnya proteinase diukur. Para KCPI1 korteks dan benih KCPI dimurnikan dari biji memiliki urutan N-terminal yang sama (VAAGGWR-PIESLNSAEVQDV). BLAST-matching urutan peptida terhadap sebuah rumah-di dihasilkan Actinidia database EST, diidentifikasi 81 cDNSs yang persis cocok dengan urutan peptida KCPI1 diukur. Peptida urutan dua KCPIs korteks lainnya masing-masing tepat sesuai urutan peptida diperkirakan dari suatu cDNA dari buah kiwi. Urutan prediksi KCPI1 dari 116 asam amino mengkode peptida sinyal dan tidak mengandung sistein. Tanpa sinyal peptida (protein matang). KCPI1 memiliki massa molekul ~ 11 kDa. Urutan konsensus memiliki karakteristik untuk phytochystatins dan menunjukkan homologi tertinggi ke cystatin dari Citrusxparadisi (52 identitas%). Ini adalah laporan pertama dari phytocystatins dari Ericales. 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.Kata Kunci: Actinidia deliciosa, Actinidia chinensis, Actinidiaceace, kromatografi cair, konstanta kinetik, Bioinformatika, Cystatin; Actinidain, Bibit; Cortex..

1. Pengantar

Superfamily cystatin inhibitor reversibel ketat dan mengikat dari proteinase sistein papain seperti (klan CA, keluarga C1) telah dibagi menjadi tiga keluarga hewan, yaitu stefines,

yang cystatins dan kinenogens, dan satu cystatin tanaman(Abrahamson, 1994) . Telah ditunjukkan bahwa anggota superfamili ini berinteraksi langsung dengan situs aktif belahan papain pada tiga daerah di cystatin matang. Ini adalah sebuah daerah

N-terminal dengan residu glisin dilestarikan, sebuah containingthe loop pusat sangat lestari QXV motifXG dan daerah C-terminal dengan residu triptofan lestari (Corr-Menguy et al, 2002.). cystatins Pabrik atau phytocystatins lebih lanjut diidentifikasi oleh urutan konsensus (LVI) - (AGT) - (RKE) - (TA) - (AS) (VI)-X-(EDQV) (HYFQ)-N ditemukan di diprediksi alpha aminoterminal-helix (Margis et al, 1998.). Phytocystatins menyerupai stefins dalam kurang ikatan disulfida dan karbohidrat dan massa molekul Havinga _11 kDa, tetapi menunjukkan homologi asam amino urutan terbesar ke cystatins (Laingand McManus, 2002). Mereka berlimpah pada tanaman dan telah diidentifikasi dalam biji, daun, akar dan buah (Abe et al, 1987; Flores et al, 2001;... Gaddour et al, 2001; Pernas et al, 2000a;. Ryan et al, 1998;. al Songet, 1995.). Meskipun paling sering mereka adalah protein kecil berkisar 11-13 kDa (Laingand McManus, 2002), sebuah cystatins sedikit yang secara signifikan lebih besar

(Joshi et al, 1998;. Misaka et al, 1996;. Siqueira-Junior et al, 2002.). cystatins Tanaman diperkirakan memiliki fungsi beberapa kemungkinan, termasuk mengatur aktivitas proteinase sistein endogen proses fisiologis duringdifferent includingseed pematangan dan perkecambahan, dan kematian sel terprogram (Arai et al, 2002;. Corr-Menguy et al, 2002;. Solomon et al ., 1999), dan bertindak sebagai protein tanaman defensif untuk biotik dan abiotik dalam berbagai tanaman (Botella et al, 1996; owg sakit et al, 2002;.. Gaddour et al, 2001;. Gutierrez-Campos et al. , 1999; Irie et al, 1996;. Joshi et al, 1998;. Koiwa et al, 2000;. Pernas et al, 1998, 2000a;. Siqueira-Junior et al, 2002;. Urwin et al, 1997;. Walker et al, 1999).. Akibatnya terjadi est increasinginter dalam membangun tanaman transgenik, tatins expressingphytocys, tahan terhadap berbagai hama (Gutierrez-Campos et al, 1999; Irie et al, 1996;.. Michaud et al, 1993; Urwin et al, 1997..). Dalam karya ini, kami melaporkan pemurnian cystatins dari korteks buah kiwi (kaya

dalam sistein proteinase actinidain) dan dari biji, identifikasi dari beberapa Enes mereka correspondingg dan karakterisasi kinetik cystatin dominan. Untuk pengetahuan kita, ini adalah laporan pertama dari pemurnian dan sequencingof sebuah phytocystatin dari jaringan tanaman yang kaya dalam sistein proteinase. Ini juga merupakan laporan pertama dari urutan inhibitor proteinase, apalagi phytocystatin, untuk disimpan di GenBank dari urutan Ericales, yang meliputi Actinidiaceae, Balsaminaceae, Ebenaceae, Lecythidaceae, Primulaceae, Polymoniaceae dan keluarga Theaceae. 1. Hasil 2.1. Pemurnian inhibitor proteinase sistein Korteks Buah kiwi memiliki tingkat tinggi dari actinidain proteinase sistein disebut (Praekelt et al, 1988.), yang dapat mengikat dan topeng, atau menurunkan, CPIS endogen hadir dalam jaringan. Selain itu, CPs bisa cystatins mengikat bahkan ketika bagian situs aktif sistein dimodifikasi dan enzim tidak aktif (Abrahamson, 1994; Lindahl et al, 1992.). Untuk menghindari kehilangan CPIS dalam ekstrak melalui CPs bindingto kami actinidain, kita didenaturasi dengan pemanasan ekstrak, pH 3, pada 60 _C selama 10 menit sebelum inhibitor purifyingthe. KCPIs Total di korteks buah segar ekstrak 7.13 (SD n = 1,04, = 4) mg / g berat basah, dan jumlah inhibitor tidak

