Respon Eksplant Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) pada perlakuan Transformasi Gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens

Digunakan untuk melengkapi Skripsi Tahun Ajaran 2012/2013

Oleh :

Fika Ayu Safitri

NIM. 081510501027

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS JEMBER

2012

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Tanaman Jarak pagar dengan nama ilmiah Jatropha curcas L. dapat

dikategorikan sebagai salah satu sumber energi alternatif pengganti solar. Hal ini

dikarenakan minyak Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) dapat menghasilkan minyak

biodiesel sebagai pengganti Bahan Bakar Minyak (Sudradjat, 2006) yang

mendekati karakteristik diesel. Biodiesel merupakan bahan bakar alternatif yang

terbuat dari minyak nabati atau hewani, minyak tersebut dapat diubah menjadi

bahan bakar mesin diesel melalui proses transesterifikasi agar sifat-sifatnya

menyerupai minyak solar (Hidayat dan Sumangat, 2008), sehingga biodiesel bisa

digunakan sebagai bahan bakar campuran solar. Keunggulan penggunaan minyak

jarakya itu tidak bersaing dengan kebutuhan pangan, ditambah lagi penanaman

jarak pagar yang dapat dilakukan di lahan – lahan marginal. Namun, kendala yang

dihadapi dalam pengembangan tanaman jarak pagar sebagai bahan bakar

pengganti yaitu keterbatasan bahan baku untuk industri biodiesel (Syakir, 2010)

karena tingkat rendemen minyak yang masih rendah sekitar 30 – 35 % (Raden, et.

A.,. 2009).

Akhir – akhir ini, banyak metode rekayasa genetik yang digunakan untuk

perbaikan sifat tanaman, seperti halnya untuk menaikkan rendemen. Salah satu

metode yang digunakan yaitu teknik transformasi gen pada tanaman agar tanaman

yang kita inginkan memiliki sifat – sifat yang diharapkan. Pada tanaman jarak

pagar, minyak terdiri dari dua komponen penyusun, yaitu gliserol dan asam

lemak. Dalam sintesis asam lemak terdapat faktor yang mempengaruhinya, yaitu

adanya protein ACP (Acyl Carrier Protein) yang dikode oleh gen Acl. Branen, et

al. (2001) menyatakan bahwa Acyl Carrier Protein (ACP) adalah protein yang

bersifat asam memiliki ukuran kecil (9 kD), dimana protein ini merupakan

kofaktor penting dalam biosintesis asam lemak pada tanaman. Menurut Guerra

(1986), protein ACP dibutuhkan dalam jumlah yang banyak pada sintesis asam

lemak dan terjadi di plastida tanaman. ACP sering dianggap sebagai suatu bentuk

protein koenzim A (Therisod dan Kennedy, 1987), sehingga semakin banyak gen

Acl yang terkandung pada suatu siklus biosintesis, maka jumlah asam lemak yang

dihasilkan oleh tanaman meningkat, sehingga rendemen minyak pada tanaman

jarak pagar juga dapat meningkat.

Gen Acl yang telah diketahui tersebut diligasi pada plasmid pBI 121 untuk

dilakukan transformasi pada tanaman jarak pagar. Pada penelitian ini digunakan

Agrobacterium tumefaciens sebagai media transformasi ke kromosom tanaman.

Media transformasi ini dipilih karena lebih sederhana dan ekonomis. Disamping

itu, Agrobacterium Tumefaciens memiliki efisiensi tinggi untuk mentransfer

dengan baik gen yang diinginkan kedalam kromosom tanaman (Sheeba, 2010)

serta jumlah kopi gen yang di masukkan kedalam kromosom tanaman relatif besar

(Wunn, 1997). Transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens lebih

disenangi daripada menggunakan penembak biolistik karena penggunaan

Agrobacterium menghasilkan proporsi yang lebih besar transgen terekspresi

dengan jumlah lokus yang lebih rendah (Ishida et al., 1996; Zhao et al., 1998

dalam Utomo, D.S., 2004). Teknik transformasi gen menggunakan

Agrobacterium Tumefaciens digunakan sebagai pendekatan molekuler yang

ditujukan untuk peningkatan rendemen minyak pada tanaman jarak dengan

memanfaatkan agrobacterium tumefaciens. Oleh karena itu, diperlukan penelitian

ini untuk mendapatkan metode yang tepat pada transformasi gen Jarak Pagar

(Jatropha curcas L.) menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.

