ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI AEROB PENDEGRADASI SELULOSA

DARI SERASAH DAUN RUMPUT GAJAH (Pennisetum purpureum Schaum)

Kurniawan Sarju Ambriyanto

Pembimbing :

Dr. rer. nat. Ir. Maya Shovitri, M.Si., Nengah Dwianita Kuswytasari S.Si., M.Si.

Jurusan Biologi

Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Sepuluh Nopember

Surabaya 2010

Abstrak

Selulosa adalah polimer yang tersusun dari rantai monomer glukosa melalui ikatanβ(1→4). Rumput gajah (Pennisetum purpureum Schaum) mengandung 22% selulosa. Penelitian inibertujuan untuk mengisolasi, purifikasi dan karakterisasi bakteri aerob pendegradasi serasahselulosa dari daun rumput gajah dengan mengikuti kunci Determinasi Bergeys Manual. Padapenelitian ini diperoleh 5 isolat yang cenderung masuk ke 3 Genus yaitu Flavobacterium (PP 127-A dan PP 141-A), Lampropedia (PP 146-A), dan Halomonas (PP 79-D dan PP 91-A). Dari ujiHidrolysis Capacity (HC) dan degradsi in vivo (penurunan berat kering) maka diketahui bahwaisolat PP127-A adalah isolat yang memiliki ratio HC tertinggi dan penurunsn berat keringterbanyak, kemudian diikuti oleh isolat bakteri yang lain.

Kata kunci : bakteri pendegradasi selulosa, rumput gajah

PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang

Sellulosa adalah polimer karbohidratyang terbanyak yang terdapat di alam (Hanand Chen, 2007). Diperkirakan 50% daribiomassa adalah selulosa. Dipekirakanjumlahnya sekitar 50 milyar ton (Claassen, etal. 1999). Polimer alami seperti selulosabelum dimanfaatkan secara optimal,sedangkan jumlahnya di alam melimpah.

Rumput gajah (Pennisetumpurpureum Schaum) adalah tanamanyang dapat tumbuh di daerah denganminimal nutrisi. Rumput gajahmembutuhkan minimal atau tanpatambahan nutrient. Sehingga tanaman inidapat memperbaiki kondisi tanah yangrusak akibat erosi. Tanaman ini jugadapat hidup pada tanah kritis dimanatanaman lain relatif tidak dapat tumbuhdengan baik (Sanderson and Paul, 2008).Produktifitas rumput gajah adalah 40 ton

per hektar berat kering pada daerahberiklim subtropis dan 80 ton per hektarpada daerah beriklim tropis (Woodardand Prine, 1993). Total karbohidrat danserat kasar termasuk selulosa jumlahnyamasing-masing adalah 30,91% dan9,09% ( Okaraonye and Ikewuchi, 2009).

Mikroorganisme memiliki peranyang cukup besar dalam siklus berbagaiunsur seperti siklus karbon, nitrogen,fosfor, belerang dan unsur yang lain.Siklus selulosa merupakan bagian darisiklus karbon (Schlegel, 1994), karenaselulosa adalah polimer terbanyak ditanaman, maka hidrolisis selulosa adalahhal yang sangat penting dalam sikluskarbon (Zhang and Lynd, 2004). Selulosayang dihasilkan oleh tanaman ada yangmengalami degradasi olehmikroorganisme menjadi humus dan adayang didegradasi oleh hewan. Akhirnya

selulosa diubah menjadi CO2 dan masukke jalur fiksasi CO2 (Brock, 1994).

Peran mikroorganisme menjadipenting karena dapat menjagakeseimbangan unsur-unsur yang ada dialam (Schlegel, 1994). Bakteri selulotikditemukan di berbagai ekosistem.Contoh bakteri selulotik adalahCellumonas sp, celvibrio sp.,Microbispora bispora,Thermomonospora sp., Acentivibriocellulolyticus, Bacteriodes cellulosolvent,Bacteriodes succinogenes, Ruminococcusalbus, Ruminococcus flavefaciens danClostridium termocellum . Enzimselulosa dapat dihasilkan oleh berbagaibakteri dan fungi, aerob dan anerob,mesofil dan termofil. (Bhat and Bhat,1997).

1.2 Rumusan MasalahRumput gajah sebagain besar

dimanfaatkan sebagian bahan makananternak. Rumput gajah mempunyai potensiuntuk digunakan sebagai bahan bakubioenergi. Untuk dapat digunakan sebagaibahan baku bioenergi, polisakarida yangterdapat pada rumput gajah harus dihidrolisis.Untuk menghidrolisis polisakaridadiperlukan bantuan mikroorganisme.Masalah yang ingin dikaji dalam penelitianini adalah apakah bakteri selulosa dapatdiisolasi dan dipurifikasi dari seresah rumputgajah (Pennisetum purpureum Schaum)?

1.3 Batasan MasalahIsolasi dan purifikasi dilakukan

secara aerobik sehingga bakteripendegradasi selulosa yang diharapkanadalah bakteri aerob. Karakterisasi yangdilakukan sampai tingkat genus denganmenggunakan Bergeys Manual OfDeterminative Bacteriology 9th (Holt etal., 1994).

1.4 Tujuan PenelitianTujuannya adalah untuk

mengisolasi, purifikasi dan mengkarakterisasibakteri aerob pendegradasi sellulosa darirumput gajah.

1.5 ManfaatManfaat dari penelitian ini adalah

untuk mendapatkan isolat murni danmengetahui seberapa besar bakteri tersebutdapat mendegradasi selulosa.

TINJAUAN PUSTAKATanaman menghasilkan biomassa

melalui proses fotosintesis (Hatami et al.,2008). Bimassa tersusun secara unik yangmembedakan antara satu spesies denganspesies yang lain. Secara umum ada tigakelompok besar penyusun biomassa padatanaman yaitu selulosa, hemiselulosa danlignin. Ketiga kelompok senyawa inibiasanya ditemukan secara bersama-samadengan perbandingan tertentu yang unik yangdidasarkan atas spesies, umur tanaman ataubagian tanaman dan keadaan lingkungantempat tanaman itu hidup (Glazer andNikaido, 2007). Karena selulosa tidakditemukan dalam keadaan murni makakomplek yang antara selulosa denganhemiselulosa dan lignin disebut dengancellulosan. Cellulosan relatif lebih larutdibandingkan dengan selulosa (Hatami, et al.,2008). Karena dalam keadaan alami tidakaada dari tiga senyawa itu yang berada dalamkeaadan murni, hal ini yang menyebabkanproses degradasi biomassa menjadi lambat(Varnaite et al., 2008)

Dinding sel merupakan sel jaringanvaskuler pada tanaman tingkat tinggi (Glazerand Nikaido, 2007).Dinding sel tanamanadalah suatu struktur yang tersusun atasselulosa, hemiselulosa dan subtrat pektin,lignin dan protein struktural (Hatfield, 1993).Struktur ini berkaitan antara polimer yangsatu dengan polimer yang lain dengan ikatankovalen cross-link,, sehingga memberikankekuatan fisik (Chesson and Forsberg, 1988dalam Matsui et al, 1988; Glazer andNikaido, 2007). Selulosa, hemiselulosa danlignin yang kemudian membentuk apa yangdisebut dengan lignoselulosa. Beratkeringnya mencapai 90% dari sel tanaman.Hemiselulosa dan lignin saling terikatmelalui ikatan ester pada residu arabinosadari hemiselulosa dengan p-coumaric acidatau ferulic acid pada lignin. Ada banyakperbedaan komposisi secara strukturalpolisakarida terutama komposisihemiselulosa antara monokotil dan dikotil(Chesson and Forsberg, 1988 dalam H.

Matsui et al, 1988). Arabinosa adalahhemiselulosa yang terbanyak yang terdapatpada dinding sel monokotil, sedangkan xylanadalah hemiselulosa yang terbanyak padadikotil (Miron and Ben-Ghedalia, 1993dalam H. Matsui et al, 1998).

Degredasi dari senyawa organikkomplek alami (hemiselulisa dan selulosa)adalah masalah yang sangat penting.Jumlahnya yang berlimpah di alammengakibatkan polimer ini menyimpansebagian besar energi hasil fotosintesis yangdisimpan dalam bentuk ikatan kimia. Adasekitar 60% energi yang diperoleh darifotosintesis berada dalam bentuk senyawahemiselulosa dan selulosa (Varnaite et al.,2008)

Gambar 2.1 Struktur dinding sel tanaman(http://www.astbury.leeds.ac.uk/history/astbury18.htm)

2.1.1 SellulosaSelulosa adalah komponen

struktural yang banyak ditemukan padadinding sel tanaman terrestrial dan laut, jugadiproduksi oleh beberapa tanaman laut danbakteri. (Linder dan Teeri, 1997). Sellulosaadalah polisakarida yang mempunyai fungsisebagai unsur struktural pada dinding seltumbuhan tingkat tinggi. Sellulosa berbentukserabut, liat, tidak larut di dalam air, danditemukan terutama pada bagian berkayupada tumbuhan. Sellulosa adalah polisakaridaterbanyak yang ditemukan pada tanaman.

Sellulosa tersusun atas D-glukosayang terikat melalui ikatan β(1→4) (gambar 2.1a). Sellulosa adalah polimer yang tidakbercabang yang terdiri dari 100-14.000monosakarida atau lebih (Beguin and Aubert,1994 : Lehninger, 1982). Ikatan β(1→4) tidak dapat diputuskan oleh enzim α-amilase(Lehninger, 1982). Molekul-molekulsellulosa seluruhnya berbentuk linier, dimanasetiap molekul glukosa sebagai penyusunpolimer dapat berotasi hingga 180° (Brown,1996) dan mempunyai kecenderungan kuatmembentuk ikatan-ikatan hydrogen intra danintermolekul. Ikatan antar fibril ini yuangkemudian membentuk selulosa crystalline(Brown et al., 1996). Jadi berkas-berkasmolekul sellulosa membentuk agregatbersama-sama dalam bentuk mikrofibril.Mikrofibril mimiliki dimensi antara 3-4 nmpada tanaman tingkat tinggi hingga 20 nmpada Valonia macrophysa, dimana setiapmikrofibril terdiri dari beberapa rantaiselulosa. Mikrofibril ini memiliki oritentasiyang sangat besar untuk tersusun secarapararel (Beguin and Aubert, 1994).Mikrofibril ini pada tempat-tempat tertentumemiliki struktur yang teratur (crystalline)(gambar 2.1b) dan pada tempat-tempattertentu memiliki struktur yang kurangteratur (amorphous) (gambar 2.1b). Strukturamorphous terjadi karena prose kristalisasiyang tidak berlangsung sempurna padasemua mikrofibril yang terbentuk (Hon, 1994dalam Linder dan Teeri, 1997).

Mikrofibril membentuk fibril-fibrildan akhirnya serat-serat sellulosa. Struktursellulosa yang berserat dan terdapat ikatan-ikatan hidrogen yang kuat mengakibatkandapat tahan terhadap tarikan tinggi (Sjostrom,1995 ; Beguin and Aubert, 1994). Jumlahselulosa amorphous dan crystalline di alamsama banyak. Selulosa terakumulasi di alamkarena relatif resisten di dalam prosesdegradasi (proses degrdasi di alam berjalanlambat). Dimensi serat selulosa dan proporsidari bagian kristalin dan amorphous sangattergantung kepada keadaannya alami (jenis

tanaman dan umur tanaman)(Atalla, 1993 dalam Linder dan Teeri, 1997).Diperkirakan bahwa jumlah karbonterbanyak terdapat dalam bentuk selulosa danmayoritas terdapat di lingkungan teresrial(Levin et al., 2009). Karena itu material

selulotik berbeda menunjukkan propertyyang berbeda tergantung kepada sumberyang digunakan dan metode ekstrasi yangdilakukan, dan jumlah subtrat berbeda yangdigunakan dan jenis enzim selulotik yangdigunakan (Linder dan Teeri, 1997).

Bentuk selulosa kristalin yangsering ditemukan di alam adalah selulosa tipeI, dimana termasuk metastabil (i.e. it is notthe most thermodynamically favorable form),dimana secara alami tidak dapat diubahmenjadi selulosa kristalin tipe yang lain.Selulosa tipe I dapat diubah menjadi selulosatipe II dengan treatment denganmenggunakan alkali (Beguin and Aubert,1994). Selulosa kristalin tipe II adalahselulosa yang paling stabil yang diketahui.Selulosa tipe I mempunyai ikatan glukosidaparalel dan mempunyai ikatan hidrogenintramolekul yang kuat. Di alam ada dua tipeselulosa tipe I sebagai selulosa kristalin

suballomorphs yaitu tipe Iα dan Iβ.Perbedaan atara tipe Iα dan Iβ terletak padaperbedaan ikatan hidrogen antar rantaiselulosa, proporsi ikatan hidrogen dantergantung kepada sumbernya di alam(Beguin and Aubert, 1994).Selulosa tipe IIjarang ditemukan di alam, secara umumdapat dikatakan bahwa sebagai hasilrepresifitasi setelah proses swelling danpelarutan kembali selulosa tipe I. selainselulosa tipe I dan II juga terdapat selulosatipe III dan IV yang sangat jarang ditemukandi alam (Brown et al, 1996). Selain tanamanbakteri juga menghasilkan selulosa.

Gambar (2.2a) struktur serat selulosa, (2.2b)struktur selulosa teratur (kristalin) dankurang teratur (amorphous) (Beguin andAubert, 1994).

Berdasarkan pada sumber alamiselulosa dan pretreatment yang dilakukanmaka ratio kristalisasi dari selulosa berkisarantara 0% pada selulosa amorphous hinggamendekati 100% pada selulosa yang diisolasidari Valonia macrophysa (Beguin andAubert, 1994). Sellulosa adalah polimerkarbohidrat yang terbanyak yang terdapat dialam (Han and Chen, 2007). Diperkirakan50% dari biomassa adalah selulosa.Diperkirakan jumlahnya sekitar 50 milyar ton(Claassen, et al. 1999). Dari limbah padatyang dihasilkan dunia 40 % (w/w) adalahsalah satu sumber sellulosa. Penelitiandifokuskan bagaimana memanfaatkan limbahorganik (terutama sellulosa) menjadi energi.Penelitian-penelitian yang dilakukan diseluruh dunia tentang konversi selulosa

menjadi energi dapat dikembangkan menjadisektor komersial (Walker and Wilson, 1991).

Secara umum biomassa berbasiskanselulosa yang digunakan dalam produksietanol dapat dibagi menjadi enam kelompokyaitu :1. Residu atau limbah pertanian. Contoh:

cane bagase, corn stover, wheat straw,rice straw, rice hulls, barley straw,sweet sorgum bagase, olive stone andpulp.