berubah setelah penyimpanan buah oneyear di udara pada 0 _C. Dalam sebuah percobaan pendahuluan, tidak ada aktivitas hambat terhadap pepsin, tripsin atau chymotrypsin terdeteksi di korteks ekstrak sementara aktivitas pepsin jelas penghambatan terdeteksi dalam ekstrak biji (data tidak ditampilkan). Cystatins dielusi dari kolom afinitas papain dipisahkan pada kolom SP HiTrap (Gbr. 1) ke dalam (SP1) dan besar tiga puncak papain lainnya minor hambat (SP2-4). Keempat puncak secara terpisah dikumpulkan dan dimurnikan dengan HPLC pada kolom C-18 Vydac. Elusi dari puncak inhibisi utama (SP1) ditunjukkan pada Gambar. 2. Silver gel bernoda penghambat utama ini menunjukkan satu pita protein (KCPI1) dengan kDa _11 Mr (Gbr. 3). Demikian pula reverse-fase kromatografi SP4 fraksi mengakibatkan isolasi pita protein yang berbeda (KCPI2, KCPI3) dari dua fraksi yang berdekatan HPLC hambat (Gbr. 3), sedangkan konsentrasi protein SP2 dan SP3 sangat rendah dan aktivitas penghambatan mereka tidak diselidiki lebih lanjut. Kami juga dimurnikan sebuah phytocystatin dari biji buah Kiwi. Gambar. 4 menunjukkan elusi dari kolom C Vydac-18, benih KCPI dimurnikan utama.2.2 Penghambatan profil

KCPI1 ditemukan menghambat proteinase sistein semua kita diuji yang termasuk keluarga klan CA C1,

keluarga papain proteinase sistein (Tabel 1), kecuali hidrolase bleomycin manusia. Nilai KI berkisar antara 0.001 nM untuk L cathepsin manusia dan 98 nM untuk endopeptidase tungau debu rumah 1 (Der p 1). Sistein proteinase milik keluarga lainnya, yaitu clostripain (C11), streptopain (C10) dan calpain (C2) adalah tidak menghambat pada inhibitor / rasio molar enzim sekurang-kurangnya 5 / 1. Kami tidak mengukur hambatan oleh KCPIs lain sebagai ada bahan yang tersedia tidak cukup.

2.3. Tingkat konstanta inhibisi oleh KCPI Tingkat konstanta (Kass dan kdiss) untuk inhibisi papain oleh KCPI1 diukur dengan persamaan fittinga n untuk perjalanan waktu reaksi. Nilai dipasang dari Kass adalah 1.60E +06 +05 _2.10E M_1 s_1 dan kdiss was.66E_04_1.18E_04 s_1 memberikan KI dihitung sebesar 0,10 nM, yang sangat dekat dengan yang ditentukan dengan metode kesetimbangan (Tabel 1).

2.4. Kurangnya pembelahan KCPI1 oleh proteinase sistein Untuk mengukur apakah berbagai proteinase sistein papain seperti mampu membelah inhibitor, KCPI1 diinkubasi dengan sedikitnya jumlah equimolar dari proteinase untuk sampai dengan 5 jam sebelum pengobatan dengan buffer sampel untuk elektroforesis SDS-PAGE. Enzim yang diuji adalah: papain, actinidain, bromelain, ficin dan manusia cathepsin B (Tabel 2). Tidak ada degradasi cystatin terjadi ketika E64 ditambahkan pada akhir masa inkubasi enzim dengan KCPI1 sebelum heatingin buffer sampel, meskipun beberapa pencernaan terjadi ketika E64 adalah ditinggalkan. Kemungkinan bahwa selama panas denaturing langkah dalam buffer sampel, inhibitor proteinase dapat mengubah sifat sesuatu benda dan menjadi rentan terhadap degradasi dengan tetap proteinase aktif. Papain tercatat untuk menjalani degradasi autocatalytic, yang dihapuskan dengan menambahkan

E-64 sebelum heatingin buffer.Thus sampel KCPI1, seperti yang telah diamati selama cystatins lain (et al Lindahl, 1992.), Tidak terdegradasi oleh sistein proteinase yang menghambat. 2.5. MALDI-TOF spektrometri massa dan analisis urutan Spektrometer massa dari korteks deliciosa A. KCPI1 mengungkapkan puncak utama dari 10,928 kDa dan 11,087 kDa bahu (Gbr. 5). Hanya urutan peptida tunggal N-terminal diperoleh dari fraksi ini, menunjukkan bahwa baik mereka mewakili spesies molekul yang sama dengan satu baik dimodifikasi atau disingkat di Cterminus atau salah satu dari mereka memiliki diblokir N-terminus. Demikian juga KCPI2 dan KCPI3 dihasilkan puncak protein utama pada

_11.6 dan masing-masing 11 kDa dengan bahu MW sedikit lebih tinggi (11,6 _11.8 dan masing-masing). Nterminal sequencing Namun, mengungkapkan dua sekuens masingmasing (Tabel 3). A. chinensis benih KCPI memiliki massa 10,926 kDa dan bahu di 11,047 kDa (data tidak ditampilkan). Kedua tokoh ini sangat dekat dengan yang diperoleh untuk KCPI1 korteks dan urutan N-terminal diperoleh persis cocok bahwa untuk KCPI1 (Tabel 3). KCPI2 urutan 1 dan urutan KCPI3 1 memiliki tiga asam amino tambahan hulu dari urutan GGWRPI ditemukan di semua sekuens (Tabel 3). Hal ini bisa disebabkan oleh pembelahan peptidase alternatif atau degradasi dari asam amino N-terminal dari phytocystatin gen phytocystatin berbeda diamati. BLAST (Altschul et al., 1997) usingthese urutan pencarian untuk