1.2. Rumusan Masalah

Peningkatan rendemen minyak tanaman jarak dapat dilakukan dengan

transformasi gen Acl ke dalam genom tanaman dengan harapan gen tersebut dapat

terekspresi sehingga rendemen minyak tanaman jarak dapat meningkat. Metode

transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens ini memiliki perbedaan antara

satu spesies tanaman ke spesies tanaman lainnya, serta antara kultivar satu dengan

kultivar lainnya. Menurut Hiei et al. (1997) bahwa keberhasilan Agrobacterium

dalam menginfeksi tanaman ditentukan oleh banyak faktor diantaranya adalah

jenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi serta galur Agrobacterium

yang digunakan. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian mengenai respon

eksplan tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) pada perlakukan transformasi

gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.

1.3. Tujuan dan Manfaat

1.3.1. Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui respon eksplant tanaman Jarak

Pagar (Jatropha curcas L.) pada perlakukan transformasi gen Acl menggunakan

Agrobacterium Tumefaciens.

1.3.2. Manfaat

Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

tentang metode transformasi gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Jarak Pagar

Tanaman Jarak Pagar (Jatropha Curcas L.) merupakan tanaman perdu yang

termasuk dalam family Euphorbiaceae dan terdiri dari 170 spesies yang telah

dikenal seperti karet dan singkong (Wudrack, 2008 dalam Carles, 2009). Menurut

Hambali (2006) klasifikasi tanaman jarak pagar sebagai berikut :

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Euphorboiales

Famili : Euphorbiaceae

Genus : Jatropha

Spesies : Jatropha curcas L.

Tanaman jarak adalah salah satu tanaman penghasil bahan bakar alami

dalam bentuk minyak diesel dan merupakan salah satu tanaman non-edible oil.

Tanaman penghasil minyak, Bahan Bakar Nabati, terkadang menimbulkan

masalah baru seperti persaingan dengan kebutuhan pangan yang penting bagi

kehidupan manusia. Namun, tanaman jarak pagar ini merupakan tanaman non-

edible oil dimana tanaman ini tidak akan bersaing dengan kebutuhan pangan. Hal

ini disebabkan biji jarak mengandung racun sehingga tidak mungkin dikonsumsi

oleh manusia. Selain itu, Jatropha curcas L. merupakan tanaman yang dapat

tumbuh dilahan marginal sehingga dalam perawatannya tidak banyak

membutuhkan banyak air dan pupuk (Siang, 2009).

Indonesia dapat dikatakan sebagai salah satu daerah penyebaran tanaman

jarak pagar selain India. Dengan kemampuan tanaman jarak pagar yang dapat

tumbuh di lahan marginal, tanaman ini dapat dimanfaatkan untuk usaha

konservasi lahan marginal sehingga dapat memberi manfaat dengan produksi

minyak sebagai energi terbarukan. Menurut Siswadi (2006) Lahan kritis di

Indonesia lebih dari 20 juta ha, sebagian besar berada di luar kawasan hutan

dengan pemanfaatan yang belum optimal. Mengingat permintaan energi dan

pangan yang naik pada tiap tahunnya, pemanfaatan lahan kritis dapat memenuhi

kebutuhan energi tanpa bersaing dengan tanaman pangan, air dan sumber alam

lainnya tidak terjadi jika pemanfaatan jarak pagar dilakukan secara optimal.

Gambar 1. Perkiraan penyebaran tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.)

(sumber : King, et al., 2009).

2.2. Kultur Jaringan

Secara konvensional, perbanyakan tanaman jarak dilakukan dengan

menggunakan benih dan stek. Namun, perbanyakan secara konvensional

menimbulkan masalah seperti rendahnya viabilitas benih, perkecambahan yang

rendah, terlambatnya pertumbuhan akar dan jumlah akar yang sedikit (Heller,

1996; Openshaw, 2000 dalam Shah, et. al., 2010). Pada umumnya tanaman jarak

memulai berbuah pada tahun ke 2 – 3. Namun, sebagian kecil tanaman jarak dapat

dilakukan pemanenanpada tahun pertama (setelah tanaman berumur 6 – 8 bulan)

dengan produktivitas yang rendah sekitar 35-45 % (Arif dan Ahmed, 2009) 0,5 –

1,0 ton biji kering per hektar per tahun. Selain itu, rata - rata viabilitas dan tingkat

perkecambahan tanaman jarak rendah (Kaewpoo dan Te-chato, 2009). Oleh

karena itu, diperlukan pendekatan baru yang dapat digunakan sebagai cara

perbanyakan tanaman jarak untuk meminimalisir menyelesaikan masalah pada

tanaman jarak.