2. Kayu keras. Contohnya: aspen danpoplar.

3. Kayu lunak. Contohnya: pine danspruce.

4. Limbah selulosa. Contohnya: kertasbekas, koran.

5. Biomassa herba. Contohnya: alfalfa hay,switchgrass, reed canary grass, coastalBermuda grass, thimoty grass.

6. Municipal solid waste (MSM) (Sun andCheng, 2002).

Konversi selulosa menjadi glukosarelatif membutuhkan biaya yang lebih besardibandingkan dengan konversi pati. Hal inidisebatkan karena struktur sekulosa lebihkomplek dibadingkan dengan struktur pati,sehingga dibutuhkan beberapa enzim untukdapat mendegradasi selulosa. Selain ituenzim pendegradasi selulosa membutuhkanmembutuhkan medium yang mengandungselulosa murni untuk mengoktimalkanproduksi enzim. Selain itu diketahui bahwaselulosa memiliki struktur yang beragam baikdilihat dari tingkat struktural atausupramelekulnya. Untuk meminimalkanbiaya produksi diperlukan pengembanganmetode konversi sellulosa menjadi glukosa.

Salah satu bidang yang sering dijadikan studidalam konversi sellulosa adalah mencarimikroorganisme yang dapat menghasilkanenzim yang lebih aktif dan efisien dalammengkonversi selulosa (Walker and Wilson,1991). Hal ini disebabkan karena adanyakeanekaragaman yang besar pada selulosayang terdapat di alam, sehingga ditemukanbanyak enzim selulase yang ditemukan. Halini berkaitan dengan kecocokan antarastruktur substrat dengan struktur enzim(Beguin and Aubert, 1994).

Setiap molekul selulosamengandung tiga tipe unit glukosa yaituglukosa dengan ujung yang tereduksi(reducing end), glukosa yang ujungnya tidaktereduksi (nonreducing end) dananhydroglucopyranose.. Unit monomeranhydroglucopyranose adalah molekulselulosa yang mengandung 3 gugus hidroksilprimer dan dua gugus hidroksil sekunder.Monomer nonreducing end mengandungempat gugus hidroksil dan monomerreducing end mengandung gugus hemiacetalpada penambahan tiga gugus hidriksil(Palonen, 2004).

2.1.2 LigninLignin adalah material organik

penyusun matrik dinding sel tanaman tingkattinggi (Spermatophyta), predominan padajaringan pengangkut (Glazer and Nikaido,2007). Lignin adalah termasuk penyusunsebagian besar biomassa atau yang lebihdikenal dengan lignoselulosa. Lignin adalahpolimer aromatik terbanyak di bumi danmerupakan penyebab utama degradasilignoselulosa menjadi lambat (Ahmed et al.,2001). Struktur lignin tidak seragam, ligninjuga terdapat bagian yang crystalline danamorphous. Lignin pada tanaman tingkattinggi tidak berbentuk crystalline (Palonen,2004). Struktur kimia pada lignin yangterdapat di alam dapat berubah pada kondisisuhu tinggi dan asam, seperti saat dilakukanperlakuan dengan menggunakan uap air.Pada saat dilakukan perlakuan denganmenggunakan suhu di atas 200°C, makalignin akan mengalami degradasi menjadisenyawa partikel dengan ukuran yang kecildan lepasnya ikatan dengan selulosa(Tanahashi et al., 1983 dalam Palonen,2004).

Untuk mempermudah dalammendegradasi lignoselulosa maka diperlukandelignifikasi. Delegnifikasi adalah suatuproses dalam menghilangkan lignin yangdilakukan dengan menggunakan bahan kimia(Ahmed et al., 2001). Namun kerena sudahditemukan mikroorganisme yang dapatmendegradasi lignin dengan cepat dan telahdisadari bahwa menggunakan bahan kimiadalam proses penghilangan lignin akanmengakibatkan limbah yang sangatberbahaya bagi lingkungan (Glazer andNikaido, 2007). Lignin tersusun oleh unityang disebut dengan lignol, yang terdiri dariaryl propanol yang tersusun pada senyawaaromatik dan tiga karbon rantai karbon.Lignol secara struktural sangat berhubungandengan asam amino phenylalanine dantyrosin. Lignol adalah derivat dari asamamino phenylalanine dan tyrosin. Ligninlebih bersifat hidrofobik dibandingkandengan selulosa dan hemiselulosa (Ahmed etal., 2001).

2.1.3 HemiselulosaHemiselulosa secara umum

diklasifikasikan berdasarkan residu gula padabackbone. Hemiselulosa dapatdikelompokkan menjadi xylan, mannans,galactans dan glucans. Hemiselulosaseringkali dilaporkan memiliki hubungansecara kimia atau cross-linked denganpolisakarida , protein atau lignin. Xylanmemiliki merupakan senyawa yangmempunyai hubungan terbanyak denganpolisakarida yang lain. Hemiselulosa lebihlarut dibandingkan dengan selulosa, dapatdiisolasi dengan melakukan ekstraksi denganmenggunakan alkali (Palonen, 2004),Softwood hemisellulosa mengandungglucomannan, galactoglucomannan,glucuronoxylan, dan arabinoglucunoxylansedangkan pada hardwood hemiselulosasebagian besar merupakan glucuronoxylan.Gambar di bawah ini adalah menjelaskanstruktur dari hemiselulosa (Glazer andNikaido, 2007).

Hemiselulosa adalah material yangberbeda dengan selulosa. Hemiselulosaadalah molekul bercabang yang hanyamemiliki 150-200 monomer (Mulcahy,1996). Hemiselulosa adalah polimer yangmirip dengan selulosa. Backbone (rangkautama) dari hemiselulosa adalah terbentuk

dari ikatan β 1,4-D-pyranosyl dari unitpenyususnnya. Jadi hemiselulosa secarastruktural homologenus dengan selulosa.Dimana selulosa adalah polimer homolineardengan sedikit modifikasi antara molekulyang satu dengan yang lain. Hemiselulosamempunyai banyak cabang, secara umumdapat dikatakan bahwa hemiseluloasamerupakan polimer noncrystallineheteropolysaccharides. Komponen yangmenyusun hemiselulosa adalah gula pentosa (D-xylose, L-arabinose ), gula hekosa ( D-galactose, L-galactose, D-mannose, L-rhamnose, L-fucose ) dan asam uronik (L-glucomonic acid ) (Glazer and Nikaido,2007).

Hemiselulosa adalah polimerpolisakarida yang komplek, komposisi danfrekuensinya tergantung kepada jenisjaringan tanaman, jenis spesies dan tahapanpertumbuhan pada tanaman. Hemiselulosajuga merupakan penyusun utama dinding seltanaman. Hemiselulosa ditemukan denganproporsi yang berbeda-beda pada lemelatengah, dan dinding sel sekunder tanaman.Hemiselulosa tidak hanya ditemukan berupaxylan, namun juga ditemukan dalam jumlahyang banyak berupa glucomannans,galactomannans, arabinogalactans dansenyawa yang lain (Mulcahy, 1996).

Kerena secara strukturalhemiselulosa dan selulosa homologenusditambah dengan adanya kemiripan nama,maka seringkali hemiselulosa diangggapsebagai produk intermediet dalam biosintesisdari selulosa. Namun sekarang jalurbiosintesis dari hemiselulosa telah diketahui.Dan diketahui bahwa jalur biosintesishemiselulosa berbeda dengan selulosa. Danjuga telah diketahui bahwa penyusunhemiselulosa berbeda dengan selulosa(Mulcahy, 1996).

2.2 Metode Menghitung Kadar SelulosaBerikut ini adalah metode untuk

mengukur kandungan selulosa dan ligninberdasarkan metode Chesson yangdikemukakan oleh Datta (1981):1. Satu g sampel kering (berat a)

ditambahkan 150 mL H2O atau alkohol-benzene dan direfluk pada suhu 100°Cdengan water bath selama 1 jam.

2. Hasilnya disaring, residu dicuci denganair panas 300 mL.

3. Residu kemudian dikeringkan denganoven sampai beratnya konstan dankemudian ditimbang (berat b).

4. Residu ditambah 150 mL H2SO4 1 N,kemudian direfluk dengan water bathselama 1 jam pada suhu 100°C.

5. Hasilnya disaring dan dicuci sampainetral (300 mL) dan residunyadikeringkan hingga beratnya konstan.Berat ditimbang (berat c).

6. Residu kering ditambahkan 100 mLH2SO4 72% dan direndam pada suhukamar selama 4 jam.

7. Ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N dandirefluk pada suhu 100oC dengan waterbath selama 1 jam pada pendingin balik.

8. Residu disaring dan dicuci dengan H2Osampai netral (400 mL).

9. Residu kemudian dipanaskan denganoven dengan suhu 105oC sampaiberatnya konstant dan ditimbang (beratd).

10. Selanjutnya residu diabukan danditimbang (berat e)

Perhitungan kadar selulosa dan kadar ligninmenggunakan rumus berikut ini:Kadar selulosa = (c-d)/a x 100%Kadar lignin = (d-e)/a x 100%http://www.biomassmagazine.com/images/upload/20080403103622.jpg

2.3 Degradasi BiomassaDalam mendegradasi biomassa

melalui mekanisme biologis, dalam hal inikonteknya adalah mendegradasi biomassadengan bantuan mikroorganisme. Degradasimelalui enzimatis menjadi sesuatu yangsangat penting. Enzim menjadi alat yangsangat penting dalam proses degradasi, halini terjadi karena enzim dapat mengkatalisisreaksi pada kondisi yang normal (Ahmed etal., 2001).

Laju degradasi juga dipengaruhioleh keadaan lingkungan pada saat prosesdegradasi. Faktor-faktor yang mempengaruhiantara lain adalah kandungan zat yangdibutuhkan oleh mikroorganisme terutamayang esensial yang digunakan baik pada saatpertumbuhan mikroorganisme ataupembentukan enzim. Faktor lain yangmempengaruhi adalah pH dan suhu optimumyang mempengaruhi pertumbuhanmikroorganisme dan aktifitas enzim selulase.Adanya produk metabolit baik primer atau

sekunder yang dapat mempengaruhi kerjaenzim dalam mendegradasi selulosa. Adanyaselobiosa dalam jumlah banyak jugamempengruhi kerja enzim. Hal ini karenaselobiosa adalah inhibitor terkuat dalamproses degradasi (Ahmed et al., 2001).

2.3.1 Degradasi SelulosaPada degradasi material

lignoselulosa dengan kadar selulosa yangtinggi sehingga bisa dikatakan selulosa murni(dihasilkan oleh tanaman kapuk), dengankadar lignin yang sangat sedikit saja prosesdegradasi tidak dapat dilakukan denganmemasukkan selulosa ke dalam selmikroorganisme. Hal ini terjadi kerenaukuran selulosa yang cukup besar. Sehinggastrategi yang dilakukan oleh mikroorganismeadalah dengan mengsekresikan enzimselulase. Hal ini dapat dilihat ketikamelakukan isolasi protein yang terdapat padatanah dan proses pengomposan, enzimselulase adalah komponen utama dari proteinyang ditemukan (Ahmed et al., 2001).

Untuk mengopimalkanmetabolisme bakteri pendegradasi selulosapada keadaan minimal nutrient, setiap bakterimempunyai strategi yang berbeda-bedatergantung pada karakteristik bakteri tersebut(Jescu, 1995). Besar hasil akhir yangdiperoleh pada proses degradasi tergantungkepada beberapa faktor yaitu pH, aksesterhadap karbon (kecocokan konformasienzim dengan subtrat), reaksi redok yangterjadi, konsentrasi produk. Dan untukmengoktimalkan hasil yang diperoleh makadiperlukan pengetahun tentang genetikamikroorganisme yang digunakan, enzimatik,dan termodinamika dalam mekanisme alirankarbon (carbon flow). Detail pengetahuanmengenai hubungan antara genome content,gen dan produk ekpresi gen, pathwayutilization, dan hasil akhir yang diperolehakan sangat penting untuk diketahui dalamdegradasi selulosa (Levin et al, 2009).Karena selulosa di alam yang bersifatberukuran besar dan tidak larut maka enzimselulase memerlukan perlakuan yang khususdalam mendegradsi selulosa. Karena substratyang tidak dapat terdifusi ke dalam enzim,maka enzim selulase harus menjadi lebihaktif dan mendefusi ke dalam substrat(Mattinen, 1998).

Bakteri selulotik dapat bekerja padavariasi keadaan lingkungan yang berbeda-beda dalam mendegradasi seresah daun padatanah (Beguin and Aubert, 1994; Denman etal., 1996 dalam Linder dan Teeri, 1997).Mikroba ini dapat mendegradasi melekulkomplek, keadaan dimana subtrat tidak larutdalam air dengan menggunakan berbagaienzim melalui berbagai cara didalammemutuskan bagian yang berbeda di dalamsubstrat. Efisiensi degradasi kayu denganmenggunakan mikorganisme sepeti fungifilamentus, merupakan tipe yangmengsekresikan dan mengsinergikan aksienzim selulase dimana bakteri menggunakankomplek enzim (cellulosome) yang bekerjapada permukaan substrat (Tomme et al.,1995; Bayer et al., 1996 dalam Linder danTeeri, 1997). Hal ini juga terjadi pada fungianaerob dimana memiliki komplek seperticellulosome dengan ukuran yang lebih besar(Fanutti et al., 1995; Denman et al., 1996;Dijkerman et al., 1996 dalam Linder danTeeri, 1997). Kedua tipe enzim dapatmelepaskan ikatan β-1,4-glukosida denganmenggunakan enzim endo atau exoglukonaseyang spesifik yang didasarkan atas topologidari sisi aktif. Keberadaan nitrogen sangatmempengaruhi laju degradasi yang terjadi.Umumnya degradasi selulosa terjadi pada pHnormal (Hatami et al., 2008).

Pada degradasi selulosa yangdilakukan oleh fungi, fungi melepaskansistem enzim selulase yang terdiri daribeberapa exo- dan endoselulase, dan satuatau dua β-glukosidase. Banyaknyakomponen sistem enzim yang dilepaskantergantung kepada fungi itu sendiri. Hal iniseperti yang ditunjukkan oleh Trichodermareesei yang melepaskan enzim komplit saatmendegradasi crystalline selulosa. Sistemenzim selulotik mengandung duacellobiohydrolases (CBH I dan CBH II),setidaknya empat endoglukanase (EG I, EGII, EG III dan EG IV) dan satu β-glukosidase(Mattinen, 1998).

Sistem enzim selulase adalah lebihsulit dibandingkan dengan sistem enzimselulase fungi dan hanya sedikit yang barudiketahui dari sistem enzim selulase bakteri.Enzim selulase yang dihasilkan olehCellulomonas fimi adalah yang paling seringdilakukan studi. Beberapa bekteri terutamabakteri anaerob menghasilkan komplek multi

enzim yang berukuran besar yang dikenaldengan cellulosome. Contoh bakteri yangmemiliki cellulosome adalah Clostridiumthermocellum (Mattinen, 1998).

Pada degradasi selulosa murni lajudegradasi terjadi penurunan yang sangatbesar. Penurunan ini disebabkan kerenaadanya inhibitor yang sangat banyak jikadibandingkan pada degradasi lignoselulosa.Selobiosa adalah inhibitor utama dalamdegradasi selulosa, oleh karena itu kehadiranenzim β-glukosidase menjadi sangat pentingdalam degradasi selulosa. Hal ini karenasetelah selobiosa diubah menjadi glulosa

maka laju degradasi menjadi jauh lebih cepat.Hasil akhir pada degradasi lignoselulosatergantung kepada tipe bahan mentah yangdigunakan. Pada berbagai penelitian yangdilakukan secra intensif dilakukan makadiketahui bahwa tidak ada faktor yang palingsignifikan pada laju hidrolisis pada materiallignoselulosa yang berbeda. Secara umumdapat dikatakan bahwa faktor pembatasdegradasi selulosa dapat dikelompokkanmenjadi dua yaitu struktur dari substrat(Tabel 2.1), dan mekanisme dan interkasienzim selulase.