menemukan pertandingan di database Actinidia HortResearch EST, containingover 92.000 urutan dari 36 EST perpustakaan, mengungkapkan pertandingan yang tepat untuk tiga dari lima urutan diukur dan sebagian yang cocok dengan dua lainnya (KCPI 3 urutan 1 dan 2). Urutan peptida diukur KCPI1 persis atched 81 EST dari Actinidia. Tujuh puluh tujuh EST berasal dari korteks A. deliciosa buah matang batin, dua dari perpustakaan deliciosa A. petal dan dua lainnya dari A. chinensis buah masak. 20 urutan asam amino dari KCPI1 dicocokkan dengan asam amino 27-46 dari urutan asam amino cystatin diprediksi (Gbr. 6). The MW teoritis dihitung untuk KCPI1 includingthe urutan peptida sinyal 12,756 kDa, dengan pI dihitung 9.4. The MW yang sesuai untuk phytocystatin dewasa adalah 10,053 kDa, (dengan pI dari 6,91), yang setidaknya 0,875 kDa kurang dari itu

eksperimen ditentukan oleh MALDITOF. Hal ini bisa disebabkan oleh modifikasi pasca translasi, untuk glikosilasi misalnya. Namun, tidak ada bagian karbohidrat terdeteksi pada KCPI1 usinga DIG glycan Detection Kit (Roche Diagnostics). Kemungkinan lain includingformylat ion, asetilasi, fosforilasi & metilasi meskipun tidak dapat dikesampingkan, tampaknya tidak mungkin untuk menjelaskan perbedaan besar dihitung antara eksperimen ditentukan dan dihitung massa protein ini larut. Urutan KCPI2 1 memberikan cocok sempurna untuk sebuah EST dari korteks A. deliciosa buah matang batin sementara urutan 2 memberikan cocok untuk dua EST ditemukan di A. eriantha youngfrui t (Gbr. 6). Dalam cDNA, sebuah preequence dari

puncak 10,928 kDa dan 11,087 kDa bahu relatif terhadap calibrant, sebuah lactalbumin-(14,071 kDa).

Gambar. 5. MALDI-TOF spektrometri massa dari KCPI1 menunjukkan utama

22 dan 25 masing-masing asam amino, dimulai dengan metionin tersebut, mendahului sequencing asam amino. KCPI2 urutan 1 dan 2 telah diprediksi sebesar 12,9 MW dan 12,7 kDa dengan PI teoritis 10,06 dan 9,4 masing-masing. MW protein yang diprediksi dewasa, adalah 10,7 dan 10,1 kDa dengan PI dari masingmasing 9,99 dan 6,91 . Selaras urutan asam amino diperkirakan EST panjang penuh yang tepat sesuai tiga kami sekuens peptida CPI (Gbr. 6), telah glisin di ujung daerah Nterminal dalam protein matang dan VAQFAVSEHN konsensus di terminal helix alpha1, yang berbeda dari bahwa untuk phytocystatin urutan konsensus, (LVI) - (AGT) - (RKE) - (TA) - (AS) - (VI)X-(EDQV) - (HYFQ)-N), hanya di posisi ketiga di mana Q menggantikan (RKE). QXVXG hadir dalam bindingloop pertama ditandai dengan motif ini. Yang bindingloop kedua kurang dilestarikan (ED)-AV-(VF)-WDK-PW) mirip dengan konsensus phytocystatin EAK-(VF)-WVKPW (Margis et al, 1998).. Urutan KCPI3 1 tidak cocok yang tepat untuk database EST, tapi identitas menunjukkan pada tingkat 16 sampai 17 dari 20 residu untuk EST, encodingcystatins, dari korteks deliciosa buah masak dalam dan dari tunas dorman buah Kiwi. urutan KCPI3 2 (Tabel 3) juga menunjukkan 17

Gambar. 6. CLUSTALX urutan alignment beberapa sekuens asam amino diprediksi dideduksi dari sekuens cystatin cDNA encoding yang identik dengan urutan N-terminal yang diperoleh dari buah Kiwi. AAG38521 adalah Citrus_paradisi Genbank cystatin urutan showingthe identitas yang paling ke urutan KCPI diukur. Karakter Bold merupakan peptida diukur, karakter teduh merupakan urutan identik

dari 20 identitas asam amino untuk berbagai macam buah A. deliciosa korteks dalam dan petal diprediksi urutan cystatin. BLAST pencarian Gen

(Altschul et al, 1997.) menunjukkan bahwa semua lima KCPIs yang paling mirip dengan protein cystatin seperti dari Citrus_paradisi (45-54 identitas %) (Gbr. 6) dan Arabidopsis thaliana (identitas 57-46%). Taksonomi, deliciosa Actinidia, Citrus_paradisi dan Arabidopsis thaliana yang eudicots inti. deliciosa Actinidia lebih jauh terkait dengan Coix lacryma-Jobi, Oryza sativa, Sorghum bicolor dan mays Zea, yang memiliki cystatins dengan identitas berkisar antara 46 dan 51%. Sementara sejumlah cystatins telah dilaporkan dari Asteridae, khususnya: kentang (nomor akses Q03196), tomat (A59155), bunga matahari (JC7333), wortel(T14323), ragweed pendek (JN0906), ubi jalar (AAF64480) dan wijen (AAK15090), cystatin belum ada diidentifikasi dalam Ericales. Clustal analisis (Jeanmougin et al, 1998.) Dari pemilihan apel dan buah Kiwi cystatin diterjemahkan urutan

panjang cDNA penuh dari alongwith data EST HortResearch delapan Arabidopsis putatif cystatin sekuens gen diterjemahkan (Laingand McManus, 2002) menunjukkan bahwa cystatins jatuh menjadi tiga kelompok besar, masing-masing dengan apel, buah Kiwi dan urutan Arabidopsis (Gambar 7).. 3. Diskusi Setidaknya ada lima urutan protein phytocystatin dalam buah kiwi (Tabel 3), dengan urutan gen tiga pencocokan diidentifikasi (Gbr. 6), dan beberapa varian cystatin lainnya juga diamati dalam database EST dari buah kiwi (Gbr. 7), yang mungkin merupakan cystatins lebih lanjut. CDNA untuk KCPI1 sangat baik diwakili di perpustakaan korteks buah Kiwi batin, konsisten dengan tingkat lebih tinggi ekspresi protein ini dibandingkan dengan KCPI2 dan KCPI3. Sebagai korteks buah dalam digunakan untuk