Dalam perbanyakan tanaman jarak pagar juga dibutuhkan teknik yang dapat

memudahkan dalam penyediaan bibit seperti kultur jaringan. Secara khusus,

kultur jaringan dapat diartikan sebagai ilmu pengetahuan yang digunakan untuk

menumbuhkan sel, jaringan atau organ tanaman yang telah dipisahkan dari

tanaman induk pada media buatan (George, et al. 2008).

Perbanyakan tanaman jarak menggunakan teknik kultur jaringan sudah sering

dilakukan penelitian, akan tetapi perlu adanya perbaikan lebih lanjut mengingat

tanaman jarak memiliki varietas yang berbeda sehingga dalam penggunaan teknik

kultur jaringan diperlukan metode yang sesuai seperti penggunaan media, hormon

serta bagian yang akan digunakan sebagai eksplan. Menurut Chaudhary, et al

(1994) menyebutkan bahwa syarat yang optimum untuk pembentukan kalus atau

pembentukan organ pada teknik kultur jaringan sangat beragam tidak hanya

berasal dari perbedaan spesies namun juga perbedaan eksplan yang diambil pada

tanaman yang sama akan menimbulkan hasil yang berbeda pula.

2.3. Tranformasi Gen dan Agrobacterium Tumefaciens

Transformasi merupakan upaya memanipulasi sifat gentik dan mentransfer

gen- gen asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri atau hewan kedalam

suatu latar belakang genetik baru. Pada metode transforamsi yang dilakukan pada

penelitian ini digunakan bakteri pathogen tanah yang dapat menyebabkan crown-

gall pada tanaman dikotil atau yang biasa disebut Agrobacterium Tumefaciens.

Agrobacterium Tumefaciensmerupakan bakteri aerob obligat gram negatif

(Mulyaningsih, 2009) dan merupakan bakteri pathogen tanah (Riva, et. al., 1998),

dimana pada awalnya bakteri ini dapat merugikan bagi tanaman inang.Secara

alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian

tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall

tumor) (Tzfira, et. al., 2004; Riva, et. al., 1998). Crown gall tumor ini merupakan

hasil dari transfer dan ekspresi gen yang terdapat pada agrobacterium kedalam sel

tanaman yang menyebabkan proliferasi sel yang tidak terkendali dan sintesis

senyawa yang dapat dimetabolisme secara khusus oleh agrobacterium (Escobar,

dan Dandekar, 2003).Dasar transformasi genetik sel tanaman oleh Agrobacterium

Tumefaciens adalah pemindahan Ti-Plasmid dari bakteri yang menginduksi

terbentuknya tumor karena Ti-Plasmid tersebut dapat berintegarsi dengan genom

tanaman inang.

Sel agrobacterium memiliki 2 macam DNA, yaitu:DNA Kromosom bakteri

dan DNA Plasmid (Gambar 3). Kemampuan membentuk tumor ditentukan oleh

plasmid Ti (Tumor Induksi) yang berada pada  A. tumefaciens. Ti-Plasmid tidak

dapat digunakan untuk cloning secara langsung karena ukuran Ti-Plasmid terlalu

besar (200 kb), sehingga Ti-Plasmid perlu diperkecil ukurannya agar dapat

ditransfer ke tanaman.

Gambar 2. Bagian alami agrobacterium Tumefaciens. (Sumber : Pighin, 2003)

Pada rekayasa genetik plasmid digunakan untuk menyisipkan/menyimpan

gen yang diinginkan. Pada plasmid terdapat beberapa susunan gen mulai dari gen

ketahanan pada antibiotic tertentu hingga gen yang dapat disalin menggunakan

gen tertentu. Pada kromosom bakteri terdapat gen ketahanan terhadap antibiotic

tertentu yang alamiah dibawa oleh bakteri tersebut.

Ti-Plasmid mengandung suatu fragmen DNA yang disebut T-DNA

(Transfer Deoxiribose Acid) (berukuran 15-30 kb) yang dapat diintegrasikan ke

dalam DNA inti sel tanaman. Pada T-DNA terdapat gen untuk sintesis hormone

akusin dan sitokinin. Keberadaan kedua hormone ini dapat merangsang

tumbuhnya kanker pada tanaman. Kedua hormone ini menyebabkan pembelahan

sel tanaman yang tidak terkendali yang dapat menyebabkan tumor pada tanaman.