Tabel 2.1 Struktural selulosa yang berpotensimenghambat pada hidrolisis dari seratselulosa pada beberapa level struktural(Mansfields et al., 1999 dalam Palonen,2004)Level struktur Faktor substrat

Microfibril

Degree of polymerization(DP)

CrystallinityCellulose lattice structure (I,

II, III, atau IV)

Fibril

Komposisi struktural(kandungan lignin,hemiselulosa danpersebarannya)

Particle size (fibrildimension )

FiberLuas permukaan

Degree of fibrer swellingStruktur pori dan distribusi

Akses enzim selulase terhadapselulosa pada lignoselulosa menjadi yangpenting dalam degradasi selulosa. Selulosamemiliki akses baik eksternal (dipengaruhioleh bentuk dan ukuran paticle) dan internal(struktur kapiler pada fibers). Padalignoselulosa yang tidak dilakukanpretreatment hanya sedikit pori yang dapatdigunakan sebagai akses enzim selulaseterhadap sustrat (Palonen, 2004). Padapretreatment yang dilakuan untukmenghilangkan hemiselulosa menunjukanterjadi peningkatan pori dan terdapatpermukaan spesifik. Hasil hidrolisisberkaitan dengan volume pori yangdigunakan dalam akses enzim selulase(Grethlein, 1985 dalam Palonen, 2004). Padabeberapa penelitian diketahui bahwapengeringan lignoselulosa menurunkan

kapileritas sel dan menurunkan pori sehinggamenurunkan efektifitas enzim selulase(Esteghlalian et al., 2001 dalam Palonen,2004). Kandungan lignin dalam lignoselulosadan persebarannya mempengaruhi degradasiselulosa (Palonen, 2004)

Kemampuan degradasi selulosaoleh bakteri berbeda dengan kemampuandegradasi fungi dalam mendegradasiselulosa. Bakteri memiliki kecenderunganuntuk mendegradasi selulosa crystallinedibandingkan dengan sisi a amorphous, dankemampuan ini dimiliki oleh hampir semuabakteri pendegradasi selulosa baik secaraaerob atau anaerob. Namun karena selulosacrystalline tidak dapat didegradasi olehenzim selulase tunggal karena sifat selulosacrystalline yang rigrid, maka didugadegradasi selulosa crystalline dilakukan lebihdari satu enzim (Mulcahy, 1996). Sedangkanfungi memiliki kecenderungan untukmendegrdasi selulosa pada sisi amorphousdibandingkan dengan sisi crystalline.Ektrasellular endo- dan exoglucanasediproduksi oleh berbagai bakteri. Secaraumum struktur enzim selulase bakterimemiliki kesamaaan dengan yang dhasilkanfungi. Bakteri mensekresikan enzim selulasesebagai enzim ekstraselluler yang bersifatsoluble atau pada keadaan anaerobikmembentuk komplek yang disebut dengancellulosome yang menempel denganpermukaan sel bakteri . Cellulosomenampaknya mampu mendegradasi tidakhanya selulosa saja, namun semua jenispolisakarida termasuk berbagai jenishemisellulosa seperti xylanases, mannanases,arabinofuranosides, and pectin lyases(Glazer and Nikaido, 2007).

2.3.2 Degradasi LigninBakteri hanya dapat sedikit

mengdegradasi lignin saat terdapat oksigendan tidak ada satu pun bakteri yang dapatmendegradasi lignin dalam keadaan anaerob(Glazer and Nikaido, 2007). Degradasi ligninmemerlukan adanya oksigen. Degradasilignin adalah proses yang sederhana namuntidak terjadi pada pada beberapa lingkunganalami. Sebagai contoh bahwa tanaman yangtelah mati ratusan tahun yang lalu masihsering ditemukan dalam timbunan tanah. Halini utamanya terjadi karena tidak terdapatoksigen. Pada lingkungan dengan keadaanasam maka proses degradasi tidak terjadi.Belum diketahui bahwa jika pH lingkungansedikit asam dan keaadaannya anaerobikapakah proses degradasi akan terjadi, namundiduga bahwa degradasi jika terjadi akanberlangsung sangat lama (Kirk and Farrell,1987 dalam Ahamed et al., 2001).

Degradasi lignin mungkin sajaterjadi dan dilakukan oleh bakteri, namuntidak ada satupun yang dapat diisolasi danditumbuhkan pada laboratorium. Banyakfilamentous bakteri (Actinomycetes) dapatmendegradasi lignin. Actinomycetes tidakdapat mengubah lignin menjadi CO2, tidakdapat melakukan mineralisasi terhadaplignin. Hanya Basidiomycetes (white rotfungi) yang dapat melakukan meniralisasiterhadap lignin. Pada saat terjadi mineralisasiterhadap lignin yang terdapat pada kayu ataudaun maka terjadi bleaching (perubahanwarna menjadi putih pucat) (Ahamed et al.,2001).

Degradasi lignin hanya dapatdilakukan oleh white rot fungus. Kemampuanfungi ini untuk mendegradasi lignin adalahcukup besar. Hal ini dapat dilihat padakemampuan Phanerochaete chrysospirumhingga 3 gram lignin setiap hari. Degradasiini terjadi optimum pada suhu 40°C dengantriggernya adalah pembatasan nitrogen.Proses degradasi ini dilakukan denganmelepaskan lignin peroxidase. Selain itu P.chrysosporium juga dapat mendegradasilignin dengan melepaskan manganese-dependent peroxidase. Sampai saat ini dapatdiisolasi 10 isoenzim dari lignin peroxidasedan lima manganese-dependent peroxidase.Jadi ini bisa memberikan bukti bahwa adakeragaman biokimia yang memungkinkan

adanya keberagaman kondisi optimumtumbuh dengan berbagai kondisi lingkunganseperti temperature, pH, dan kekuatan ionik.Enzim ini mirip tetapi tidak identik dimanatiap enzim dapat mendegradasi suatu strukturpolimer yang berbeda dalam satu tanaman,dimana hal ini tergantung kepada strukturkimia, keadaan fisik atau akses (Glazer andNikaido, 2007).

Degradasi lignin memerlukanhidrogenperoksidase. Hidrogen peroksidasediproduksi oleh white rot fungus dandisekresikan untuk mengaktifkan ligninperoxidase dan manganese-dependentperoxidase dalam proses mendegradasilignin. Pada proses degradasi melalui ligninperoksidase diperlukan kondisi asam untukmenciptakan kondisi yang optimum padaproses degradasi dengan menggunakan reaksioksidasi. Lignin peroksidase mengkatalisispembukaan ikatan pada sisi arylpropane,ikatan pada ether, pembukaan ikatan siklikaromatik dan hydroxylation. Kesuksesandegradasi lignin tergantung kepadapenyerangan komponen nonfenol danfenollignin. Ektraselluler Mn (II)-dependentperoxidase dalam mengoksidasi komponenfenol lignin. Fenol lignin tidak dapatdidegradsi oleh lignin peroxsidase, sepertiveratryl alcohol, atau model nonfenol yangmerupakan subtruktur dari lignin. Mn (II)-dependent peroxidase dan H2O2 diperlukanuntuk mengaktifkan isoenzim yangdigunakan dalam degradasi lignin. Quinonmerupakan produk yang dihasilkan dariproses degradasi melalui peroksidase.Sehingga diperlukan adanya quinonreduktase baik intraselluler dan extraselluler.Ektraselluler cellobiosa-quinonoksidureduktase hanya akan aktif jikaterdapat selulosa. Enzim ini menggunakancellobiosa sebagai donor hydrogen untukmereduksi quinon menjadi hidroquinon.Intraselluler quinon reduktase menggunakanNAD(P)H sebagai kofaktor. Fungi dapatmenggunakan hidroquinon dalammetabolismenya. Jadi dapat dikatakan bahwafungsi dari quinon reduktase adalahmengubah produk dari degradasi ligninsehingga dapat digunakan dalamrepolimerasi.Berikut merupakan skemaproses degradasi lignin (Glazer and Nikaido,2007).

Lignifikasi dan struktur selulosayang tersusun dengan baik pada polisakarida,termasuk kristalisasi pada selulosa yangterdapat pada dinding sel tanamanmengakibatkan proses degradassi menjaditerhambat (Chesson and Fosberg, 1988dalam Matsui et al., 1998). Lignifikasiadalah proses yang mana penambahanmelekul lignin memenuhi ruang kosong padafibril selulosa dan hemiselulosa sertamembentuk ikatan diantaranya pada dindingsel (Glazer and Nikaido, 2007). Padapenelitian yang dilakukan oleh Benoit et al.,(1992), diketahui bahwa bakteri yang mampumendegradasi berbagai macam jenis selulosamurni (sumber selulosa) termasuk selulosadengan tingkat kristalisasi yang tinggi (highcristalin) hingga 60-80% hanya dapatmendegradasi lignoselulosa seperti koransebesar 15% dan majalah sebesar 35 %. Padapenelitian yang dilakukan oleh Sharma andHobson (1986) dalam Cailliez et al., (1993)diketahui bahwa proses degradasilignoselulosa lebih tergantung kepadakandungan lignin yang terdapat pada materialselulotik tersebut dibandingkan dengankristalitas suatu material selulotik.

Softwood mengandung lignin yanglebih banyak dibandingkan denganhardwood. Hemiselulosa tertinggi terdapatpada rumput-rumputan. Perbandingankandungan dari selulosa, lignin danhemiselulosa pada softwood, hardwood danrumput terdapat pada Tabel 2.2. Karenakadar hemiselulosa yang besar maka prosesdegradasi selulosa pada rumput-rumputanrelatif menjadi lebih sulit.Tabel 2.2 Persentase perbandingan lignoselulosa(Glazer and Nikaido, 2007)

Jenistanaman

Lignin Selulosa Hemiselulosa

Rumput-rumputan

10-30 25-40 25-50

Softwood 25-35 45-50 25-35Hardwood 18-25 45-55 24-50

2.3.3 Degradasi HemiselulosaSeperti selulosa, hemiselulosa juga

merupaka bagian dari penyusun sebagianbesar biomassa dan juga diperlukan enzimhidrolitik untuk memutuskan ikatan. Namundiperlukan 24 enzim untuk mendegradasiseluruh hemiselulosa (Srinivasan, 1992).Namun enzim yang paling dikenal adalah

xylanase yang terdiri dari endoxylanases(1,4-β-D-xylan xylanohydrolases, EC3.2.1.8) dan xylosidases yang merupakanenzim pendegradasi xylan (senyawahemiselulosa yang terbanyak) (Moracci etal., 2000). Selain enzim pendegradasi xylanadalah enzim yang juga penting dalamdegradasi hemiselulosa adalahendomannanases (1,4-β-D-mannanmannanohydrolase, EC 3.2.1.78) yangmendegradasi glucomannan. Enzim yangdigunakan dalam mendegradasi oligomerberantai pendek yang dihasilkan oleh enzimendo pada degradasi hemiselulosa adalah β-xylosidase (1,4-β-D-xyloside xylohydrolaseEC 3.2.1.37), β-mannoside (1,4-β-D-manoside mannohydrolase EC 3.1.1.25) danβ-glukosidase (EC 3.2.21), enzim ini akanmemutuskan ikatan oligosakarida pada sisi βpada xylan dan mannans. Sedangkan untukikatan α pada sisi α oligomer maka ikatanakan diputus dengan menggunakn enzimdiantaranya adalah α-glucoronidase (EC3.2.1.139), α-arabinosidase (α-L-arabinofuranoside arabinofuranohydrolase,EC 3.2.1.55) dan α-D-galactosidase (α-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.22).Gugus acetyl pada hemiselulase akandipindahkan melalui enzim esterase (EC3.1.1.72) (Palonen, 2004)..

Degradasi hemiselulosa adalahproses yang komplek karena tipe enzim yangdihasilkan adalah multiple isoenzymes(enzim yang mempunyai fungsi katalitikyang sama namun memiliki lebih dari satukarakteristik physical yang membendakanantara komponen yang satu dengankomponen yang lain seperti pH optimum),beberapa mempunyai Cellulose BindingDomain (CBD), beberapa menghasilkanmulti domain protein yang salah satudomainya dapat mendegradasi selulosa.Produksi enzim xylanase lebih dipengaruhioleh adanya selulosa dibandingkan denganxylan. Penjelasan mengenai hal ini belumdiketahui sampai saat ini (Ahmed et al.,2001).

Dalam menghidrolisis hemiselulosadiperlukan sinergi dari banyak untukmemutuskan ikatan glikosida pada poly- atauoligosakarida. Tiap-tiap enzim akan bekerjasecara spesifik memustuskan ikatan kimiadalam mendegradasi hemiselulosa Cazemieret al., (1997) dalam Zverlova et al. (2003)

enzim pendegradasi lignin tidak ditemukandalam keadaan anaerob Guo et al., (2001)dalam Zverlova et al. (2003).

2.4 Derivat SelulosaSelulosa memiliki banyak derivat

yang dimanfaatkan di berbagai bidangkehidupan. Derivat selulosa dilakukandengan melakukan modifikasi selulosa murniyang diisolasi. Derivat selulos yang seringdigunakan dalam isolasi bakteri pendegradasiselulosa adalah Hydroxyethylcellulose (HEcellulose) dan Carboxymethylcellulose(CMC) (Klemm et al., 1998).Carboxymethylation polisakarida adalahsuatu bidang penelitian yang diminati danbanyak dilakukan. Hal ini kerena metode iniadalah metode yang mudah dilakukan danhasil yang diperoleh banyak digunakan untukberbagai bidang kehidupan. Secara umumdapat dikatakan bahwa metode yang

dilakukan adalah dengan menggunakanlarutan alkali hydroxide (umunya adalahNaCl) pada polisakarida sehingga adapenggantian gugus hidroksi yang terdapatpada polisarida. Jadi Carboxymethylationtidak terjadi hanya pada selulosa dan patinamun pada polisakarida yang lain (Heinze,2005).

Carboxymethylcellulose (CMC)pertama kali ditemukan pada tahun 1918 dandiproduksi secara masal pertama kali padaawal 1920 oleh IG Farbenindustrie AG diJerman. Namun hingga sekarang peningkatanteknologi yang digunakan dalam produksimasih diperbaiki, peningkatan kualitasproduk, dan efisiensi dalam melakukanproduksi (Heinze, 2005). Saat ini terdapatberbagai jenis kualitas CMC yangdigolongkan berdasarkan kandungan padaCMC seperti yang tersaji pada Tabel 2. 3.

