Abstrak Plasma di dalam darah yang berkualitas tinggi lebih banyak dipilih untuk analisis biomedis dan metode diagnostik klinis. Telah terbukti bahwa tantangan utama untuk memanfaatkan mickrofluida sebagai perangkat pemisah adalah untuk memproses cairan dengan isi sel tinggi, seperti seluruh darah. Disini, kami melaporkan pada coustophoresis berasal dari pemisahan chip yang bersifat menyiapkan diagnostik plasma dari seluruh darah yang terkait untuk dilakukan aplikasi secara klinis. Ini sebagai pemisah akustik yang memiliki kapasitas secara berurutan untuk menghapus sel darah yang diperbanyak dalam beberapa langkah untuk menghasilkan plasma kualitas tinggi dengan isi seluler yang rendah. Plasma yang dihasilkan memenuhi persyaratan standar ( < 6,0 109 eritrosit /L ) yang direkomendasikan oleh Dewan Eropa. Selanjutnya, kami berhasil menghubungkan microchip plasmapheresis untuk dikembangkan sebelumnya menjadi berpori silikon sandwich antibodi microarray chip untuk mendeteksi prostate specific antigen (PSA). PSA terdeteksi oleh baik linearitas ( R2 > 0.99 ) dalam plasma yang dihasilkan melalui fluoresensi pembacaan tanpa sinyal amplifikasi pada tingkat yang relevan secara klinis ( 0,19-21,8 ng / mL ) .Perkembangan mikro teknologi dan laboratorium pada sebuah perangkat chip memiliki target operasi yang cepat dan miniatur untuk analisis komponen darah dan plasma darah. Mikro teknologi memiliki bermacam-macam teknik yang telah dikembangkan untuk memungkinkan pemisahan dan konsentrasi dari berbagai komponen yang berbeda di seluruh darah. Beberapa kelompok telah berfokus pada pemisahan sel darah merah dari plasma dan sel darah merah dari sel darah putih. Upaya-upaya lain juga telah dilakukan untuk pengembangan chip yang mengutamakan tingkatan plasma sebagai uji diagnostik miniatur.Sebuah cara yang sering digunakan untuk memisahkan plasma dari darah dengan menggunakan saluran kecil agar terbentuk hubungan dari suatu pori-pori yang kecil sehingga sel bisa lewat. Hal ini dapat berupa filtrasi buntu atau cross-flow filtration, di mana plasma keluar secara tegak lurus ke saluran utama, desain yang jauh lebih menguntungkan karena jauh lebih kecil kemungkinannya untuk tersumbat. Cara lain untuk memisahkan plasma dari sel adalah dengan menggunakan plasma skimming di mana sel-sel darah cenderung untuk tetap bersama pada aliran rendah, sehingga menciptakan konsentrasi sel lebih rendah pada saluran dinding di mana plasma dapat dipindahkan. Efek Zweifach-Fung, atau hukum bifurkasi, dapat digunakan untuk tingkat plasma karena sel-sel yang mengalir di saluran utama lebih tinggi dibandingkan saluran bercabang dengan sisi yang lebih kecil secara bersama-sama pipa terus mengalir dalam saluran utama sementara bagian plasma yang bersih dan kecil dapat disedot melalui saluran sampingnya.Kekuatan akustik yang dihasilkan oleh gelombang ultrasonik bisa juga digunakan untuk memisahan plasma. Gelombang akustik menghasilkan kekuatan radiasi pada sel-sel yang mampu memindahkan mereka ke dalam medan gelombang. Pada dasarnya ada dua pendekatan yang berbeda untuk memanfaatkan fenomena ini. Yang pertama menggunakan akustik gelombang untuk memindahkan sel-sel ke dalam kelompok yang lebih besar. ketika bagiannya menjadi lebih besar, mereka akan mulai berkumpul dan mengendap, yang dimana semua sel berada di bagian bawah kontainer. Teknik ini dapat dirancang untuk proses bets atau sistem aliran secara terus menerus di mana pada bagian atas plasma akan di buang dan bagian tengah sel menjadi padat hingga bagian bawah. Namun, proses ini cukup lama dan tidak cocok untuk implementasi di system mikofluida karena tergantung pada volume yang lebih besar dan proses sedimentasi tidak akan sangat efektif dalam saluran sempit di mana kondisi batas akan dominan.