Oleh karena itu, gen yang menyebabkan produksi auksin dan sitokinin

dihilangkan agar dapat digunakan dalam transformasi gen pada tanaman.

Keberadaan T-DNA dalam agrobacterium mengakibatkan bakteri ini lebih

banyak dipilih dalam transfer gen karena kemampuannya yang dapat membawa

gen lain serta mentransfernya kedalam tanaman inang sehingga tanaman inang

dapat mengekspresikan gen tersebut.Gen yan mengkode produksi auksin dan

sitokinin dapat dihilangkan dengan menggunakan enzim retriksi yang kemudian

diganti dengan gen yang diinginkan.

Proses transfer T-DNA bakteri ke dalam sel tanaman dijalankan oleh produk

dari daerah virulen (vir. region) yang berada di Ti-plasmid sehingga dapat

mentransfer gen yang terdapat pada tanaman. Berikut merupakan beberapa

tahapan transfer T-DNA dari Agrobacterium kedalam tanaman (gambar 4), antara

lain : 1) Induksi terbentuknya ekspresi gen virulensi oleh komplek protein Vir A

dan Vir G, dimana Vir A mendeteksi adanya senyawa fenolik yang dihasilkan

tanaman akibat pelukaan, setelah itu, Vir A memfosforilisasi Vir G untuk

melakukan transkripsi gen virulence. 2) Produksi T-Strand (sebuah ss salinan dari

T-DNA) oleh komplek protein Vir D1/Vir D2. 3) Terbentuknya T-Komplek yang

merupakan kesatuan T-Strand dan komplek protein Vir E. 4) T-komplek keluar

dari sel bakteri. 5) T-komplek masuk ke dalam sel tanaman. 6) T-komplek

menembus dindinh inti sel yang kemudian 7) berintegerasi dengan kromosom

tanaman.

Gambar 3. Proses transfer T-DNA dari Agrobacterium Tumefaciens ke sel tanaman.

(Sumber : Zupan, J.P dan Zambryski, P., 1995)

Penggunaan agrobacterium sebagai media transformasi gen dinilai sebagai

cara yang relatif murah dan lebih alami dibandingkan dengan menggunakan

metode transformasi yang lain. Selain itu gen yang ditransformasi dengan

A.tumefaciens terintegrasi lebih stabil di dalam genom tanaman target. (B. Santosa

dan Sofiari, 2005) dan lebih mudah dalam memberikan perlakuan pada tanaman.

Namun, keberhasilan proses transformasi juga dipengaruhi oleh kombinasi dari

kekuatan bakteri (strain Agrobacterium) dan genotipe tanaman. (Sheeba, et. al.,

2010). Agrobacterium ini berbahaya bagi tanaman, tetapi sangat berguna bagi

peneliti karena: Agrobacterium dapat mentransformasikan kedalam genom

tanaman,mudah ditemukan didalam tanah, serta sangat berguna untuk alat

menstranfer DNA yang diinginkan peneliti untuk memodifikasi genetik tanaman

(Winstead, 2001).

Penggunaan agrobacterium sebagai media tranformasi sering dilakukan

tidak hanya pada tanaman jarak pagar tetapi juga pada tanaman jagung (Utomo,

2004), Tomat (B. Santosa dan Sofiari., E, 2005), serta tanaman lainnya, sehingga

penggunaan Agrobacterium sebagai media transformasi sangat umum

digunakan.Secara konvensional, proses transformasi A. Tumefaciens diawali dari

tahapan co-culture yaitu tahapan transfer T-DNA ke sel tanaman dalam jaringan

eksplan yang diikuti oleh adanya seleksi yang selanjutnya regenerasi dari yang

ditransformasi menjadi tanaman utuh (Chabaud, et al., 2011).

2.4. Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR (polymerase chain reaction) adalah salah suatu teknik perbanyakan

DNA yang dilakukan secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Menurut

lestari, P (2011) menyatakan bahwa kelebihan metode untuk mengidentifikasi

atau membedakan varietas dominan dengan metode PCR ini adalah tidak butuh

waktu yang lama, mudah dalam pelaksanaannya dan efisien dalam segi waktu

dapat dijadikan sebagai alat bantu untuk identifikasi varietas. Dalam Proses PCR

diperlukan bahan yang digunakan selama perbanyakan DNA yaitu :

1. DNA template merupakan DNA sampel yang berisi urutan target. Pada awal

reaksi,suhu tinggi diterapkan pada molekul DNA beruntai ganda asli untuk

memisahkan untaian satu sama lain.