Tabel 2.3 Pembagian CMC berdasarkan kualitas dan pemanfaatannya (Heinze, 2005)Kelompok kualitas

dari CMCContoh penggunaan Kandungan CMC (%) Kandungan garam (%)

TechnicalDitergents, mining

flotation< 75 > 25

Semi-purifedOil and gas drilling

muds75-85 15-25

Purired

Paper coating, textilesizing and printing,ceramic glazing, oil

drilling muds

> 98 < 2

Extra purifiedFood, toothpate,pharmaceuticals

> 99,5 < 0.5

Pada CMC ada 2 istilah yang seringdigunakan yaitu Degree of Polimeritation(DP) dan Degree of Substitution (DS). DPmenunjukkan seberapa panjang atau berapamonomer penyusun suatu rantai CMC.Sedangkan DS menunjukkan seberapabanyak gugus hidroksi pada selulosa yangdiganti dengan gugus lainya setiap 100 AGU(anhydroglucopyranose unit(s)), range dariDS adalah 0-3. Semakin rendah DS makaakan semakin mudah mikroorganismemendegradasi CMC tersebut. Sehinggasemakin tinggi DS maka aktifitas enzimhidrolisis seperti enzim selulase akanmenunjukkan hasil yang semakin rendah. Halini karena semakin tinggi DS maka terjadiresistensi CMC terhadap enzimselulase.Namun DS yang terlalu rendah (0,4

dan 0,7) tidak efektif digunakan sebagaiCMC, sehingga disarankan menggunakanCMC dengan DS 0,9 terutama padapengukuran aktifitas enzim selulase padabakteri (Hankin and Anagnostakis, 1977).Disarankan untuk menggunakan CMCdengan DS 1,2 untuk mendeteksi enzimselulase yang dihasilkan olehmikroorganisme yang diisolasi dari tanah danair selokan (Hankin et al., 1974; Hankin andSands, 1974 dalam Hankin andAnagnostakis, 1977). CMC dengan DS 0,4baik digunakan untuk mendeteksi enzimselulase pada beberapa fungi yang tidakdapat efektif mendegradasi CMC dengan DS0,9. CMC dengan DS 0,9 dapat digunkanuntuk mendeteksi secara efektif enzimselulase pada semua mikroorganisme. Tidak

ada perbedaan yang nyata antara lajudegradasi CMC pada media padat denganmedia cair (Hankin and Anagnostakis, 1977).Hal ini dapat diduga karena enzim selulasedisekresikan pada lingkungan sekitar yangmengandung selulosa.

2.5 Mikroorganisme PendegradasiSelulosa (Bakteri Selulotik)

Bakteri pendegradasi karbohidratsering diisolasi dari tanah yang mengandungseresah daun. Hal ini disebabkan karenatanah mengandung bahan organik yangrelatif kaya dan terdapat seresah daunmengandung polisakarida yang relatifkomplek. Kondisi tersebut menyebabkantanah dan seresah daun menjadi habitat yangbaik untuk berbagai mikroorganisme(William and Govind, 2003). Pada penelitianyang dilakukan oleh Hatami et al., (2008)diketahui bahwa jumlah bakteri yang berhasildiisolasi pada tanah hutan lebih banyakdibandingkan dengan yang berhasil diisolasipada lahan pertanian. Dari total bakteri yangberhasil diisolasi juga diketahui bahwajumlah total isolat bakteri pendegradasiselulosa lebih banyak dibandingkan denganyang diisolasi dari lahan pertanian. Hal initerjadi karena terdapat perbedaan materialorganik yang terdapat pada hutan dan lahanpertanian. Hutan memiliki keanekaragamanmaterial organik yang lebih tinggidibandingkan dengan lahan pertanian.

Pada penelitian yang dilakukanoleh Hatami et al., (2008) diketahui bahwarata-rata pada ratio Hydrolisys Capacity (HC)isolat yang diisolasi pada lahan pertanianlebih besar dibandingkan dengan ratio HCyang diisolat pada hutan. Ratio HC yangdiperoleh pada hutan adalah 1,6 sedangkanpada lahan pertanian ratio HCnya adalah 2.1.Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteripendegradasi selulosa pada lahan pertanianmemiliki potensi yang lebih besardibandingkan dengan isolat bakteri yangdiperoleh pada hutan untuk digunakan dalammendegradasi material selulosa.

Sellulosa adalah polimerkarbohidrat yang terbanyak yang terdapat dialam (Han and Chen, 2007). Oleh karena itumikroorganisme pendegradasi selulosaditemukan di berbagai ekosistem. Enzimselulosa dapat dihasilkan oleh berbagaibakteri dan fungi, aerob dan anerob, mesofil

dan termofil. Fungi aerob yang dapatmendegradasi selulosa diantaranya adalahTrichoderma viride, Trichoderma reesi,Penicillium pinophilum, Sporotrichumpulvelentum, Fusarium solani, Tolaromycesemersonii, dan Trichoderma koningii. Hanyasedikit mikroorganisme yang digolongkan kedalam kelompok seperti fungi termofilikaerobik ( Sporotrichum thermophile,Thermoascus aurantiacus, Chetomiumthermophile, Humicola insolens), fungimesofil anaerobik (Neocallimastix frontalis,Piromonas communis, Sphaeromonascommunis), bakteri mesofilik dan termofilikaerobik (Cellumonas sp, celvibrio sp,Microbispora bispora, Thermomonosporasp),bakteri mesofilik dan termofilikanaerobik (Acentivibrio cellulolyticus,Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodessuccinogenes, Ruminococcus albus,Ruminococcus flavefaciens dan Clostridiumtermocellum). Bakteri pendegradasi selulosatermofil dapat menghasilkan enzim selulaseyang relatif stabil (tahan pada kondisi asamatau basa dan pada suhu tinggi hingga 90°C)(Bhat, and Bhat, 1997).

Organisme dapat mendegradasiselulosa dan menjadikan selulosa sebagaisumber karbon tunggal yang secara ekologimenjadi sangat penting, dan sebagian besarproses degradasi selulosa terjadi dalamkeadaan aerob. Hanya 5-10% degrdasi yangberlansung secara anaerob. Bakteri selulotikyang ditemukan terdapat pada filumThermotogae, Proteobacteria,Actinobacteria, Spirochaetes, Firmicutes,Fibrobacteres and Bacteroides. Diperkirakan80% isolat yang diperoleh ditemukan padafilum Firmicutes dan Actinobacteria danmayoritas bakteri pendegradasi selulotikGram positif masuk ke dalam kelasClostridia dan genus Clostridium yangtermasuk ke dalam Filum Firmicutes (Levinet al., 2009).

Simbiosis antara hewan(ruminansia) dan mikroorganisme adalahhubungan yang saling menguntungkan.Polimer karbohidrat tidak dapat dicerna olehkebanyakan hewan tetapi dapat dihidrolisisdan difermentasi oleh mikroorganisme yangterdapat di rumen. Hasil akhir yang diperolehadalah asam lemak yang digunakan dalammetabolisme rumennansia. Mikroorganismependegradasi selulosa yang terdapat pada

rumennasia antara lain adalah Butyrivibriofibrisolvens, Fibrobacter succinogenes,Neocallimastix frontalis, Neocallimastixpatriciarum, Orpinomyces jayanii,Orpinomyces sp, Piromyces equi, Piromyces

sp. E2, Piromyces rhizinflata, Prevotellaruminocola, Ruminococcus albus,Ruminococcus flavefaciens, dan Prevotellaalbensis (Krause, et al. 2003).

Untuk mengokimalkanmetabolisme bakteri pendegradasi selulosapada keadaan minimal nutrient, setiap bakterimempunyai strategi yang berbeda-beda.Besar hasil akhir yang diperoleh pada prosesdegradasi tergantung kepada beberapa faktoryaitu pH, akses terhadap karbon (kecocokankonformasi enzim dengan subtrat), reaksiredok yang terjadi, konsentrasi produk. Danuntuk mengoktimalkan hasil yang diperolehmaka diperlukan pengetahun tentanggenetika mikroorganisme yang digunakan,enzimatik, dan termodinamika dalammekanisme aliran karbon (karbon flow).Detail pengetahuan mengenai hubunganantara genome content, gen dan produkekpresi gen, pathway utilization, dan hasilakhir yang diperoleh akan sangat pentinguntuk diketahui dalam degradasi selulosa(Levin et al., 2009).

2.6 Enzim SelulaseDi alam, enzim selulase ditemukan

di berbagai ekosistem, terutama ditemukanpada dekomposisi serasah daun pada tabah,hingga keadaan anaerobik pada rumenansia(Denman et al., 1996).

Sistem enzim sellulosa sangatpenting karena berperan dalam mengubahsellulosa menjadi gula sederhana. Sellulosarelatif sulit diubah menjadi gula sederhana,namun jumlah sellulosa yang melimpahmenjadikan sellulosa menjadi bahan yangpotensial untuk digunakan dalam produksibioetanol (Himmel et al.,1997 dalamWilliam and Govind, 2003).

Enzim sellulase terdiri dari enzimEndosellulase , Eksosellulase, dan β-glukosidase (tabel 2.1). Enzim selulaseadalah enzim yang dapat mengkatalisis danmenghidrolisis ikatan glukosidik padasellulosa (ikatan yang paling banyak disellulosa) (Bhat, 2000). Enzim endosellulase(EC 3.2.1.4) terdiri dari satu jenis enzimyaitu 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases(Bhat dan Bhat, 1997 ; Wood, 1985).Endoglucanases atau yang sering disebutdengan CM-cellulases(carboxymethylcellulose) atau Cx enzim,

menghidrolisis secara acak ikatan pada seratselulosa (Wood, 1985). Hal inimengakibatkan rantai polisakarida yang telahterpotong (oligosakarida) mempunyaipanjang rantai yang berbeda-beda (Bhat,2000). Hasil dari hidrolisis serat sellulosaadalah glukosa, cellobiose, cellotriose, danoligosakarida yang lebih tinggi (Wood,1985). Enzim endoselulase sangat aktif padadegradasi derivat selulosa seperticarboxymethylcellulose danhydroxyethylcellulose, dalam degradasi iniendoselulase bekerja sama denganexoselulase (Mattinen, 1998). Enzimeksoselllulase (EC 3.2.1.91) terdiri dari 1,4-D-glucan glucanohydrolases (lebih dikenaldengan cellodextrinases) dan1,4-D-glucancellobiohydrolases (cellobiohydrolases).Enzim eksoselulase adalah enzim yang aktifpada sisi crystalline selulosa (Mattinen,1998). β-glucoside glucohydrolases lebihdikenal sebagai β-glukosidase.Cellobiohydrolyase, yang seing disebutdengan exoglucanse, adalah enzimpendegradasi selulosa yang ditemukan padamayoritas fungi yang dapat mendegradasiselulosa (Wood, 1985). Cellobiohydrolyasedapat menghidrolisis microcrystalline namuntidak dapat menghidrolisis CMC(carboxymethylcellulose) (Kim and Kim,1995). β-glukosidase adalah enzim yangdigunakan untuk menghidrolisis cellobiosedan pada beberapa kasus dapatmenghidrolisis cello-oligosakarida menjadiglukosa. Enzim endogluconases dan β-glukosidase dapat menghirolisis selulosamenjadi glukosa. β-glukosidase di butuhkanuntuk menghidrolisis inhibitor cellobiose(Wood, 1985).

Tabel 2.4 Jenis-jenis enzim selulase (Bhat dan Bhat, 1997)

Jenis enzim KodeEC

Sinonim Mekanismereaksi

Endo-(1-4)-β-D-selulase

EC3.2.1.4

Endoselulaseatauendoglukanase

-G-G-G-G-

Memutuskanikatan secara

acakEkso-(1-4)-β-D-selulase

EC3.2.1.91

Selobiohidrolase ataueksoselulase

G-G-G-G-

Melepaskanselobiosa baikyang reducingatau non-reducing end

Ekso-(1-4)-β-D-selulase

EC3.2.1.74

Eksoglukanaseatauglukohidrolase

G-G-G-G

Melepaskanglukosa darinon-reducing

endβ-glukosidase

EC3.2.1.21

Selobiose G-G, G-G-G-

Melepaskanglukosa dariselobiosa ataurantai cello-oligosakaridapendek

Luas permukaan adalah faktor yangberprngaruh dalam proses degadasi serbukselulosa crystalline. Hal ini dapat dilihat bahwaluas permuaan mempengaruhi kontak enzimselulase dengan permukaan selulosa (Weimer etal., 1993 dalam Rodrigues et al., 2003).Degradasi selulosa dengan menggunakanmeadow hay (rumput-rumputan) menunjukkanbahwa dalam degradasi selulosa perlekatan daribakteri memainkan peran yang penting dalammendegradasi selulosa (Sequeira and Sequiera,1993)

Enzim selulase dapat menghidrolisissubtrat selulosa melalui sistem reaksi komplekyang terdiri dari beberapa tahapan (Lee and Fan,1982). Tahapan reaksi tersebut adalah :1. Transfer enzim dari bulk aqueous phase ke

permukaan substrat selulosa2. Adsopsi enzim dan pembentukan komplek

enzim-substrat

3. Hidrolisis sellulosa4. Transfer sellodextrins, glukosa dan

sellobiosa ke bulk aqueous phase5. Hidrolisis sellodextrins dan sellobiosa

menjadi glukosaFase adsopsi dan pembentukan

komplek enzim-substrat adalah fase kritis didalam hidrolisis selulosa (Bledman et al, 1988).Tahapan hidrolisis selulosa tergantung kepadastruktur selulosa, interaksi anatara enzimselulase dan serat selulosa, mekanisme hidrolisisenzim tersebut di alam dan inhibitor yangterbentuk (Coughlan, 1985). Glukosa dansellobiose adalah inhibitor enzim dalammenghidrolisis selulosa. Sellobiosamenghambat enzim sellobiohidrolase padakomplek enzim selulase dan glukosamenghambat enzim penghidrolisis sellobiosa .Sellobiose mempunyai potensi menjadi inhibitoryang lebih kuat dibandingkan dengan glukosapada mekanime hidrolisis selulosa (Marsdenand Gray, 1986). Dua mekanisme inhibibisiyaitu inhibitor kompetitif dan inhibitor nonkompetitif (Lee and Fan, 1982). Laju hidrolisisenzim selulase ditentukan oleh struktur enzimdan struktur substrat (Mandels, 1985), dimanastruktur Kristal dari selulosa relatif lebih sulitdihidrolisis dibandingkan dengan struktur amorf( Coughlan, 1985). Karena struktur kristal lebihsulit didegradasi dibandingkan dengan strukturamorf, maka enzim selulase (enzimendosellulase) menghidrolisis struktur amorf.Mekanisme skematis kerja enzim selulaseseperti pada Gambar 2.3.

Gambar 2.3 Skematis mekanisme degradasi selulasa(Beguin and Aubert, 1994)

Bakteri selulotik dapat bekerja padavariasi keadaan lingkungan yang berbeda-bedadalam mendegradasi seresah daun pada tanah(Beguin and Aubert, 1994; Denman et al., 1996dalam Linder dan Teeri, 1997). Mikroba inidapat mendegradasi melekul komplek, keadaandimana subtrat tidak larut dalam air denganmenggunakan berbagai enzim melalui berbagaicara didalam memutuskan bagian yang berbedadi dalam substrat. Efisiensi degradasi kayudengan menggunakan mikorganisme sepetifungi filamentus, merupakan tipe yangmengsekresikan dan mengsinergikan aksi enzimselulase dimana bakteri menggunakan komplekenzim (cellulosome) yang bekerja padapermukaan substrat (Tomme et al., 1995; Bayeret al., 1996 dalam Linder dan Teeri, 1997). Halini juga terjadi pada fungi anaerob dimana

memiliki komplek seperti cellulosome denganukuran yang lebih besar (Fanutti et al., 1995;Denman et al., 1996; Dijkerman et al., 1996).Kedua tipe enzim dapat melepaskan ikatan β-1,4-glukosida dengan menggunakan enzim endoatau exoglukonase yang spesifik yangdidasarkan atas topologi dari sisi aktif.