Gambar 1. Penampang Skema microchannel yang bagus dengan panjang gelombang ultrasonic gelombang / 2, dimana eritrosit berurutan difokuskan pada pusat saluran dengan kekuatan radiasi akustik primer.

Cara lain dari gelombang akustik yaitu dapat digunakan untuk pemisahan selanjutnya dengan menggunakan saluran mikofluida yang dicocokkan dengan lebar setengah panjang gelombang. Saat campuran partikel mengalir melalui saluran tersebut akan terkena gelombang ultrasonic standing wave ( USW ), kekuatan akustik akan memindahkan semua partikel ke saluran tekanan bagian tengah. Dalam perangkat mikofluida, gabungan USW dengan aliran laminar akan membentuk sebuah ikatan partikel yang terkonsentrasi di tengah saluran dari partikel serta pembersihan didistribusikan ke bagian pinggir. dengan memberikan saluran trifurcated keluar, pembersihan dilakukan keluar melalui sisi samping sementara partikel diperbanyak pada bagian tengah saluran lalu akan keluar melalui pusat keluar. Petersson menunjukkan perangkat pemisahan dimana pengumpulan darah selama operasi dipisahkan menjadi satu fraksi yang mengandung lipid dan satu fraksi dengan sel-sel darah . Dalam konteks ini , partikel lipid dicampur dengan plasma dan dikeluarkan melalui sisi luar . Kelemahan dari mikofluida akustik dimunculkan pada sistem pemisahan yang sejauh ini telah terbatas untuk sampel konsentrasi dengan volume sekitar 5-10 % agar efisiensi pemisahan dapat diterima. Namun, susunan suatu benda juga dapat digunakan untuk menghasilkan plasma yang bersih dari seluruh darah jika pengaturan dapat dimodifikasi dan diimplementasikan,.Meskipun banyak yang melaporkan bahwa perangkat mikofluida dapat bekerja dengan baik pada darah untuk penggunaannya, sebagian besar dari mereka tidak puas terbukti dari penyediaan sampel darah yang sangat encer guna dilakukan pemisahan. Darah memiliki hematokrit 38-54%, akan menyebabkan banyak sumbatan dan kelebihan beban pada sistem mikrofluida. Mengencerkan sampel tidak akan bermanfaat. Chip solusi lain, yang mampu menangani hematokrit tinggi, biasanya memiliki volume yang sangat rendah.Dalam perawatan kesehatan, cara yang paling sering digunakan untuk mencapai sel bebas plasma adalah penggunaan sentrifugal. Meskipun memberikan derajat sel plasma bebas yang tinggi, ada beberapa kelemahan. Pertama, proses penjumlahan dan pengukuran sentrifugal yaitu dapat mencegah pemasukan total pada sistem analisis di mana sampel dapat terus diproses melalui beberapa langkah berurutan termasuk perawatan presample, pemisahan, analisis, dan pembacaan sampel. Kedua, putaran sentrifugal menginduksi gaya geser tinggi pada sel deformasi dan akhirnya bisa terpecah, sehingga mencemari plasma dalam tingkatan intraseluler. Semua kelemahan ini dapat dihilangkan menggunakan on-chip plasmapheresis acoustophoretic, seperti laporan sebelumnya.Sebuah harapan yang baik untuk microchip berbasis klinis sejenis plasmapheresis adalah suatu kopling chip terpadu untuk microscaled berguna untuk pembacaan diagnostik. Telah di lakukan pencarian untuk diagnosis kanke dini dengan eksplorasi teknologi proteomic yang canggih, di mana pencarian dan identifikasi biomarkers kanker untuk meningkatkan diagnostics yang baru. Selain diagnosa awal, biomarker menjanjikan