2. DNA polimerase merupakan sejenis enzim yang mensintesis untai baru DNA

komplementer yang sesuai dengan urutan target. DNA polymerase ini memiliki

kemampuan sebagai: 1) mereka dapat menghasilkan untai DNA baru

menggunakan template DNA dan primer, dan 2) mereka tahan panas.

3. Primer merupakan potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi

urutan target. Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.

4. Nukleotida (dNTPs or deoxynucleotide triphosphates) - unit tunggal dari basis

A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untaian DNA baru.

5. RT-PCR (Reverse Transcription PCR) adalah PCR diawali dengan pengubahan

RNA sampel ke dalam cDNA dengan enzim reverse transcriptase.

Berikut merupakan tahapan kerja pada PCR (gambar 5), diantaranya :

1. Denaturasi

Proses ini merupakan proses pemisahan untaian ganda DNA menhjadi galur

tunggal. Selamalangkah awal ini, temperature yang digunakan pada suhu yang

tinggi(biasanyalebih panasdari 94 - 96 derajatcelsius). Denaturasi ini dilakukan

karena ikatan hidrogen yang menghubungkan basis satu sama lain merupakan

ikatan lemah. Ikatan hidrogen pecah pada suhu tinggi, sedangkan ikatan antara

deoksiribosa dan fosfat, yang merupakan ikatan kovalen kuat, tetap utuh.

2. Annealing

Proses ini merupakan proses penempelan untaian DNA komplementer dengan

primer yang digunakan. Suhu yang digunakan yaitu antara 40 - 65 derajat celsius,

tergantung pada panjang dan urutan dasar primer. primer dapat membentuk ikatan

hidrogen, dengan urutan komplementer dalam DNA target. Primer dan DNA

target mengikuti dasar-pasangan aturan, yaitu Sebuah (A) adenin pasang dengan

timin (T), dan (C) sitosin pasang dengan guanin (G).

3. Extention/Elongation

Setelah proses annealing selesai, suhu dinaikkanmenjadi sekitar72

derajatcelsius, danenzim DNA polimerase Taq digunakan untuk meniru untai

DNA.Perpan jangan selalu dimulai pada ujung 3' dari primer membuat untai

ganda dari masing - masing dua untai tunggal. Setelah satu siklus lengkap,

terdapat dua untai ganda salinan DNA target.

Pada reaksi PCR mengandung banyak salinan primer dan nukleotida sehingga

dibutuhkan lebih banyak lagi siklus agar hasil kopian DNA yang diinginkan dapat

diperoleh dalam jumlah yang banyak. Setelah siklus kedua, terdapat empat salinan

DNA target. Setelah siklus 3 selesai, terdapat 8 salinan urutan target ganda DNA

beruntai. Tetapi, hanya 2 dari untai ganda yang terdiri dari hanya fragmen target.

Setelah 4 siklus, setengah dari fragmen terdiri dari hanya DNA target, dan

setengah dari fragmen juga mengandung DNA lain yang mengapit. Dengan setiap

siklus tambahan, jumlah salinan dari 4 ganda urutan target. Pada akhir siklus 25

ada lebih dari 33 juta salinan dari wilayah ini beruntai ganda.

Gambar 4. Tahapan kerja pada proses Polymerase Chain Reaction (PCR)Sumber : Konietzny, U dan Greiner R, 2003.

2.5. Transformasi gen pada Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.)

Berdasarkan Inpres No.1 tahun 2006 tentang penyediaan dan pemanfaatan

bahan bakar nabati/BBN (biofuel). Kendala yang dihadapi dalam pengembangan

jarak pagar perlu di atasi dengan inovasi baru seperti penggunaan klon unggul.

Untuk sekarang klon unggul daerah kering yaitu klon IP-2A, dimana klon ini

mempunyai potensi produksi 2 ton/ha pada tahun pertama dan diprediksi

mencapai 6-7 ton/ha di tahun ke-4 pada kondisi optimal . Umur panennya 4 bulan

setelah penanaman (Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2010).

Cara pengembangan klon unggul tersebut, salah satunya dengan

menggunakan transfer gen dengan bantuan vektor Agrobacterium

tumefaciens.Metode ini dapat digunakan untuk mengintroduksi sifat-sifat tertentu

(misal: ketahanan terhadap hama, penyakit, dan cekaman abiotik) ke dalam

genom tanaman yang produktivitasnya tinggi (Lindsey dan Jones, 1990).