2.7 Cellulose Binding Domain (CBD)CBD pertama kali ditemukan pada

Trichoderma reesei. Sekarang telah behasildiidentifikasi 120 CBD dan diklasifikasikanmenjadi 10 families (I-X). Ada dua families (IIdan III) yang memiliki anggota yang banyaksehingga dibagi menjadi subfamilies (IIa, IIb,IIIa dan IIIb). Sebagian besar CBD termasuk kedalam families I, II dan III, pada beberapafamilies hanya mengandung beberapa anggotadan pada families yang lain hanya memiliki satuanggota. Families I hanya mengandung CBDyang berasal dari fungi dan semua CBD yangtermasuk ke dalam families II-V, IX-Xsemuanya merupakan CBD yang berasal daribakteri (Mattinen, 1998).

CBD yang termasuk ke dalam familiesI adalah CBD yang berukuran kecil dan tersusunoleh peptide yang kompak, mengandung 32-36asam amino. CBD fungi memiliki kemiripanyang sangat tinggi antara yang satu dengan yanglain. Contoh terbaik CBD families I adalah yangterdapat pada Trichoderma reesei. CBD bakteriyang termasuk ke dalam families II tersusun dariasam amino yang lebih banyak yaitu 95-108.CBD yang termasuk ke dalam families III adalahdihasilkan oleh bakteri yang dapat menghasilkancellulosome (Mattinen, 1998). Klasifikasi dariCBD dari organisme yang berbeda disajikanpada Lampiran 12.

Enzim ada yang mempunyai singgelBinding Domain dan ada yang mempunyai duaatau lebih Binding Domain. Namun hampirsemua enzim selulase memiliki multidomain.Berdasarkan perbedaan enzim selulase beberapalebih memilih mendegradasi substrat selulosapada bagian amorphous dibandingkan bagianyang lain yaitu bagian kristalin. Beberapapenelitian yang dilakukan terhadap enzim

selulase yang berbeda dapat digunakan untukmengidentifikasi enzim mana yangkemungkinan pada masa yang akan datangdigunakan untuk mendegradsi selulosa padabagian kristalin (Wilson and Mertens, 1995;Davies and Henrissat, 1995; Teeri, 1997 dalamLinder dan Teeri, 1997). Salah satu yangmenjadi perhatian utama adalah mengenaiadsopsi yang berhubungan dengan aktifitas

katalitik pada substrat padat (Klyosov, 1990dalam Linder dan Teeri, 1997). Karasteristikstruktural dari berbagai enzim selulasedidasarkan pada pengetahuan mengenaimelekuler yang merupakan bagian terpentingdalam memahami degradsi selulosa.Kebanyakan, namun tidak semua enzim selulaseefektif mendegradasi selulosa berdasarkanmodel struktur penyusun sehingga tempatperlekatan sisi katalitik berkaitan dengancellulose-binding domain (CBD) (Tomme et al.,1995).

Mirip dengan enzim selulase,pemindahan substrat binding domainaktifitasnya meningkat pada subtrat yang tidaklarut namun tidak pada substrat yang larut(Blaak and Schrempf, 1995 dalam Linder danTeeri, 1997). Hal ini menunjukan bahwa strukturmodular domain memiliki keuntungan yangsignifikan dalam mengdegradasi substrat yangtidak larut (Linder dan Teeri, 1997).

2.8 Rumput Gajah (Pennisetum purpureumSchum)

Rumput gajah adalah tanaman yangtermasuk ke dalam kelompok tanaman rumput-rumputan. Rumput gajah banyak dimanfaatkanpada bidang peternakan yaitu sebagai makananhewan ternak seperti sapi, kambing dan kuda.Umumnya rumput gajah yang digunakandiindonesia adalah rumput yang tumbuh secaraliar. Namun untuk peternakan yang relatif besarmaka rumput yang digunakan adalah rumputyang sengaja ditanaman atau dipelihara secarakhusus. Hal ini dilakukan untuk memenuhikebutuhan pakan ternak. Rumput-rumputandipilih karena merupakan tanaman yangproduktifitasnya tinggi dan memiliki sifat yangdapat memperbaiki kondisi tanah (Gonggo et al.,2005).

Rumput-rumputan yang ditanam padasuatu lahan dapat memperbaiki kondisi tanah.Tanaman tumput-rumputan membuat tanahmenjadi lebih gembur. (Gonggo et al., 2005).Hal ini dapat meningkatkan porositas, yangmenyebabkan terjadi aerasi yang lebih baikterhadap lahan yang ditanami oleh rumput-rumputan (Handayani, 2002). Banyaknya porijuga membantu terjadinya degradasi olehmikroorganisme dari guguran daun. Potensiuntuk mendapatkan isolat bakteri pendegradasi

selulosa menjadi cukup besar . Lahan yangditanami rumput juga tahan terhadapkekeringan, hal ini terjadi karena perakaranyayang dalam (Rismunandar, 1989 dalam Gonggoet al., 2005). Tanaman penutup tanah dari jenisrumput-rumputan dapat juga berfungsi sebagaipelindung permukaan tanah dari daya dispersedan daya penghancur oleh butiran-butir airhujan, memperlambat aliran permukaan(Kartasapoetra et al., 2000 dalam Gonggo et al.,2005).

Sumber energi yang ramah lingkungandan ekonomis menjadi perhatian utamapengembangan teknologi dalam bidang energi.Pada saat ini biomassa adalah menjadi perhatianutama dalam pengembangan energi terbarukan.Fokus utama yang menjadi pertimbangan dalammemilih biomassa adalah bahan tersebut mudahdiperbaharui dan energi yang dapat diperoleh.Biomassa adalah sumber energi terbarukan yangmelimpah dan dapat diperoleh dari berbagaiindustri sebagai sampah/limbah sepertipertanian, industri gula, limbah industri yangmenggunakan kayu, dan industri makanan.Selain menggunakan bahan yang merupakanlimbah dari industri lain energi terbarukan dapatberasal dari tanaman yang ditanam sebagaisumber energi (sumber karbon) (Strezos et al.,2008). Salah satu tanaman yang mempunyaipotensi dijadikan sumber biomassa pada energiterbarukan adalah rumput gajah (PennisetumPurpureum Schum). Berikut adalah klasifikasidari Pennisetum purpureum Schum.

Kingdom : PlantaePhlum : SpermatophytaClass : MonokotilOrdo : PoalesFamily : PoaceaeGenus : PennisetumSpesies : Pennisetum purpureum Schum

(Tjitrosoepomoe, 2004)Rumput gajah (Pennisetum purpureum

Shaum) berasal dari afrika tropik, tumbuhberumpun dan tingginya dapat mencapai 3 mlebih. Permukaan buluhnya licin dan pada buluhyang masih muda bisanya ditutupi oleh sejeniszat lilin tipis. Pelepahnya licin atau berbulu padawaktu muda dan kemudian berbulu-bulu tersebutgugur. Daunnya berbentuk garis, pangkalnya

lebar dan ujungnya lancip sekali. Tepi daunkasar. Perbungaan berupa tandan tegak yangpanjangnya sampai 25 cm. gagang-gagangnyaberbulu. Bulir-bulirnya berkelompok, terdiri dari3-4 buliran tiap kelompoknya dan bergagangpendek sekali. Pangkal bulirnya bulirannyaberbulu panjang dan halus. Perbanyakan dapatdilakukan dengan pemecahan rumpun danpotongan-potongan buluhnya. Dapat tumbuhhingga pada ketinggian 1500 m dpl(www.flickr.com).

Gambar 2.4 Rumput gajah (Pennisetum purpureum Shaum)(www.flickr.com)

Penamaman tanaman seperti rumputgajah mengalami kompetisi perebutan lahandengan tanaman pangan seperti jagung. Olehkarena itu, untuk meminimalkan kompetisipenggunaan lahan kritis perlu ditingkatkan.Lahan kritis umumnya tidak banyak digunakansebagai lahan pertanian. Di dunia terdapat 2 Ghalahan kritis yang tidak dapat ditanami tanamanpangan. Lahan kritis yang tidak digunakanmemiliki kecenderungan mengalami kerusakanyang lebih parah seperti erosi. Penanamantanaman penghasil energi dapat memperbaikikualitas tanah (Strezos et al, 2008).

Rumput gajah adalah tanaman yangberasal dari afrika yang dapat mencapai hingga

45 ton per hektar berat kering pada daerahsubtropis dan 80 ton per hektar berat kering padadaerah tropis (Woodard and Prine, 1993).Rumput gajah dapat hidup pada daerah dengankandungan nutrisi yang minimal. Dalam satutahun rumput gajah dapat dipanen hingga empatkali. Menurut Okaraonye dan Ikewuchi (2009)analisis kandungan kimia dari rumput gajah adapada Tabel 2.5.

Tabel 2.5 Analisisa kandungan kimia rumput gajah(Pennisetum purpureum Shaum)

ParameterBeratbasah

Beratkering

Kandungan air 89,0 -Jumlah abu 2,00 18,18Protein kasar 2,97 27.00Lemak kasar 1,63 14.82Jumlah totalkarbohidrat

3,40 30,91

Serat kasar 1,00 9,09

Sedangkan menurut Strevoz (2008) kandunganmineral pada rumput gajah ada pada Tabel 2.6.

Table 2.6 Analisis kandungan mineral pada rumput gajah

Analisiskandungan

mineral padaabu

Mineral yangdianalisis

dalam bentuksenyawa

Jumlahsenyawa dari

total beratabu yangdianalisis

Silikon SiO2 43Almunium Al2O3 <0,1

Besi Fe2O3 1,4Kalsium CaO 1,9

Magnesium MgO 9,9Natrium Na2O <0,01Kalium K2O 30,5

Titanium TiO2 0,03Mangan Mn5O4 0,17Fosfor P2O5 7,2

Belerang SO3 5,7Strontium SrO 0,03

Barium BaO 0,08Zink ZnO 0,08

Vanadium V2O5 0,01

Softwood mengandung lignin yanglebih banyak dibandingkan dengan hardwood.Hemiselulosa tertinggi terdapat pada rumput-

rumputan. Perbandingan kandungan dariselulosa, lignin dan hemiselulosa pada softwood,hardwood dan rumput terdapat pada Tabel 2.7(Glazer and Nikaido, 2007). Karena kadarhemiselulosa yang besar maka proses degradasiselulosa pada rumput-rumputan relatif menjadilebih sulit.

METODOLOGI3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulanFebruari 2009 sampai April 2010 diLaboratorium Mikrobiologi dan BioteknologiBiologi ITS Surabaya.

3.2 Pengambilan Sampel Sedimen danSerasah Daun

Lokasi pengambilan sampel di WanaWisata Air Panas Padusan Wisata PerumPerhutani Unit II Pacet Mojokerto. Sampelberupa sedimen, serasah daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) dan daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) segar. Sampel diambil padahari Kamis, 5 Februari 2009 pada pukul 00.00WIB. Sampel diambil di 5 titik.

Sampel serasah daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) diambil denganmenggunakan paralon dan sekop kecil. Sampelserasah diambil mulai dari permukaan hinggakedalaman ±15 cm. Sebelum diambil, terlebihdahulu serasah dicampurkan agar homogen.Sampel dari kelima titik dicampur menjadi satudan kemudian dimasukkan ke dalam kantongplastik dan disimpan di dalam ice box yangberisi dry ice. Sampel dibawa ke laboratoriumdan langsung dilakukan perlakuan sesuai denganprosedur isolasi bakteri.

3.3 Pengayaan Kultur BakteriPendegradasi SelulosaPerlakuan pengayaan kultur bakteri

dilakukan pada medium cair PCS. Medium inidibuat dengan memodifikasi metodologi daripenelitian Haruta et al., 2002. Pembuatanmedium ini dengan mencampurkan 1 g ekstrakyeast, 5 g pepton, 5 g CaCO3, 5 g NaCl ke dalamgelas Erlenmeyer kemudian ditambahkan 800 mlakuades. Material selulotik adalah 20 g daunrumput gajah (P. purpureum Shaum) segar yangsebelumnya diblender terlebih dahulu denganakuades 200 ml dan kemudian disaring. Filtrat

daun rumput gajah (P. purpureum Shaum)dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer yangtelah berisi medium PCS tersebut diatassehingga total volume menjadi 1 L. Mediumdisterilisasi ke dalam autoklaf pada suhu 121°Cdan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.

Sumber inokulum untuk pengayaankultur bakteri pendegradasi selulosa adalahsedimen dan serasah daun rumput gajah (P.purpureum Shaum). Serasah daun rumput gajah(P. purpureum Shaum) sebanyak 5 gdicampurkan secara aseptik ke dalam gelasErlenmeyer 500 ml yang berisi 250 ml mediumPCS (1:50 gr/vol). Kemudian kultur bakteridiinkubasi di atas rotary shaker (Health/H-M-SR) dengan kecepatan 100 rpm selama 2 minggupada suhu ruangan. Pada hari ke-5, ke-7 dan ke-15 dilakukan perhitungan jumlah konsentrasi selbakteri yang bertujuan untuk mengetahuipertumbuhan bakteri. Setelah 15 hari masainkubasi kultur pengayaan dipindahkan kemedium PCS baru dengan perbandingan 1:10.

3.4 Isolasi Bakteri Pendegradasi SelulosaUntuk mengisolasi bakteri pendegradasi

selulosa digunakan medium Cellulose CongoRed Agar (CCRA) (Hendricks et al., 1995).Medium CCRA dibuat dengan dengankomposisi K2HPO4 sebanyak 0,5 gr, MgSO4

0,25 gr, Congo red 0,2 gr, agar 7,5 gr, gelatin 2gr, CMC 1,88 gr, 100 ml filtrat serbuk daunrumput gajah (P. purpureum Shaum) dan 900 mlakuades steril. Bahan-bahan tersebutdicampurkan kecuali agar dan gelatin.Keasaman medium adalah pH 7,0. Agar dangelatin kemudian dilarutkan dalam mediumdengan pemanasan menggunakan hot plate.Medium kemudian diautoklaf selama 15 menitpada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm,didinginkan lalu dituangkan ke cawan Petri sterildan disimpan pada suhu 4°C.

Pengenceran bertingkat dilakukan untukmemudahkan isolasi. Kultur pengayaan yangberusia 15 hari tersebut diatas (metode 3.3 )diambil sebanyak 1ml dan dimasukkan ke dalamtabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril laludi vorteks agar homogen. Ini merupakanpengenceran tingkat 10-1. Pengenceranbertingkat dilakukan hingga tingkat pengenceran10-10 (Lampiran 1). Dari setiap tingkatpengenceran diteteskan sebanyak 0,1 ml ke

permukaan medium padat (CCRA) dankemudian diratakan dengan menggunakanspatula. Metode isolasi bakteri yang digunakanpada penelitian ini adalah Spread PlateMethode. Biakan bakteri di inkubasi dalaminkubator pada suhu 37°C selama 1-7 hari.