Gambar. 7. Cluster analisis cystatins dari buah kiwi dan apel dengan cystatins Arabidopsis. urutan panjang Kendali cystatin telah dikelompokkan menggunakan Clustal X. Cystatins berlabel Actinidia berasal dari salah korteks A. deliciosa buah matang dalam (, 100599 101993, 103292), youngfruit eriantha A.(166750), A. arguta kelopak (248990, 249535), eriantha A. kelopak (224538), A. chinensis kelopak (245733, 249284), A. chinensis buah masak (189355, 244982) atau A. tunas dorman deliciosa tiga hari setelah pengobatan hidrogen sianamida (233.730). Apple (Malus domestica) sekuen termasuk memacu tunas dari Rose Pasifik pohon (155.697), Royal Gala buah disimpan selama 24 jam di bawah oksigen rendah / CO2 tinggi (118.064), Royal floem Gala (118.064), Royal Gala sebagian senescingleaf (223.566), Malus domestica kultur sel (262.321), Royal Gala 10 hari setelah buah mekar penuh (110.369) dan Royal Gala pra-dibuka tunas vegetatif (139.822). Pada nomor mengacu pada sekuens genom Arabidopsis thaliana dari database MIPs (http://mips.gsf.de/proj/thal/db/). Berbayang EST namanya urutan ditunjukkan pada Gambar. 6.

membuat perpustakaan cDNA termasuk biji, ada kemungkinan bahwa beberapa urutan diamati KCPI berasal dari biji. Genom Arabidopsis mengandung setidaknya delapan gen phytocystatin dengan prediksi molekul konsisten dengan phytocystatins buah kiwi (Laingan d McManus, 2002) berat. Kami memilih untuk melakukan analisis cluster dari cystatins buah kiwi dalam hubungannya dengan yang diprediksikan dalam Arabidopsis sebagai genom lengkap Arabidopsis diketahui, memberikan kita spektrum penuh spesies dikotil 'cystatins. Kami juga termasuk memprediksi cystatins apel yang juga telah ditemukan di database HortResearch EST. The cystatins dimurnikan dijelaskan dalam makalah ini semua turun dalam satu kelompok (Gbr. 7), yang termasuk hits terdekat dalam database EST untuk KCPI3-1 dan -2, yang tidak memiliki pencocokan sama persis. EST cystatin Kiwi ditemukan di ketiga cluster, seperti juga EST kelopak. Kecuali untuk clusteringof para EST yang cystatins dimurnikan dalam makalah ini, tampaknya ada sedikit lain cystatins clusteringof fungsional. Sebagian atau seluruh dari 26, 22 atau 25 urutan asam amino KCPI1,

urutan pertama KCPI2 1 atau 2, sebelum asam amino sequencing, diperkirakan menjadi peptida sinyal yang terlibat dalam melampirkan polipeptida baru lahir untuk membran untuk transportasi ke lokasi nonsitoplasma atau sekresi ke cairan ekstraseluler (Briggs dan Gierasch, 1986). Sebuah sinyal peptida telah diidentifikasi untuk oryzacystatin-1 (Womack dkk, 2000.) Dan disarankan untuk langsung preprotein ke retikulum endoplasma untuk processingto bentuk matang. Sunflower cystatin SCB disintesis sebagai sebuah prepeptide consistingof 22 asam urutan sinyal amino dan peptida dari 101 asam amino untuk protein dewasa (Doi-Kawano et al, 1998.). Sebuah kDa 18 cystatin larut ekstraseluler wortel (Ojima et al, 1997.) Telah ditemukan terdiri dari 133 residu asam amino yang disertakan sinyal sequence. KCPI1 ditemukan menjadi inhibitor sangat kuat dari mereka proteinase sistein papain seperti, dari manusia, hewan atau berasal dari tumbuhan, kita diuji. L cathepsin Manusia sangat rentan terhadap inhibisi oleh KCPI1 dan sejauh pengetahuan kami tidak

ada aktivitas inhibisi tersebut kuat telah dilaporkan untuk phytocystatins (Abe dkk, 1994; Rogelj dkk, 1998..). Para ensitivity dari cathepsins terhadap KCPI1 berada di urutan: cathepsin L> cathepsin H> cathepsin B, mirip dengan yang diamati untuk stefin bovine A (et al Turki., 1995), sedangkan jagung cystatin 1 jauh lebih inhibitor untuk cathepsin H dan menunjukkan sedikit kemampuan untuk menghambat cathepsin B (Abe dkk, 1994.). The cystatin buah kiwi lebih dari dua lipat lebih efektif penghambat cathepsin manusia H dari chelidocystatin (Rogelj et al, 1998.), Jagung cystatin 1 (Abe et al, 1994.) Dan oryzacystatin-II (Kondo et al., 1990). KCPI1 juga tentang 60_ dan 40_ lebih menghambat untuk cathepsin B dari berangan cystatin (Pernas et al, 1998.) Dan cystatin jagung 1 (Abe et al., 1994). KI untuk inhibisi papain oleh KCPI1 (0,16 nM) adalah urutan yang sama besarnya seperti yang inhibisi papain oleh chelidocystatin (Rogelj et al., 1998) dan oleh inhibitor proteinase sistein dari buah apel (Ryan et al., 1998). Oryzacystatin-1 (Kondo et al, 1990.), Jagung cystatin 1 (Abe et al, 1994.), Sebuah barley CPI rekombinan (Gaddour et al., 2001) dan biji kenari cystatin Namun (Pernas et al., 1998) lebih dari dua perintah besarnya kurang inhibitor untuk papain dari KCPI1. KCPI1 juga 02:58 lipat lebih inhibitor untuk ficin dari jelai (Gaddour et al, 2001.) dan berangan cystatin (Pernas et al, 1998.). Tungau debu rumah, pteronyssinus Dermatophagoides, endopeptidase 1