Eksplan yang digunakan pada transformasi gen pada tanaman jarak ini antara

lain daun (Deore dan Johnson, 2008; Misra dan Toppo, 2011; Zoung, et al., 2010),

hipokotil (Misra dan Toppo, 2011) dan kotiledon (Li, et al., 2008; Pan, et al.,

2010).

2.6. Hipotesis

Berdasarkan latar belakang yang telah di kemukakan di atas maka penulis

merumuskan hipotesis :

1. jika Gen Acl yang dapat terimplikasi pada eksplan tanaman jarak pagar

(Jatropha curcas L.), maka dapat berpengaruh pada transformasi gen Acl

menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.

2. Penggunaan eksplant tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) juga

berpengaruh pada perlakuan transformasi Gen Acl menggunakan

Agrobacterium Tumefaciens.

BAB 3. METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan diLaboratorium Kultur Jaringan jurusan Budidaya

Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Jember pada bulan April sampai

dengan selesainya penelitian ini.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan antara lain : Benih Jarak IP 2A, Agrobacterium

Tumefaciens strain GV 3101, gen Acl dalam plasmid PbAcl, Media MS-Basaal

(Murashige Skoog), Vitamin, Hormon (IBA, BAP), air destilasi, alkhohol 70%,

etanol 70%, 20% Commercial bleach (5,25% Na2Cl), Sucrose, yeast extract,

Sodium Cholride (NaCl), Peptone, Glyserol, Antibiotik (Streptomycin,

Kanamycin, Rifampycin, dan Cefotaxime), acetosyringone, alumunium foil,

tissue, Kertas Saring, dan plastic wrap.

Alat – alat yang digunakan adalah timbangan analitik, magnetic stirrer, pH

meter, microwave, autoclave, Laminar Air Flow (LAF), Thermocyceler

equilibrated, spectrophotometer, sentrifuge, cawan petri, gelas ukur, botol kultur,

petridish, microtube, sentrifuge tube 50 ml, orbital shaker, micropipette.

3.3. Metode Pelaksanaan

3.3.1. Konfirmasi gen Acl pada Agrobacterium Tumefaciens::pBIAcl

3.3.1.1. Kultur Agrobacterium::pBIAcl

Agrobacterium yang telah mengandung gen Acl ditumbuhkan pada media

YEP padat dalam petridish dan disimpan pada suhu 40C.

3.3.1.2. Isolasi PBIAcl dari Agrobacterium::pBIAcl

Isolasi PBIAcl dari Agrobacterium dilakukan untuk memastikan

keberadaan gen Acl dalam Agrobacterium Tumefaciens. Plasmid diisolasi dari

Agrobacterium transforman dengan menggunakan metode miniprep (Li, J.F,

et.al., 2010).

Isolasi ini menggunakan Agrobacterium Tumefaciens strain GV 3101 yang

telah diinkubasi selama semalam dalam media YEP 3 ml pada suhu ± 280C.

Bakteri yang telah diinkubasi dipindah pada ependorf yang kemudian disentrifuge

12000 rpm selama 3 menit, ambil supernatant. Ependorf yang berisi pellet

ditambahkan dengan solution A sebanyak 150 µL.3 mL-1 dan RNAse 25 µL,

kemudian divortex hingga tercampur. Setelah itu, solution Bditambahkan

sebanyak 150 µL.3 mL-1 dan larutan digojog, kemudian disentrifuge 12000 rpm

selama 10 menit. Supernatan dipindahkan sebanyak 400 ml ke ependorf baru yang

telah berisi 750 µL solution D dan digojog kembali, silica matricditambahkan

sebanyak 200 µL. Setelah itu didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang.

Campuran disentrifuge selama 10 menit pada kecepatan 10.000 rpm dan

supernatant dibuang. Peletdicuci dengan 750 µL solution E dan vortex hingga

tercampur. Kemudian sentrifuge kembali campuran selama 10 menit pada

kecepatan 10.000 rpm dan supernatant dibuang. Kegiatan tersebut diulang dua 2

kali. kemudain pellet disentrifuge kembali selama 10 menit pada kecepatan

10.000 rpm dan supernatant dipindahkan menggunakan pipet untuk

membersihkan pellet dari supernatant dan disentrifuge kembali selama 10 detik

untuk membersihkan dari supernatant. Empat puluh µL sterile waterditambahkan

dan votex beberapa detik agar supernatant dapatdipisahkan dari pellet,didiamkan

selama 2 menit pada suhu 700C. Kemudian sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm

selama 2 menit dan cairan bening (supernatant) dipindahkan pada ependorf baru.