Koloni yang tumbuh diamati zonabeningnya. Zona bening menunjukkan bahwakoloni bakteri tersebut menghasilkan enzimselulolitik dan mendegradasi selulosa yang adadisekitarnya. Koloni dengan dengan rasio HCtertinggi atau diameter dari zona bening yangterbesar dipilih dan akan digunakan untuklangkah selanjutnya. Koloni yang terpilihdiberikan kode PP. Huruf “PP” merupakansingkatan dari Pennisetum purpureum Shaum.

3.5 Pemurnian KulturSetelah inkubasi selama 7 hari akan

tampak zona bening pada tiap koloni yangterbentuk. Setiap koloni terpisah yangmemunculkan zona bening dimurnikan denganmetode 16 goresan pada medium CCRA sepertipada Lampiran 2. Pemurnian ini dilakukansebanyak lima kali tahap pemurnian. Setelah 3kali proses pemurnian, isolat kultur diamatisecara mikroskopik. Jika telah ditemukan kulturmurni maka perlakuan pemurnian dihentikan.Kultur murni adalah kultur yang terdiri dari selyang sama bentuk dan ukurannya. Dari hasilpemurnian, isolat yang didapat disimpan padamedium CCRA miring untuk dilakukanpengamatan selanjutnya. Untuk uji biokimia,digunakan isolat yang disimpan pada mediumNutrient Agar (NA). Pembuatan medium NAdapat dilihat pada Lampiran 3.

Pengamatan mikroskopik dilakukandengan melakukan metode pewarnaansederhana. Akuades steril diteteskan sebanyaksatu tetes pada bagian ujung dari kaca obyek.Satu ose bakteri kemudian digoreskan padatetesan akuades dan diratakan. Preparatkemudian difiksasi dengan melewatkan di atasapi bunsen hingga akuades mengering.Penyediaan preparat dengan mengikuti langkah-langkah tersebut di atas selanjutnya disebutsebagai preparat ulas. Preparat ulas yang telahdibuat kemudian diwarnai dengan methylen blue(Merck®, Jerman). Sebanyak 2-3 tetes methylenblue diteteskan diatas sediaan dan ditungguselama ± 3 menit. Setelah itu dibilas sisa

methylen blue pada preparat denganmenggunakan akuades. Pengamatan sel bakteridilakukan dibawah mikroskop (Olympus,CX21FSI®, Jepang) dengan perbesaran 1000X.Untuk memperjelas pengamatan di berikanbantuan dengan meneteskan satu tetes minyakimersi pada permukaan atas gelas penutup.

3.6 Karakterisasi BakteriIsolat bakteri murni kemudian

dikarakterisasi dan diidentifikasi yang dilakukansecara biokimia yang mengacu pada BergeyManual of Determinative Bacteriology 9th yangmerupakan bagan alir hasil modifikasi dapatdilihat pada Lampiran 4 sampai dengan 7,karakterisasi yang dilakukan meliputi:

1. Pengamatan makroskopikKarakteristik koloni bakteri hasil

inokulasi pada media CCRA datar yaituberdasarkan:

a. Bentuk koloni (dilihat dari atas) :berupa titik-titik, bulat, berbenang,tak teratur, serupa akar, serupakumparan.

b. Permukaan koloni (dilihat darisamping) : rata, timbul-datar,melengkung, membukit, serupakawah.

c. Tepi koloni (dilihat dari atas) : utuh,berombak, berbelah, bergerigi,berbenang, keriting.

d. Warna koloni : keputih-putihan,kelabu, kekuning-kuningan atauhampir bening.

(Dwijoseputro,2005)2. Pengamatan mikroskopik

Pengamatan mikroskopik dilakukan

untuk melihat bentuk sel bakteri dan

untuk melihat kemurnian dari isolat.

3. Uji biokimiaUji biokimia yang dilakukan merupakan

hasil modifikasi metode dari Collins and

Lyne (1985), Lay (1994), Cappucino

and Sherman (2001), Harley and

Prescott (2002), Noviani dan Gusrizal

(2002). Uji biokimia yang dilakukan

terdiri dari pewarnaan Gram, kebutuhan

oksigen, kemampuan tumbuh pada

medium NA+20% NaCl dan motilitas.

Uji biokimia mengikuti bagan alir

dikotomi (Lampiran 4-7) berdasarkan

buku panduan standar Bergeys Manual

of Determinative Bacteriology. Untuk

melakukan pengujian tersebut,

digunakan isolat bakteri sebelumnya

yang diremajakan dalam media padat

NA, hingga diperoleh isolat bakteri yang

berumur 24 jam.

Pewarnaan GramPreparat ulas ditetesi larutan kristal

violet sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama20 detik, selanjutnya dicuci preparat di bawahair mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnyalarutan iodin (Merck, Jerman) diteteskansebanyak 2-3 tetes di atas permukaan preparatdan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicucidi bawah air mengalir dan dikeringanginkan.Larutan etil alkohol (Merck, Jerman) 95%diteteskan setetes demi setetes di ataspermukaan lapisan preparat sampai kristal violettercuci dan kemudian dicuci di bawah airmengalir dan dikeringanginkan. Larutan safraninditeteskan di atas permukaan kaca obyek dandidiamkan selama 20 detik, dicuci di bawah airmengalir dan dikeringanginkan. Setelah kering,preparat ditutup dengan gelap penutup untukdiamati dibawah mikroskop pada perbesaran1000X dengan bantuan minyak imersi (Lay,1994).

Kebutuhan OksigenSebanyak 3 gram agar dan 29.5 gram

media thioglycollate (Oxoid, CMO173®,Inggris) (Lampiran) dilarutkan ke dalam 1 literakuades dan dipanaskan diatas pemanas sampaiagar larut dan homogen. Kemudian mediadipindahkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 7ml dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu121°C selama 15 menit dan tekanan 1,5 atm.Setelah dikeluarkan dari autoklaf, tabung reaksiyang berisi media langsung dimasukkan kedalam bak yang berisi air yang telah diatursuhunya setinggi 50°C untuk mencegahterjadinya pemadatan agar. Setelah suhu mediateradaptasi pada suhu 50°C yang ditandai

dengan media terasa hangat-hangat kuku,kemudian sebanyak satu ose isolat bakteriberumur 24 jam di inokulasikan ke dalam mediatersebut secara aseptis. Tabung reaksi kemudiandiputar dengan bantuan telapak tangan, agarbakteri terdistribusi merata di dalam agar.Setelah masa inkubasi selama 48 jam pada suhu37°C, pola pertumbuhan dari isolat bakteridiamati. Apabila isolat bakteri hanya tumbuh dipermukaan media, maka isolat tersebut adalahaerob obligat. Apabila isolat bakteri tumbuhsepanjang kolom tabung reaksi, tetapipertumbuhan terpekat pada permukaan agar,maka isolat adalah anaerob fakultatif. Apabilaisolat bakteri tumbuh merata sepanjang kolomtabung reaksi, maka isolat adalah anaerobaerotoleran. Apabila isolat bakteri hanya tumbuhdi bawah permukaan agar, tetapi tidak sampaisepanjang kolom tabung reaksi, maka isolatadalah mikroaeroflik. Sedangkan apabila hanyatumbuh pada dasar tabung reaksi, maka isolatadalah anaerob obligat (Cappuccino andSherman, 2001; Harley and Prescott, 2002).

3.7 Uji Hydrolisys Capacity (HC)Uji HC ini dilakukan untuk mengetahui

kemampuan dari isolat untuk mendegradasiselulosa di lingkungan sekitarnya. Rasio HC(hydrolysis capacity / HC value) adalah rasioantara diameter zona bening dengan diameterkoloni yang menghasilkan zona bening (Lu etal., 2005). Medium CCRA padat digunakanpada pengujian ini. Biakan dari isolat murnidiambil dengan menggunakan jarum ose tanamtajam kemudian disentuhkan bagian ujung jarumyang mengandung biakan pada bagian tengahmedium CCRA. Biakan dinkubasikan di dalaminkubator pada suhu 37º C. Pengukuran rasioHC dilakukan setiap hari selama 1 minggu.

3.8 Uji Kemampuan Degradasi Selulosadari Isolat

Uji kemampuan degradasi selulosadilakukan dengan memodifikasi metodologipenelitian yang digunakan Lu et al., 2005. Padauji ini digunakan medium minimal (Lampiran 3)yang didapatkan pada penelitian Widdel etal.(1992). Medium sebanyak 88 ml dimasukkanke dalam gelas Erlenmeyer 250 ml yang telahberisi 5 potong daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) dengan ukuran 2x2 cm.

Kelima potong daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) tersebut telah diketahui totalberat kering awal. Medium kemudiandisterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menitpada suhu 121º C dengan tekanan 1,5 atm.

Kedalam larutan yang telah disterilisasi,dimasukkan isolat dengan konsentrasi 105 sel/ml.Konsentrasi sel bakteri tersebut didapatkandengan cara memasukkan 1 ose isolat murnibakteri pendegradasi selulosa ke dalam 2 mlmedium minimal steril dan dihomogenkandengan menggunakan vorteks (Lampiran 8).Larutan isolat dinokulasikan ke dalam mediumminimal steril secara aseptik sehinggavolumenya menjadi 90 ml. Kemudian larutandiinkubasikan pada suhu ± 45oC di atas rotaryshaker (Health, H-M-SR®) dengan kecepatan100 rpm.

Kemampuan isolat untuk mendegradasiselulosa diamati berdasarkan total berat keringdaun rumput gajah (P. purpureum Shaum)setelah 7 hari masa inkubasi dan menghitungkonsentrasi sel dengan menggunakanHaemacyometer. Perlakuan dilakukan secaraduplo.

Berat kering daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) dicari dengan caramenimbang berat awal (basah) daun sebelumdimasukkan ke dalam oven (Lampiran 9).Setelah itu dibungkus daun rumput gajah (P.purpureum Shaum) dengan menggunakanaluminium foil dan dioven pada temperatur 80ºC selama 1-3 hari. Setiap hari dilakukanpenimbangan untuk mengetahui berat keringyang konstan.HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Isolasi dan Karakterisasi

Pada penelitian ini berhasil diisolasidan dipurifikasi 5 isolat bakteri yangberpotensi sebagai bakteri pendegradasiselulosa. Material selulosa yang diambiladalah berasal dari daun rumput gajah segarbaik yang masih muda atau sudah tua yangdiambil secara acak dari daerah wisitapemandian air panas yaitu Wana Wisata AirPanas Padusan wisata perum Perhutani unitII Pacet Mojokerto. Rumput gajah dapattumbuh di daerah pantai hingga daerahdengan ketinggian 1500 dpl (di atas

permukaan air laut). Kelima isolat itu dikodedengan nama PP 127-A, PP 141-A, PP 146-A, PP 79-D, dan PP 91-A. Huruf PP padakode isolat adalah kependekan dariPenesetum purpureum (nama ilmiah darirumput gajah). Tabel 4.1. menunjukkankarakter koloni isolat tersebut.

Selanjutnya kelima isolatdikarakterisasi secara biokimia denganmengikuti dikotomi berdasarkan Bergey’sManual of Determinative Bacteriology 9th

edition ( Holt, et al., 1994). Karakter hasiluji biokimia dari kelima isolat bakteritersebut terdapat pada Tabel 4.2.Berdasarkan karakter biokimia tersebutisolat bakteri PP 127-A dan PP 141-Acenderung masuk ke genus Flavobacterium,isolat bakteri PP 146-A cenderung masuk kegenus Lampropedia dan isolat bakteri PP79-D dan PP 91-A cenderung masuk kegenus Halomonas.

Menurut Holt et al. (1994) karakterdari koloni Flavobacerium adalah sebagaiberikut. Sel berbentuk batang dengan sisiyang sejajar dan ujung bulat, berukuran0,5x1,0-3,0 µm. endospora tidak terbentuk.Sel bersifat Gram negatif, non motil,aerobik, dan oksidase positif, serta dapattumbuh di lingkungan dengan suhu 37°C.Flavobacterium terdapat di tanah, air, jugaditemukan pula pada daging, susu danmakanan yang lainnya, serta dapatditemukan di lingkungan rumah sakit danmaterial klinis manusia.

Genus Flavobacterium adalah salahsatu genus yang penting dalam degradasipolisakarida (Yang et al., 1985). Daripenelitian yang dilakukan oleh Ishigaki etal. (2000) untuk mengisolasi bakteripendegradasi selulosa asetat diketahuibahwa 3 dari 35 strain yang berhasildiisolasi adalah dari genus Flavobacterium.

Genus Halomonas menurut Bergey’sManual of Determinative Bacteriology 9th

edition ( Holt, et al., 1994), memiliki

karakter berbentuk batang, berukuran 1-2,5µm, Gram negatif, endospora negatifaerobik obligat, tidak motil dan mempunyaiflagella, koloni yang terbentuk sangat tipisdan tampak kering, kemoorganotrof, tidakmempunyai karetenoid dan pigmenfotosintesis, tidak mempunyai vakuola gas,tidak menyimpan sulfur dalam tubuhnyametabolismenya memerlukan oksigen

sebagai aseptor elektron terminal, katalasedan oksidase positif, anaerobic fakultatif,dan halotoleran (0,05-20 ‰) . Dari hasilyang didapat, dua isolat memiliki karaktergenus Halomonas yaitu dengan kode PP 79-D dan PP 91-A.

Tabel 4.1 Morfologi koloni bakteri

No.KodeIsolat

Bentuk Permukaan Pinggiran Warna

1 PP 127-A Bulat Mencembung basah Utuh Merah2 PP 141-A Bulat Mencembung basah Utuh Merah3 PP 146-A Titik-titik - Utuh Putih susu4 PP 79-D Rizoid Melengkung basah Utuh Putih susu5 PP 91-A Bulat Mencembung basah Utuh Putih susu

Tabel 4.2 Karakteristik isolat pada uji biokimia

Keterangan : AO=Aerob ObligatAF=Anaerob Fakultatif*=Uji tidak dilakukan

Genus Halomonas dapat diisolasidari berbagai habitat laut termasuk garamhasil dari evaporasi air laut (Vreeland et al.,1980 dalam Gandbhir et al., 1995 ). Genusini termasuk ke dalam Gram negatifproteobacteria, yang tersebar luas di habitatlaut (Gauthier et al., 1992; dalam Gandbhiret al., 1995). Pada penelitian yang dilakukanoleh Gandbhir et al., 1995 diketahui bahwaHalomonas elongata dapat tumbuh hinggasalinitas 30 %. Dari hasil penelitianmenunjukkan bahwa H. elongate dapat

hidup pada lingkungan halofil. GenusHalomonas tidak hanya dapat beradaptasiterhadap daerah dengan kadar garam yangtinggi tetapi juga dapat cocok hidup padahabitat laut dengan range dari air tawar,payau hingga air laut dengan kadar garamyang tinggi. Halomonas bahkan ditemukandi pH hingga 11 ( Yang et al., 2010).