dalam memberikan informasi tentang penyakit Status pada suatu titik waktu tertentu, sehingga memungkinkan juga untuk memonitor perkembangan penyakit serta penilaian target terapi.Sejalan dengan hal ini, strategi biochip baru sedang dikembangkan untuk menganalisa protein yang tinggi dalam biofluids. deteksi protein rendah menggunakan microarray antibodi dalam spesimen yang kompleks, misalnya, secara keseluruhan darah, plasma, atau serum sampel, telah berhasil ditunjukkan oleh Carlsson et al. dan Ingvarsson et al. Namun, hal ini sering membutuhkan persiapam sampel yang sulit. Pada laki-laki kanker yang paling sering di Eropa Barat dan Amerika Serikat adalah kanker prostat. Antigen prostat spesifik (PSA) baik diketahui dan biomarker kanker yang paling banyak digunakan, diukur dalam serum dan plasma pasien untuk diagnosis kanker prostat. Namun, konsentrasi PSA cukup tinggi tidak langsung menunjukkan kanker prostat karena kasus hiperplasia prostat jinak mungkin menunjukkan hasil yang sama. PSA itu sendiri adalah suatu serine protease yang dilepaskan ke plasma mani setelah ejakulasi dengan konsentrasi 1 g / L, sementara kehadirannya dalam serum dalam kondisi normal adalah sekitar 0,6 ng / mL. Pencarian pada biomarker untuk deteksi kanker merupakan upaya luas di seluruh dunia. Hal ini diantisipasi bahwa diagnosis di masa depan skrining biomarker akan luas digunakan secara paralel yang kemudian memerlukan spesifik substrat untuk protein microarrays.Potensi dalam penggunaan silikon berpori sebagai microchip substrat dalam aplikasi protein microarray sebelumnya telah dijelaskan, memenuhi persyaratan untuk sebuah wellperforming bioassay di plasma murni, silikon berpori menyediakan permukaan yang menunjukkan daerah tempat kecil karena sifat hidrofobik dari mikro / permukaan nanomorphology chip, baik reproducibility spot, profil tempat homogen, dan latar belakang fluoresensi intrinsik yang rendah, serta memberikan tingkatan batas deteksi bila dibandingkan dengan komersial lainnya. Hal itu juga menunjukkan bahwa silikon berpori kompatibel dengan dual mode pembacaan yang bersamaan menyediakan baik afinitas (fluoresensi) dan identitas massa.Makalah ini menyajikan sebuah ultrasonic standing wave (USW), yang mampu memproses seluruh fraksi plasma darah dan memproduksi immunoassay berikutnya. USW telah mampu meningkatkan saluran pemisah panjang dibandingkan perangkat sebelumnya, dengan beberapa outlet di sepanjang bagian bawah saluran pemisahan, di mana fraksi sel terkonsentrasi dapat dialihkan dari aliran utama tanpa mempengaruhi pengaruh kekuatan radiasi sel fokus, sampai pada bagian dasar hanya sel plasma bebas yang tersisa dalam saluran. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa saat ini 12,5% volume plasma berssih yang diekstraksi dari darah. Plasma yang diperoleh kurang dari 6,0 109 eritrosit / L yang sejalan dengan kualitas spesifikasi untuk transfusi darah yang dinyatakan oleh Dewan Eropa.Selain itu, makalah ini menjelaskan aplikasi klinis dari kemajuan Chip plasmapheresis bila dibandingkan sebelumnya. Dengan menggabungkan mikrofluida USW dan protein teknologi microarray, semua microchip berbasis deteksi PSA dari Seluruh darah diperoleh dalam konfigurasi baru laboratorium dalam chip.

Material dan MetodeFabrikasi Chip Plasmapheresis. berbentuk sutu dalam alat separator plasmapheresis yang merupakan suatu alat pemisah anti bodi dari komponen plasma yang berada di dalam darah, alat tersebut dibuat dari bahan silikon melalui prosen fotolitografi sisi ganda dan melalui proses basa-etse yakni menggunakan KOH untuk membuat sifat anisotropic. Pemisahan saluran dirancang dengan resonansi sekitar 2 MHz , dengan lebar saluran sekitar 350 m . saluran disegel dengan tutup kaca menggunakan ikatan anodic, untuk mengurang korosi . Silicon tubing menempel pada outlet di bagian belakang yang berfungsi sebagai pengait pada 1/16 Teflon tubing . Informasi lebih rinci mengenai proses fabrikasi dapat ditemukan di Nilsson et al.18 2 MHz piezoceramic transduser ( PZ26 , Ferroperm Piezoceramics , Kvistgard , Denmark ) yang digabungkan ke dalam chip secara bersama-sama melalui hidrogel (Aquasonic Clear Ultrasound Gel, Parker Laboratories Inc., Fairfield, NJ) dengan kopling akustik yang baik . Pengaturan eksperimental. Berupa penggerakan Transduser piezoceramic menggunakan generator gelombang Agilent 33250A dan dan memperkuat daya dengan menggunakan Amplifier pada penelitian di gunakan 75A250 amplifier. Pemasukan kekuatan pada transduser dipantau menggunakan Bird Model 5000 - EX yang merupakan pengukur kekuatan secara digital . Darah disedot melalui pemisah menggunakan jarum suntik berbentuk pompa ( WPI SP210iwz , world Precision Instrumen , Sarasota , FL ) dan menggunakan Hamilton 5 mL yang merupakan jarum suntik berbahan kaca ( TLL 1005 , Hamilton Bonaduz AG , Bonaduz , Swiss ) . Pemisahan itu secara visual dimonitor menggunakan mikroskop Nikon SMZ - 2T . Pengumpulan Sampel. Terdapat dua belas tempat penyuntik( 25.EPC12W , Vici , Valco Instruments , Houston , TX ) digunakan untuk memperoleh sampel dari stopkontak. Teflon tubing ( 0,5 mm i.d. ) , lalu dimasukkan ke dalam tabung silikon, pada bagain ini berfungsi menghubungkan chip dan penyuntik . setiap sample penyuntuk yang dikumpulkan dari dua outlet sebanyak 50 uL Teflon tubing ( 0,5 mm i.d. ) putaran. Sampel darah . Pada sample diperlakukan suatu sitrat yang diperoleh dari donor darah yang sehat namun tanpa pencantuman identitas. Perbedaan jumlah hematokrit yang berbeda diperiksa dengan cara mengencerkan seluruh darah serta di lakukan sentrifugasi plasma dari sampel yang sama . Tingkat hematokrit diperhatikan menggunakan sentrifus ( Haematocrit 210 , Hettich , Tuttlingen , Jerman ) . A Coulter Counter ( Multisizer 3 , Beckman Coulter Inc , Fullerton , CA ) digunakan untuk menentukan efisiensi pemisahan persentase sel yang dilepaskan dari setiap outlet kualitas plasma yang dihasilkan pada hal ini : Ukuran partikel dihitung berada di kisaran 4-8 pM Diameter eritrosit adalah sekitar 7 m leukosit umumnya lebih besar atau sama 23 yang

Efisiensi pemisahan dihitung sebagai :

Sep. eff. NAQA + NBQB + NCQC + NDQD NAQA + NBQB + NCQC + NDQD + NEQE

dimana Nx adalah jumlah partikel dalam 10 uL sampel berasal dari stopkontak x yang diukur dengan Coulter Counter dan Qx yang merupakan besarnya tingkatan aliran yang berasal stopkontak x, sebagaimana fungsi dari pompa jarum suntik. Protein dan Reagen. Prostat Spesific Antien (PSA) yang berasan dari cairan semen manusia diperoleh dari Sigma. antibodi monoklonal 2E9 dan H117 diproduksi dan di beri tanda seperti sebelumnya 2E9 diberi label dengan isotiosianat fluorescein (FITC) isomer I-Celite (Sigma St Louis, MO, USA) dan dipisahkan dalam kolom PD10 (Amersham, Uppsala, Swedia). Pada perempuan Whole Blood Spiked dengan PSA. sampel darah perempuan diperoleh dari donor yang sehat sebagai dijelaskan di atas. yang dimana sampel darah individu sebelumnya sudah dibubuhi PSA sebelum di lakukan plasmapheresis. seluruh darah dari perempuan tersebut di ambil terlebih dahulu untuk memastikan bahwa tidak di temukanya PSA dalam sampel tersebut sebelumnya. Porous Chip Silicon Protein . Fabrikasi pada silicon berpori dilakukan oleh pembubaran anodik tipe-p monocrystalline silikon wafer ( Addison Engineering, Inc San Jose , CA ; resistivitas 1,0-10,0 cm ) . Dalam proses ini , silikon dalam bentuk wafer ditempatkan di antara dua sel elektrokimia kemudian diisi dengan larutan elektrolit yang mengandung campuran 1:10 terdiri dari dari 40 % asam fluorida dan 99,8 % dimetil formamida . elektrolit memberikan kontak pada kedua sisi wafer. Selama anodization , bagian belakang wafer diterangi menggunakan lampu halogen 100 W dari 91 mA secara sistematik selama 70 menit, pembentukan pori dimulai dari pembentukan lapisan silikon berpori di sisi anodik wafer . wafer silikon berpori tersebut selanjutnya potong dadu kecil-kecil dari 6 6 mm , membentuk chip silicon berpori . Microarraying Menggunakan Aliran piezoelectric-melalui Microdispenser . Sebuah microdispenser piezoelektrik dikembangkan secara in-house dan software tersebut dikendalikan dari suatu stasiun yang digunakan untuk membentuk microarray(susunan kecil) sebanyak 600 tempat / susunan dari setiap tikus monoklonal yang bersifat anti PSA yang megikat antibodi H117 . microdispenser yang digerakkan oleh elemen piezoceramic , mampu menghasilkan 100 pL tetesan antibodi untuk membentuk sebuah susunan dengan jarak 150 m antara masing-masing tempat . H117 diizinkan untuk mengikat bagian permukaan melalui adsorpsi fisik . Sandwich Antibodi Microarray . sandwich silikon berpori antibodi microarray dilakukan untuk deteksi PSA dalam microchip plasmapheresis yang berasal dari plasma sampel . antibodi H117 di ambil dari PBS ( 0,5 mg / mL ) atelah tersusun ke dalam chip silikon berpori kemudian di lanjutkan dengan 3 langkah pencucian di PBS ( 0,05 % Tween 20 di PBS ) untuk menbuang antibody yang telepas . Chip tersusun kemudian diblokir dengan 5% susu rendah lemak di PBS - Tween selama 30 menit untuk mencegah peningkatan tidak spesifik pada langkah inkubasi berikutnya . Langkah pencucian ulang dilakukan sebelum mengekspos chip untuk inkubasi mengunakan 24 uL larutan sampel selama 70 menit . Setelah inkubasi , chip dicuci lagi 3 kali . Langkah berikutnya adalah menetaskan chip menggunakn 24 uL FITC - label 2E9 monoklonal tikus anti - PSAantibody . Setelah 1 jam inkubasi , chip dicuci 3 kali dalam 5 ml PBS - Tween , dengan cepat dicelupkan ke dalam air suling , dan dikeringkan menggunakan udara bertekanan sebelum di lihat pada mikroskop confocal. Pembacaan Fluoresensi dan Analisis . deteksi fluoresensi dilakukan dengan menggunakan mikroskop confocal ( Olympus ) , sebuah minyak di celupkan dengan pembesaran lensa objektif 20 , serta dengan penggunaan laser ion ( Melles Griot Laser Group) dengan panjang gelombang eksitasi 488 nm , serta penggunaan pemindah menggunakan FluoView ( FluoView , Olympus ) . Analisis citra dilakukan menggunakan FluoView software 300 . Total intensitas setiap tempat adalah dihitung menggunakan FluoView 300 dan metode lingkaran . l Total intensitas diukur dengan menggunakan metode yang sama dan kemudian dikurangkan dari total intensitas setiap tempat . setiap sembilan tempat dan latar belakang diukur untuk analis pencitraan, sehingga menghasilkan rata-rata intensitas tempat dan disajikan dalam angka-angka . Analisis Delfia . Delfia Prostatus PSA bebas / total adalah waktu penyelesaian fluoroimuno kuantitatif yang dikembangkan oleh Perkin -Elmer ( Perkin -Elmer , Turku , Finlandia ) untuk mendeteksi total PSA dan PSA bebas secara simultan ( terkomplekskan PSA ) pada serum . Ini adalah immunoassay fase solid berdasarkan tehnik sandwich, Teknik ini memanfaatkan tiga antibodi monoklonal . penangkapan antibodi PSA antitotal digunakan untuk mengikat kedua jenis PSA yakni yang bebas dan yang komplek ke dalam solid fase . Europium antibodi di gunakan sebagai label untuk PSA bebas sedangkan samarium antibodi untuk gabungan dua jenis PSA yakni yang bebas dan complexe ( PSA total ) . fluoresensi tersebut, europium dan samarium dideteksi menggunakan waktu penyelesaian fluoresensi sebanding dengan konsentrasi PSA bebas dan total dalam sample. Dalam studi ini , Delfia digunakan sebagai acuan untuk uji total PSA berbasis Chip .