(Der p 1) dihambat oleh KCPI1 sementara itu tidak dihambat oleh cystatin kastanye yang hanya hambat ke tungau debu rumah Dermatophagoides farina endopeptidase 1 (Der f 1) (Pernas et al, 2000b.). Berbeda dengan cystatin kastanye (Pernas et al., 1998), KCPI1 tidak memiliki properti penghambatan terhadap proteinase serin. Sementara KCPI efektif terhadap berbagai sistein non-tanaman tanaman dan proteinase milik klan CA C1 keluarga, itu tidak efektif terhadap actinidain (KI = 14 nM), yang proteinase sistein utama endogen di korteks buah Kiwi. afinitas relatif rendah tersebut terhadap actinidain juga diamati untuk cystatin rekombinan manusia C (Bjork et al, 1994.) dan ayam putih telur cystatin (Bjork dan Ylinenjarvi, 1990). Actinidain adalah sekitar dua perintah besar kurang sensitif terhadap inhibisi oleh KCPI1 dari papain, bromelain dan chymopapain. KCPI1 tidak menghambat proteinase sistein (calpain, clostripain, streptopain dan bleomycin hidrolase) sedikit terpengaruh oleh E-64. Menariknya, bleomycin hidrolase, satu-satunya anggota keluarga klan CA C1 yang tidak dihambat oleh KCPI1, juga relatif tidak sensitif terhadap E-64 (Bromme dkk, 1996.) Dibandingkan dengan proteinase sistein lain (et al Barrett., 1982). Ada sangat terbatas dipublikasikan analisis kinetika interaksi antara phytocystatins dan papain seperti proteinase, tetapi lebih banyak untuk cystatins hewan. Dalam kasus apel

phytocystatin berat molekul tinggi dan papain (Ryan et al., 2003), konstanta laju untuk asosiasi dan disosiasi (Kass dan kdiss) mirip dengan yang diukur untuk phytocystatin buah kiwi dalam makalah ini. Para Kass untuk inhibisi papain oleh KCPI1, juga mirip dengan yang ditemukan untuk C stefin sapi ketika inhibitingpapa di (et al Turki, 1993.) Dan hampir urutan besarnya lebih rendah dari ayam dan C cystatin rekombinan manusia dan papain (Bjork et al, 1994; Lindahl et al, 1992..). The kdiss Namun, setidaknya setengah dari yang diukur untuk stefins dan papain (Turki et al, 1993.) Dan lebih dari 1000_ lebih tinggi daripada untuk C cystatin manusia dan papain (Lindahl et al., 1992). Ini menjelaskan mengapa cystatin ayam dan manusia C (Bjork dkk, 1994.) merupakan penghambat lebih baik papain dari KCPI1. Fungsi ini cystatin di korteks diasumsikan saat ini tidak untuk melindungi sel terhadap actinidain sebagai pertama, actinidain hadir lebih luas, dan yang kedua itu bukan inhibitor actinidain sangat efektif. Mungkin berfungsi untuk mengontrol proteinase sistein endogen kecil, atau merupakan pertahanan tanaman terhadap serangga protein / serangan patogen. Fungsi yang terakhir mungkin lebih layak untuk benih di mana actinidain tidak ada sedangkan selisih luas actinidain atas cystatin di korteks dapat mencegah proteinase inhibitor dari functioningon eksogen setelah sel terganggu. Singkatnya, kami telah melaporkan adanya keluarga phytocystatins dalam buah

kiwi meskipun adanya tingkat tinggi actinidain, proteinase sistein, yang dihambat oleh yang paling dominan dari KCPIs. KCPI1, seperti stefins hewan dan cystatins, menghambat proteinase sistein papain seperti tanaman, hewan atau asal-usul manusia ketika sedang unggul phytocystatins lain dalam kegiatan penghambatan ke arah cathepsin manusia L. 4. Bahan dan metode 4.1. Tanaman bahan Tanaman buah-buahan segar dari Actinidia deliciosa (A. Chev.) CF Liang et AR Ferguson var. deliciosa 'Hayward', cv. Hayward, disimpan di udara pada 0 _C, digunakan di seluruh penelitian ini untuk ekstraksi korteks. Kiwi benih diperoleh dari buah yang matang dari chinensis Actinidia Planch. var. chinensis 'Hort16A'. 4.2. Benih persiapan Seratus buah matang dipotong dua, daging cekung dan diinkubasi dalam 5 l air dengan 1 ml dilusian (1:200, v / v) pectalase (Rohapect, D5L pectalase khusus, Carter Associates). Suspensi ditinggalkan di 20-25 _C selama 2-3 hari dan pulp kemudian dicuci melalui saringan, menggunakan jet air, meninggalkan benih di belakang. Ini adalah mengusap-kering, beku dan lahan di pabrik-cryo, pada suhu nitrogen cair, untuk menjadi bubuk halus.

4.3. Papain kromatografi afinitas A 10 papain kolom afinitas ml dengan baik aktif (yaitu di hadapan al DTT (et Ryan, 1998).) Atau papain tidak aktif (tidak aktif oleh karboksi-metilasi dari kelompok sulfhidril dengan iodoacetamide (Brocklehurst et al., 1981) digunakan untuk memurnikan CPIS dengan hasil yang sama. Kolom dielusi (1 ml / menit) dengan buffer 20 mM glisin-HCl, pH 2,5, dan fraksi terelusi disesuaikan segera ke PH 7. 4.4. Pemurnian inhibitor proteinase sistein korteks buah Kiwi Fresh Kiwi korteks (200 g) ditangguhkan (1 / 3, v / v) dan secara singkat homogen dalam 100 sitrat natrium mM, pH 3, containing2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1% (v / v) Tween 20, 10 mM DTT, 1% (v / v) 2mercaptoethanol (2-ME), 0,1% (b / v) PEG6000, 0,6 mM PMSF dan 10 mg / ml PVPP (Ryan et al, 1998.). Ekstrak disaring melalui Miracloth dan disentrifugasi pada 13.000 g untuk 30 menit pada 4 _C. Karena kiwifruits kaya dalam aktivitas proteinase sistein, yang sebagian besar disebabkan actinidain, kami tidak aktif ini proteinase oleh inkubasi supernatan pada 60 _C selama 10 menit. Setelah sentrifugasi coolingand seperti di atas, supernatan dinetralkan, disentrifugasi lagi dan terkonsentrasi menggunakan modul VivaFlow 200 aliran tangensial dengan membran MWCO PES 5000 (Sartorious). berkonsentrasi ini diterapkan ke kolom afinitas papain dan fraksi dengan aktivitas inhibisi

papain dikumpulkan, usinga terkonsentrasi diaduk sel dengan membran MWCO 3000 (Amicon, tipe YM) dan buffer ditukar dengan 50 mM sodium formate buffer pH 4,0. Sampel ini kemudian diterapkan untuk SP HiTrap, 5 kolom ml (Amersham Pharmacia) dan dielusi, dengan laju alir 1 ml / menit, dengan 1 M NaCl gradien dalam 50 formate sodium mM pH 4,0. Fraksi puncak protein dielusi diterapkan ke kolom C-18 Vydac reverse-fase (25_0.46 cm) (Altech, Deerfield, IL), diequilibrasi dengan asetonitril 10% dalam 0,1% TFA dalam air, dan dielusi (1 ml / menit) dengan gradien (10-90%) dari asetonitril di TFA 0,1% dalam air. Fraksi Puncak containingpa nyeri aktivitas inhibisi (diuji dengan substrat lebih sensitif Ala-Leu-Lys-AMC) dikumpulkan untuk penyelidikan lebih lanjut. 4.5. Pemurnian inhibitor proteinase sistein biji Ekstraksi biji (60 g) seperti yang dijelaskan untuk korteks KCPI kecuali bahwa buffer sitrat digantikan with100 bis-mM tris-propana, pH 7,0, containing1 M NaCl, dan tidak ada perlakuan panas diterapkan sebagai sistein Aktivitas proteinase dalam biji diabaikan dibandingkan dengan di korteks. supernatan itu dikromatografi pada kolom G75 Superdex diequilibrasi dengan 0,1 M Tris-HCl pH 8,0. Fraksi Papain penghambatan adalah mengumpulkan, terkonsentrasi dan dimurnikan pada kolom afinitas inactivepapain diikuti oleh HiTrap SP

dan C Vydac-18 kolom, seperti yang dijelaskan untuk korteks KCPI. 4.6. Pemurnian actinidain Actinidain dimurnikan dari korteks Kiwi dengan kromatografi kovalen pada Thiopropyl-Sepharose (1,5 el gg) seperti yang dijelaskan oleh Brocklehurst et al. (1981). fraksi Purified (possessinga single band protein pada gel SDS perak-patri) digunakan untuk studi kinetika. 4.7. SDS-PAGE NuPAGETM 12% bis-tris gel Invitrogen) dijalankan di MES-SDS RunningBuffer (Invitrogen). SeeBlue Plus2 Pra-bernoda Standar (Invitrogen) digunakan untuk penentuan Bapak dan gel adalah perak-noda menggunakan protokol standar (Ryan et al, 1998.) atau usingColloidal Coomassie stain (Neuhoff et al, 1988.). 4.8. Tes inhibisi proteinaseSelama prosedur pemurnian, fraksi

Denmark) seperti dilaporkan sebelumnya (Ryan et al., 1998). Sebuah jumlah yang sesuai dari proteinase (Tabel 2) dalam larutan buffer (100 ml) ditambahkan ke inhibitor (5-20 ml) dan campuran diinkubasi pada 25 _C selama 10-15 menit sebelum adding10 ml substrat neon (2,5 mM, di DMF). Harga dihitung dari regresi linier dari data menggunakan in-house dihasilkan perangkat lunak (Christeller et al, 1992.). 4.9. Kuantifikasi inhibitor proteinase sistein dan penentuan KI Konsentrasi situs aktif dari proteinase sistein pertama kali ditentukan oleh titrasi dengan E-64 (bila diperlukan) pada konsentrasi enzim yang tinggi (yakni jauh di atas KI diukur untuk CPI) dan konsentrasi KCPI ditentukan dengan titrasi terhadap papain dikalibrasi, lagi pada konsentrasi tinggi papain. KI kemudian ditentukan oleh titrasi dari usingcali brated inhibitor enzim pada konsentrasi enzim dekat dengan KI. Dimana enzim tersebut tidak secara kuantitatif dihambat oleh E-64, konsentrasi KCPI adalah pra-ditentukan dari inhibisi papain, seperti dijelaskan di atas, dan kemudian digunakan untuk mengkalibrasi tion assuminginterac enzim pada rasio molar 1:1 . Kuantifikasi KCPI di korteks buah kiwi ekstrak kasar juga dilakukan oleh titrasi, dari buah Kiwi actinidaindilemahkan dan ekstrak dinetralkan, terhadap papain, pada konsentrasi tinggi papain.

diuji kemungkinan penghambatan pepsin, tripsin, chymotrypsin atau papain. CPI dimurnikan juga diuji kemampuannya untuk menghambat tripsin, chymotrypsin, pepsin dan sejumlah proteinase sistein. Enzim dan substrat sumber dan buffer tes yang tercantum dalam Tabel 2. Pengujian untuk mengukur keberadaan inhibitor dilakukan dalam piring 96-baik putih mikro-titre fluorescent (A / S Nunc, Roskilde,

4.10. Sisa proses inhibisi papain oleh KCPI1 Kami mengukur tingkat konstanta (Kass dan kdiss) untuk interaksi KCPI1 dengan usinga papain spectrofluorimeter Perkin Elmer LS50B dalam kondisi reaksi seperti yang dijelaskan untuk pengukuran keseimbangan. Tingkat proteolisis awalnya diikuti selama beberapa menit sebelum inhibitor ditambahkan dan tentu saja waktu itu followingthis Selain dianalisis untuk mengekstrak tarif konstanta interaksi inhibitor dengan proteinase (Bieth, 1995; Copeland, 2000). 4.11. Spektrometer massa Massa CPI dimurnikan ditentukan oleh spektrometer Finnigan MALDITOF Lasermat 2000 massa Fasilitas pada Protein Microchemistry, Departemen Biokimia, University of Otago. 4.12. Protein sequencing asam amino N-terminal dari CPI disekuensing oleh Protein Microchemistry Fasilitas, Departemen Biokimia, University of Otago. Analisis telah dilakukan usingnarrow dikenakan HPLC derivatif PTC (Hubbard, 1995). Mana dua urutan yang diamati pada satu sampel, mereka diskriminasi karena mereka hadir dalam proporsi yang berbeda.Ucapan Terima Kasih

mengucapkan terima kasih kepada Ross Crowhurst untuk providing bioinformatics layanan yang memungkinkan kami untuk mengeksplorasi database EST HortResearch, Lesley Beuning, YarKhingYauk dan Kim Snowden untuk mempersiapkan perpustakaan korteks buah Kiwi. Penelitian ini didanai oleh Hort Penelitian.References Abe, K., Emori, Y., Kondo, H., Suzuki, K., Arai, S., 1987. Molecularcloningof a cysteine proteinase inhibitor of rice (oryzacystatin). Homology with animal cystatins and transient expression in the ripeningprocess of rice seeds. J. Biol. Chem. 262, 1679316797. Abe, M., Abe, K., Iwabuchi, K., Domoto, C., Arai, S., 1994. Corncystatin I expressed in Escherichia coli: investigation of its inhibitoryprofile and occurrence in corn kernels. J. Biochem. (Tokyo, Jpn.)116, 488492. Abrahamson, M., 1994. Cystatins. Methods Enzymol. 244, 685700. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 33893402. Arai, S., Matsumoto, I., Emori, Y., Abe, K., 2002. Plant seed cystatins and their target enzymes of endogenous and exogenous origin. J. Agric. Food Chem. 50, 66126617. Barrett, A.J., Kembhavi, A.A., Brown, M.A., Kirschke, H., Knight, C.G., Tamai, M., Hanada, K., 1982. ltrans-Epoxysuccinyl-leucylamido( 4-guanidino)butane (E-64) and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases includingcathepsins B, H and

Ucapan

Terima

Kasih

Kami

L. Biochem. J.201, 189198. Bieth, J.G., 1995. Theoretical and practical aspects of proteinase inhibition kinetics. Methods Enzymol. 248, 5984. Bjork, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A.D.,Mort, J.S., 1994. Differential changes in the association and dis-sociation rate constants for bindingof cystatins to target proteinases occurringon N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes. Biochem. J. 299, 219 225. Bjork, I., Ylinenjarvi, K., 1990. Interaction between chicken cystatin and the cysteine proteinases actinidin, chymopapain A, and ficin. Biochemistry 29, 17701776. Botella, M.A., Xu, Y., Prabha, T.N., Zhao, Y., Narasimhan, M.L., Wilson, K.A., Nielsen, S.S., Bressan, R.A., Hasegawa, P.M., 1996. Differential expression of soybean cysteine proteinase inhibitor genes during development and in response to wounding and methyl jasmonate. Plant Physiol. 112, 12011210. Briggs, M.S., Gierasch, L.M., 1986. Molecular mechanisms of protein secretion: the role of the signal sequence. Adv. Protein. Chem. 38, 109180. Brocklehurst, K., Baines, B.S., Malthouse, J.P., 1981. Differences in the interaction of the catalytic groups of the active centres of actinidin and papain. Rapid purification of fully active actinidin by covalent chromatography and characterization of its active centre by use of two-protonic-state reactivity probes. Biochem. J. 197, 739 746. Bromme, D., Rossi, A.B., Smeekens, S.P., Anderson, D.C., Payan, D.G., 1996. Human bleomycin hydrolase: molecular cloning, sequencing, functional expression, and enzymatic characterization Biochemistry 35, 67066714. Christeller, J.T., Laing, W.A., Markwick, N.P., Burgess, E.P.J., 1992. Midgut protease activities in 12 phytophagous lepidopteran larvae: dietary and protease inhibitor interactions. Insect Biochem. Mol. Biol.

22, 735746. Copeland, R.A., 2000. Enzymes. John Wiley and Sons Inc, New York. Corr-Menguy, F., Cejudo, F.J., Mazubert, C., Vidal, J., Lelandais- Briere, C., Torres, G., Rode, A., Hartmann, C., 2002. Characterization of the expression of a wheat cystatin gene during caryopsis development. Plant Mol. Biol. 50, 687 698. Cowgill, S.E., Wright, C., Atkinson, H.J., 2002. Transgenic potatoes with enhanced levels of nematode resistance do not have altered susceptibility to nontarget aphids. Mol. Ecol. 11, 821827. Doi-Kawano, K., Kouzuma, Y., Yamasaki, N., Kimura, M., 1998. Molecular cloning, functional expression, and mutagenesis of cDNA encodinga cysteine proteinase inhibitor from sunflower seeds. J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124, 911916. Flores, V.M., Louro, R.P., Xavier-Filho, J., Barratt, D.H., Shewry, P.R., Fernandes, K.V., 2001. Temporal and tissue localization of a cowpea (Vigna unguiculata) cystatin. Physiol. Plant. 112, 195199. Gaddour, K., Vicente-Carbajosa, J., Lara, P., Isabel-Lamoneda, I., Diaz, I., Carbonero, P., 2001. A constitutive cystatin-encodingg ene from barley (Icy) responds differentially to abiotic stimuli. Plant Mol. Biol. 45, 599608. Gutierrez-Campos, R., Torres-Acosta, J.A., Saucedo-Arias, L.J. Gomez-Lim, M.A., 1999. The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants. Nat. Biotechnol. 17, 12231226. Hubbard, M., 1995. Calbindin 28 kDa and calmodulin are hyperabundant in rat dental enamel cells. Identification of the protein phosphatase calcineurin as a principal calmodulin target and of a secretionrelated role for calbindin 28 kDa. Eur. J. Biochem. 230, 6879. Irie, K., Hosoyama, H., Takeuchi, T., Iwabuchi, K., Watanabe, H., Abe, M., Abe, K., Arai, S., 1996. Transgenic rice established to express corn cystatin

exhibits stronginhibitory activity against insect gut proteinases. Plant Mol. Biol. 30, 149157. Jeanmougin, F., Thompson, J.D., Gouy, M., Higgins, D.G., Gibson, T.J., 1998. Multiple sequence alignment with Clustal X. Trends Biochem. Sci. 23, 403405. Joshi, B.N., Sainani, M.N., Bastawade, K.B., Gupta, V.S., Ranjekar, P.K., 1998. Cysteine protease inhibitor from pearl millet: a new class of antifungal protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 246, 382 387. Koiwa, H., Shade, R.E., Zhu-Salzman, K., DUrzo, M.P., Murdock, L.L., Bressan, R.A., Hasegawa, P.M., 2000. A plant defensive cystatin (soyacystatin) targets cathepsin l-like digestive cysteine proteinases (DvCALs) in the larval midgut of western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera). FEBS Lett. 471, 67 70. Kondo, H., Abe, K., Nishimura, I., Watanabe, H., Emori, Y., Arai, S., 1990. Two distinct cystatin species in rice seeds with different specificities against cysteine proteinases. Molecular cloning, expression, and biochemical studies on oryzacystatinII. J. Biol. Chem. 265, 1583215837. Laing, W.A., McManus, M.T., 2002. Proteinase inhibitors. In: McManus, M.T., Laing, W.A., Allan, A.C. (Eds.), Protein Protein Interactions in Plants, Vol. 7. Sheffield Academic Press, Sheffield, pp. 77119. Lindahl, P., Abrahamson, M., Bjork, I., 1992. Interaction of recombinant human cystatin C with the cysteine proteinases papain and actinidin. Biochem. J. 281, 4955. Margis, R., Reis, E.M., Villeret, V., 1998. Structural and phylogenetic relationships amongplant and animal cystatins. Arch. Biochem. Biophys. 359, 2430. Michaud, D., Nguyen-Quoc, B., Yelle, S., 1993. Selective inhibition of Colorado potato beetle cathepsin H by oryzacystatins I and II. FEBS Lett. 331, 173176. Misaka, T., Kuroda, M., Iwabuchi, K., Abe, K., Arai, S., 1996. Soyacystatin, a novel cysteine proteinase inhibitor in soybean, is

distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin. Eur. J. Biochem. 240, 609614. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W., 1988. Improved stainingof proteins in polyacrylamide gels includingisoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis 9, 255 262. Ojima, A., Shiota, H., Higashi, K., Kamada, H., Shimma, Y., Wada, M., Satoh, S., 1997. An extracellular insoluble inhibitor of cysteine proteinases in cell cultures and seeds of carrot. Plant Mol. Biol. 34, 99 109. Pernas, M., Sanchez-Monge, R., Gomez, L., Salcedo, G., 1998. A chestnut seed cystatin differentially effective against cysteine proteinases from closely related pests. Plant Mol. Biol. 38, 12351242. Pernas, M., Sanchez-Monge, R., Salcedo, G., 2000a. Biotic and abiotic Stress can induce cystatin expression in chestnut. FEBS Lett. 467, 206210. Pernas, M., Sanchez-Ramos, I., SanchezMonge, R., Lombardero, M., Arteaga, C., Castanera, P., Salcedo, G., 2000b. Der p 1 and Der f 1, the highly related and major allergens from house dust mites, are differentially affected by a plant cystatin. Clin. Exp. Allergy 30, 972 978. Praekelt, U., McKee, R., Smith, H., 1988. Molecular analysis of actinidin, the cysteine protease of Actinidia. Plant Mol. Biol. 10, 193 202. Rogelj, B., Popovic, T., Ritonja, A., Strukelj, B., Brzin, J., 1998. Chelidocystatin, a novel phytocystatin from Chelidonium majus. Phytochemistry (Elsevier) 49, 16451649. Ryan, S.N., Laing, W.A., McManus, M.T., 1998. A cysteine proteinase inhibitor purified from apple fruit. Phytochemistry (Elsevier) 49, 957963. Ryan, S.N., McManus, M.T., Laing, W.A., 2003. Identification and characterisation of proteinase inhibitors and their genes from seeds of apple (Malus domestica). Journal

of Biochemistry 134, 3142. Siqueira-Junior, C.L., Fernandes, K.V.S., Machado, O.L.T., Cunha, M., Gomes, V.M., Moura, D.T.J., 2002. 87 kDa tomato cystatin exhibits properties of a defense protein and forms crystals of prosystemin overexpressigtransg entic plants. Plant Physiol. Biochem. 40, 247254. Solomon, M., Belenghi, B., Delledonne, M., Menachem, E., Levine, A., 1999. The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants. Plant Cell 11, 431444. Song, I., Taylor, M., Baker, K., Bateman Jr., R.C., 1995. Inhibition of cysteine proteinases by Carica papaya cystatin produced in Escherichia coli. Gene 162, 221224. Turk, B., Krizaj, I., Kralj, B., Dolenc, I., Popovic, T., Bieth, J.G., Turk, V., 1993. Bovine stefin C, a new member of the stefin family. J. Biol. Chem. 268, 7323 7329. Turk, B., Ritonja, A., Bjork, I., Stoka, V., Dolenc, I., Turk, V., 1995. Identification of bovine stefin A, a novel protein inhibitor of cysteine proteinases. FEBS Lett. 360, 101105. Urwin, P.E., Lilley, C.J., McPherson, M.J., Atkinson, H.J., 1997. Resistance to both cyst and root-knot nematodes conferred by transgenic Arabidopsis expressing a modified plant cystatin. Plant J. 12, 455 461. Walker, A.J., Urwin, P.E., Atkinson, H.J., Brain, P., Glen, D.M., Shewry, P.R., 1999. Transgenic Arabidopsis leaf tissue expressinga modified oryzacystatin shows resistance to the field slug Deroceras reticulatum (Muller). Transgenic Res. 8, 95103. Womack, J.S., Randall, J., Kemp, J.D., 2000. Identification of a signal peptide for oryzacystatin-I. Planta 210, 844847.