4.2 Uji degradasiUji degradasi adalah uji yang

dilakukan untuk mengetahui seberapa besarkemampuan isolat bakteri untukmendegradasi selulosa. Uji degradasi

No. Kode isolat Gram Bentuk

KecenderunganGenus

1 PP 127-A Negatif Batang AO * - Flavobacterium2 PP 141-A Negatif Batang AO * - Flavobacterium3 PP 146-A Negatif Kokus AO * * Lampropedia4 PP 79-D Negatif Batang AF + - Halomonas5 PP 91-A Negatif Batang AF + - Halomonas

dilakukan dengan dua uji dan berbeda yangdilakukan secara terpisah, yaitu ujiHidrolisis Capacity (HC) dan uji degradasimaterial selulotik dari daun rumput gajahsecara in vivo.

Uji HC dilakukan denganmenggunakan medium padatCongo Red Agar (CCRA) yang mengandung2 macam material selulotik yaituCarboxymethylcellulose (CMC) dan filtratdari serbuk daun rumput gajah. Ratio HCmenunjukkan kemampuan isolat bakteriyang diperoleh dalam mendegradasi selulosayang diindikasikan dengan terbentuknyazona bening. Ratio HC adalah perbandinganantara diameter zona bening dengandiameter koloni.

(Sudiana et al., 2002)

Menurut Zverlova et al., (2003), ujidegradasi dengan menggunakan metodezona bening adalah uji semikarena data hanya berupa perbandinganantara diameter zona bening dan dengandiameter koloni. Kesulitan metode ini adalahapabila bentuk koloni atau zona beningyang dihasilkan tidak benar-benar berbentukbulat, atau bahkan tidak bulat sama sekali.Zverlova et al., (2003) juga menyebutkanzona bening yang terbentuk terkait dengan

dilakukan dengan dua uji dan berbeda yangdilakukan secara terpisah, yaitu uji

(HC) dan uji degradasimaterial selulotik dari daun rumput gajah

dilakukan denganmenggunakan medium padat Cellulose

(CCRA) yang mengandung2 macam material selulotik yaitu

(CMC) dan filtratdari serbuk daun rumput gajah. Ratio HCmenunjukkan kemampuan isolat bakteri

dalam mendegradasi selulosayang diindikasikan dengan terbentuknyazona bening. Ratio HC adalah perbandinganantara diameter zona bening dengan

., (2003), ujidegradasi dengan menggunakan metodezona bening adalah uji semi-quantitatif,karena data hanya berupa perbandinganantara diameter zona bening dan dengandiameter koloni. Kesulitan metode ini adalahapabila bentuk koloni atau zona bening

benar berbentukbulat, atau bahkan tidak bulat sama sekali.

., (2003) juga menyebutkanzona bening yang terbentuk terkait dengan

kelarutan dari enzim selulase. Semakintinggi tingkat kelarutan suatu enzim makaakan semakin besar zona bening yangterbentuk. Diameter zona bening umumnyaberukuran lebih besar dibandingkan dengandiameter koloni, karena enzim selulasedisekresikan ke lingkungan sekitarnya olehbakteri pendegradasi selulosa. Bakteri tidakdapat memasukkan molekul selulosa, karenaukuran selulosa lebih besar daripada ukuransel bakteri.

Luas zona bening tergantung padakonsentrasi CMC dan/atau agar yangdigunakan. Semakin banyak CMC dan/atauagar yang digunakan semakin tinggikepadatan medium. Semakin tinggikonsentrasi agar, semakin kecil porimedium sehingga enzim selulase yangdisekresikan lebih sulit melewati poritersebut dan mengakibatkan terhambatnyaproses degradasi. Demikian pula sebaliknya.Namun penggunaan agar pada medium yangdigunakan juga tidak boleh terlalu sedikit,penggunaan agar dibawah 0,8%menyulitkan proses isolasi bakteri (Hankinand Anagnostakis, 1997), medium menjaditerlalu lunak sehingga sulit untuk isolasi daninokulasi. Pada awal penelitian ini agar yangsemula digunakan adalah 0,5 %, namunkarena medium yang dihasilkan terlalulunak maka agar ditingkatkan menjadi1,5%.

kelarutan dari enzim selulase. Semakintinggi tingkat kelarutan suatu enzim maka

emakin besar zona bening yangterbentuk. Diameter zona bening umumnyaberukuran lebih besar dibandingkan dengandiameter koloni, karena enzim selulasedisekresikan ke lingkungan sekitarnya olehbakteri pendegradasi selulosa. Bakteri tidak

molekul selulosa, karenaukuran selulosa lebih besar daripada ukuran

Luas zona bening tergantung padakonsentrasi CMC dan/atau agar yangdigunakan. Semakin banyak CMC dan/atauagar yang digunakan semakin tinggikepadatan medium. Semakin tinggikonsentrasi agar, semakin kecil pori-porimedium sehingga enzim selulase yangdisekresikan lebih sulit melewati pori-poritersebut dan mengakibatkan terhambatnyaproses degradasi. Demikian pula sebaliknya.Namun penggunaan agar pada medium yang

juga tidak boleh terlalu sedikit,penggunaan agar dibawah 0,8%menyulitkan proses isolasi bakteri (Hankinand Anagnostakis, 1997), medium menjaditerlalu lunak sehingga sulit untuk isolasi daninokulasi. Pada awal penelitian ini agar yang

adalah 0,5 %, namunkarena medium yang dihasilkan terlalulunak maka agar ditingkatkan menjadi

Tabel 4.3 Ratio HC hari ke-1 hingga ke-7 masa inkubasiKodeIsolat

Waktu(Hari)

PP 127-A PP 141-A PP 146-A PP 79-D PP 91-A

DZB(cm)

DK(cm)

HC DZB(cm)

DK(cm)

HCDZB(cm)

DK(cm)

HCDZB(cm)

DK(cm)

HCDZB(cm)

DK(cm)

HC

1 2,5 0,9 2,8 4,3 1,2 3,6 3,4 1,5 2,3 9 8 1,1 2,0 0,6 3,32 2,8 1 2,8 4,7 1,3 3,6 3,7 1,9 1,9 9 8 1,1 2,0 0,8 2,53 2,8 1 2,8 5 1,5 3,3 4,1 2 2 9 8 1,1 2,4 0,8 34 3,3 1,1 3 5,1 1,5 3,4 4,2 2,1 2 9 8 1,1 2,6 0,9 2,95 3,5 1,2 2,9 5,3 1,6 3,3 4,3 2,1 2 9 8 1,1 2,7 1,1 2,56 3,5 1,2 2,9 5,5 1,7 3,2 4,6 2,2 2 9 8 1,1 2,9 1,2 2,47 5,2 1,4 3,7 6 1,9 3,2 6,1 2,5 2,4 9 8 1,1 4,5 1,5 3

Keterangan : DZB = Diameter Zona beningDK = Diameter KoloniHC = Hidrolysis Capacity

Tabel 4.4 Hasil uji kemampuan bakteri selulotik melakukan degradasi material selulotik daridaun rumput gajah setelah 7 hari inkubasi

No. Kode isolatRata-rata penurunan berat kering

dalam (%)1 PP 127-A 252 PP 79-D 223 PP 146-A 214 PP 141-A 195 PP 91-A 176 Kontrol 14

Berdasarkan ratio HC pada hari ke-7 masa inkubasi, isolat PP 127-A adalahyang mempunyai kemampuan tertinggidalam mendegradasi CMC dan filtratserbuk daun rumput gajah yang kemudiandiikuti oleh isolat PP 141-A, PP 91-A, danPP 146-A (Tabel 4.3). Sedangkan untukisolat PP 79-D, ratio HC stabil dan lebihkecil daripada isolat yang lain. Hal inimungkin karena dari hasil pengamatankoloni, diketahui bahwa sejak hari ke-1isolat PP 79-D sudah memenuhi cawanPetri sehingga tidak ada lagi tempat yangdapat digunakan untuk pertumbuhanbakteri sampai akhir masa inkubasi. Halini mengakibatkan hasil pengukurandiameter zona bening dan koloni adalahtetap. Ratio HC menjadi stabil dan lebihkecil dibandingkan dengan isolat yanglain. Morfologi koloni bakteri PP 79-Dadalah rizoid (menyerupai akar).

Selanjutnya uji yang kedua adalahuji kemampuan bakteri isolatmendegradasi material selulotik dari daunrumput gajah (P. purpureum Shaum)secara in vivo selama 7 hari. Hasil dari ujiini ada di Tabel 4.4 dan Lampiran 10. DariTabel 4.4 terlihat bahwa isolat PP 79-Dyang berberbentuk rizoid dan tidakterdeteksi kemampuan uji HC mampumendegradasi selulosa secara in vivo.Kemampuan isolat PP 79-D setara denganisolat PP 127-A. Isolat PP 127-Amenunjukkan hasil yang setara antar ujiHC dan uji in vivo. Hal ini diduga bahwaisolat PP 127-A mampu menghasilkanenzim selulase sama banyak dan aktif padapengujian di medium padat dan cair.

Tidak semua isolat bakteri yangratio HC-nya tinggi juga menunjukkan ujiin vivo yang tinggi seperti PP 141-A danPP 91-A. Hal ini diduga bahwa isolattersebut hanya dapat mendegradasimaterial selulotik sederhana, seperti CMC.CMC adalah molekul selulotik sederhanabila dibandingkan dengan daun rumputgajah. Pada medium yang digunakan untukuji HC, kandungan CMC lebih banyak daripada serbuk rumput gajah (2:1). Perbedaanhasil yang diperoleh bukan hanyadisebabkan oleh perbedaan panjangpolimer selulosa saja tetapi lebihdipengaruhi oleh struktur selulosa tersebut(Hankin dan Anagnostakis, 1997).Material selulotik alami merupakanstruktur komplek yang tersusun atasselulosa, hemiselulosa, lignin danbeberapa kelompok senyawa lain yangbukan merupakan penyususun yangpredominan. Sanchez (2009) menyebutkanrumput gajah (P. purpureum Schaum)mengandung 23,9% lignin, 24%hemiselulosa, 22% selulosa dan 6% abu(ash).

Dari Tabel 4.4 ternyata padakontrol juga terjadi penurunan beratkering. Klemm et al., 1998 menyebutkanbahwa degradasi selulosa dapat terjadisecara mekanik, kimia, panas dan radiasi.Akumulasi dari mekanisme tersebutdiduga merupakan faktor adanya degradasiyang cukup besar pada kontrol.Mekanisme mekanik diduga terjadi karenainkubasi dilakukan di shaking incubatorpada kecepatan 100 rpm. Mekanismedegradasi kimiawi pada kontrol didugamelalui hidrolisis dengan menggunakan

alkalin, karena Minimal Media (MM) yangdigunakan banyak mengandung garam darigolongan tersebut diantaranya adalahNaCl, MgCl.6H2O, CaCl2.2H2O, Na2SO4,KH2PO4 dan KCl. Sedangkan penggunaanMM sangatlah penting untuk pengujiandegradasi selulosa in vivo, karenadiharapkan sumber karbon dan energihanya berasal dari selulosa tersebut(Ljungdahl and Eriksson, 1985).Padapenelitian ini inkubasi dilakukan padasuhu 45°C untuk memicu ekpresi enzimselulase. Untuk menciptakan kondisi suhu45°C tersebut shaker ditutup rapat dengankardus. Penggunaan lampu dop tersebutdiduga dapat memberikan efek radiasi,walaupun gelas Erlenmeyer tempat prosesdegradasi sudah ditutup dengan kertaskarbon.

PENUTUP5.1 Kesimpulan1. Pada penelitian ini diperoleh 5 isolat yaitu

PP 127-A, PP 141-A, PP 146-A, PP 79-Ddan PP 91-A yang cenderung masuk kedalam genus Flavobacterium (PP 127-Adan PP 141-A), Lampropedia (PP 146-A),dan Halomonas (PP 79-D dan PP 91-A).

2. Berdasarkan uji HC, isolat PP127-A adalahisolat yang memiliki ratio HC tertinggikemudian berturut-turut diikuti oleh isolatPP 141-A, PP 91-A, dan PP 146-A.

3. Isolat PP 127-A juga menunjukkanpenurunan berat kering terbanyak pada ujiin vivo, kemudian secara berturut-turutdiikuti oleh isolat PP 79-D, PP 146-A, PP141-A,dan PP 91-A.

5.2 SaranPada penelitian ini masih banyak

aspek yang masih bisa dijadikan bahankajian pada penelitian yang lain. Aspekyang dapat dijadikan bahan kajian antaralain:1. Seberapa besar isolat bakteri dapat

mendegradasi selulosa crystalline (serbukselulosa, contoh avicel, sigmacel).

2. Apakah isolat yang diperoleh dapatmendegradasi selobiosa, selotriosa danoligoselulosa yang lain.

3. Bagaimana kemampuan isolat dalammendegradasi selulosa pada daun rumputgajah setelah dilakukan delignifikasi.

4. Apakah isolat bakteri yang diperolehdapat mendegradasi lignin danhemiselulosa

DAFTAR PUSTAKAAhmed, Z., Banu, H., Rahman, M. M.,

Akhter F., and Haque M. S.2001. Microbial activity on thedegradation of lignocellulosicpolysaccharides. Journal ofbiological sciences. 1(10):993-997.

Beguin, P. and Aubert, J. P. 1994. Thebiological degradation ofcellulose. FEMS MicrobiologyReviews, 13, 25-58.

Benoit, L., Cailliez, C., Petitdemange, E.& Gitton, J. (1992).Isolation ofcellulolytic mesophilic clostridiafrom a municipal solid wastedigestor. Microbia. Ecology.,23, 117-25.

Bhat, M. K. (2000). Cellulose and reletedenzymes in biotechnology.Biotecnology advanteces, 18,355-358.

Bhat, M.K. and S., Bhat. 1997. Cellulosedegrading enzymes and theirpotensial industrial applications.Biotechnology Advances, Vol.15, Nos. 3/4, pp. 583~20, 1997.

Brock, T. D., Madigan, M. T., Martinko, J.M., Parker, J. 1994. Biologyof microorganisms.Prantice Hall, EnglewoodCliffs.

Brown, M. R. Jr. 1996. The biosynthesisof cellulose. Journal macromolscience-pure applied chemistry.A33:1345-1373.

C. Cailliez, C., Benoit, L., Gelhaye, E.,Petitdemange, H., and Raval, G.1993. Solubilization of celluloseby mesophilic cellulolyticclostridia isolated from amunicipal solid-waste digester.Bioresource Technology, 43:77-83

Cappuccino, J,G. dan Sherman, N. 2001.Microbiology A LaboratoryManual. San Fransisco,Benjamin Cummings.

Claassen, P. A. M., et al. 1999. Utilisationof biomassa for the supply ofenergy carrier. Appliedmicrobiology andbiotechnology, 52, 741-755.

Colombatto, D. Mould, F. L., Bhat, M. K.,Morgavi, D. P., Beauchemin, K.A., and Owen, E. 2004.Influence of fibrolytic enzymeson the hydrolysis andfermentation of pure celluloseand xylan by mixed ruminalmicroorganisms in vitro.Ameciran society of animalscience. 81:1040-1050.

Coughlan, M. P. 1985. The properties offungal and bacterial cellulaseswith comment on theirproduction and application.Biotechnology GeneticEngginering. Review, 3, 39-109.