Dan siap untuk di lakukan pengujian elektroforesis. Dan dapat disimpan pada

suhu -40 C.

3.3.1.3. Analisis PCR dan Enzim retriksi pBIAcl

a. Analisis Enzim Retriksi pBIAcl

Plasmid yang didapatkan diuji menggunakan enzim retriksi pst I untuk

dapat diketahui keberadaan gen Acl pada Agrobacterium Tumefaciens::pBIAcl.

Adapun susunan bahan yang digunakan sebagai berikut :

Bahan Volume

plasmid 10 µL

Buffer H 1,5 µL

Air Sterile 2,0 µL

Enzim pst I 1,5 µL

25,0 µL

Keempat bahan tersebut di inkubasi pada suhu 37o C selama ± 3 jam.

3.3.1.3.2. Analisis PCR

Plasmid PBAcl hasil isolasi digunakan sebagai template untuk PCR

menggunakan kit dari Intro. Adapun susunan bahan untuk dipergunakan pada

proses PCR adalah sebagai berikut :

Reagen Volume

2 x PCR Master 12,5 µL

Template DNA (PBAcl) 1,0 µL

Primer forward 1,0 µL

Primer Reverse 1,0 µL

Akuasides sterile 9,5 µL

25,0 µL

Program untuk PCR adalah sebagai berikut :

1. Predenaturasi 940C selama 2 menit

2. Denaturasi 940C selama 10 detik

3. Annealing 580C selama 10 detik

4. Extension (Elongation) 720C selama 20 detik

5. Post-extension 720C selama 2 menit

Siklus tersebut diulang sebanyak 30 siklus.

Berikut merupakan primer untuk analisis PCR

Gambar 5. Konstruk Plasmid pBII121 sebelum diligasi dengan gen Acl (14758bp)

Gambar 6. Konstruk Plasmid pBII121 setelah diligasi dengan gen Acl menjadi

pBIAcl (13345bp)

3.3.2. Persiapan Agrobacterium Tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk transformasi di

inokulasi pada media YEP 3 ml yang mengandung Kanamycin 100 µg/ml dan

Streptomycin 50 µg/ml kemudian ditumbuhkan selama satu malam 200 rpm dengan

suhu 280 C. Setelah semalam, menginokulasi bakteri pada median YEP 3 ml

Bagian yang dibuang

kedalam media 100 ml yang mengandung antibiotic yang sama selama 5 – 6 jam

200 rpm pada suhu 280 C.

Setelah 5-6 jam bakteri di sentrifuge dengan kecepatan 20.000 rpm selama

10 menit pada suhu 100 C untuk didapatkan pelet. Setelah pelet didapatkan, pelet

disuspensikan dengan media MS cair untuk siap digunakan untuk proses

transformasi.

3.3.3. Persiapan Eksplant

Biji jarak Pagar (Jatropha curcas L.) yang digunakan yaitu varietas IP-2A

yang diperoleh dari Kebun Percobaan Balai Penelitian Tanaman Serat

(BALITTAS) Malang di Situbondo. Ekplan yang digunakan yaitu kotiledon jarak

pagar. Untuk mengambil prepary cotyledon, biji direndam pada air selama 1

malam dan diletakkan pada suhu ruang. Permukaan biji disterilisasi dengan

merendam didalam etanol 70% selama 15 menit. Kemudian buang kulit biji dan

rendam kernel kedalam air steril selama 1 – 2 jam. Setelah itu, kernel disterilisasi

dengan etanol 70% selama 30 detik dan bilas dengan air steril selama 1 menit

sebanyak 3 kali. Biji diperlakukan dengan merendam pada larutan 20% (v/v)

commercial bleach yang mengandung 5,25% Natrium hypoclorite) ditambah

dengan 0,1% tween 20 selama 10 menit dengan beberapa kali penggojogan.

Direndam pada air steril selama 1 menit sebanyak 4 kali. Kemudian dipisahkan

antara prepary cotyledon (Gambar 7).