Davies, G., and Henrissat. 1995. Structuresand mechanism of glycosylhydrolases. Structure. 3:853-859.

Denman, S., Xue, G., and Patel, B. 1996.Characterisation ofNeocallomastix patriciarumcellulose cDNA (CelA)homologus to Tricoderma reeseicellobiohydrolase II. Applied.Environ. Microbiol, 62:1889-1896.

Dijkerman, R., Vervurem, M., Camp, H.,and Drif, C. van der. 1996.Adsorption characteristics ofcellulolytic enzymes from theanaerobic fungus Piromyces sp.Strain E2 on microcrystallinecellulose. Applied. Environ.Microbiol, 62:20-25

Dunca, S., Nimitan, E., Ailiesei, O.,Stefan, M., Olteanu, Z. 2000.Reports of University Iasi, Iasi,Romania.

Dwijoseputro. (2005). Dasar-dasarMikrobiologi. Djambatan :Malang

Eynde, H. A. D., Peer, Y. V. D. Perry, J.,and Wachter, R. D. 1990. 5srRNA sequences ofrepresentatives of the generaChlorobium,Prosthecochloris,Thermomicrobium, Cytophaga,Flavobacterium, Flexibacterand Saprospira and a discussionof the evolution of eubacteria ingeneral. Journal of GeneralMicrobiology.136: 11-18.

Fanutti, C., Ponyi, T., Black, G.,Hazlewood, G., and Gilbert, H.1995. The conservednoncatalytic 40-residuesequence in celluloses andhemicelluloses from anaerobicfungi functions as a proteindocking domain. JournalBiology Chemistry. 270:29314-29322.

Ferrera, I.R., Massana, R., Casamayor,E.O., Balague´ , V., Pedro´ s-Alio´ , C., Mas, J., 2004. Highdiversity biofilm for theoxidation of sulfidecontainingeffluents. Applied Microbiologyand Biotechnology.64:726–734.

Glazer, A. N., and Nikaido, H. 2007.Microbial biotechnology:fundamentals of appliedmicrobiology, second edition.Cambridge:USA

Gonggo, B. M., Hermawan, B., andAnggraeni, D. 2005. Pengaruhjenis tanaman penutup danpengolakan tanah terhadap sifatfisika tanah pada lahan alang-alang. Jurnal ilmu-ilmupertanian Indonesia. 7(1):44-55.

Han, Ye Jun and H. Z., Chen. 2007.Synergism between corn stoverprotein and cellulose. Enzymeand microbial technology,41,638-645.

Handayani, I. P. 2002. Laporan penelitianpendayagunaan vegetasi invasi

dalam proses agradasi tanahuntuk percepatan restorasilahan kritis. Lembaga penelitianUniversitas Bengkulu,Bengkulu.

Hankin, L., and Anagnostakis, S. L. 1997.Solid media containingcarboxymethylcellulose todetect Cx cellulase activity ofmicroorganisms. Journal ofgeneral microbiology. 98:109-115.

Hankin, L., Sands, D. C., and Hill, D. E.(1974). Relation of land use tosome degradative enzymaticactivities of soil bacteria. SoilScience:118: 38-44.

Harley dan Prescott. 2002. LaboratoryExercises in Microbiology.McGraw-Hill Company.

Haruta, S., Cui, Z., Huang Z., Li, M.,Ishii, M. and Igarashi, Y. 2002.Construction of a stable microbialcommunity with high cellulose-degradation ability. AppliedMicrobiol Biotechnol, 59:529–534

Hatami, S., Alikhani, H. A., Besharati, H.,Salehrastin, N., Afrousheh, M.,and Jahromi, Y. Z. 2008.Investigation on aerobiccellulolytic bacteria in some ofnorth forest and farming soils.American-Eurasian J. Agric. &Environ. Sci. 3 (5): 713-716

Hatfield, R. D. 1993. Cell wallpolysaccharide interactions anddegradability. Pages 285-314 inforage cell wall structure anddegesbility. H. G. Jung, D. R.Buxton, R. D. Hatfield, and J.Ralph, (ed).ASA-CSSA-SSSA,Madison, WI.

Heinze, T. 2005. Carboxymethyl ethers ofcellulose and starch-a review.Center of excellence forpolysaccharide research,Friedrich Schiller University,Germany.

Hendricks, C.W., J.D. Doyle and B.Hugley, 1995. A new solidmedia for enumeratingcellulose-utilizing Bacteria insoil. Environmental researchlaboratory, u.s. Environmentalprotection agency,1 andmantech environmentaltechnology, inc.,2 corvallis:Oregon

Hengstmann, U., Chin, K-J., Janssen, P.H.,Liesack, W., 1999. Comparativephylogenetic assignment ofenvironmental sequences ofgenes encoding 16S rRNA andnumerically abundant culturablebacteria from an anoxic ricepaddy soil. Applied andEnvironmental Microbiology.65:5050–5058.

Holt, J.G. 1994. Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriologyninth ed. Williams and Wilkins:USA

Jeschu, L. 1995. Celulaze de originemicrobiana. St. cerc. Biochim.38:65-78.

Kim, C. H., and Kim, D. S., 1995.Purification and specificity of aspecific endo-β-D-glucanase(Avicelase II) resembling exo-cellobiohydrolase from Bacilluscirculans. Enzyme andMicrobial Technology, 17: 248-254.

Klemm, D., Philipp, B., Heinze, T.,Heinze, U., Wagesknecht. 1998.Comprehensive cellulosechemistry, volume 1:fundamentals and analyticalmethods. Germany:Wiley-VCH.

Krause, D. O., Denman S. E., Mackie R.I., Morrison, M., Rae, A. L.,Attwood, G. T., andMacSweeney, S. C. 2003.Opportunities to improve fiberdegradation in rumen:microbiology, ecology, andgenomics. FEMS MicrobiologyReviews 27:663-696.

Landy, E. T., Mitchella, J. I., Hotchkissa,S., and Eatona, R. A. 2008.Bacterial diversity associatedwith archaeological waterloggedwood: Ribosomal RNA clonelibraries and denaturing gradientgel electrophoresis (DGGE).International Biodeterioration& Biodegradation.61:106–116.

Lay, B. 1994. Analisis Mikroba diLaboratorium. Raja GrafindoPersada. Jakarta.

Lee, Y.H., and L.T., Fan. 1982. Kineticstudies of enzymatic hydrolysisof insoluble cellulose : (II).Analysis of extended hydrolysistime. BiotechnologyBioengginering, 25,939-66.

Lehninger, A. L. 1982. Dasar-dasarbiokimia jilid 1. Jakarta:Erlangga.

Levin, D. B., Carere C. R., Cicek R., andSparling R. 2009. Challenges forbiohydrogen production viadirect lignocellulosefermentation. Internationaljournal of hydrogen energy,34:7390–7403.

Linder, M., and Teeri, T. 1997. The roleand fungtion of cellulose-binding domains. JournalBiotechnology, 57:15-28.

Ljungdahl, L. G. and Eriksson, K. E. 1985.Ecology of microbial cellulosedegradation. In: Marshall (Ed).Advances in microbial ecologyvol 8.

Llobet-Brossa, E., Rosello´ -Mora, R.,Amann, R., 1998. Microbialcommunity composition ofWadden sea sediments asrevealed by fluorescence in situhybridisation. Applied andEnvironmentalMicrobiology.64:2691–2696.

Lo, Y. C., Saralate, G. D., Chen, W. M.,Bai, M. D., and Chang, J. S.2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria andapplications of the cellulolytic

enzymes for cellulosicbiohydrogen production.Enzyme and microbialtehnology, 44:417–425

Lu, W.J., Wang, H., Yang, S., Wang, Z.and Nie, Y. 2005. Isolation andCharacterization of MesophilicCellulose-Degrading BacteriaFrom Flower Stalks- VegetableWaste Co-Composting System.J.Gen.Appl.Microbiol. 51: 353-360

Mandels, M. 1985. Aplication ofcellulases. Biochem SocietyTrans., 13, 414-16.

Matsui, H., Ushida, K., Miyazaki, K., andKojima, Y. 1998. Use of ratio ofdigested xylan to digestedcellulose (X/C) as an index offiber digestion in plant cell-wallmaterial by ruminalmicroorganisms. Animal feedscience technology, 71:207–215.

Mattinen, M. L. 1998. Structural andfunctional studies of fungalcellulose binding domain byNMR spectroscopy. Academicdissertation from University ofHelsinki, Finland.

McCammon, S.A., and Bowman, J.P.,2000. Taxonomy of AntarcticFlavobacterium species:description of Flavobacteriumgillisae sp. nov.,Flavobacterium tegetincola sp.nov. and Flavobacteriumxanthum sp. nov. mon. rev. andre-classification of[Flavobacterium] salengens asSalegentibacter salegens gen.nov., comb. nov. InternationalJournal of SystematicBacteriology.50:1055–1063.

Moracci, M., Ponzano, B. C., Trincone,A., Fusco S., De Rosa, M., Vander Oost, J., Sense C. W.,Carlobois R. L., and Rossi, M.2000. Identification andmolekuler characterization ofthe first alpha –Xylosidase from

an Archaeon. J. Biol. Chem.275:22082-22089.

Mulcahy. 1996. An investigation ofcellulose Binding Domain innon-celululose binding domainsin non-cellulolytic enzymes.Final year project university ofLimerick.

O’Sullivan, L.A., Weightman, A.J., Fry,J.C., 2002. New degenerateCytophaga–Flexibacter-Bacteroides-specific 16Sribosomal DNA-targetedoligonucleotide probes revealhigh bacterial diversity in riverTaff epilithon. Applied andEnvironmentalMicrobiology.68:201–210.

Okaraonye, C. C., and Ikewuchi, J. C.2009. Nutritional andantinutritional components ofPennisetum purpureumSchumach. Pakistan journal ofnutritional 8(1): 32-34.

Palonen, H. 2004. Role of lignin in theenzymatic hydrolysis oflignocelluloses. Disertation atUniversity ofTechnology.Helsinki Finland.

Rodrigues, M. A. M., Cone, J. W., vanGelder, A. H., Sequieria, J. C.,and Fonseca, A. M. 2003. Theeffect of cellulose crystallinityon the in vitro digestibility andfermentation kinetics ofmeadow hay and barley, wheatand rice straws. Journal of thescience of food andagriculture,83:652-657.

Sanderson, M. A. and R. A., Paul. 2008.Perennial forages as secondgeneration bioenergy crops.International Journal ofMolecular Sciences, 9, 768-788.

Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umumedisi keenam. Yogyakarta :Gajah Mada University Press.

Sequeira, C. A., and Sequeira, J. C. 1993.Bacterial adhesion to fibreduring in vitro degradations

under varying osmotic pressure.Anim feed sciencetechnology,41:65-72.

Sjostrom, E. 1995. Kimia kayu, dasar-dasar dan penggunaan. edisikedua. Yogyakarta: Gajah MadaUniversity Press.

Srinivasan, M. C., 1992. Lignocellulosesbiotechnology: Recent advanceand technology prospects.In:New trends abiotechnology.R. N. S. Subba, C. Balagopalanand S. V. Ramakrishna (Ed). Pp315-320. Oxford and IBHpublishing Co. Pvt. Ltd., NewDelhi, India.

Strezos, V., J. E. Tim, H., Cris. 2008.Thermal conversion of elephantgrass (Pennisetum PurpureumSchum) to bio-gas, bio-oil andcharcoal. BioresourceTechnology, 99 (2008) 8394–8399.

Sudiana, I. M., Kanti, A., Rahmansyah,M., Widawati, S., Suliasih,Rahayu R. W., and Imanuddin,H. 2002. Populasi dankarakterisasi bakteri selulotikyang diisolasi berbegaiketinggian lokasi di tamannasional gunung Halimun.Laporan teknik proyekinventarisasi dan karakterisasisumberdaya hayati, Puslitbiologi-LIPI, Indonesia.

Sun, Y., and J., Cheng. 2002. Hydrolysisof lignocelluloses material forethanol production: a review.Bioresource technology, 83, 1-11.

Tjitrosoepomo, G. 2004. Taksonomitumbuhan (spermatophyta).Yogyakarta: Gajah MadaUniversity Press.

Tomme, P., Waren, R., Miller, R., Kilburn,D., and Gilkes, N. 1995.Cellulose binding domains:Clasification and properties. In:Saddler. J., and Penner M. (Ed).Enzymatic degradation of

insoluble carbohydrates.American chemical society,Washington DC, 618:143-163.

Varnaite, R., Paskevicius, A., andRaudoniene, V. 2008. Cellulosedegradation in rye straw bymicromycetes and theircomplexes. Ekologija 54 (1):29-31.

Walker, L. P., and D.B. Wilson. 1991.Enzymatic hydrolysis ofcellulose: an overview.Bioresource Technology, 36(1991) 3-14.

Widdel, F., and F. Bak. 1992. Gram-negative mesophilicsulfatereducing bacteria, p.3352-3378. In A. Balows, H. G.Truper, M. Dworkin, and K.-H.Schleifer (ed.), The prokaryotes,2nd ed., vol. IV. Springer-Verlag, New York.

William R. and N. S., Govind. 2003.Identification of carbohydratedegrading bacteria in sub-tropicalregions. Rev. Biol. Trop., 51,Supl. 4: 205-210.

Wilson, J. R. and Mertens, D. R. 1995.Cell wall accessibility and cellstructure limitations to microbialdigestion of forage. Crop sci.35:251-259.

Wood, T. M. 1985. Properties ofcellulolytic enzyme systems.Biochem Society Trans, 13, 407-10.

Woodard, K.R., and G.M., Prine, 1993.Dry matter accumulation ofelephantgrass, energycane andelephantmillet in a subtropicalclimate. Crop Science, 33, 818–824.

www. flickr.com Diakses pada tanggal 5Januari 2009 pukul 21.13 WIB

www.astbury.leeds.ac.uk/history/astbury18.htm diakses pada 10 Juni 2010pada pukul 18.15 WIB

www.biomassmagazine.com/images/upload/20080403103622.jpg diakses

pada 10 Juni 2010 pada pikul19.09 WIB

Yang, C., Niu, Y., Su, H., Wang, Z., Tao,F., Wang, X., Tang, H., Ma, C.,and Xu, P. 2010. A novelmicrobial habitat of alkalineblack liquor with very highpollution load: microbialdiversity and the key membersin application potentials.Bioresaouce technology.101:1737-1744.

Yang, V. C., Linhardt, R. J., Bernstein, H.,Cooney, C. L. and Langer, R.(1985) Purification andcharacterization of heparinasefrom Flavobacteriumheparinum. J. Biol. Chem.260,1849-1857.

Zhang Y. H. P., and Lynd, R. L. 2004.Kinetics and relative importanceof posphorylytic and hydrolyticcleave of cellodextrins andcellobiose in cell extracts ofClostridium thermocellum.Appl. Environ. Microbiol. 70:1563-1569.

Zverlova, V. V., Holl, W., and Schwarz,H. 2003. Enzymes for digestionof cellulose and otherpolysaccharides in the gut oflonghorn beetle larvae, Rhagiuminquisitor L. (Col.,Cerambycidae). Internationalbiodeterioration &biodegradation. 51:175–179.