Gambar 7. Bagian eksplan yang digunakan

3.3.4. Proses Transformasi Agrobacterium Tumefaciens Kedalam Tanaman

Prepary cotyledon diinfeksi dengan merendam pada suspensi

agrobacterium selama 20 menit ; 200 rpm pada suhu ruang. Eksplant yang

Pepary cotiledon

terinferksi disaring pada kertas saring steril yang kemudian di tanam pada media

MS- Jc1 (Media MS yang mengandung 3 mg/L 6-benzylaminopurine (BAP) dan

0,01 mg/L indole-3-butryc acid (IBA)) yang kemudian disimpan 3 hari dalam

keadaan gelap dengan suhu 26 ± 20 C. Setelah 3 hari, eksplan dicuci dengan

media MS-Jc1 cair (ditambah cefotaxime 200 mg/L) dan ditanam pada media

Callus Inducing Medium (CIM) yang mengandung media MS dengan 3 mg/L 6-

benzylaminopurine (BAP) dan 0,01 mg/L indole-3-butryc acid (IBA) dan antibiotic

cefotaxime 300 mg/L, disimpan selama 4 minggu dengan kondisi 12 jam terang dan

12 jam gelap suhu 260 C. Setelah 4 minggu, kalus disubkulturkan kedalam media

Shoot Inducing Medium (SIM) yang mengandung media ½ MS dengan 3 mg/L 6-

benzylaminopurine (BAP) dan 0,01 mg/L indole-3-butryc acid (IBA) dan antibiotic

Kanamycin 20 mg/L dan cefotaxime 100 mg/L, disimpan selama 4 – 5 minggu

dengan kondisi terang.

3.4.5. Isolasi DNA genomik tanaman hasil transformasi

Isolasi DNA genomik dari tanaman hasil transformasi dilakukan pada

beberapa tahapan, yaitu 0,2 – 0,5 gram jaringan daun digerus dalam nitrogen cair,

kemudian ditambahkan dengan 2,0 g PVP/ g daun. Hasil gerusan dipindahkan

dalam ependorf dan ditambahkan dengan 1,2 mL Extraction Buffer dan diinkubasi

pada suhu 550C ± 1 jam. Setelah itu, hasil inkubasi dsentrifuge pada kecepatan

12.000 rpm selama 15 menit, kemudian supenatan dipindahkan pada tabung baru

sebanyak 1,0 ml dan ditambahkan 1,0 ml chloroform : iso amyl alcohol (24:1) dan

diulang 3 kali. Selanjutnya isopropanol dingin ditambahkan sebanyak 0,7 kali

volume supernatant, kemudian dibolak balik beberapa kali hingga tampak DNA

melayang – layang dalam tabung. Tabung disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm

selama 10 menit dan supernatant dibuang. Pellet hasil sentrifuge dicuci dengan

70% etanol kemudian dikeringkan. Sepuluh mikro liter TE dan 10 µL RNAse

ditambahkan untuk melarutkan DNA. Kemudian diinkubasi dalam oven 370C ±

30 menit. Dan DNA genomic siap untuk dilakukan analisis elektroforesis.

3.4. Parameter Pengamatan

Analisis data yang digunakan secara deskriptif yang disajikan secara visual

dengan parameter sebagai berikut :

1. Perubahan morfologi yang terjadi pada eksplan disajikan secara

pengamatan visual dan disajikan berdasarkan prosentase

perkembangannya dengan parameter. Perkembangan eksplan yang tumbuh

pada media pertumbuhan dilakukan secara visual pada hari pertama pada

media co-cultivasi, hari ke -5 pada media seleksi dan hari ke 20 pada

media seleksi.

a. Prosentase eksplan tahan media seleksi merupakan prosentasi eksplan

yang tersisipi gen Acl sehingga dapat tahan terhadap antibiotic

kanamicyn dan cefotaxime pada media seleksi, dimana prosentase

tersebut dihitung dengan rumus :

Jumlah eksplan yang tahan pada med iaseleksijumlah eksplanawal

x 100%

a. Jumlah eksplan bertunas merupakan banyaknya ekplan yang mampu bertunas, dimana cara menghitung presentase eksplan bertunas dengan rumus :

Jumlah eksplan bertunasjumlaheksplan awal

x 100 %

b. Jumlah tunas per eksplan merupakan jumlah tunas tiap eksplan yang dapat dihitung dengan rumus :

Jumlah tunasjumlaheksplan bertunas

x 100 %

2. Amplifikasi (PCR) gen Acl dari tanaman transforman disajikan secara deskriptif melalui hasil elektroforesis. Penyajian hasil elektroforesis dengan cara gambar hasil, dimana gambar tersebut terdapat band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya.