ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi,...

96
UNIVERSITAS INDONESIA ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN TOKSISITAS MENGGUNAKAN Artemia salina Leach DARI FRAKSI AKTIF EKSTRAK METANOL DAUN JAMBO-JAMBO [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.] SKRIPSI NURLISA DWI NOVIANTI 0806327950 FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM SARJANA REGULER FARMASI DEPOK JULI 2012 Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Transcript of ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi,...

Page 1: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

 

UNIVERSITAS INDONESIA

ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN TOKSISITAS MENGGUNAKAN Artemia salina Leach DARI FRAKSI AKTIF

EKSTRAK METANOL DAUN JAMBO-JAMBO [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.]

SKRIPSI

NURLISA DWI NOVIANTI 0806327950

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM SARJANA REGULER FARMASI

DEPOK JULI 2012

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 2: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

ii 

 

UNIVERSITAS INDONESIA

ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN TOKSISITAS MENGGUNAKAN Artemia salina Leach DARI FRAKSI AKTIF

EKSTRAK METANOL DAUN JAMBO-JAMBO [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.]

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi

NURLISA DWI NOVIANTI 0806327950

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM SARJANA REGULER FARMASI

DEPOK JULI 2012

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 3: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 4: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 5: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 6: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

vi 

 

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillahirobbil’alamiin, puji syukur saya haturkan kepada Alloh

SWT penguasa bumi dan langit beserta isinya yang tak pernah lelah mencurahkan

segenap rahmat, taufik, dan hidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian guna menyusun tugas akhir atau skripsi ini. Penulisan skripsi ini

dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar

Sarjana Farmasi pada Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.

Saya menyadari bahwa tanpa bimbingan, bantuan, dan doa dari berbagai

pihak mulai dari awal perkuliahan sampai pada penelitian dan penyusunan skripsi

ini maka sangatlah sulit saya untuk mengerjakan dan menyelesaikannya. Oleh

karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada :

1. Dr. Berna Elya, M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing dari fakultas

Farmasi-UI dalam penelitian ini atas segala bimbingan dan sarannya dan

Dra. Puspa Dewi N.L., M.Eng., selaku pembimbing penelitian di

Laboratorium Bahan Alam Puslit Kimia, LIPI-Serpong, yang dengan sabar

membimbing, memberikan ilmu dan pengarahan selama penelitian di

Lanoratorium BAPF Puslit Kimia LIPI-Serpong.

2. Pusat Penelitian Kimia LIPI-Serpong atas izin yang diberikan kepada

penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium Bahan Alam & Produk

Farmasi serta dukungan fasilitas dan dana yang diberikan selama penelitian.

3. Bapak M. Hanafi selaku kepala bidang Laboratorium Bahan alam dan

Produk Farmasi, Pusat Penelitian Kimia LIPI-Serpong.

4. Bapak Akhmad Darmawan, M.Sc., atas segenap ilmu yang diberikan dalam

pembelajaran NMR dan saran yang luar biasa selama penelitian.

5. Prof. Dr. Yahdiana Harahap, MS., selaku Ketua Departemen Farmasi UI.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 7: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

vii 

 

6. Prof. Dr. Effionora Anwar, MS., selaku pembimbing akademis.

7. Seluruh Staf Puslit Kimia LIPI-Serpong terutama Ibu Lia, Ibu Mega, Ibu

Lala, Bapak Udin dan Bapak M. Ghozali atas saran dan bimbingannya

selama penelitian.

8. Seluruh dosen/staf pengajar di Departemen Farmasi UI atas segala ilmu dan

bimbingannya selama masa perkuliahan.

9. Orang tua tercinta, Bapak H Johny Nurharyanto E.S., S.Sos., M.Si. dan Ibu

Hj Siti Anisah, S.Ag. atas limpahan perhatian, kasih sayang, doa dan

dukungan moral maupun material yang tiada hentinya diberikan selama 22

tahun ini. Kakak dan adik, Pamelia Rahma Kartika sari dan Arrijal

Dewantara atas dukungan dan kasih sayangnya.

10. Teman-teman seperjuangan Bahan Alam 2012 dalam melakukan penelitian

untuk tugas akhir, skripsi maupun tesis : Dewi Murni, Ziyadah Fitriana,

Irwanto, Kak Dilla Fairusi, Nurul dan Ibu Dwi atas berbagai ilmu, bantuan,

kasih sayang dan dukungannya selama kurang lebih 4 bulan di laboratorium

BAPF LIPI-Serpong, serta kepada Oksa Rezza atas perhatian dan

bantuannya selama penyusunan skripsi ini.

11. Teman-teman seperjuangan : FARMASI UI 2008 atas suka duka selama

menempuh pendidikan, khususnya untuk sahabat tersayang dalam senyuman

dan tangisan Nisa, Dian dan Neti. Kawan seatap Ima, Iri, Septi dan Kak Ika.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa penulis bukanlah makhluk yang

sempurna, yang tak lepas dari kesalahan dan dosa. Penulis mengucapkan mohon

maaf atas segala kesalahan dalam tutur kata maupun perbuatan. Penulis berharap

Alloh SWT membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu selama

perkuliahan, penelitian dan penyusunan skripsi. Semoga skripsi ini membawa

manfaat bagi ilmu pengetahuan dan masyarakat.

Wassalamu’alaikum Wr. Wb.

Penulis

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 8: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 9: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

ix 

 

ABSTRAK Nama : Nurlisa Dwi Novianti

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi, Uji Antioksidan dan Toksisitas Menggunakan Artemia salina Leach dari Fraksi Aktif Ekstrak Metanol Daun Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.]

Keunikan biodiversitas pegunungan Mekongga telah menarik perhatian banyak peneliti. Tim konservasi dari Amerika dan Indonesia telah menemukan sejumlah tanaman mengandung zat yang memiliki aktivitas antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa kimia yang menyebabkan tanaman-tanaman lain memiliki potensial sebagai antikanker berdasarkan uji pendahuluan terhadap aktivitas antioksidan dan efek toksik, salah satunya adalah Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.]. Aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan kemampuan meredam radikal bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), sedangkan efek toksik dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Daun Jambo-Jambo diekstraksi dengan pelarut metanol dan dipartisi menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat, butanol dan metanol. Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak metanol mempunyai potensi toksik terhadap larva Artemia salina dengan nilai LC50 243,5 ppm dan aktivitas antioksidan senilai IC50 12,59 ppm. Isolasi dilakukan terhadap fraksi etil asetat menggunakan kromatografi kolom silika dan kromatotron. Senyawa murni yang diperoleh diidentifikasi struktur kimianya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, IR, NMR dan LCMS. Didukung dengan data hasil penapisan kimia, diduga senyawa tersebut golongan flavonoid yang mempunyai berat molekul 478.

Kata Kunci : antioksidan, toksisitas, Kjelbergiodendron celebicus (Koord)

Merr., BSLT, DPPH xv + 78 halaman : 13 gambar; 8 tabel; 5 lampiran Daftar Pustaka : 57 (1958-2012)

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 10: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

 

ABSTRACT

Name : Nurlisa Dwi Novianti

Program Study : Pharmacy

Tittle : Isolation, Antioxidant Assay and Toxicity using Brine Shrimp Lethality Test from Active Fraction of Methanolic Extract of Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. Leaves]

The unique biodiversity of Mekongga mountains have attracted many researches. Conservation team from US and Indonesia have discovered a number of plants growing on Mekongga mountains which have anticancer activity. This study is aimed to identify chemical compounds which have anticancer activity based on preliminary testing of the antioxidant activity and toxic effects, one of them is Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.]. The antioxidant activity of Jambo-jambo leaves was measured by its ability to scavenge free radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), whereas the toxic effect was analyzed by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Jambo-Jambo leaves was extracted using methanol solvent and its methanolic extract was partitioned using the n-hexane, ethyl acetate, buthanol and methanol. Test results showed that the LC50 and IC50 value of its methanolic extract was 243,5 and 12,59 ppm. The ethyl acetate fraction which showed the best activity was isolated using silica column chromatography and chromatotron. Pure compounds was obtained by the chemical structures were identified using Spectrofotometer UV-Vis, IR, NMR and LCMS. Supported by data on the results of chemical screening, the compounds were suspected as flavonoid compound which has molecular weight 478.

Keywords : antioxidant, toxicity, Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr., BSLT, DPPH

xv + 78 pages : 13 figures; 5 table; 5 appendixes

References : 54 (1958-2012)

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 11: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

xi 

 

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .............................................................................................. ii HALAMAN PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME .............................. iii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................... iv HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... v KATA PENGANTAR ...................................................................................... vi HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ........................................... viii ABSTRAK ........................................................................................................ ix ABSTRACT ...................................................................................................... x DAFTAR ISI ....................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiii DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xv 1. PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 1 1.2 Tujuan Penelitian .......................................................................................... 3 1.3 Manfaat Penelitian ........................................................................................ 4 2. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... 5 2.1 Suku Myrtaceae ............................................................................................ 5 2.2 Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. ............................................... 5 2.3 Simplisia dan Ekstrak ................................................................................... 7 2.4 Fraksinasi dan Isolasi .................................................................................... 9 2.5 Penapisan Fitokimia ...................................................................................... 16 2.6 Antioksidan ................................................................................................... 19 2.7 Toksisitas ...................................................................................................... 26 2.8 Instrumen ...................................................................................................... 27 3. METODE PENELITIAN ................................................................................ 30

3.1 Lokasi Penelitian .......................................................................................... 30 3.2 Bahan dan Alat .............................................................................................. 30 3.3 Cara Kerja ..................................................................................................... 31

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 40

4.1 Penyiapan Bahan ........................................................................................... 40 4.2 Ekstraksi dan Partisi ..................................................................................... 40 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan ............................................................................ 42 4.4 Uji Toksisitas ................................................................................................ 44 4.5 Penapisan Fitokimia ..................................................................................... 46 4.6 Isolasi Senyawa Aktif .................................................................................. 48 4.7 Identifikasi Struktur Kimia .......................................................................... 52

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 12: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

xii 

 

5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................... 58 5.1 Kesimpulan ................................................................................................... 58 5.2 Saran .............................................................................................................. 58

DAFTAR ACUAN .................................................................................................. 59 

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 13: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

xiii 

 

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Tanaman Kjelbergiodendron celebicus ...................................... 5 Gambar 2.2. Reaksi Peredaman Radikal Bebas DPPH oleh Antioksidan ........... 23 Gambar 2.3. Pembentukan radikal ABTS●+ stabil dari ABTS+K2S2O8 ........... 24 Gambar 2.4. Mekanisme Reduksi [Fe(TPTZ)2

3+] oleh Antioksidan ................ 26 Gambar 3.1. Skema Ekstraksi dan Partisi ............................................................. 63 Gambar 3.2. Skema Fraksinasi dan Isolasi Senyawa Aktif .................................. 64 Gambar 4.1. Kurva Konsentrasi Dan % Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil

Partisi Ekstrak Daun Kjelbergiodendron Celebicus pada Uji Antioksidan terhadap Radikal Bebas DPPH .......................... 65

Gambar 4.2. Kurva Log Konsentrasi dan % Mortalitas fraksi-fraksi hasil partisi ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus pada uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach ...................................... 65

Gambar 4.3. Kurva konsentrasi dan % inhibisi Fr11.32a pada uji antioksidan ....................................................................................... 66

Gambar 4.4. Kurva log konsentrasi dan % mortalitas Fr11.32a pada uji toksisitas ........................................................................................... 66

Gambar 4.5. Pola Kromatogram Fr11.32 .............................................................. 50 Gambar 4.6. Spektrum Infra Merah Fr 11.32a ................................................ 55 Gambar 4.7. Struktur Dasar Flavonoid ........................................................... 57

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 14: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

xiv 

 

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Jenis-Jenis Bahan Penyerap Fase Diam pada KLT ....................... 13 Tabel 4.1. Data Persentase Rendemen Ekstrak ................................................... 41 Tabel 4.2. Data Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak dari Daun

Kjelbergiodendron celebicus dengan Metode DPPH ................... 43 Tabel 4.3. Data Hasil Uji Toksisitas Daun Kjelbergiodendron celebicus

dengan Metode BSLT ................................................................... 46 Tabel 4.4. Data Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Metanol Awal dan

Fraksi Etil Asetat Daun Kjelbergiodendron celebicus ..................... 48 Tabel 4.5. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dan Uji Toksisitas Fraksi-

Fraksi Hasil Kromatografi Kolom Cepat ......................................... 67 Tabel 4.6. Data Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Fr11.32a .............................. 50 Tabel 4.7. Data Hasil Uji Toksisitas Fr11.32a .................................................... 50

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 15: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

xv 

 

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi daun Kjelbergiodendron celebicus .................. 68 Lampiran 2. Kurva Optimasi Panjang Gelombang DPPH ............................... 69 Lampiran 3. Spektrum LC-MS dari Fr11.32a .................................................... 70 Lampiran 4. Spektrum 13C NMR dari Fr11.32a ................................................ 72 Lampiran 5. Spektrum 1H-NMR dari Fr11.32a .................................................. 75

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 16: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

1

 

  Universitas Indonesia

 

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pegunungan Mekongga merupakan sebuah wilayah tertinggi di daratan

provinsi Sulawesi Tenggara. Secara geografis posisinya terletak di dua wilayah

kabupaten, yaitu kabupaten Kolaka Utara dan Kolaka. Secara geologis, wilayah

pegunungan ini terbentuk dari atol yang terangkat sekitar ratusan juta tahun lalu

sehingga membentuk kawasan karst dataran tinggi yang sangat indah. Fenomena

ini memungkinkan berbagai jenis flora dan fauna khas yang kemudian menjadi

biodiversiti yang unik di wilayah ini sekaligus menjadi daya tarik bagi para

peneliti. Mekongga memiliki potensi sumber daya alam yang harus dipertahankan

keberadaannya. Berbagai hewan endemik dan langka banyak hidup disini. Hal ini

sangat berguna dalam ilmu pengetahuan, bahkan sangat berguna di bidang

kesehatan. Tim konservasi menemukan sejumlah tanaman di pegunungan ini

mengandung zat yang positif dapat membunuh virus kanker (Kendari Pos, 2011).

Tim International Cooperative Biodiversity Grup (ICBG) dari Amerika

bekerja sama dengan tim peneliti LIPI-Cibinong mengonservasi flora fauna

pegunungan Mekongga secara bertahap mulai tahun 2009. Hasil eksplorasi

dikirim ke laboratorium Puslit Kimia LIPI-Serpong untuk diidentifikasi. Ekstrak

metanol awal dari seluruh tanaman tersebut diuji aktivitas antioksidan dengan

metode peredaman 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan uji toksisitas dengan

metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) di LIPI-Serpong. Sedangkan uji

antibakteri dilakukan di LIPI-Cibinong dan uji antikanker dilakukan di Amerika.

Data uji aktivitas antioksidan dan uji toksisitas LIPI-Serpong menunjukkan

beberapa tanaman aktif sebagai antioksidan dan bersifat toksik. Uji antioksidan

dan toksisitas biasa digunakan sebagai uji pendahuluan terhadap antikanker.

Apabila suatu sampel bersifat aktif sebagai antioksidan dan bersifat toksik maka

sampel berpotensi sebagai antikanker. Hal tersebut mendorong tim peneliti untuk

meneliti lebih lanjut guna mengetahui fraksi dan senyawa aktif pada tanaman-

tanaman yang berpotensial tersebut. Pada penelitian ini, dilakukan identifikasi

lebih lanjut tanaman Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. yang pada

1

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 17: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

2

 

  Universitas Indonesia

 

pengujian awal juga menunjukkan aktivitas antioksidan dan bersifat toksik.

Tanaman ini merupakan salah satu tanaman khas Sulawesi yang keberadaannya

mulai langka karena jenis kayu ini berpotensial sebagai kayu ramuan (bahan

bangunan) yang banyak ditebang secara liar oleh pihak tak bertanggung-jawab.

Dalam beberapa tahun terakhir ini, banyak perhatian ditujukan kepada

radikal bebas. Reactive oxygen species (ROS) merupakan jenis radikal bebas

paling banyak dan berkaitan dengan sejumlah kerusakan jaringan/organ yang

dipicu oleh senobiotik, iskemia, aktivasi leukosit, paparan UV dan lain-lain

(Mena, Ortega dan Estrela, 2009). Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan

molekul yang sangat reaktif yang berasal dari metabolisme oksigen. ROS (radikal

superoksida, radikal hidroksil, hidrogen peroksida) dihasilkan sebagai produk

reaksi biologis atau dari faktor eksogen (Chanda dan Dave, 2009).

Ketidakseimbangan antara jumlah ROS dan kemampuan tubuh mengendalikan

ROS atau memperbaiki kerusakan yang diakibatkan oleh ROS menyebabkan

keadaan stress oksidatif. Stress oksidatif merupakan mekanisme patofisiologi

yang berbahaya karena dapat mengakibatkan berbagai penyakit seperti kanker,

aterosklerosis, malaria, arthritis rheumatoid dan penyakit-penyakit

neurodegeneratif (Mena, Ortega dan Estrela, 2009).

Antioksidan berfungsi melindungi tubuh terhadap radikal-radikal bebas

sehingga antioksidan penting dalam memelihara kesehatan (Arts, Haenen, Voss

dan Bast, 2004). Keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan diperlukan

untuk memelihara fungsi fisiologis tubuh. Oleh karena itu, pemberian sumber

antioksidan dari luar perlu dilakukan untuk membantu tubuh mengatasi stress

oksidatif ini. Antioksidan sintesis seperti BHA (butylated hydroxyanisole) dan

BHT (butylated hydroxytoluene) baru-baru ini dilaporkan berbahaya bagi

kesehatan manusia (Lobo, Patil, Phatak dan Chandra, 2010). Oleh karena itu,

penggunaan antioksidan alami menjadi alternatif utama.

Antioksidan alami menarik perhatian untuk diteliti karena keamanan dan

potensi efek terapetiknya. Penelitian mengenai tumbuhan yang memiliki aktivitas

antioksidan telah diintensifkan (Rufino, Alves, Fernandes dan Brito, 2010).

Terlebih lagi, Indonesia sebagai negara tropis mempunyai keanekaragaman hayati

yang tinggi. Berdasarkan survey, Indonesia yang memiliki 13-15% dari seluruh

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 18: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

3

 

  Universitas Indonesia

 

jenis tanaman di dunia atau sekitar 35.000-40.000 jenis tanaman (Pusat Penelitian

Biologi-LIPI, 2011).

Pengujian antioksidan senyawa-senyawa bahan alam dapat dilakukan

dengan menggunakan DPPH sebagai senyawa radikal bebas stabil yang

ditetapkan secara spektrofotometri. Kapasitas antiradikal bebas DPPH diukur dari

peredaman warna ungu merah dari DPPH pada panjang gelombang 515 nm. Suatu

bahan dikatakan aktif sebagai antioksidan bila dapat meredam radikal DPPH

sebesar 50% dengan konsentrasi kurang dari 1000 µg/mL (Blois, 1958). Daun

Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. diekstraksi menggunakan metanol

dan selanjutnya dipartisi secara secara gradien dengan pelarut n-heksana, etil

asetat, n-butanol, dan metanol membentuk lima fraksi dan fraksi teraktif

dipisahkan menggunakan kromatografi kolom. Fraksi-fraksi tersebut dilakukan

pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode peredaman radikal bebas

DPPH dan pengujian toksisitas menggunakan metode BSLT. Isolasi senyawa aktif

dilakukan terhadap fraksi-fraksi aktif yang memiliki aktivitas antioksidan dan

bersifat toksik. Senyawa yang diperoleh diidentifikasi dengan spektrofotometri

ultraviolet dan cahaya tampak (UV-Vis), spektrofotometri inframerah (IR),

kromatografi cair - spektroskopi massa (LC-MS) dan spektrofotometri resonansi

magnetik inti (NMR) serta diuji kembali aktivitas antioksidan dan toksisitasnya.

1.2 Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :

a. Mengukur aktivitas antioksidan dan toksisitas ekstrak metanol daun

Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.

b. Mengukur aktivitas fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan dan toksisitas

paling tinggi.

c. Mengidentifikasi senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi aktif yang

menunjukkan aktivitas antioksidan dan toksisitas paling tinggi.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 19: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

4

 

  Universitas Indonesia

 

1.3 Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah

mengenai daun Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.] yang

hingga saat ini belum ditemukan literaturnya serta untuk memperkaya khasanah

pengetahuan mengenai tanaman obat yang berada di Indonesia.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 20: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

5

 

  Universitas Indonesia

 

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Suku Myrtaceae

Sebagian besar terdiri atas tumbuhan yang berupa semak-semak atau pohon-

pohonan yang berbatang berkayu, jarang sekali berupa terna. Daunnya tunggal

tanpa daun penumpu yang terletak menyebar atau berhadapan. Sebagian besar

bunga aktinomorf, hemaprodit dengan empat hingga lima daun kelopak dan juga

memiliki empat hingga lima buah daun mahkota. Di bagian atas daun-daun

mahkotanya seringkali berlekatan. Benang sari berkelompok berhadapan dengan

daun mahkota yang jumlahnya sedikit dan terkadang dengan tangkai sari yang

berwarna nyata. Bakal buah tenggelam dengan saatu tangkai putik, beruang satu

dengan tiga tembuni yang menonjol ke dalam. Dapat pula beruang lebih dari satu,

dua hingga lima, dengan delapan hingga satu bakal biji dalam tiap ruang. Buah

sangat bermacam-macam, dapat berupa buah buni, buah keras, buah batu, biji

dengan endosperma atau tidak. Dalam organ tumbuhannya seperti daun,

seringkali terdapat ruang berisi minyak atsiri (Citrosupomo, 1994).

2.2 Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.

[Sumber : Koleksi penulis, 2012]

Gambar 2.1. Tanaman Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr

5

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 21: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

6

 

  Universitas Indonesia

 

2.2.1 Taksonomi

Secara taksonomi, tanaman Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.

diklasifikasikan sebagai berikut (Kebun Raya Bogor Plant List dan LIPI, 2006) :

Kerajaan : Plantae

Divisi : Magnoliophyta (Angiospermae)

Kelas : Magnoliopsida (Dicotyledoneae)

Bangsa : Myrtales

Suku : Myrtaceae

Marga : Kjelbergiodendron

Jenis : Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.

Nama Daerah : Jambo-Jambo, Bungur, Bungur Bumbung, Tombe Uwa

2.2.2 Morfologi Tumbuhan

Pohon Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. berbentuk model Koriba,

yakni pada batang pokok tampak letak kelompok cabang yang pertama

bertentangan arahnya dengan kelompok cabang kedua dan seterusnya, sehingga

pertumbuhan batang tampak zig-zag (LIPI, 2006). Penampilan bagian luar batang

bertipe batang menyerpih seperti kertas. Daun bertipe majemuk menjari dan

susunan daun pada ranting berhadapan silang. Bangun umum helai daun

berbentuk lanset sungsang dengan ujung daun yang tumpul dan pangkal daun

yang berbentuk pasak. Pertulangan daun menyirip dengan urat daun dan sejajar

dengan tepi daun.

2.2.3 Distribusi Geografis, Habitat dan Ekologi

Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. merupakan tanaman khas

Sulawesi yang keberadaannya di alam semakin menipis (LIPI, 2002).

2.2.4 Kandungan Kimia dan Kegunaan

Hingga tahun 2012 belum ditemukan publikasi mengenai kandungan kimia

daun Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. Batang dari pohon ini biasa

digunakan masyarakat sekitar sebagai kayu untuk bahan bangunan (LIPI, 2002).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 22: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

7

 

  Universitas Indonesia

 

2.3 Simplisia dan Ekstrak

2.3.1 Simplisia

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang belum

mengalami pengolahan apapun dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan alam

yang dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi simplisia nabati, simplisia hewani

dan simplisia pelikan (mineral). Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa

tanaman utuh, bagian tanaman tertentu atau eksudat tanaman. Simplisia nabati

harus bebas dari serangga, fragmen hewan atau kotoran hewan; tidak boleh

menyimpang bau dan warnanya; tidak boleh mengandung lendir dan cendawan,

atau menunjukkan tanda-tanda pengotoran lain; tidak boleh mengandung bahan

lain yang beracun atau berbahaya. Jika dalam beberapa hal khusus ada sedikit

penyimpangan dari beberapa ketentuan mengenai morfologik dan mikroskopik

yang tertera dalam Materia Medika Indonesia, sedangkan semua persyaratan lain

dipenuhi maka simplisia yang bersangkutan dapat dianggap memenuhi

persyaratan Materia Medika Indonesia (Depkes, 1995).

Materia Medika Indonesia berlaku sebagai pedoman untuk simplisia yang

akan dipergunakan untuk keperluan pengobatan, tetapi tidak berlaku bagi bahan

yang dipergunakan untuk keperluan lain yang dijual dengan nama yang sama.

Namun simplisia nabati secara umum merupakan produk hasil pertanian

tumbuhan obat setelah melalui proses pasca panen dan proses preparasi secara

sederhana menjadi bentuk produk kefarmasian yang siap dipakai atau siap

diproses selanjutnya, yaitu (Depkes, 2000) :

a. Siap dipakai dalam bentuk serbuk halus untuk diseduh sebelum diminum

(jamu).

b. Siap dipakai untuk dicacah dan digodok sebagai jamu godokan (infus).

c. Diproses selanjutnya untuk dijadikan produk sediaan farmasi lain yang

umumnya melalui proses ekstraksi, separasi dan pemurnian, yaitu menjadi

ekstrak, fraksi atau bahan isolat senyawa murni.

2.3.2 Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 23: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

8

 

  Universitas Indonesia

 

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan. Sebagian besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku obat

secara perkolasi. Seluruh perkolat biasanya dipekatkan secara destilasi dengan

pengurangan tekanan, agar bahan sesedikit mungkin terkena panas.

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisahkan dari bahan yang tidak bisa larut dengan pelarut cair.

Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan

senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain.

Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke

dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Struktur kimia

yang berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa-

senyawa tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat dan derajat

keasaman. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan

mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat. Ekstraksi dengan

menggunakan pelarut dibedakan menjadi dua golongan, yakni cara dingin dan

cara panas yang didasarkan pada kestabilan senyawa kimia dalam simplisia.

Berikut adalah metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut (Depkes, 2000) :

2.3.2.1 Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut dengan

beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (suhu

kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode

pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti

dilakukan pengadukan yang kontinyu (terus-menerus). Remaserasi berarti

dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan

maserat pertama dan seterusnya.

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstrasi dengan pelarut selalu baru sampai sempurna

(exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan.

Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap meserasi antara, tahap

perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus-menerus

sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 24: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

9

 

  Universitas Indonesia

 

2.3.2.2 Cara panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya

selama waktu tertentu dan jumlah pelarutnya terbatas yang relatif konstan

dengan adanya pendinginan balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses

pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses

ekstraksi sempurna.

b. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu

dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu pada

umumnya dilakukan pada temperature 40o-50o C.

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur yang terukur

(96o-98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai

titik didih air selama 30 menit.

2.4 Fraksinasi dan Isolasi Ekstrak

Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan

golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain. Senyawa yang

bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan senyawa non-polar akan masuk ke

pelarut non-polar (Harbone, 1987). Dari proses fraksinasi ini dapat diduga sifat

kepolaran dari senyawa yang akan dipisahkan. Berbagai metode kromatografi

memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Gagasan dasarnya

sederhana untuk dipahami, caranya beragam mulai dari cara sederhana sampai

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 25: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

10

 

  Universitas Indonesia

 

yang agak rumit dari segi kerja dan peralatan dan metode ini dapat dipakai untuk

setiap jenis senyawa (Gritter, Bobbit dan Schwarting, 1991).

Kromatografi merupakan suatu teknik analisis biokimia berdasarkan

metode pemisahan yang memerlukan waktu relatif singkat dan tidak

membutuhkan alat yang rumit dibandingkan dengan metode pemisahan lainnya.

Dikenal dua fase pada kromatografi, yaitu fase mobil atau fase gerak yang

membawa sampel dan fase stasioner atau fase diam yang menahan sampel. Jika

fase geraknya berupa cairan maka disebut kromatografi cair; dan jika fase

geraknya berupa gas maka disebut kromatografi gas. Teknik pemisahan

kromatografi yang sering digunakan ialah kromatografi adsorpsi dimana teknik

pemisahannya didasarkan pada interaksi yang didominasi oleh mekanisme

adsorpsi dari komponen dalam sampel terhadap fase diam dan fase gerak

(Bintang, 2010).

Suatu metode pemisahan yang terbaik untuk memisahkan campuran dalam

jumlah banyak yaitu menggunakan kromatografi kolom. Kolom kromatografi diisi

dengan penyerap berupa zat padat seperti alumunina atau silika gel yang dialiri

dengan satu pelarut atau menggunakan perbandingan dua atau beberapa pelarut.

Campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas kolom penyerap,

pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom. Pita senyawa pelarut

bergerak melalui kolom dengan laju berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa

fraksi yang keluar dari kolom (Hardjono, 1991).

Jika kita menangani senyawa tak bewarna, eluen yang keluar dari dasar

kolom harus dipantau untuk mengetahui dimana linarut itu berada. Hal ini dapat

dilakukan secara terus menerus dengan memakai detektor yang cocok atau dengan

membagi eluen menjadi sejumlah cuplikan yang berurutan dan menganalisisnya,

biasanya dengan kromatografi lapis tipis (KLT), atau dengan menimbang masing-

masing fraksi setelah pelarutnya diuapkan. Kromatografi lapis tipis dan kertas

lebih sering dikembangkan dengan pelarut tunggal atau campuran pelarut yang

tetap, sedangkan kromatografi kolom dikembangkan dengan campuran pelarut

yang terus menerus berubah dengan cara landaian (Gritter, Bobbit dan

Schwarting, 1991).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 26: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

11

 

  Universitas Indonesia

 

2.4.1. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom klasik merupakan yang tertua dari cara kromatografi,

dan seperti yang dipraktikkan secara tradisional, merupakan bentuk kromatografi

cair. Fase diam, baik bahan yang menyerap (KCP) atau film cair pada penyangga

(KCC), ditempatkan di dalam tabung kaca berbentuk silinder, pada bagian bawah

tertutup dengan katup atau keran, dan fase gerak dibiarkan mengalir ke bawah

melaluinya karena gaya berat. Penyerap dapat dikemas ke dalam tabung baik cara

basah (dibuat lumpuran terlebih dahulu) maupun dengan cara kering (langsung

dituang ke tabung sedikit demi sedikit). Pada umumnya, cara basah lebih mudah

dan lebih sering dipakai untuk silika gel, sedang cara kering lebih baik untuk

alumina (Gritter, Bobbit dan Schwarting, 1991).

Kolom kromatografi biasanya dibuat dengan menuangkan lumpuran atau

suspensi fase diam dalam pelarut yang sesuai ke dalam kolom dan dibiarkan

memampat. Selanjutnya permukaan pelarut diturunkan sampai tepat pada bagian

atas penyerap, dan cuplikan yang dilarutkan dalam pelarut yang sesuai diletakkan

pada bagian atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam lapisan atas penyerap

atau penyangga. Kemudian fase gerak dimasukkan dan dibiarkan mengalir

mengembangkan kromatogram. Pada kondisi yang dipilih dengan baik, linarut

yang merupakan komponen campuran, turun berupa pita dengan laju yang

berlainan dan dengan demikian dipisahkan. Linarut biasanya dipisahkan dengan

cara membiarkannya mengalir keluar kolom dan mengumpulkannya sebagai

fraksi, seringkali dengan memakai pengumpul fraksi mekanis (Gritter, Bobbit dan

Schwarting, 1991). Pemisahan dengan kromatografi kolom dapat menggunakan

bantuan tekanan oleh vakum dan dapat pula hanya mengandalkan gravitasi untuk

penurunan fraksinya (Bintang, 2010).

Kromatografi kolom yang fase diamnya berupa gel filtrasi termasuk ke

dalam kromatografi eksklusi atau filtrasi. Prinsip kerjanya adalah pemisahan

berdasarkan perbedaan ukuran dan bobot molekul (BM) terhadap gel filtrasi.

Komponen yang memiliki ukuran dan BM yang lebih besar akan terlebih dahulu

terelusi dibandingkan dengan yang lebih kecil. Komponen dengan ukuran dan BM

yang lebih besar langsung terelusi karena tidak dapat tertahan pada pori-pori gel

filtrasi, sedangkan komponen dengan ukuran dan BM yang lebih kecil akan

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 27: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

12

 

  Universitas Indonesia

 

tertahan sementara pada pori-pori gel filtrasi sehingga akan terelusi terakhir.

Fraksi yang dihasilkan pun diharapkan mengandung komponen yang terpisah

berdasarkan ukuran BM (Wu, 1995). Gel filtrasi yang biasa digunakan ialah

sephadex, sepharosa dan poliakrilamida.

2.4.2. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan cara analisis cepat yang

memerlukan bahan yang sedikit (Markham, 1988). (KLT) termasuk ke dalam

kromatografi adsorpsi. Media yang digunakan berupa pelat tipis yang dilapisi oleh

fase diam. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika gel, alumenita,

kieselguhr maupun selulosa bergantung pada sampel yang akan dianalisis

(Bintang 2010). Pada KLT, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan pada

lapisan tipis yang nantinya akan diabsorpsi oleh zat penyerap dan kemudian

dielusi oleh fase gerak. Pemisahan didasarkan pada sifat polaritas senyawa.

Senyawa yang memiliki polaritas hampir sama dengan fase geraknya akan terelusi

terlebih dahulu dibandingkan senyawa dengan sifat polaritas yang berbeda dengan

fase geraknya. Pada kromatografi lapis tipis ini terjadi persaingan antara proses

penyerapan yang cenderung untuk menempelkan senyawa dalam fase diam dan

Pelarutan yang cenderung membawa dalam fase gerak (Shellard, 1975).

Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk tujuan kualitatif dan

preparatif. KLT tujuan kualitatif digunakan untuk menganalisis senyawa-senyawa

organik dalam jumlah kecil (misalnya menentukan jumlah kumpulan dalam

campuran), menentukaan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT

preparatif maupun kromatografi kolom dan juga untuk mengidentifikasi

komponen penyusun campuran melalui suatu perbandingan dengan senyawa yang

diketahui strukturnya (Townshend, 1995). Parameter pada KLT yang digunakan

untuk identifikasi adalah nilai Rf. Untuk analisis preparatif, sampel yang

ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan

dideteksi dengan cara yang nondekstruktif. Bercak yang mengandung analit yang

dituju selanjutnya dikerok dan dilakukan analisis lanjutan. Adapun pelaksanaan

KLT sebagai berikut (Gandjar dan Rohman, 2007) :

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 28: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

13

 

  Universitas Indonesia

 

2.4.2.1 Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penyerap berukuran

kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata

partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam maka semakin

baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penyerap yang paling sering

digunakan adalah silika dan serbuk selulosa. Sementara mekanisme sorpsi yang

paling utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi. Berikut adalah beberapa

penyerap fase diam yang digunakan pada KLT :

Tabel 2.1. Jenis-jenis bahan penyerap fase diam KLT

Penyerap Mekanisme sorpsi Penggunaan

Silika Gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid

Silika modifikasi dengan hidrokarbon

Partisi termodifikasi

Senyawa-senyawa non-polar

Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida, karbohidrat

Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam, pewarna makanan, alkaloid

Kieselgur Partisi Gula, asam-asam lemak

Selulosa penukar ion

Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, ion logam, halogen

Gel Sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam

[Sumber : Gandjar dan Rohman, 2007]

2.4.2.2 Fase Gerak

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan

mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling

sederhana adalah campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran

kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat

terjadi secara optimal.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 29: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

14

 

  Universitas Indonesia

 

Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase

gerak :

a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan teknik yang sensitif

b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak

antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,

polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti

juga menentukan nilai Rf.

d. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik diguunakan campuran

pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan

perbandingan tertentu.

2.4.2.3 Penotolan sampel

Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling

sedikit 0,5 µL. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 µL maka

penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar

totolan.

2.4.2.4 Pengembangan

Selanjutnya mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang

sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng

tipis yang telah ditotoli sampel selanjutnya dicelupkan ke dalam fase gerak kurang

lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus di bawah lempeng yang

telah berisi totolan sampel. Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat

mungkin volume fase gerak sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi

lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan

penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase

gerak telah mencapai ujung dari kertas saring maka dapat dikatakan bahwa fase

gerak telah jenuh.

2.4.2.5 Metode Deteksi

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara

kimia yang biasa dilakukan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu

pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 30: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

15

 

  Universitas Indonesia

 

yang dapat dialakukan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara

pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar

ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak

akan terlihat jelas. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

a. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi

secara kimia dengan solut yang mengandung gugus fungsional tertentu

sehingga bercak menjadi bewarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih

dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna

bercak.

b. Mengamati lempeng di bawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang

gelombang emisi 254 atau 366 nm untuk menampakkan solut sebagai bercak

yang gelap atau bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang

berfluoresensi seragam. lempeng yang diperdagangkan dapat dibeli dalam

bentuk lempeng yang sudah diberi dengan fluoresen yang tidak larut yang

dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar fluoresensi atau

dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluoresensi setelah

dilakukan pengembangan.

c. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat atau asam nitrat pekat lalu

dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak

sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.

d. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.

e. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu

instrument yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari

permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar

tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak

(peak) dalam pencatatan (recorder).

Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen (2.1) jarak yang ditempuh oleh pelarut

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 31: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

16

 

  Universitas Indonesia

 

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0. Beberapa pustaka menyatakan nilai

Rf yang baik yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar

antara 0,2-0,8.

2.4.3 Kromatografi Radial

Kromatografi radial atau kromatografi sirkular termasuk ke dalam

kromatografi planar. Kromatografi radial terdiri atas kromatografi kertas radial

dan kromatografi lapis tipis radial. Prinsip pemisahannya sama seperti

kromatografi lainnya, yakni berdasarkan interaksi antara komponen dalam sampel

terhadap fase diam dan fase gerak. Lapis tipis yang digunakan pada KLT radial

berupa fase diam yang diaplikasikan di atas pelat kaca berbentuk bundar yang

memiliki diameter 24 cm. Fase diam yang digunakan sama seperti pada KLT,

diantaranya alumina, silika gel dan lainnya. Komponen KLT radial terdiri dari

pelat, motor penggerak, lampu UV, chamber dan wadah eluen. Penggunaanya

dilakukan dengan cara mengalirkan sampel ke bagian tengah pelat yang telah

dipasang dalam chamber lalu diikuti dengan mengalirkan eluen. Motor penggerak

akan berotasi pada 800 rpm memutar pelat dalam chamber searah jarum jam dan

proses elusi akan terjadi. Fase diam bergerak secara radial dari bagian tengah pelat

ke bagian pinggir akibat daya kapilaritas pelat dan gaya sentrifugal yang

dihasilkan dari pelat yang berotasi (Cazes, 2010).

Pada umumnya, campuran 50-500 mg dapat dipisahkan pada lapisan 2 mm

sepanjang Rf pada pelat KLT analitik terletak antara 0,2 dan 0,5. Pada awal

pemisahan harus dipakai sistem pelarut yang kepolarannya ditingkatkan perlahan-

lahan selama pengelusian. Pemasukan cuplikan diikuti dengan pengelusian

menghasilkan pita-pita komponen berupa lingkaran sepusat. Pada tepi pelat pita-

pita terputar keluar dan ditampung dalam tabung. Fraksi eluat yang diperoleh

dianalisis dengan KLT (Hostettmann, Marston dan Hostettmann, 1986). Beberapa

alat yang digunakan untuk pemisahan kromatografi radial diantaranya adalah

Chromatotron, Rotachrom, Cyclograph dan Extrachrom (Cazes, 2010).

2.5 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia adalah pemeriksaan kandungan kimia secara kualitatif

untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam suatu tumbuhan.

Universitas Indonesia

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 32: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

17

 

  Universitas Indonesia

 

Pemeriksaan diarahkan pada senyawa metabolit sekunder yang memiliki khasiat

bagi kesehatan seperti, alkaloid, senyawa flavonoid, terpen, tanin, saponin,

glikosida, kuinon dan antrakuinon (Harborne, 1987).

2.5.1 Alkaloid

Alkaloid adalah golongan senyawa kimia yang bersifat basa, mengandung

satu atau lebih atom nitrogen biasanya dalam gabungan berbentuk siklik, serta

dapat dideteksi dengan cara pengendapan menggunakan pereaksi Mayer,

Dragendorf, dan Bouchardat. Alkaloid sebagian besar berbentuk kristal padat dan

sebagian kecil berupa cairan pada suhu kamar, memutar bidang polarisasi dan

terasa pahit (Harborne, 1987).

2.5.2 Flavonoid

Flavonoid merupakan senyawa kimia yang umumnya terdapat pada

tumbuhan berpembuluh. Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai glikosida

dan aglikon flavonoid. Biasanya dalam menganalisis flavonoid, yang diperiksa

ialah aglikon dalam ekstrak tumbuhan yang sudah dihidrolisis. Proses ekstraksi

flavonoid dilakukan dengan etanol mendidih untuk menghindari oksidasi enzim

(Harborne, 1987).

2.5.3 Terpen

Terpen adalah suatu senyawa kimia yang tersusun oleh molekul isopren

CH2=C(CH3)-CH=CH2 dan kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan

dua atau lebih satuan unit C5. Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa

seperti monoterpen dan seskuiterpen yang mudah menguap, diterpen yang kurang

menguap dan yang tidak menguap, triterpen, dan sterol. Secara umum senyawa ini

larut dalam lemak dan terdapat dalam sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya

senyawa ini diekstraksi dengan menggunakan eter dan kloroform. Saponin dan

glikosida jantung merupakan golongan senyawa triterpen atau steroid yang

terdapat dalam bentuk glikosida (Harborne, 1987).

2.5.4 Tanin

Tanin merupakan senyawa kimia yang umum terdapat dalam tumbuhan

berpembuluh, memiliki gugus fenol, rasa sepat dan mampu menyamak kulit

karena kemampuannya menyambung-silang protein. Tanin dapat bereaksi dengan

protein membentuk kopolimer mantap yang tak larut dalam air.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 33: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

18

 

  Universitas Indonesia

 

Secara kimia, tanin dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu tanin

terkondensasi dan tanin terhidrolisis. Tanin terkondensasi secara biosintesis dapat

dianggap terbentuk dengan cara kondensasi katekin tunggal yang membentuk

senyawa dimer dan kemudian oligomer yang lebih tinggi. Tanin terhidrolisis

mengandung ikatan ester yang terhidrolisis jika dididihkan dalam asam klorida

encer (Harborne, 1987).

2.5.5 Saponin

Saponin adalah glikosida triterpen yang merupakan senyawa aktif

permukaan dan dapat menimbulkan busa jika dikocok dengan air. Pada

konsentrasi yang rendah dapat menyebabkan hemolisis sel darah merah pada tikus

(Harborne, 1987).

2.5.6 Glikosida

Glikosida merupakan suatu senyawa yang bila dihidrolisis akan terurai

menjadi gula (glikon) dan senyawa lain (aglikon atau genin). Pada umumnya

glikon berupa glukosa, fruktosa, laktosa, galaktosa dan manosa. Dapat pula

berupa gula khusus seperti sarmentosa, oleandrosa, simarosa dan rutinosa.

Sedangkan aglikon (genin) biasanya mempunyai gugus –OH dalam bentuk

alkoholis atau fenolis. Glikosida dapat dibedakan atas α-glikosida dan β-glikosida.

Pada tanaman, glikosda biasanya terdapat dalam bentuk β-glikosida. Kegunaan

glikosida bagi tanaman adalah untuk cadangan gula sementara, sedangkan bagi

manusia umumnya digunakan untuk obat jantung, diuretika dan prekursor hormon

steroid (Harborne, 1987).

2.5.7 Kuinon dan Antrakuinon

Kuinon merupakan senyawa berwarna dan memiliki kromofor dasar. Untuk

tujuan identifikasi, kuinon dibagi menjadi empat kelompok, diantaranya adalah

benzokuinon, naftokuinon dan antrakuinon diperlukan hidrolisis asam untuk

melepas kuinon bebasnya. Sedangkan kuinon isoprenoid yang terlibat dalam

respirasi sel dan fotosintesis diperlukan cara khusus untuk memisahkannya dari

bahan lipid lain (Harborne, 1987).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 34: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

19

 

  Universitas Indonesia

 

2.6 Antioksidan

Radikal bebas (free radical) adalah satu senyawa atau molekul yang

mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital luarnya.

Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat

reaktif mencari pasangan dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul

yang berada di sekitarnya. Jika elektron yang terikat oleh senyawa radikal bebas

tersebut bersifat ionik, dampak yang timbul mungkin tidak terlalu berbahaya.

Namun, bila elektron yang terikat radikal bebas berasal dari senyawa yang

berikatan kovalen, akan sangat berbahaya karena ikatan digunakan secara

bersama-sama pada orbital terluarnya. Umumnya, senyawa yang memiliki ikatan

kovalen adalah molekul-molekul besar (biomakromolekul) seperti lipid, protein

maupun DNA (Soetmaji, 1998).

Antioksidan berfungsi melindungi tubuh terhadap radikal-radikal bebas

sehingga antioksidan yang penting dalam memelihara kesehatan (Arts, Haenen,

Voss dan Bast, 2004). Keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan

diperlukan untuk memelihara fungsi fisiologis tubuh. Oleh karena itu, pemberian

sumber antioksidan dari luar perlu dilakukan untuk membantu mengatasi keadaan

stres oksidatif ini (Lobo, Patil, Phatak dan Chandra, 2010). Antioksidan

merupakan senyawa yang dapat menghambat spesies oksigen reaktif

atau spesies nitrogen reaktif (ROS/RNS) dan juga radikal bebas sehingga

antioksidan dapat mencegah penyakit yang dihubungkan dengan radikal bebas

seperti kanker, kardiovaskuler dan penuaan (Halliwell dan Gutteridge, 1999).

2.6.1. Penggolongan Antioksidan (Pokorni, 2001)

Tubuh memiliki sistem pertahanaan internal terhadaap radikal

bebas. Sistem pertahanan tersebut dikelompokkan menjadi 3 golongan. Pertama

adalah antioksidan primer (antioksidan endogen / antioksidan enzimatis).

Contohnya superoxide dismutase (SOD), katalase dan glutation peroxidase.

Enzim - enzim ini mampu menekan atau menghambat pembentukan radikal bebas

dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk lebih

stabil. Reaksi ini disebut sebagai chain-breaking-antioxidant. Golongan kedua

adalah antioksidan sekunder (antioksidan eksogen/antioksidan non enzimatis).

Contohnya adalah vitamin E, vitamin C, β-karoten, isoflavon, asam urat, bilirubin

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 35: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

20

 

  Universitas Indonesia

 

dan albumin. Senyawa-senyawa ini dikenal sebagai penangkap radikal bebas

(scavenger free radical). Golongan ketiga adalah antioksidan tersier. Misalnya

enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase yang berperan dalam

perbaikan biomolekul yang dirusak oleh radikal bebas.

2.6.2 Sumber Antioksidan

Antioksidan sangat beragam jenisnya. Berdasarkan sumbernya antioksidan

dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang

diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil

ekstraksi bahan alami). Pokorni (2001) menyatakan sebagai berikut :

2.6.2.1 Antioksidan Sintetik

Diantara beberapa contoh antioksidan sintetik yang diijinkan untuk

makanan, ada lima antioksidan yang penggunaannya meluas dan menyebar di

seluruh dunia, yaitu butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi toluen (BHT),

propil galat, tert-butil hidroksi quinon (TBHQ) dan tokoferol. Antioksidan alami

yang telah diproduksi secara sintetis untuk tujuan komersial.

2.6.2.2 Antioksidan Alami

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari : senyawa

antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, senyawa

antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan,

senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke

makanan.

Kebanyakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami adalah

berasal dari tumbuhan. Kingdom tumbuhan, Angiosperm memiliki kira-kira

200.000 sampai 300.000 spesies dan dari jumlah ini kurang lebih 400 spesies

yang telah dikenal dapat menjadi bahan pangan manusia. Isolasi antioksidan alami

telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian

yang dapat dimakan. Antioksidan alami terbesar di beberapa bagian tanaman,

seperti pada kayu, akar, daun, buah, biji dan serbuk sari (Pokorni, 2001).

2.6.3. Senyawa Kimia Antioksidan

Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik

atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat,

kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 36: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

21

 

  Universitas Indonesia

 

yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, kateksin,

flavonol dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat meliputi asam kafeat, asam

ferulat, asam klorogenat dan lain-lain. Senyawa antioksidan polifenolik ini adalah

multifungsional dan dapat bereaksi sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas,

pengkelat logam atau peredam terbentuknya singlet oksigen. Kira-kira 2% dari

seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoid atau

senyawa yang berkaitan erat dengannya sehingga flavonoid merupakan salah satu

golongan fenol alam terbesar. Lebih lanjut disebutkan bahwa sebenarnya

flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau sehingga pastilah ditemukan pula

pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Kebanyakan dari golongan dan senyawa

yang berkaitan erat dengannya memiliki sifat-sifat antioksidan baik di dalam

lipida cair maupun dalam makanan berlipida (Pokorni, 2001).

Flavonoid mencakup banyak pigmen yang paling umum dan terdapat pada

seluruh dunia tumbuhan dari Fungus sampai Angiospermae. Pada tumbuhan

tingkat tinggi, flavonoid terdapat baik dalam bagian vegetatif maupun dalam

bunga (Robinson, 1995). Sebagian besar flavonoid alam ditemukan dalam bentuk

glikosida dimana unit flavonoid terikat pada satu gula. Flavonoid yang berupa

glikosida merupakan senyawa polar sehingga dapat diekstrak dengan etanol,

metanol maupun air. Senyawa fenol bila ditambah basa, warnanya akan berubah

sehingga mudah dideteksi pada kromatogram.

Flavonoid merupakan pigmen bewarna yang terdapat pada tanaman,

misalnya antosianin yang merupakan penyusun warna biru, violet dan merah;

flavon dan flavonol penyusun warna kuning redup; khalkon dan auron penyusun

warna kuning terang; sedangkan isoflavon merupakan senyawa tak bewarna.

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi. Oleh karena itu

menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah spektrum UV dan tampak

(Harbone, 1987).

2.6.4. Mekanisme Kerja Antioksidan

Oksidasi dapat dihambat oleh berbagai macam cara diantaranya mencegah

masuknya oksigen, penggunaan temperatur yang rendah, inaktivasi enzim yang

mengkatalis oksidasi, mengurangi tekanan oksigen dan penggunaan pengemas

yang sesuai. Cara lain untuk melindungi terhadap oksigen adalah dengan

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 37: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

22

 

  Universitas Indonesia

 

menggunakan bahan tambahan spesifik yang dapat menghambat oksidasi secara

tepat disebut penghambat oksidasi, tetapi baru-baru ini lebih sering disebut

sebagai Antioksidan (Pokorni, 2001). Penambahan antioksidan primer dengan

konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi

autooksidasi. Reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi

untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru.

Mekanisme yang paling sering adalah reaksi antara antioksidan dan radikal

bebas. Biasanya antioksidan bereakasi dengan radikal bebas peroksil atau

hidroksil yang terbentuk dari hidroperoksida yang berasal dari lipid. Senyawa

antioksidan lain dapat menstabilkan hidroperoksida menjadi senyawa non-radikal.

Peruraian hidroperoksida dapat dikatalisis oleh logam berat akibatnya senyawa-

senyawa dapat mengkelat logam juga termasuk antioksidan. Beberapa senyawa

disebut sinergis karena senyawa tersebut dengan sendirinya tidak mempunyai

aktivitas antioksidan akan tetapi senyawa tersebut dapat meningkatkan aktivitas

antioksidan senyawa lain. Kelompok lain adalah senyawa-senyawa yang mampu

menguraikan hidroperoksida melalui jalur non-radikal sehingga senyawa ini

mampu mengurangi radikal bebas (Pokorni, 2001).

2.6.5. Metode Uji Antioksidan

Untuk mengetahui aktivitas antioksidan suatu zat, dapat dilakukan beberapa

uji baik secara in vivo maupun in vitro. Pengujian secara in vitro dilakukan

dengan beberapa metode, antara lain :

2.6.5.1 Metode Peredaman Radikal DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

Uji peredaman radikal DPPH merupakan uji dekolorisasi yang mengukur

kapasitas antioksidan untuk bereaksi secara langsung dengan radikal DPPH yang

kemudian dilihat serapannya pada panjang gelombang 517 nm menggunakan

spektrofotometer. Radikal DPPH merupakan radikal bebas yang stabil dengan

nitrogen organik sebagai pusatnya. Radikal DPPH berwarna ungu tua yang ketika

berubah menjadi bentuk nonradikal memudar warnanya akibat antioksidan

(Moore dan Yu, 2007). Metode ini merupakan metode yang paling sering

dilaporkan dalam skrining aktivitas antioksidan dari berbagai jenis tanaman obat.

Metode peredaman radikal bebas DPPH ini berdasarkan pada reaksi reduksi dari

larutan metanol radikal bebas DPPH yang berwarna oleh penghambatan radikal

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 38: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

23

 

  Universitas Indonesia

 

bebas. Prosedurnya melibatkan pengukuran penurunan serapan DPPH pada

panjang gelombang maksimalnya, yang sebanding dengan konsentrasi

penghambat radikal bebas yang ditambahkan ke larutan DPPH. Aktivitas tersebut

dinyatakan sebagai konsentrasi efektif (effective concentration), EC50 atau IC50

(Shivaprasad, Mohan, Kharya, Shiradkar dan Lakshman, 2005). Reaksi

peredaman radikal DPPH adalah sebagai berikut :

O2N

N-N(C6H5)2

NO2

NO2

+ AH

O2N

N-N(C6H5)2

NO2

NO2

H

+ A

  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin

[Sumber: Joon Kwan dan Takayuki, 2009, telah diolah kembali]

Gambar 2.2. Reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh antioksidan 

2.6.5.2 Metode Reducing Power

Metode ini berprinsip pada kenaikan serapan dari campuran reaksi,

peningkatan pada serapan menunjukan peningkatan pada aktivitas antioksidan.

Dalam metode ini antioksidan membentuk kompleks berwarna dengan kalium

ferrisianida, asam trikloroasetat dan besi (III) klorida yang diukur pada 700 nm.

Peningkatan pada serapan campuran reaksi menunjukan kekuatan mereduksi dari

sampel (Shivaprasad, Mohan, Kharya, Shiradkar dan Lakshman, 2005).

2.6.5.3 Metode Uji kapasitas serapan radikal Oksigen atau Oxygen Radical

Absorbance Capacity (ORAC)

Prosedur analisis ini mengukur kemampuan antioksidan dari makanan,

vitamin, suplemen nutrisi atau bahan kimia lainnya terhadap radikal bebas. Uji ini

dilakukan dengan menggunakan trolox (analog vitamin E) sebagai standar untuk

menentukan trolox ekuivalen (TE). Selanjutnya nilai ORAC dihitung dari TE dan

ditunjukan sebagai satuan atau nilai ORAC dimana semakin tinggi nilai ORAC

maka semakin besar kekuatan antioksidannya.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 39: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

24

 

  Universitas Indonesia

 

Metode uji ini berdasarkan pada pembentukan radikal bebas

menggunakan 2,2-azobis-2-amindopropandihidroklorida (AAPH) dan pengukuran

dari penurunan fluorosensi dengan penghambatan radikal. Pada uji ini, β-

phycoerytrin (β-PE) digunakan sebagai target kerusakan radikal bebas, AAPH

sebagai penghasil radikal peroksi dan trolox sebagai standar. Setelah penambahan

AAPH ke larutan uji, florosensi direkam dan aktivitas antioksidan ditunjukan

sebagai trolox ekuivalen (TE). Selain β-PE senyawa lain yang dapat dijadikan

target perusakan oleh radikal bebas adalah fluorescein dan pyrogallol red (Lopez,

Alarcon dan Lissi, 2006).

2.6.5.4 Metode Peredaman Kation Radikal ABTS

Metode peredaman kation radikal ABTS (ABTS●+) merupakan metode

dekolorisasi yang mengukur kemampuan antioksidan dengan cara berinteraksi

secara langsung dengan kation radikal ABTS. ABTS●+ adalah suatu radikal

dengan pusat nitrogen yang berwarna biru-hijau, dimana jika tereduksi

antioksidan berubah menjadi bentuk nonradikalnya (ABTS) yang tidak berwarna.

Kemampuan antioksidan diketahui melalui pengkuran absorbasi dari campuran

antioksidan-radikal pada 734 nm menggunakan spektrofotometer. Hasilnya

dibandingkan dengan standar trolox (Moore dan Yu, 2007).

 

 

 

 

 

 

 

 

[Sumber: Joon Kwan dan Takayuki, 2009, telah diolah kembali]

Gambar 2.3. Pembentukan radikal ABTS●+ stabil dari ABTS+K2S2O8

ABTS

ABTS●+

 

+ K2S2O8

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 40: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

25

 

  Universitas Indonesia

 

2.6.5.5 Aktivitas penghambatan Radikal Superoksida

Aktivitas penghambatan radikal superoksida secara in vitro diukur oleh

reduksi riboflavin/cahaya/nitro blue tetrazolium (NBT). Reduksi NBT merupakan

metode yang paling dikenal. Metode ini didasarkan pada pembangkitan radikal

superoksida oleh autooksidasi dari riboflavin dengan adanya cahaya. Radikal

superoksida mereduksi NBT menjadi formazon yang berwarna biru yang dapat

diukur pada 560 nm. Kemampuan ekstrak untuk penghambatan warna hingga

50% diukur dalam EC50. Radikal superoksida dapat juga dideteksi melalui

oksidasi hidrosilamin, menghasilkan nitrit yang kemudian diukur dengan reaksi

kolorimetri (Shivaprasad, Mohan, Kharya, Shiradkar dan Lakshman, 2005).

NBT berwarna kuning yang ketika tereduksi O2●- membentuk formazan

berwarna biru yang dapat diukur pada 560 nm dengan spektrofotometer.

Kemampuan penangkapan radikal O2●- dihitung sebagai persen O2

●- yang tersisa

(Moore dan Yu, 2007).

2.6.5.6 Aktivitas Penghambatan Radikal Hidroksil

Kapasitas penghambatan radikal hidroksi dari suatu ekstrak dihubungkan

secara langsung terhadap aktivitas antioksidannya. Metode ini melibatkan

pembangkitan in vitro dari radikal hidroksi dengan menggunakan sistem Fe3+,

askorbat, EDTA atau H2O2 berdasarkan reaksi Fenton. Penghambatan dari radikal

hidroksi dengan adanya antioksidan diukur.

Dalam metode ini, radikal hidroksi yang terbentuk oleh oksidasi dibuat

untuk bereaksi dengan dimetil sulfoksida (DMSO) untuk menghasilkan

formaldehid. Formaldehid membentuk warna kuning intensif dengan pereaksi

Nash (ammonium asetat 2 M). Intensitas dari warna kuning yang terbentuk diukur

pada 412 nm dengan spektrofotometer terhadap blanko pereaksi. Aktivitas

dinyatakan sebagai % penghambatan radikal hidroksi (Shivaprasad, Mohan,

Kharya, Shiradkar dan Lakshman, 2005).

2.6.5.7 Metode Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP)

Metode FRAP menggunakan kompleks besi-ligan 2,4,6-tripiridil-triazin

[Fe(TPTZ)23+] sebagai pereaksi. Kompleks biru [Fe(TPTZ)2

3+] akan berfungsi

sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi [Fe(TPTZ)22+]

yang bewarna kuning dengan reaksi sebagai berikut :

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 41: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

26

 

  Universitas Indonesia

 

[Sumber: Joon Kwan dan Takayuki, 2009, telah diolah kembali]

Gambar 2.4. Mekanisme reduksi kompleks [Fe(TPTZ)23+] oleh antioksidan

2.7 Toksisitas

Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi

dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa

tersebut mengenai atau masuk ke dalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia

dapat dikatakan bersifat racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan

efek racun dalam jangka waktu singkat dan bersifat racun kronis jika senyawa

tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu panjang (Satmoko,

2002).

Untuk skrining dan fraksionisasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat

dilakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang

digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu metode untuk

menguji bahan-bahan yang bersifat toksik dan digunakan sebagai suatu bioassay

yang pertama untuk penelitian bahan alam. Metode ini menggunakan larva

Artemia salina Leach sebagai hewan coba. Uji toksisitas dengan metode BSLT ini

merupakan uji toksisitas dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam

waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian dosis uji.

Prosedurnya dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif

tanaman terhadap larva Artemia salina Leach. Suatu ekstrak dikatakan toksik jika

harga LC50 kurang dari 1000 µg/ml (Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nichols

dan McLaughlin, 1982).

Antioksidan (e‐)

[Fe(TPTZ)23+]  [Fe(TPTZ)2

2+] 

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 42: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

27

 

  Universitas Indonesia

 

Metode BSLT dapat dipercaya untuk menguji aktivitas farmakologis dari

bahan-bahan alam. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan

aktivitasnya dimonitor dengan BSLT menunjukkan adanya korelasi terhadap

suatu uji spesifik antikanker (Harmita dan Radji, 2008). Apabila suatu ekstrak

tanaman bersifat toksik berdasarkan LC50 dengan metode BSLT maka tanaman

tersebut dapat dikembangkan sebagai obat antikanker. Namun, bila tidak bersifat

toksik maka tanaman tersebut dapat diteliti kembali untuk mengetahui khasiat

lainnya dengan menggunakan hewan coba lain yang lebih besar dari larva

Artemia salina seperti mencit dan tikus secara in vivo (Carballo, Hernandez, Perez

dan Garcia, 2002).

2.8 Instrumen

2.8.1 Spektrofotometer Uv-Vis

Spektrofotometer UV-Vis merupakan suatu metode identifikasi yang

didasarkan pada struktur elektronik molekul, yang dikenal sebagai spektroskopi

elektronik (Sastrohamidjojo, 1991). Penyerapan sinar tampak dan ultraviolet oleh

suatu molekul dapat menyebabkan terjadinya eksitasi molekul dari tingkat energi

dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Elektron-elektron yang menyerap radiasi

ultraviolet dalam suatu molekul organik adalah elektron-elektron yang terlibat

langsung dalam ikatan antara dua atom dan elektron-elektron bebas seperti pada

atom oksigen, halogen, nitrogen dan belerang (Hendayana, Kadarohman, Sumarna

dan Supriatna, 1994).

Transisi yang penting pada daerah ultraviolet dan tampak yaitu transisi

nπ* dan ππ* , sedangkan transisi nσ* jarang terjadi (Fessenden dan

Fessenden, 1986). Transisi yang terjadi pada flavonoid yaitu transisi ππ*

akibat adanya ikatan rangkap terkonjugasi dan transisi nπ* karena adanya

elektron bebas. Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi oleh

karena itu menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah ultraviolet dan

tampak (Harbone, 1987). Senyawa dengan ikatan rangkap terkonjugasi seperti

flavonoid akan mengalami penyerapan radiasi pada panjang gelombang yang

lebih besar dari 217 nm (Sastrohamidjojo, 1991).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 43: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

28

 

  Universitas Indonesia

 

2.8.2 Kromatografi Cairan Spektroskopi Massa ( Liquid Chromatography–Mass

Spectrophotometry / LC-MS )

Kromatografi Cairan Spektroskopi Massa (LC-MS) merupakan suatu

metode pemisahan modern dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai

uji identitas dan uji kemurnian. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-

senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi yang tidak

bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas (GC). Banyak senyawa yang dapat

dianalisis dengan LC-MS mulai dari senyawa anorganik sampai senyawa organik

makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemat

optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (Chirale Trennphasen) yang

mampu menentukan resemis dan isomer aktif (Lindsay, 1992)

Pemisahan sampel dimulai dari kromatografi (LC) berdasarkan sifat

kepolaran sampel dengan kolom dan fase gerak dalam kolom. Komponen-

komponen sampel yang telah terpisah mengalami ionisasi yang kemudian berat

molekul sampel dapat diidentifikasi berdasarkan fragmentasi komponen oleh

detektor pada spektrometer (MS). Secara umum prinsip dari spektrometer massa

dalam menghasilkan spektrum massa melalui empat tahap, yakni pengenalan

sampel, ionisasi molekul sampel untuk mengubah molekul netral menjadi ion

dalam fase gerak, menganalisis massa (menyortir ion yang dihasilkan oleh rasio

massa ke muatan) dan mendeteksi ion yang telah dipisahkan (Kazakevich dan

Lobrutto, 2007).

2.8.3 Spektrofotometri Inframerah (Infrared Spectrophotometry / IR )

Bila radiasi infra merah dilewatkan melalui suatu cuplikan maka molekul-

molekulnya dapat menyerap energi dan terjadilah transisi di antara tingkat vibrasi

dasar (ground state) dan tingkat energi tereksitasi (excited state). Pengabsobsian

energi pada berbagai frekuensi dapat dideteksi oleh Spektrofotometer Infra Merah

yang memplot jumlah radiasi infra merah yang diteruskan melalui cuplikan

sebagai fungsi frekuensi (panjang gelombang) radiasi (Hendayana, Kadarohman,

Sumarna dan Supriatna, 1994). Penggunaan Spektroskopi inframerah pada bidang

kimia organik hampir menggunakan daerah di 650-4000 cm-1. Daerah dengan

frekuensi lebih rendah dari 650 cm-1 disebut inframerah jauh dan daerah dengan

frekuensi lebih tinggi dari 4000 cm-1 disebut inframerah dekat. Ikatan-ikatan yang

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 44: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

29

 

  Universitas Indonesia

 

berbeda (C-C, C=C, C-O, O-H, N-H) mempunyai serapan yang berbeda dan

ikatan-ikatan tersebut dalam molekul organik dapat dideteksi dengan

mengidentifikasi frekuensi-frekuensi karakteristiknya sebagai pita serapan dalam

spektrum IR (Sastrohamidjojo, 1991).

Sampel yang dianalisis diberi radiasi sinar inframerah. Sinar inframerah

dapat menyebabkan getaran (vibrasi) pada ikatan molekul baik berupa rentangan

(streaching) maupun berupa tekukan (bending). Tiap ikatan dari gugus fungsi

pada molekul menyerap radiasi pada bilangan gelombang yang berbeda-beda

sehingga tiap gugus memiliki bilangan gelombang yang khas dalam spektrum

(Hermanto, 2009).

2.8.4 Spektrofotometri Resonansi Magnetik Nuklir (Nuclear Magnetic Resonance

/ NMR)

Spektrum IR suatu senyawa memberikan gambaran mengenai berbagai

gugus fungsional dalam sebuah molekul organik, tetapi memberikan hanya sedikit

petunjuk mengenai bagian hidrokarbon molekul itu. Spektroskopi resonansi

magnetik nuklir mengisi kesenjangan ini dengan memberikan gambaran mengenai

atom-atom hidrogen dalam sebuah molekul. Spektroskopi NMR didasarkan pada

penyerapan gelombang radio oleh inti-inti tertentu dalam molekul organik, apabila

molekul ini berada dalam medan magnet yang kuat (Fessenden dan Fessenden,

1986).

Spektra Resonansi Magnetik Inti biasanya ditentukan dari larutan substansi

yang akan dianalisis. Untuk itu pelarut yang digunakan tidak boleh mengandung

atom hidrogen karena adanya atom hidrogen pada pelarut akan mengganggu

puncak-puncak spektrum. Ada dua cara untuk mencegah gangguan oleh pelarut.

Kita dapat menggunakan pelarut seperti Tetraklorometana, CCl4, yang tidak

mengandung hidrogen atau pelarut yang atom-atom hidrogennya telah diganti

oleh isotopnya, deuterium, sebagai contoh CDCl3 sebagai ganti CHCl3. Atom-

atom deuterium mempunyai sifat-sifat magnetik yang sedikit berbeda dari

hidrogen sehingga mereka akan menghasilkan puncak pada area spektrum yang

berbeda (Sudjadi, 1985).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 45: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

30

 

  Universitas Indonesia

 

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam PUSLIT Kimia

LIPI, Serpong dan Laboratorium Penelitian Fitokimia Fakultas Farmasi

Universitas Indonesia, Depok. Waktu penelitian dilaksanakan kurang lebih

selama empat bulan, yakni bulan Februari hingga Mei 2012.

3.2 Bahan dan Alat

3.2.1 Bahan Uji

Bahan yang diteliti adalah daun Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus

(Koord) Merr.] yang diperoleh dari hutan Mekongga, Sulawesi Tenggara.

Tanaman dideterminasi di Herbarium Bogoriense LIPI-Cibinong.

3.2.2 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah : Dimetil

sulfoksida (DMSO), asam klorida, kalium iodida, iodium, asam sulfat, raksa (II)

klorida, serbuk magnesium, serbuk zink, serbuk asam borat, serbuk asam oksalat,

gelatin, bismut (III) nitrat, asam nitrat, natrium sulfat anhidrat (Merck, Jerman);

n-heksan, etil asetat, n-butanol, etanol, metanol, kloroform, isopropanol, air

suling, natrium bikarbonat, timbal (II) asetat, asam asetat anhidrat (Univar, USA),

α-naftol, aseton, eter, FeCl3, NaCl (Mallinckrodt Chemicals, USA), KOH, AlCl3,

NH4OH, benzen, hidrogen peroksida, silika gel 60 (35-70 mesh & 70-230 mesh,

E. Merck 1.07734), pelat KLT silika gel 60 F254 (E. Merck 05554), pipa kapiler,

almunium foil, H2SO4 10%, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), Vitamin C,

Kuersetin, Ekstrak Centella Herba, Ekstrak Rhei Radix, Ekstrak Orthosiphonis

Folium, Ekstrak Theae Folium, Ekstrak Chinae Cortex, Ekstrak Psidii Folium dan

Ekstrak Caryophulli Flos.

3.2.3 Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini (Uji Toksisitas) adalah larva

udang (Artemia salina Leach).

30

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 46: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

31

 

  Universitas Indonesia

 

3.2.4 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan selama penelitian antara lain : peralatan ekstraksi

(perkolator), peralatan partisi, botol vial 12 cc, botol 150 mL, erlenmeyer asah

250 mL, gelas ukur 100 mL dan 500 mL, tabung reaksi, batang pengaduk, corong,

mortar, lampu UV, micro plate, chamber, eppendorf, pipet tetes, pinset, hot plate,

Chromatotron, penguap putar (rotary evaporator Buchii), peralatan Kromatografi

Kolom, Kromatografi Lapis Tipis, Spektrofotometri Uv-Vis (Hitachi U-2000),

Infra Merah (Perkin Elmer 16 PC, FTIR Prestige-21 Shiimadzu), LC-MS Mariner

Biospectrometry dan JEOL JNM ECA-500.

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Determinasi Tumbuhan

Determinasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense (Pusat

Penelitian Biologi, LIPI-Cibinong)

3.3.2 Preparasi Sampel

Sejumlah daun Jambo-Jambo [Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.]

segar dipetik, dikumpulkan, disortir dan dikeringkan (pengumpulan dan

pengeringan dilakukan oleh tim konservasi LIPI). Simplisia yang telah kering

dihancurkan hingga menjadi partikel kecil.

3.3.3 Ekstraksi dan Partisi

Serbuk kering sebanyak 600 gram diekstraksi secara maseasi yang

dimodifikasi dengan perkolasi menggunakan metanol sebanyak 6 L sehingga

seluruh serbuk terendam selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Perkolasi

dilakukan hingga larutan tampak jernih (±5 hari). Seluruh ekstrak yang didapat

ditampung dan dipekatkan menggunakan rotary vacum evaporator serta

disempurnakan pengeringannya di dalam oven 400C sehingga didapat ekstrak

metanol awal (Crude extract). Ektrak yang telah kering ditimbang untuk

ditentukan rendemennya terhadap berat simplisia awal.

Ekstrak metanol awal dipartisi menggunakan beberapa pelarut yang

semakin meningkat kepolarannya yaitu n-heksana, etil asetat, butanol dan metanol

(Gambar 3.1). Ekstrak metanol awal dihaluskan dan dilarutkan dengan sedikit

aquadest lalu dimasukkan ke dalam corong pisah dan dipartisi berturut-turut

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 47: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

32

 

  Universitas Indonesia

 

menggunakan n-heksan : air (1:1), etil asetat : air (1:1), butanol : air (1:1) dan

metanol, masing-masing sebanyak 700 ml. Seluruh ekstrak yang didapat

dipekatkan menggunakan rotary vacum evaporator serta disempurnakan

pengeringannya di dalam oven 400C sehingga didapatlah ekstrak kental lima

fraksi yaitu n-heksana, etil asetat, butanol dan metanol. Masing-masing fraksi dan

ekstrak metanol awal selanjutnya ditimbang dan dilakukan uji aktivitas

antioksidan dan toksisitas.

3.3.4 Uji Antioksidan

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode

peredaman radikal bebas DPPH (Hatano et al., 1988; Yen dan Chen, 1995) yang

telah dimodifikasi.

3.3.4.1 Pembuatan Larutan DPPH (BM 394,32)

Larutan DPPH dibuat dengan cara menimbang seksama lebih kurang 19,7

mg serbuk DPPH kemudian dilarutkan dengan metanol p.a. dalam labu ukur 50

mL dan dicukupkan dengan metanol p.a. hingga tanda batas sehingga didapatkan

larutan DPPH 1mM.

3.3.4.2 Pembuatan Larutan Blanko

Larutan blanko yang digunakan terdiri atas 4000 µL metanol p.a. lalu

dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1000 µL larutan DPPH

sehingga didapat konsentrasi DPPH akhir sebesar 0,2 mM.

3.3.4.3 Pembuatan Larutan Standar

Standar yang digunakan adalah Asam askorbat dan Kuersetin. Larutan

induk standar konsentrasi 1000 µg/mL dibuat dengan sejumlah 5 mg standar

ditimbang dan dilarutkan dalam 5 mL methanol p.a. kemudian dikocok hingga

homogen.

Pembuatan larutan seri standar 1, 5,10,15 dan 20 µg/mL. Dipipet 5,0; 25,0;

50,0; 75,0 dan 100,0 µL larutan induk standar ke dalam lima tabung reaksi dan

ditambah dengan methanol p.a. sampai volume total 4 mL.

3.3.4.4 Pembuatan Larutan Uji

Sejumlah 5 mg sampel dilarutkan dalam metanol p.a. 5 ml sehingga

didapatkan konsentrasi 1000 µg/mL (1000 ppm) sebagai larutan induk.

Selanjutnya dibuat larutan seri dengan konsentrasi antara 40-200 µg/mL yakni

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 48: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

33

 

  Universitas Indonesia

 

dengan memasukkan larutan induk sebanyak 100-500 µL ke dalam tabung reaksi.

Selanjutnya masing-masing tabung reaksi dicukupkan volumenya dengan metanol

hinggal 4 mL.

3.3.4.5 Optimasi Panjang Gelombang DPPH

Larutan DPPH yang telah dibuat sebesar 1 mM diukur spektrum

serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang

400-800 nm lalu ditentukan panjang gelombang optimumnya.

3.3.4.6 Pengujian Sampel

Masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 4 mL larutan uji dalam

metanol p.a ditambah dengan 1 mL larutan DPPH 1mM lalu dikocok hingga

homogen dan diinkubasi pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi 30 menit, serapan

masing-masing larutan uji diukur pada panjang gelombang optimumnya. Nilai

IC50 ditentukan degan program komputer sederhana untuk analisis probit pada

taraf kepercayaan 95% (Blois, 1958). Persentase inhibisi terhadap radikal DPPH

dari masing-masing konsentrasi larutan sampel dapat dihitung dengan rumus :

     (3.1)

Setelah didapatkan persentase inhibisi dari masing-masing konsentrasi,

persamaan ditentukan dengan perhitungan secara regresi linear

dimana x adalah konsentrasi (µg/mL) dan y adalah persentase inhibisi (%).

Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50% atau IC50

yaitu konsentrasi sampel yang dapat meredam radikal DPPH sebanyak 50%

konsentrasi awal. Nilai IC50 didapatkan dari nilai x apabila y senilai 50.

3.3.6 Uji Toksisitas

Metode Meyer digunakan untuk menguji toksisitas sampel secara umum

dengan menggunakan larva Artemia salina Leach. Langkah pengerjaannya

sebagai berikut (Meyer et al., 1982) :

3.3.6.1 Penetasan Larva Udang

Disiapkan wadah untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam wadah

tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan,

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 49: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

34

 

  Universitas Indonesia

 

sedangkan di ruang sebelahnya diletakkan telur udang. Wadah diisi air laut lalu

dimasukkan 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup

dengan aluminium foil dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan

telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.

3.3.6.2 Pembuatan larutan Uji

Ekstrak yang akan diuji dibuat dalam konsentrasi 20, 200, 1000 dan 2000

ppm dalam air laut. Pertama, ditimbang 10 mg ekstrak dan dilarutkan 10 µL

DMSO serta air laut 5 mL sehingga didapatkan konsentrasi 2000 ppm yang

merupakan larutan induk. Selanjutnya dilakukan pengenceran menjadi konsentrasi

1000, 200 dan 20 ppm.

3.3.4.6 Prosedur Pengujian

Sebanyak 100 µL air laut yang mengandung larva udang sebanyak 10-11

ekor dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah uji. Lalu ditambahkan

larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 100 µL, dengan

konsentrasi 20, 200, 1000 dan 2000 ppm, masing-masing konsentrasi dilakukan

triplo. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel. Larutan dibiarkan

selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari

tiap wadah uji.

Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara : akumulasi mati dibagi

jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log

konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50

merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian 50% yang diperoleh

dengan memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan aktif

atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu

senyawa murni.

Mortalitas = akumulasi mati x 100% (3.2) akumulasi mati + akumulasi hidup

3.3.6 Fraksinasi dan Pemurnian

Fraksinasi atau pemisahan komponen-komponen kimia yang terkandung

dalam ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus dilakukan secara kromatografi,

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 50: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

35

 

  Universitas Indonesia

 

yakni kromatografi kolom dan kromatografi radial serta diidentifikasi lebih lanjut

dengan kromatografi lapis tipis.

3.3.6.1 Kromatografi Kolom

Pemisahan awal senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak

dilakukan secara kromatografi kolom yang dipercepat dengan bantuan vakum.

Kemudian hasil pemisahan kasar ini difraksinasi lebih lanjut secara kromatografi

kolom dengan diameter kolom yang lebih kecil dan kecepatan pengelusian yang

didasarkan pada gaya gravitasi. Preparasi kolom dilakukan dengan cara basah,

yakni memasukkan silika dengan cara membuat suspensi dalam n-heksana.

Kolom beserta kerannya dipasang tegak lurus pada statif, lalu dimasukkan sedikit

kapas pada ujung mulut kolom sebelum keran. Suspensi silika dimasukkan ke

dalam kolom sambil dialiri eluen secara terus menerus dengan keran terbuka

sampai permukaan absorben tidak turun lagi.

Ekstrak etil asetat daun Kjelbergiodendron celebicus ditimbang sebanyak

11,99 g, kemudian ditambahkan silika gel 60 (35-70 mesh) sebanyak ±6,00 g

selanjutnya digerus hingga homogen. Silika gel 60 G (ukuran partikel <55µm)

ditimbang sebanyak 70,04 g, lalu dibuat suspensi dengan cara menambahkan

pelarut n-heksana secukupnya. Suspensi silika dimasukkan ke dalam kolom

kromatografi (d = 9,50 cm) yang dilengkapi kolom vakum hingga padat diikuti

penambahan n-heksana sambil vakum dinyalakan. Sampel yang telah dicampur

dengan silika gel 60 dimasukkan ke dalam kolom kemudian ditutup dengan kapas

secukupnya. Eluen n-heksana ditambahkan hingga seluruh sampel dalam kolom

terendam sambil vakum tetap dibuka. Proses elusi dilakukan dengan

menggunakan eluen n-heksana : etil asetat dan etil asetat : metanol dielusi secara

bergradien dengan kenaikan 1% (He : Ea 1-5%), 5% (He : Ea 5% - Ea : Me 25%),

25% (Ea : Me 25-100%), masing-masing eluen sebanyak 700 ml. Fraksi yang

dihasilkan ditampung per 100 ml dan dipekatkan dengan rotary vacuum

evaporator, lalu diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis dengan

penyemprotan H2SO4 10%. Fraksi dengan pola kromatogram yang sama,

digabung dalam satu vial yang telah ditimbang bobot kosongnya. Fraksi yang

didapatkan sebanyak 15 fraksi, yaitu Fr1-Fr15. Fraksi 11 dianalisis lebih lanjut

dengan kromatografi kolom lambat. Skema kerja dapat dilihat pada Gambar 3.2.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 51: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

36

 

  Universitas Indonesia

 

Fraksi 11 hasil kromatografi kolom cepat ditimbang sebanyak 1,00 g dan

ditambahkan dengan 0,50 g silika gel 60 (35-70 mesh) kemudian digerus hingga

homogen. Kolom kromatografi dengan diameter 4,25 cm disiapkan. Suspensi

silika gel dimasukkan ke dalam kolom seperti cara sebelumnya. Campuran Fr11

dan silika gel 60 dimasukkan lalu n-heksana ditambahkan hingga seluruh sampel

terendam. Proses elusi dilakukan dengan eluen n-heksana : etil asetat dan etil

asetat : metanol secara bergradien masing-masing sebanyak 500 ml. Fraksi yang

didapatkan ditampung dalam botol setiap 50 ml. Masing-masing fraksi

diidentifikasi dengan KLT dan penyemprotan H2SO4 10%. Fraksi dengan pola

kromatogram yang sama, digabung dalam satu vial yang telah ditimbang bobot

kosongnya. Fraksi yang didapatkan sebanyak 45 fraksi, yaitu Fr11.1-Fr11.45.

Fr11.32 dianalisis lebih lanjut.

3.3.6.2 Kromatografi Lapis Tipis Radial

Fr11.32 dianalisis lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis radial

yaitu kromatotron. Pelat kromatotron dengan fase diam silika gel 60 G dan tebal 2

mm dikeringkan dalam oven selama 5 menit pada suhu 50oC. Pelat kemudian

diletakkan dalam chamber lalu motor penggerak dinyalakan dan pelat dibasahi

dengan mengalirkan n-heksana. Aliran eluen langsung dihentikan setelah tetes

pertama n-heksana keluar. Sebanyak 73,1 mg Fr11.32 dilarutkan dengan sedikit

heksana. Sampel dimasukkan ke lubang chamber dengan bantuan pipet tetes dan

diaplikasikan pada pelat setelah n-heksana sudah tidak keluar. Eluen n-heksana :

etil asetat dan etil asetat : metanol dalam berbagai perbandingan dialirkan ke

dalam chamber dan proses elusi dibiarkan berlangsung. Pita-pita hasil elusi pada

KLT diidentifikasi dengan lampu UV. Fraksi yang dihasilkan ditampung dalam

botol vial 12 cc per 6 ml. Masing-masing fraksi diidentifikasi dengan KLT dan

penyemprotan H2SO4 10%. Fraksi dengan pola kromatogram dan warna yang

sama, digabung dalam 1 vial yang telah ditimbang bobot kosongnya. Fraksi yang

didapat sebanyak 5 fraksi, yaitu Fr11.32a-Fr11.32e. Fraksi 11.32a membentuk

satu spot pada identifikasi dengan KLT.

3.3.6.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Seluruh eluat hasil fraksinasi diidentifikasi keberadaan senyawa kimianya

dengan kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng silika GF254. Eluen yang

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 52: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

37

 

  Universitas Indonesia

 

digunakan mengacu pada pelarut yang mengelusikannya pada sistem

kromatografi, yakni n-heksana-etil asetat dan etil asetat-metanol dalam berbagai

perbandingan. Eluat yang telah ditotolkan pada pelat KLT selanjutnya dielusi

dalam chamber yang telah dijenuhkan dan diamati secara visual menggunakan

sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366 serta disemprot dengan pereaksi

semprot asam sulfat 10% dalam metanol. Fraksi yang menunjukkan pola

kromatogram yang sama digabung.

3.3.7 Penapisan Fitokimia

3.3.7.1 Identifikasi Alkaloid (Depkes, 1995 dan Farnsworth, 1966)

Larutan Uji : 500 mg ekstrak ditambahkan 1 mL HCl 2N dan 9 mL air

kemudian dipanaskan di penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring

sehingga diperoleh filtrat.

a. Pereaksi Bouchardat

Pereaksi : 2 g iodium P dan 4 g KI P dilarutkan dalam 100,0 mL aquades

Prosedur : 1 mL filtrat ditambahkan 2 tetes Pereaksi Bouchardat. Jika

terbentuk endapan coklat sampai hitam maka positif mengandung alkaloid.

b. Pereaksi Mayer

Pereaksi : campuran larutan raksa (II) klorida P (1,358 g HgCl2 dalam 60

mL akuades) dengan larutan kalium iodida P (5 g kalium iodida P dalam 10

mL akuades) dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 100,0 mL.

Prosedur : 1 mL filtrat ditambahkan 2 tetes Pereaksi Mayer. Jika terbentuk

endapan menggumpal putih atau kuning yang larut dalam metanol maka

positif mengandung alkaloid.

c. Pereaksi Dragendorf

Pereaksi : campuran larutan bismuth nitrat P (8 g bismuth nitrat P dalam 20

mL asam nitrat) dan larutan kalium iodida P (27,2 g kalium iodida P dalam

50,0 mL akuades) yang didiamkan hingga memisah sempurna. Larutan jernih

diambil dan dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 100,0 mL.

Prosedur : 1 mL filtrat ditambahkan 2 tetes Pereaksi Dragendorf. Jika

terbentuk endapan jingga coklat maka positif mengandung alkaloid.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 53: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

38

 

  Universitas Indonesia

 

Serbuk mengandung alkaloid jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan

dengan dua golongan larutan percobaan yang digunakan (Departemen

Kesehatan RI, 1995).

3.3.7.2 Identifikasi Flavonoid (Depkes, 1995)

Beberapa mg ekstrak ditambahkan 4 mL etanol P hingga ekstrak larut.

Hasil identifikasi dibandingkan dengan standar yaitu daun kumis kucing.

a. 2 mL larutan ditambahkan 0,5 gram serbuk seng P dan 2 mL HCl 2N,

didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes HCl pekat P. Jika

terbentuk warna merah intensif dalam waktu 2-5 menit menunjukkan adanya

flavonoid (glikosida-3-flavonol).

b. 2 mL larutan ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium P dan 10 tetes HCl

pekat P. Jika terbentuk warna merah jingga sampai merah ungu (positif

flavonoid) atau kuning jingga (flavon, kalkon dan auron)

c. Ekstrak dilarutkan dalam aseton P kemudian ditambahkan sedikit serbuk

halus asam borat P dan serbuk asam oksalat P, dipanaskan hati-hati dan

dihindari pemnasan berlebihan. Sisa dicampur dengan 10 ml eter P. Diamati

dibawah sinar UV 366 nm, jika larutan berflurosensi kuning intensif

menunjukkan adanya flavanoid. Hasil uji dibandingkan dengan standar yaitu

Ortosiphon folium.

3.3.7.3 Identifikasi Sterol / Terpen (Farnsworth, 1966)

10 mg ekstrak ditambahkan 5 mL eter dan diuapkan di dalam cawan

penguap. Residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat

pekat. Ekstrak mengandung sterol/terpen apabila terbentuk warna merah-hijau

atau violet-biru. Hasil uji dibandingkan dengan standar yaitu Caryophili flos.

3.3.7.4 Identifikasi Tanin (Farnsworth, 1966)

Beberapa mg ekstrak kental ditambahkan 15 mL air panas. Kemudian

dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit. Saring filtrat (filtrat c) :

a. Ditambahkan beberapa tetes FeCl3 1% menghasilkan hijau violet.

b. Ditambahkan beberapa tetes gelatin membentuk endapan putih.

c. Dijenuhkan dengan Na asetat ditambah FeCl3 1% menghasilkan warna biru

tinta atau hitam, menunjukkan adanya tanin galat.

Hasil identifikasi dibandingkan dengan standar yaitu Camellia folium.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 54: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

39

 

  Universitas Indonesia

 

3.3.7.5 Identifikasi Saponin (Depkes, 1995)

500 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan

10 mL air panas, dinginkan dan kocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk buih

yang mantap setinggi 1 hingga 10 cm selama tidak kurang dari 10 menit. Pada

penambahan 1 tetes HCl 2N buih tidak hilang. Hasil identifikasi dibandingkan

dengan standar yaitu Liquiritae radix.

3.3.7.6 Identifikasi Gula (Depkes, 1995)

Terhadap gula dilakukan Reaksi Molisch. Pereaksi dibuat dari campuran

1,5 g α-naftol P dalam 50 mL metanol. 1 mL larutan percobaan dimasukkan ke

dalam tabung reaksi dan dikeringkan di atas penangas air. Sisanya dilarutkan

dalam 2 mL air dan 5 tetes Molisch LP. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati

2 mL asam sulfat P. Terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas cairan

menunjukkan adanya gula. Hasil identifikasi dibandingkan dengan standar yaitu

Nerii folium.

3.3.7.7 Identifikasi Kuinon & Antrakuinon (Depkes, 1995)

Beberapa mg ekstrak kental ditambahkan 10 mL air panas. Kemudian

dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit. Filtrat disaring. Ke dalam 5 mL

filtrat ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N, terbentuk warna merah

(positif kuinon). Hasil identifikasi dibandingkan dengan standar yaitu Rheii radix.

3.3.8 Identifikasi Senyawa

Isolat murni (Fr11.32a) yang didapat diidentifikasi struktur kimianya

dengan cara Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Spektrofotometri Ultraviolet-

Visible (UV-Vis), Spektrofotometri Inframerah (IR), Kromatografi Cairan-

Spektroskopi Massa (LCMS) dan Spektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir

(NMR). Selanjutnya terhadap isolat dilakukan uji toksisitas dan uji antioksidan.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 55: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

40

 

  Universitas Indonesia

 

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Penyiapan Bahan

Sejumlah daun Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. segar dipetik

dari pohonnya yang berada di hutan Mekongga, Sulawesi Tenggara oleh tim

konservasi dari ICBG (International Cooperative Biodiversity Group) dan LIPI-

Cibinong. Selanjutnya, daun dibersihkan dan dikeringkan. Kemudian dikirim ke

LIPI-Cibinong untuk disempurnakan pengeringannya. Tujuan pengeringan adalah

untuk menghilangkan kandungan air yang dapat menyebabkan reaksi enzimatis.

Reaksi enzimatis dapat menyebabkan rusaknya sampel akibat susunan senyawa

dalam simplisia yang berubah (Harborne, 1987). Selanjutnya, simplisia kering

dihancurkan hingga menjadi serbuk untuk memperluas bidang kontak dengan

pelarut sehingga proses pengektraksiannya maksimal dan seluruh kandungan

kimia dapat tersari. Serbuk kering dikirim ke laboratorium kimia bahan alam

PUSLIT Kimia LIPI Serpong untuk diidentifikasi.

4.2. Ekstraksi dan Partisi

Serbuk kering daun Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. sebanyak

600 gram diekstraksi dengan metode maserasi dengan modifikasi perkolasi.

Maserasi merupakan salah satu proses ekstraksi yang dilakukan pada suhu

ruangan sehingga dipilih untuk mencegah rusaknya senyawa metabolit sekunder

yang tidak tahan terhadap suhu tinggi.

Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana perkolator lalu direndam

metanol selama 24 jam dengan sesekali pengadukan. Hal ini dimaksudkan agar

pelarut metanol mampu menarik kandungan kimia dalam simplisia. Menurut

Lenny (2006) proses perendaman sampel tumbuhan akan menyebabkan

pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan luar

sel. Hal ini menyebabkan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam

sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik. Ekstraksi dilakukan hingga warna

larutan yang menetes bening. Hal tersebut mengindikasikan bahwa senyawa

metabolit sekunder yang terkandung dalam simplisia telah terekstrak seluruhnya.

40

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 56: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

41

 

  Universitas Indonesia

 

Ekstrak cair yang didapat selanjutnya dipekatkan menggunakan rotary vacum

evaporator pada suhu 40-50oC. Pengeringan dilanjutkan di dalam oven bersuhu

40oC sehingga menjadi ekstrak kering yang disebut sebagai ekstrak metanol awal

(crude extract). Ekstrak metanol awal yang diperoleh sebanyak 65,08 gram

(rendemen 10,84 %) berupa kepingan dan bewarna hijau pekat.

Pemisahan dalam penelitian ini sebagian besar dilakukan berdasarkan

kepolaran. Oleh karena itu, ekstrak metanol dipisahkan secara partisi dengan

corong pisah menggunakan dua pelarut yang berbeda kepolarannya. Pertama,

ekstrak metanol dihaluskan dan dilarutkan dengan sedikit aquadest untuk

memperbesar luas permukaan ekstrak sehingga penyarian lebih sempurna.

Kemudian ditambah n-heksana : aquadest 1:1 dan dimasukkan ke dalam corong

pisah dengan pengocokan perlahan sebelum didiamkan beberapa jam. Senyawa

kimia yang bersifat nonpolar akan tertarik ke lapisan heksana yang terletak di atas.

Lapisan heksana cenderung lebih hijau dan pekat karena klorofil yang merupakan

zat warna daun bersifat nonpolar sehingga tertarik ke dalam lapisan heksana

tersebut. Lapisan heksana dipisahkan, diuapkan dan dikeringkan sehingga

diperoleh fraksi heksana sebanyak 5,35 gram. Lapisan air dipartisi kembali

berturut-turut dengan pelarut yang lebih polar yakni etil asetat, butanol dan

metanol dengan cara yang sama dan diperoleh berturut-turut 14,94 gram fraksi etil

asetat; 6,45 gram fraksi butanol; 11,84 fraksi metanol dan 6,12 residu (Tabel 4.1).

Tabel 4.1. Data persentase rendemen ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus

No Jenis Fraksi Bobot (gram) Rendemen (%)

1 Ekstrak metanol awal 65,8 10,84

2 Fraksi n-heksana 5,35 10,09

3 Fraksi etil asetat 14,94 29,79

4 Fraksi butanol 6,45 12,97

5 Fraksi metanol 11,84 23,68

6 Residu 6,12 12,40

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 57: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

42

 

  Universitas Indonesia

 

4.3 Uji Aktifitas Antioksidan

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan secara in vitro menggunakan

metode peredaman terhadap radikal bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).

DPPH merupakan metode yang umum digunakan sebagai radikal untuk menguji

aktivitas antioksidan karena sifatnya yang stabil dalam bentuk radikal bebas dan

merupakan metode yang sederhana, cepat dan murah (Bozin, Mimica, Samojilik,

Goran dan Igic, 2008).

Aktivitas antioksidan sampel diukur melalui pengukuran intensitas serapan

dari setiap sampel setelah ditambahkan DPPH menggunakan spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang tertentu. Berdasarkan hal tersebut, sebelum

dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan, dilakukan terlebih dahulu penentuan

panjang gelombang maksimum larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil. Hasil

percobaan menunjukkan serapan maksimum 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil terletak

pada panjang gelombang 515 nm. Hal ini berarti bahwa pengukuran serapan atas

peredaman seluruh ekstrak maupun fraksi terhadap radikal bebas DPPH dilakukan

pada panjang gelombang 515 nm.

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode

peredaman radikal bebas DPPH (Hatano et al., 1988; Yen dan Chen, 1995) yang

prinsip kerjanya berdasarkan pada keamampuan sampel dalam meredam radikal

bebas (DPPH) melalui donor atom hidrogen atau elektron.  Pengujian aktivitas

antioksidan terhadap ke-5 fraksi awal daun Kjelbergiodendron celebicus

menunjukkan bahwa seluruh fraksi mempunyai aktivitas antioksidan, kecuali

fraksi n-heksana. Selain dapat dilihat secara visual melalui perubahan warna

DPPH dari ungu menjadi kuning, keaktifan ini juga ditunjukkan secara kuantitatif

melalui penurunan absorbansi larutan DPPH sehingga menyebabkan nilai IC50

nya yang kurang dari 1000 ppm yang bernilai kurang dari 50 ppm. Fraksi butanol

memiliki aktivitas antioksidan yang paling baik dengan nilai IC50 sebesar 8,34

ppm (Tabel 4.2).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 58: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

43

 

  Universitas Indonesia

 

Tabel 4.2. Data hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak dari daun Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. dengan metode DPPH

Sampel Absorbansi Konsentrasi

% Inhibisi

Persamaan IC50 (ppm) Blanko Sampel (ppm)

Regresi Linear

Quersetin 1,823 0,127 15 93,03 y = 6,514x + 7,05 0,343 10 81,18 4,108 1,083 5 40,59 1,758 1 3,57 r 2= 0,942

Vit C 1,823 0,732 15 59,85 y = 4,218x - 12,09 0,994 10 45,47 1,029 1,481 5 18,76 1,776 1 2,58 r 2= 0,986

Metanol 1,920 0,130 65 93,23 y = 0,897x + 12,59 Awal 0,257 50 86,61 38,710

0,549 30 71,41 1,013 15 47,24 r 2= 0,934

Heksana 1,920 0,344 250 82,08 y = 0,204x + 78,14 0,473 200 75,36 34,060 0,554 150 71,15 0,896 100 53,33 1,115 50 41,93 r 2= 0,947

Etil 1,920 0,136 80 92,92 y = 0,921x + 26,52 Asetat 0,471 50 75,47 23,690

0,947 20 50,68 1,476 10 23,13 r 2= 0,92

Butanol 1,920 0,121 80 93,70 y = 0,663x + 8,34 0,215 65 88,80 44,470 0,374 50 80,52 0,571 30 70,26 0,993 15 48,28 r 2= 0,925

Metanol 1,920 0,128 80 93,33 y = 0,702x + 10,55 0,186 65 90,31 42,580 0,286 50 85,10 0,974 15 49,27 r 2 = 0,917

Aktivitas antioksidan dari suatu sampel uji didasarkan pada

kemampuannya dalam meredam aktivitas radikal DPPH melalui donasi atom

hidrogen atau elektron. Analisa DPPH merupakan salah satu metoda pengujian

untuk mengetahui kemampuan suatu senyawa dalam bertindak sebagai donor

atom hidrogen (Stoilova et al, 2006). Dalam analisis tersebut, 1,1-difenil-2-

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 59: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

44

 

  Universitas Indonesia

 

pikrilhidrazil (DPPH) bertindak sebagai senyawa radikal sintetik yang akan

menerima atom hidrogen dari senyawa ekstrak yang aktif antioksidannya.

Pendonoran atom hidrogen kepada DPPH akan mengubah bentuk DPPH yang

radikal (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) menjadi bentuk non-radikal (1,1-difenil-2-

pikrilhidrazin) yang dapat diamati secara visual melalui perubahan warnanya dan

secara kuantitatif melalui absorbansinya. DPPH yang berbentuk radikal bewarna

ungu pekat. Apabila terdonasi atom hidrogen, DPPH berubah menjadi bentuk

nonradikal yang ditandai dengan memudarnya warna ungu menjadi lebih muda

hingga kuning. Semakin memudar warna larutan DPPH maka ekstrak tersebut

semakain aktif. Secara kuantitatif, kemampuan suatu ekstrak dalam meredam

radikal DPPH ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan uji yang dihitung

terhadap larutan blanko. Semakin kecil nilai absorbansi maka semakin kuat

ekstrak dalam meredam DPPH.

Ekstrak kasar metanol daun Kjelbergiodendron celebicus menunjukkan

efek yang cukup signifikan dalam meredam DPPH yakni mencapai 86,61% pada

konsentrasi 50 µg/mL dan IC50 sebesar 12,59 μg/mL. Hasil fraksinasi yang

memiliki aktivitas antioksidan tertinggi adalah fraksi butanol dengan nilai IC50

8,34 μg/mL (Gambar 4.1.). Aktivitas antioksidan fraksi butanol menunjukkan

bahwa di dalam fraksi tersebut terkandung senyawa aktif. Berdasarkan Tabel 4.2

aktifitas antioksidan semakin naik seiring dengan naiknya kepolaran fraksi. Hal

ini sesuai dengan sifat-sifat senyawa antioksidan pada ekstrak tanaman yang

sebagian besar berupa senyawa polifenol atau bergugus –OH yang merupakan

gugus bersifat polar.

4.4. Uji Toksisitas

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan suatu metode pengujian

menggunakan hewan uji yaitu Artemia salina Leach yang dapat dijadikan

bioassay sederhana untuk meneliti toksisitas suatu senyawa dengan cara

menentukan nilai LC50 baik dari komponen aktif maupun ekstrak dari suatu

tanaman. Apabila ekstrak tergolong toksik maka tanaman tersebut dapat

dikembangkan sebagai obat antikanker (Carballo, 2002). Metode ini dapat

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 60: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

45

 

  Universitas Indonesia

 

digunakan sebagai bioassay-guided fractionation dari bahan alam karena mudah,

cepat murah dan cukup reprodusibel (Harmita dan radji, 2008).

Suatu senyawa dinyatakan memiliki potensi toksisitas jika nilai LC50

kurang dari 1000 ppm. LC50 atau Lethal Concentration 50 merupakan konsentrasi

dimana zat dapat menyebabkan terjadinya kematian 50% pada hewan coba yakni

Artemia salina Leach (Meyer et al., 1982). Uji BSLT terhadap lima ekstrak daun

Kjelbergiodendron celebicus bernilai antara 100-200 ppm (Tabel 4.3) yakni 243,5

ppm (Ekstrak metanol awal), 214,8 µg/mL ( fraksi n-heksana), 50,84 ppm (fraksi

etil asetat), 228 ppm (fraksi butanol) dan 168,7 ppm (fraksi metanol). Fraksi etil

asetat memiliki sifat toksik yang terbesar (Gambar 4.2.). Jadi, dapat dikatakan

bahwa ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus pada pengujian ini memiliki

potensi toksisitas menurut metode BSLT yakni pengujian dengan menggunakan

hewan coba Artemia salina Leach.

Mekanisme kematian larva udang berhubungan dengan dimungkinkan

karena keberadaan metabolit sekunder golongan alkaloid, terpen, tanin, saponin,

antraquinon, glikosida maupun flavonoid dalam ekstrak-ekstrak daun

Kjelbergiodendron celebicus yang bersifat toksik.

Jumlah kematian larva Artemia salina Leach pada setiap tabung uji dalam

berbagai konsentrasi ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus ditunjukkan pada

Tabel 4.3. dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa pada berbagai konsentrasi

ekstrak pada percobaan ini memperlihatkan pengaruh yang cukup toksik terhadap

kematian larva artemia Artemia salina Leach. Berdasarkan penelitian Rita, Suirta,

dan Sadikin (2008) senyawa toksik yang terkandung dalam ekstrak buah pare

dapat mengakibatkan efek antifedant. Cara kerja senyawa-senyawa tersebut

adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena

itu, bila senyawa-senyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya

akan terganggu hingga menyebabkan larva mati. Mekanisme di atas menjadi

kemungkinan penyebab sifat toksik dari ekstrak daun Kjelbergiodendron

celebicus.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 61: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

46

 

  Universitas Indonesia

 

Tabel 4.3. Hasil uji toksisitas daun Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr. dengan metode BSLT

NO Sampel Konsentrasi

(ppm) Log Mortalitas

Persamaan Regresi Linear

R2 LC 50

1 Metanol 10 1 11,54 y = 30,668 -23,189

0,9305 243,50 Awal 100 2 31,91 500 2,7 53,33 1000 3 77,27

2 Heksana 10 1 7,84 y = 36,098x – 34,179

0,9194 214,80 100 2 27,91 500 2,7 57,50 1000 3 84,09

3 Etil asetat 10 1 23,53 y = 39,302x - 17,057

0,9935 50,84 100 2 58,06 500 2,7 92,11 1000 3 100,00

4 Butanol 10 1 4,17 y = 36,829x – 36,838

0,9554 228,00 100 2 30,00 500 2,7 57,50 1000 3 81,40

5 Metanol 10 1 11,76 y = 35,577x -29,232

0,9316 168,70 100 2 32,56

500

1000 2,7 3

61,90 86,36

4.5. Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia merupakan pemeriksaan kimia secara kualitatif untuk

mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam suatu sampel. Pemeriksaan

terhadap ekstrak metanol awal dan fraksi etil asetat dari daun Kjelbergiodendron

celebicus meliputi uji golongan alkaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, tanin,

kuinon, glikosida dan saponin (Tabel 4.4.).

Pemeriksaan alkaloid dilakukan dengan menggunakan larutan pereaksi

Dragendorf, Mayer dan Bouchardat. Sampel ditambahkan HCl encer dalam

tabung reaksi lalu diteteskan larutan pereaksi. Apabila suatu ekstrak mengandung

senyawa alkaloid maka penambahan larutan pereaksi Mayer akan membentuk

endapan menggumpal berwarna putih atau kuning, dengan larutan pereaksi

Bouchardat akan memberikan endapan berwarna coklat hingga hitam, dan hasil

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 62: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

47

 

  Universitas Indonesia

 

elusi ekstrak ketika disemprot dengan larutan pereaksi Dragendorf akan

menimbulkan bercak jingga. Hasil positif ditunjukkan oleh ekstrak metanol awal

dan fraksi etil asetat.

Flavonoid dalam ekstrak diidentfikasi keberadaannya menggunakan Tes

Shinoda. Serbuk seng atau magnesium dalam suasana asam akan menghasilkan

reduktor hidrogen yang akan mereduksi flavonoid sehingga akan terbentuk

kompkeks berwarna. Pemberian logam seng akan membentuk warna merah

intensif setelah 2 menit, sedangkan logam magnesium membentuk warna merah

jingga hingga ungu atau kuning jingga. Hasil skrining fraksi etil asetat warna

kuning jingga. Jadi fraksi etil asetat dan ekstrak metanol mengandung flavonoid.

Apabila suatu ekstrak mengandung tanin, penambahan ekstrak dengan

larutan gelatin dan larutan natrium klorida akan menghasilkan endapan putih.

Selain itu, pemeriksaan tanin bisa dilakukan dengan penambahan beberapa tetes

larutan FeCl3 1% yang akan membentuk warna hijau violet. Berdasarkan hasil

skrining, ekstrak metanol awal dan fraksi etil asetat daun Kjelbergiodendron

celebicus mengandung tanin.

Fitosterol dan terpen dapat diidentifikasi keberadaanya dengan tes

Liebermann-Bouchard. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna

merah-hijau atau violet-biru. Ekstrak metanol awal dan fraksi etil asetat keduanya

membentuk warna violet-biru sehingga fraksi tersebut positif terhadap

sterol/terpen. Dalam cairan, saponin dapat membentuk busa setelah pengocokan

kuat selama 10 detik dengan air suling panas dan busa bertahan tidak kurang dari

10 detik. Kedua frakasi tersebut membentuk busa yang mantap lebih dari 10

menit.

Pada proses identifikasi glikosida dilakukan untuk identifikasi terhadap

keberadaan gula, yakni dengan tes Molisch setelah dilakukan proses hidrolisis,

yaitu dengan cara memanaskan ekstrak di dalam larutan asam terlebih dahulu.

Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya cincin ungu setelah ditambahkan

larutan pereaksi molisch dan H2SO4 pekat. Berdasarkan pengujan, ekstrak metanol

awal dan fraksi etil asetat mengandung glikosida.

Tes Borntrager digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan antrakuinon

dalam suatu ekstrak. Hasil positif tes Borntrager ditunjukkan dengan

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 63: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

48

 

  Universitas Indonesia

 

dihasilkannya warna kuning saat dilakukan penarikan senyawa antrakuinon

dengan benzene dan dihasilkannya warna merah saat ditambahkan amonia encer.

Berdasarkan hasil skrining, kedua fraksi dari daun Kjelbergiodendron celebicus

tidak mengandung antrakuinon.

Tabel 4.4. Data penapisan fitokimia ekstrak metanol awal dan fraksi etil asetat

daun Kjelbergiodendron celebicus (Koord)Merr.

Golongan Kimia

Pengamatan Sampel

Ekstrak metanol awal Fraksi etil asetat

Alkaloid + +

Flavonoid + +

Tanin + +

Sterol/Terpen + +

Saponin + +

Antraquinon - -

Glikosida + +

4.6. Isolasi Senyawa Aktif

Berdasarkan hasil uji antioksidan dan uji toksisitas 5 fraksi hasil partisi

dari ekstrak metanol, dipilih fraksi etil asetat untuk difraksinasi lebih lanjut.

Sebanyak 11,99 g fraksi etil asetat difraksinasi menggunakan kromatografi kolom

dipercepat (KKC) dengan silika gel 60 sebagai fase diam dan pengelusi dengan

kepolaran bertingkat dalam berbagai perbandingan, yakni n-heksan : etil asetat

dan etil asetat : metanol sebagai fase geraknya. Hasil dari KKC tersebut

didapatkan 15 fraksi (Fr1-Fr15). Hasil penggabungan berdasarkan kesamaan pola

kromatogram pada identifikasi KLT.

Lima belas fraksi hasil pemisahan fraksi etil asetat dilakukan uji

pendahuluan antioksidan dengan reaksi semprot DPPH dan juga uji toksisitas

metode BSLT (Tabel 4.5.). Pengujian antioksidan dengan reaksi semprot DPPH

pada KLT menunjukkan bahwa terdapat 5 fraksi yang bersifat aktif sebagai

antioksidan, yaitu Fr5, Fr11, Fr12, Fr14 dan Fr15 yang ditandai dengan

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 64: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

49

 

  Universitas Indonesia

 

terbentuknya warna kuning pada totolan di KLT. Selanjutnya, ke-5 fraksi tersebut

dilakukan pengujian antioksidan dengan metode DPPH secara in vitro. Hasil

pengujian tersebut menunjukkan bahwa ke-5 fraksi memiliki aktivitas antioksidan

yang sangat baik karena memiliki IC50 kurang dari 1000 ppm yakni Fr5 sebesar

28,22 ppm, Fr11 sebesar 29,13 ppm, Fr12 sebesar 11,93 ppm, Fr13 sebesar 19,02

ppm dan Fr15 sebesar 12,06 ppm. Sedangkan pada uji toksisitas ke-15 fraksi

menggunakan metode BSLT memperlihatkan potensi toksisitas akut dengan nilai

LC50 kurang dari 1000 ppm yakni berkisar antara 20–300 IC50 (Tabel 4.5) Sifat

toksik terbesar dimiliki oleh Fr12 dengan nilai LC50 sebesar 22,88 ppm.

Berdasarkan nilai IC50, LC50 dan berat fraksi maka dipilihlah fraksi 11 untuk

difraksinasi lebih lanjut dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam

berupa silika dan fase gerak yang semakin meningkat kepolarannya berupa

campuran pelarut berbagai perbandingan yakni n-heksan : etil asetat dan etil asetat

: metanol.

4.6.1 Isolasi Senyawa Fr11.32

Pemisahan fraksi 11 menggunakan kromatografi kolom silika

menghasilkan 151 fraksi (botol 50 mL). Setelah diidentifikasi dengan KLT,

fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabungkan sehingga

diperoleh fraksi gabungan sebanyak 45 (Fr11.1 - Fr11.45). Pada fraksi gabungan

Fr 11.32 terdapat pasta kuning yang pada pelat KLT dengan eluen 2,0 mL etil-

asetat 100% tampak 2 spot bewarna kuning (Gambar 4.5a). Sebanyak 73,1 mg

Fr11.32 dilakukan pemurnian lebih lanjut menggunakan kromatotron.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 65: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

50

 

  Universitas Indonesia

 

Keterangan : (a) Kromatogram Fr11.32 hasil pemisahan dengan Kromatogtafi Kolom, eluen Etil Asetat 100% (b) Kromatogram Fr11.32a hasil pemisahan dengan Kromatotron, eluen Etil Asetat 100%

Gambar 4.5. Pola kromatogram Fr11.32 (a) dan Fr11.32a (b)

Pemisahan dengan khromatotron menggunakan pelat kaca berbentuk

lingkaran dengan fase diam berupa silika gel G 60 (ukuran partikel <55µm)

dengan tebal 2 mm. Sebelum digunakan, pelat dikeringkan dalam oven pada suhu

50oC selama 5 menit terlebih dahulu untuk menghilangkan sisa pelarut atau uap

air yang terjerap sehingga dapat mengaktifkan silika gel. Pelat selanjutnya

dipasang pada chamber dan dielusi dengan n-heksana. Elusi menggunakan pelarut

n-heksana bertujuan untuk mencuci pelat dari komponen-komponen pengotor

sekaligus membasahi pelat. Elusi dilakukan secara gradien, yakni menggunakan

n-heksana : etil aetat dan etil asetat : metanol dalam berbagai perbandingan

dengan kenaikan kepolaran 25%. Sampel membentuk pita-pita kearah tepi pada

saat dielusi menggunakan heksana-etil asetat 75%. Pemisahan terjadi optimal

pada saat eluen yang digunakan etil asetat 100% dan etil asetat-metanol 25%.

Hasil pemisahan berupa pita-pita berbentuk cincin yang terbentuk pada

pelat dimulai dari bagian tengah ke bagian pinggir pelat saat proses elusi terjadi.

Banyaknya cincin dan warna cincin yang terbentuk tergantung dari sampel yang

dianalisis. Cincin yang terbentuk saat proses elusi sampel Fr11.32 berwarna

kuning sesuai dengan profil kromatogram KLT sebelumnya. Terbentuknya cincin

diamati dengan lampu UV baik pada 254 nm maupun 366 nm karena

32 32a (a) (b)

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 66: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

51

 

  Universitas Indonesia

 

dikhawatirkan ada komponen yang hanya terlihat pada sinar UV. Posisi chamber

yang miring pada chromatotron memungkinkan hasil elusi keluar dengan mudah

dan dapat ditampung. Selain itu pemisahan dengan kromatografi radial

memberikan persentase perolehan kembali yang tinggi yakni sebesar 90%

dibandingkan dengan KLT preparatif yang hanya 80% (Hostettmann, Marston dan

Hostettmann, 1998).

Fraksi yang dihasilkan ditampung per 6 ml dengan tujuan agar spot

tunggal akan tertampung dan terpisah dari spot yang lain karena berdasarkan

kromatogram KLT sebelumnya kedua spot memiliki jarak yang cukup dekat. Jika

ditampung terlalu banyak dikhawatirkan saat diidentifikasi dengan KLT akan

menunjukkan dua spot kembali. Eluen selanjutnya digunakan metanol saat hasil

elusi sudah tidak berwarna dan tidak menunjukkan spot lagi saat diamati pada

lampu UV. Hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa-sisa komponen sampel

pada pelat yang sudah tidak dapat terelusi dengan eluen yang digunakan. Hasil

elusi dengan metanol ditampung dan diidentifikasi dengan KLT. Pengelusian

dengan metanol dilakukan hingga hasil elusi sudah tidak berwarna lagi. Eluat

ditampung dan diidentifikasi melalui KLT. Didapat 5 fraksi gabungan berdasar

kesamaan pola kromatogram (Fr11.32a-Fr11.32e). Identifikasi menggunakan

kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa Fr11.32a dengan berat 11,3 mg

membentuk satu spot bewarna kuning (Gambar 4.5b). Menurut Harborne (2006),

reaksi positif berupa warna kuning yang dihasilkan setelah disemprot dengan

vanilin-sulfat dan flouresensi kuning pada UV 254 nm merupakan golongan

senyawa flavonoid atau xanton. Sedangkan hasil penapisan fitokimia Fr11.32a

terhadap pereaksi AlCl3 memberikan warna biru kehitaman yang mengindikasikan

bahwa senyawa kimia merupakan golongan flavonoid. Oleh karena itu,

Fr111.32a kemungkinan besar merupakan golongan flavonoid. Flavonoid yang

memiliki spot bewarna kuning redup dan apabila dlihat dibawah sinar UV

bewarna coklat merupakan flavonoid flavon atau glikosilflavon (Harborne, 1987).

Selanjutnya, Fr11.32a diidentifikasi menggunakan LC-MS, IR dan NMR untuk

menganalisis struktur kimia isolat murni tersebut.

Senyawa murni Fr11.32a dilakukan uji aktivitas antioksidan menggunakan

metode peredaman radikal bebas DPPH dan uji toksisitas menggunakan metode

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 67: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

52

 

  Universitas Indonesia

 

BSLT. Fr11.32a memiliki aktivitas antioksidan yang cukup baik (Gambar 4.4).

Hal ini ditunjukkan dengan IC50 senilai 95,83 ppm yang berarti bahwa senyawa

kimia tersebut mampu meredam radikal bebas sebesar 50% pada kosentrasi 95,83

ppm. Sedangkan hasil uji toksisitas Fr11.32a dengan nilai LC50 21,23 ppm

mengindikasikan bahwa senyawa bersifat sangat toksik (Gambar 4.5.).

Tabel 4.6. Data hasil uji aktivitas antioksidan Fr11.32a

Sampel Konsentrasi

(µg/mL) Absorbans

% Inhibisi Persamaan

Linier IC50

(ppm) Blanko Sampel

Fr 11.32a 150 1,703 0,395 76,80 y = 0,415x 95,83 100 0,895 47,44 + 10,23 75 1,034 39,28 50 1,212 28,83 r2= 0,967 10 1,387 18,55

Tabel 4.7. Data hasil uji toksisitas Fr11.32a

Sampel Konsentrasi

(ppm) Akumulasi

Hidup Akumulasi

Mati Mortalitas

(%) Persamaan

Regresi LC50

(ppm)

Fr11.32a 10 100 500

1000

17 6 2 0

9 26 44 64

34,61 81,25 95,65

100,00

y = 32,872x - 6,3818 r² = 0,9516

21,3

4.7. Identifikasi Struktur Kimia Senyawa Murni

Identifikasi struktur senyawa kimia isolat murni (Fr11.32a) dilakukan

melalui analisis data-data spektroskopi, yakni menggunakan spektroskopi

ultraviolet dan visibel (UV-Vis), spektroskopi infra merah (IR), kromatografi cair-

spektroskopi massa (LCMS) dan resonansi magnetik inti proton dan karbon (1H-

NMR dan 13C-NMR).

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 68: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

53

 

  Universitas Indonesia

 

4.7.1 Analisis data spektrum UV-Vis

Sektrofotometri UV-Vis memberikan informasi adanya gugus kromofor

dari senyawa organik dan membedakan senyawa aromatik atau ikatan rangkap

yang terkonjugasi dari senyawa alifatik rantai jenuh. Analisis ini dilakukan karena

dugaan awal yang berdasarkan hasil penapisan dan pola kromatogram

menunjukkan bahwa isolat FR11.32a merupakan senyawa kimia golongan

flavonoid. Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga

menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah ultraviolet dan tampak

(Harborne, 1987). Senyawa dengan ikatan rangap terkonjugasi seperti flavonoid

akan mengalami penyerapan radiasi pada panjang gelombang yang lebih besar

dari 217 nm (Sastrohamidjojo, 1991).

Hasil pengukuran absorbansi Fr11.32a dalam metanol menunjukkan 3

puncak pada panjang gelombang 220, 262 dan 337 nm (Gambar 4.6.) dengan

absorbansi kuat masing-masing sebesar 0,876; 0,794 dan 0,555. Menurut

Markham (1988), flavonoid yang memiliki puncak pada panjang gelombang 330-

350 nm pada pita I dan 250-280 nm pada pita II merupakan flavonoid golongan

flavon. Hal tersebut ditunjukkan oleh Fr11.32a yang memiliki spektrum pada 262

dan 337 nm.

Pita I (337 nm) yang terletak antara 300-550 nm menunjukkan adanya

ikatan ππ* seperti ikatan C=C terkonjugasi. Sedangkan adanya pita II (262 nm)

yang terletak antara 210-285 nm maka dapat diperkirakan terdapat ikatan ππ*

seperti C=C terkonjugasi serta nπ* berupa kromofor tunggal seperti ikatan C=O

(Sastrohamidjojo, 1991).

 

 

 

 

 

Gambar 4.6. Spektrum UV-Vis Isolat Fr11.32a

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 69: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

54

 

  Universitas Indonesia

 

4.7.2 Analisis data spektrum FT-IR (Fourier Transform – Infra Red)

Spektrum inframerah suatu senyawa dapat memberikan gambaran

berbagai gugus fungsi yang terdapat dalam sebuah molekul organik (Fessenden

dan Fessenden, 1986). Puncak kurva yang dihasilkan diidentifikasi dengan cara

membandingkannya dengan pustaka. Gugus-gugus fungsi penting merupakan

parameter identifikasi senyawa yang dianalisis (Sastrohamidjojo, 1991).

Berdasarkan spektrum FT-IR fraksi 11.32a, terdapat pita-pita serapan pada

bilangan panjang gelombang yang bisa dilihat pada Gambar 4.1. Pita-pita serapan

tersebut kemudian dibandingkan dengan pustaka.

Pita serapan lebar antara 3400-3100 cm-1 merupakan vibrasi rentangan

gugus hidroksil (-OH) yang diakibatkan oleh ikatan hidrogen intermolekul, yang

diperkuat juga oleh serapan berintensitas sedang pada bilangan gelombang 1448

cm-1. Pita serapan pada daerah yang sama dan tumpang tindih dengan daerah

serapan gugus hidroksil pada bilangan gelombang antara 3420-3250 cm-1 juga

dapat menunjukkan adanya gugus hidroksil yang terikat pada cincin aromatik

benzene atau yang dikenal sebagai gugus fenol (Ar-OH), keberadaan gugus fenol

tersebut diperkuat dengan serapan pada daerah bilangan gelombang 721 cm-1.

Daerah pada bilangan gelombang 3159-3050 cm-1 menunjukkan adanya

senyawa aromatik. Regangan C-H aromatik selalu berada di sebelah kiri daerah

3000 cm-1. Pada gambar 4.1 terdapat pita pada 3140,11 cm-1 namun tidak terlihat

jelas. Hal ini dikarenakan akibat adanya serapan lebar –OH. Untuk memastikan

apakah 3140,11 cm-1 merupakan regangan C=C-H, harus diperkuat dengan pita

serapan berintensitas kuat pada daerah bilangan gelombang 1600–1450 cm-1 dan

pita serapan yang berupa sepasang serapan tajam dan pada bilangan gelombang

900-600cm-1 yang merupakan pita-pita informative senyawa aromatik. Kedua hal

tersebut terbukti dengan adanya pita serapan tajam pada 1502,55 cm-1 & 1448,54

cm-1 dan pita serapan berdempetan sepanjang 835,18–644,22 cm-1.

Pita dengan panjang gelombang 2978,09 cm-1 mengindikasikan adanya

gugus metil (-CH3) dengan vibrasi regangan asimetris dari ikatan C-H. Hidrogen

metilen (-CH2) mengakibatkan dua serapan rentangan C-H yang dihasilkan dari

vibrasi rentangan simetri dan asimetri dari gugus fungsi tersebut, yakni pada

2843,07 cm-1 yang merupakan regangan simetris dan regangan asimetrisnya pada

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 70: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

55

 

  Universitas Indonesia

 

60080010001200140016001 8002000240028003200360040001/cm

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

%T

3414

.00

3302

.13

3182

.55

3140

.11

2978

.09

2939

.52

2843

.07

2727

.35

2357

.01

1955

.82

1653

.00

1602

.85 15

02.5

5

1448

.54

1373

.32

1298

.09

1201

.65

1166

.93 11

39.9

3

1089

.78

1055

.06

1024

.20

993.

34

954.

76

835.

1881

2.03

765.

74

721.

38

678.

9464

4.22

543.

93

UHAIS 15-32

pada 2939,52 cm-1. Pada literatur disebutkan bahwa gugus metil, metilen dan

metin akan memberikan puncak pada kisaran panjang gelombang 1465-1370 cm-1.

Spektrum IR fraksi 11.32a memperlihatkan pita serapan dari 1448,54 hingga

1373,32 cm-1 yang berarti terdapat gugus metil, metilen dan metin dalam senyawa

(Sastrohamidjojo, 1991).

Pita absorbansi sedang pada 1653,0 cm-1 menunjukkan adanya karbonil

(C=0) pada ester β-keton. Absorbansi sangat kuat yang terletak pada bilangan

gelombang 1280-1150 cm-1 mengindikasikan adanya C-O-C ester. Hal ini terjadi

pada 1201,65 cm-1 yang berarti bahwa Fr11.32a memiliki gugus C-O-C ester.

Berdasarkan analisis spektrum FT-IR di atas, isolat Fr11.32a memiliki

gugus –OH, Ar-OH, C=O dan C-O-C. Gugus-gugus fungsi tersebut merupakan

gugus fungsi yang terdapat pada struktur umum flavonoid. Hal tersebut

mendukung dugaan bahwa isolat Fr11.32a merupakan senyawa golongan

flavonoid.

Gambar 4.6. Spektrum Infra Merah Fr11.32a

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 71: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

56

 

  Universitas Indonesia

 

4.7.3 Analisis data spektrum NMR

Berdasarkan data hasil pengukuran 1H-NMR dapat diketahui bahwa isolat

11.32a mempunyai 9 buah puncak proton dan 19 puncak karbon dengan data

pergeseran kimia (δ) proton (ppm) adalah 0,94 (t, 3H); 3,32 (dd, 1H); 3,74 (dd,

1H); 3,87 (s, 3H); 4,23 (dd, 1H); 5.30 (d, 1H, J=1.95 Hz), 6.20 (d, 1H, J=2.6 Hz),

6.36 (d, 1H, J= 1.95 Hz) dan 6.88 (s, 2H). Sedangkan δ karbon (ppm) 17,8; 61,0;

73,3; 72,1; 71,9; 94,9; 100,0; 103,8; 106,0; 109,8; 127,1; 136,8; 139,4; 152,0;

158,7; 159,1; 163,4; 166,3 dan 179,7.

Berdasarkan data-data nilai pergeseran kimia dari 1H-NMR di atas dapat

diketahui bahwa puncak pada δ 0,94 ppm merupakan gugus metil (-CH3) hal ini

didukung dengan letak dari puncak tersebut yang berada pada kisaran daerah

pergeseran kimia untuk gugus metil dan didukung dengan nilai integrasi 3H yang

menunjukkan jumlah atom proton yang dimiliki oleh gugus metil. Puncak pada δ

3,32; 3,74; 4,23 merupakan puncak-puncak dari gugus metin (-CH-) yang

bergeser menjadi lebih downfield/deshielded dengan nilai integrasi masing-

masing 1H, hal ini menunjukkan bahwa ketiga gugus metin (-CH) tersebut

berdekatan letaknya dengan atom elektronegatif dan umumnya atom

elektronegatif tersebut adalah atom oksigen (O), puncak pada δ 3,87 ppm dengan

multiplisitas puncak tunggal (singlet), tajam dengan nilai integrasi 3H

menunjukkan puncak khas untuk gugus metoksi (-OCH3), puncak pada δ 5,30

ppm yang terletak pada kisaran daerah pergeseran kimia khas untuk rantai karbon

ikatan rangkap dan dengan nilai integrasi 1H, menunjukkan bahwa puncak

tersebut merupakan puncak gugus metin (-CH=), puncak-puncak pada δ 6,20;

6,36 dan 6,88 ppm merupakan puncak-puncak khas dari H aromatik yang terletak

pada kisaran daerah 6,5 – 8 ppm.

Berdasarkan data-data nilai pergeseran kimia 13C-NMR dapat diketahui

bahwa isolat Fr11.32a mempunyai 1 buah atom C metil pada δ 17,8 ppm, 2 buah

atom C metin alifatik downfield yang khas menunjukkan daerah pergeseran kimia

C yang mengikat O (C-O) pada δ 71,9; 72,1 dan 73,3 ppm, 1 buah gugus C

metoksi (-OCH3) pada δ 61,0 ppm, 13 buah puncak atom C ikatan rangkap (-

C=C-) pada δ 94,9; 100,0; 103,8; 106,0; 109,8; 127,1; 136,8; 139,4; 152,0; 158,7;

159,1; 163,4 dan 166,3 ppm, dari puncak-puncak tersebut dapat diketahui bahwa

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 72: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

57

 

  Universitas Indonesia

 

puncak pada δ 72,1; 109,8 dan 152,0 ppm masing-masing mewakili 2 buah atom

karbon yang simetris, hal ini ditunjukkan dengan intensitas puncaknya yang

hampir 2 kali lebih tinggi, 1 buah atom C karbonil (-C=O) khas untuk gugus asam

(R-COO-R) pada δ 179,7 ppm.

Dari uraian di atas dapat diketahui bahwa isolat 11.32a merupakan suatu

senyawa yang memiliki gugus -C=C- aromatik, -C=C- alkena, metoksi (-OCH3),

metil (-CH3), gugus -C-O- dan gugus karbonil asam (-RCOOR).

4.7.4 Analisis data spektrum LC-MS

Identifikasi senyawa kimia dalam fraksi 11.32a pertama-tama dilakukan

menggunakan LC-MS atau kromatografi cair–spektrofotometri massa. Pemisahan

menggunakan kromatografi cair menunjukkan satu puncak kromatogram

(Lampiran 9) dengan waktu retensi 1,8 menit (T 1,8). Puncak tersebut selanjutnya

dianalisis menggunakan spektrometri massa untuk mengetahui bobot molekul dari

senyawa yang terkandung dalam Fr11.32a

Spektrum hasil MS Fr11.32a menunjukkan sebuah korelasi antara (m/z)

478,55; dan 977,29. Dari fragmentasi tersebut dapat diartikan bahwa (M+)

sebesar 478,55 mewakili berat molekul senyawa. Sedangkan (m/z) 977,29

merupakan (2M+ + Na). Adanya penambahan berat molekul Natrium dikarenakan

sistem eluen yang mengandung Na.

Berdasarkan hasil analisis penapisan fitokimia dan pola kromatogram serta

analisis struktur kimia menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, IR, NMR dan

LC-MS maka diduga isolat Fr11.32a merupakan senyawa flavonoid (Gambar 4.7)

golongan flavon.

[Sumber : Markham, 1988]

Gambar 4.7. Struktur Dasar Flavonoid

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 73: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

58

 

  Universitas Indonesia

 

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan data yang diperoleh dari penelitian maka dapat diambil

kesimpulan bahwa:

a. Aktivitas antioksidan (IC50) dan efek sitotoksik (LC50) ekstrak metanol kasar,

fraksi n-heksana, etil asetat, butanol, dan metanol dari daun Jambo-Jambo

[Kjelbergiodendron celebicus (Koord) Merr.] berturut-turut adalah sebesar

12,59 dan 243,5 µg/mL ; 78,14 dan 214,5 µg/mL; 26,52 dan 50,84 µg/mL;

8,34 dan 228,00 µg/mL; serta 10,56 dan 168,70 µg/mL.

b. Aktivitas antioksidan tertinggi ditunjukkan oleh fraksi butanol dengan IC50

8,34 µg/mL. Sedangkan toksisitas tertinggi ditunjukkan oleh fraksi etil asetat

dengan LC50 50.84 µg/mL.

c. Senyawa kimia aktif yang diisolasi dari fraksi etil asetat diperkirakan

merupakan golongan flavonoid (flavon) dengan berat molekul sebesar 478

yang berdasarkan hasil analisis 12C-NMR memiliki atom C sejumlah 22 yang

berupa ikatan -C=C- aromatik, -C=C- alkena, metil (-CH3), metoksi (-OCH3),

-C-O- dan ikatan karbonil asam (-RCOOR) dan berdasarkan analisis FT-IR

memiliki gugus hidroksil –OH, fenol Ar-OH, karbonil C=O dan C-O-C ester.

5.2 Saran

a. Diperlukan analisis data hasil NMR lebih lanjut (HMBC, HMQC dan COSY)

untuk memastikan struktur kimia senyawa murni.

b. Diperlukan pemisahan lebih lanjut beberapa fraksi yang memiliki potensi

keaktifan terhadap aktivitas antioksidan dan toksisitas.

58

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 74: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

59

 

  Universitas Indonesia

 

DAFTAR ACUAN

Arts, M.J.T.J., Haenen, G.R.M.M., Voss, H.P. dan Bast, A. (2004). Antioxidant capacity of reaction products limits the applicability of the Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) assay. Food and Chemical Toxicology, 42, 45–49.

Bintang, Maria. (2010). Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga, 141-148.

Blois, M.S. (1958). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 181, 1199-1200.

Bozin, B., Mimica, D.N., Samojilik, I., Goran, A. dan Igic, R. (2008). Phenolics as antioxidant in garlic. Food Chemistry, 111, 925-929.

Carballo, J.L., Hernandez-Inda, Z.L., Perez, P. dan Garcia-Gravaloz, M.D. (2002) Comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology, 2, 1472-6570.

Cazes, J. (2010). Encyclopedia of Chromatography. London: CRC Press, 71-75.

Chanda, S. dan Dave, R. (2009). In vitro models for antioxidant activity evaluation some medicinal plants possessing antioxidant properties: An overview. African Journal of Microbiology Research Vol 3(13), 981-996.

Citrosupomo, Gembong. (1994). Taksonomi, Tumbuhan Obat-Obatan. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press, 221.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 308, 322-324, 328, 333-337.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1-33.

Farnsworth, N.R. (1966). Biological and phytochemical screening of plants. Journal of Pharmaceutical Science, 55(3), 226-276.

Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S. (1986). Kimia Organik Edisi ke-3. Diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D. Jakarta : Penerbit Erlangga, 315-316, 327, 354-355.

Gandjar, I.G. dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar, 353-359.

Gritter, J.R., Bobbit, J.M. dan Schwarting, A.E. (1991). Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung : ITB, 107-109, 140-147, 160-163.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 75: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

60

 

  Universitas Indonesia

 

Halliwel, B. dan Gutteridge, J.M.C. (1999). Free Radical in Biology and Medicine. 3rd ed. Oxford University Press, 23-31, 105-115.

Harbone, J.B. (1987). Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan Edisi ke-2. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung : Penerbit ITB, 47-69, 85-88, 102-109, 123, 245.

Hardjono. (1991). Kromatografi. Yogyakarta : Liberty, 57.

Harmita dan Radji, M. (2008). Analisis Hayati. Jakarta : Penerbit Buku

Kedokteran, 77.

Hatano, T., Kagawa, H., Yasuhara, T. dan Okuda, T. (1988). Two new flavonoids and other constituents in licorice root : their relative astringency and radical scavenging effects. Chem. Pharm. Bull., 36, 1090-2097.

Hendayana, S., Kadarohman, A., Sumarna, A.A. dan Supriatna, A. (1994). Kimia Analitik Instrumen. Semarang : IKIP Semarang Press, 155-156, 189-191.

Hermanto S. 2009. Mengenal Lebih Jauh Teknik Analisis Kromatografi dan Spektroskopi. Jakarta : UIN Jakarta, 98.

Hostettmann, K., Marston A. dan Hostettmann, M. (1998). Preparative Chromatography Techniques. Berlin: Springer, 9-11.

Joon-Kwan Moon dan Takayuki Shibamoto. (2009). Antioxidant assays for plant and food components. J. Agric. Food Chemistry, 57, 1655–1666.

Kendari Pos. (2011). Eksotisme Pegunungan Mekongga : Peneliti Dalam dan Luar Negeri Tertantang untuk Menjajal Keunikannya. Kendari : Graha Pena. Edisi 31 Juli 2011.

Kazakevich Y dan Lobrutto R. (2007). HPLC for Pharmaceutical Scientists. New Jersey : John Wiley & Sons, 282.

Lenny, S. (2006). Isolasi dan Uji Bioaktivitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metode Brine Shrimp Lethality. USU Repository. http://ww.usu.ac.id/penelitian/maserasi. diakses tanggal 26 Mei 2012.

Lindsay, S. (1992). High Performance Liquid Chrotomagraphy second edition. New York, Chihester, Brisbane, Toronto, Singapore : John Wiley & Sons, 157.

LIPI - Kebun Raya Bogor Plant List. http://www.nbinindonesia.org/krb/krbview.asp/ID=13367. Diunduh tanggal 4 februari pukul 15.00 WIB

Lopez-Alarcon, C. dan E. Lissi. (2006). A novel and simple ORAC methodology based on the interaction of pyrogallol red with peroxyl radicals. Free Rad Res, 40 (9), 979-985.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 76: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

61

 

  Universitas Indonesia

 

Markham, K.R. (1988). Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Terjemahan Kosasih Padmawinata. Bandung : Penerbit ITB, 15-35; 43-55; 85-89.

Mena, S., Ortega, A. dan Estrela, J. M. (2009). Oxidative stress in environmental-induced carcinogenesis. Mutation Research, 674, 36–44.

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen L.B., Nichols, D.E. dan McLaughlin J.L. (1982). Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Medica, 45(5), 31-4.

Moore, J. dan Yu, L. (2007). Methods for antioxidant capacity estimation of wheat-based food products. Liangli Yu (Ed.).Wheat Antioxidants. USA : John Wiley & Sons., 22-24.

Nguyen, H. dan Widodo, S. (1999). Momordica L. In: Medicinal and Poisinous Plant Research of South-East Asia 12. De Padua L. S. N. Bunyapraphatsana and R.H. M. J. Lemmens (eds.). Pudoc Scientific Publisher, Netherland : Wageningen, 353-359.

Pokorni. (2001). Antioxidant in Food : practical applications. New York : CRC Press, 5-33.

Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bali. (2006) Koleksi Pohon Sulawesi. Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya “Eka Karya” Bali – LIPI, 36-47.

Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor-LIPI. (2002). Flora Sulawesi: Unik, endemik dan langka. Bogor: Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor-LIPI, 17.

Pusat Penelitian Biologi-LIPI. (2011). Status Keanekaragaman Hayati Indonesia. Bogor: LIPI Press, 7.

Rita W.S., Suirta I.W. dan Sabikin A. (2008). Isolasi&Identifikasi Senyawa Yang Berpotensi aebagai Antitumor pada Daging Buah Pare (Momordica charantia L.). Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran. Jurnal Kimia Vol.2, ISSN 1907-9850.

Robinson, T. (1995). Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Diterjemahkan oleh Padmawinata K. Bandung : Penerbit ITB, 191.

Rufino, M.S.M., Alves, R.E., Fernandes, F.A.N. dan Brito, E.S. (2010). Free radical scavenging behavior of ten exotic tropical fruits extracts. Food Research International, 44, 2072–2075.

Sastrohamidjojo, H. (1991). Spektroskopi. Yogyakarta : Liberty, 34-35.

Satmoko, W. (2002). Efek Toksik dan Cara Menentukan Toksisitas Bahan Kimia. Cermin Dunia Kedokteran, 135, 32-37.

Shellard, E. J. (1975). Quantitative Paper and Thin Layer Chromatography. New York : Academic Press, 157-158.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 77: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

62

 

  Universitas Indonesia

 

Shivaprasad, H.N., Mohan, S., Kharya, M.D., Shiradkar, M.R. dan Lakshman, K. (2005). In-Vitro Models For Antioxidant Activity Evaluation: A Review. Pharmaceutical Reviews, 3 (4). 2005.

Soetamaji, D.W. (1998). Peran stress oksidatif dalam patogenesis angiopati mikro dan makro DM. Medica, 5 (24), 318-325.

Stahl, E. (1985). Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung : Penerbit ITB.

Stoilova, I., Krastanov, A., Stoyanova, A., Denev, P. dan Gargova, S. (2006). Antioxidant activity of a ginger extract (Zingiber officinale). Food Chemistry, 102, 764-770.

Sudjadi. (1985). Penentuan Struktur Senyawa Organik. Jakarta : Ghalia

Indonesia, 128.

Townshend, A. (1995). Encyclopedia of Analitycal Science, Vol. 2. London : Academic Press Lnc, 714-728.

Ukra, Mark. (2008). The Ultimate Tea Diet. New York: Harper Collins ebooks,

47.

Winarsi, Hery. (2007). Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta : Kanisius, 15-17.

Wu C. (1995). Handbook of Size Exclusion Chromatography. New Jersey : Marcel Dekker, 5.

Yen, G.C. dan H.Y. Chen. (1995). Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. J. Agric. Food. Chemistry, 27-32.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 78: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 79: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

63

 

  Universitas Indonesia

 

evaporasi

Gambar 3.1. Skema Kerja Ekstraksi dan Partisi

evaporasi

evaporasi

evaporasi

evaporasi

Ekstrak metanol (65,08 gram)

50,1 gram dipartisi dengan n-heksan dan aquadest 1:1, dipisahkan

Lapisan air

Fraksi n-heksan (5,35 gram)

Partisi dengan etil asetat 1:1 

Lapisan etil asetat

Fraksi etil asetat (14,94gram)

Lapisan air

Partisi dengan butanol 1:1

Lapisan butanol Lapisan air

Fraksi butanol (6,45 gram)

Dikeringkan, ditambah

metanol, disaring

Fraksi methanol (11,84gram)

Residu (6,12gram)

Lapisan n-heksan

Maserasi, metanol

Kjelbergiodendron celebicus (Daun 600 gram)

Uji Antioksidan DPPH dan Uji Toksisitas BSLT

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 80: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

64

 

  Universitas Indonesia

 

Gambar 3.2. Skema Kerja Fraksinasi dan Isolasi Senyawa Aktif

K.Kolom (Vakum) Silika

Fraksi Etil asetat (11,99 gram) IC50 =26,52 ; LC50=50,84

Skrining berdasar nilai IC50 dan LC50

Fr1 – Fr15

KLT

Reaksi semprot DPPH

6 fraksi aktif

Uji Antioksidan DPPH dan Uji Toksisitas BSLT

Fr5 (IC50=28,22; LC50=69,40)

Fr1 (IC50=29,1; LC50=135,08)

Fr12(IC5011,9; LC50=22,88)

Fr13(IC50=9,02; LC50=1146,6)

Fr15(C50=12,06;LC50=161,8)

Fraksi 11 (K. Kolom, Silika)

45 fraksi gabungan (F11.1 – F11.45)

F11.32a (11,3 mg)

Fr11.32 (73,1 g)

Kromatotron

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 81: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

65

 

  Universitas Indonesia

 

Gambar 4.1. Kurva konsentrasi dan % inhibisi fraksi-fraksi hasil partisi ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus pada uji antioksidan

Gambar 4.2. Kurva log konsentrasi dan % mortalitas Fr11.32a fraksi-fraksi hasil partisi ekstrak daun Kjelbergiodendron celebicus pada uji

toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 82: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

66

 

  Universitas Indonesia

 

 

Gambar 4.3. Kurva konsentrasi dan % inhibisi Fr11.32a pada uji antioksidan terhadap radikal bebas DPPH

Gambar 4.4. Kurva log konsentrasi dan % mortalitas Fr11.32a pada uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 83: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 84: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

67

 

  Universitas Indonesia

 

Tabel 4.5. Hasil uji aktivitas antioksidan dan uji toksisitas fraksi-fraksi hasil Kromatografi Kolom Cepat

Fraksi Berat (mg) IC50 (ppm) LC50 (ppm)

1 1,3 - -

2 304,4 - 287.30

3 304,1 - 112.17

4 465,5 - 188.75

5 1973,1 28,22 69.41

6 a.169,1; b.50,7 - 182.17

7 a.50,8; b.150,3 - 68.87

8 a.57,7; b.141,8 - 190.88

9 a.85,0; b.154,9 - -

10 a.37,5; b.99,98 - -

11 1573,1 29,13 135.08

12 6211,5 11,93 22.88

13 43,17 19,02 1146.58

14 5,7 - -

15 468,6 12,06 161.83

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 85: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 86: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

68

 

  Universitas Indonesia

 

Lampiran 1. Hasil determinasi daun Kjelbergiodendron celebicus(Koord) Merr.

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 87: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

69

 

  Universitas Indonesia

 

Lampiran 2. Kurva Optimasi Panjang Gelombang DPPH

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 88: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

70

 

  Universitas Indonesia

 

01.8

3.65.4

7.29.0

Reten

tion T

ime (M

in)

0257.5

0102030405060708090100

% Intensity

BPI=>

NR(2.

00)

T2.2

T1.7

Lampiran 3. Spektrum LC-MS dari Fr11.32a

3.1. Kromatogram

LC MS –ESI pos ion 

UHA 15 32 : Vol injection 20 ul; Flow 1  ml/min; Eluent  Methanol+Water =   90+10 

 

 

 

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 89: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

71

 

  Universitas Indonesia

 

99.0

319.2

539.4

759.6

979.8

1200

.0

Mass

(m/z)

0224.1

0102030405060708090100

% Intensity

Marin

er Sp

ec /4

4:46

(T /2

.12:2

.22) -

39:4

1 (T -

2.12:

2.22)

ASC

=>NR

(2.00

)[BP =

478.6

, 224

]

478.55

332.86

448.62

977.29

624.21

449.60

333.86

203.14

114.02

1077.1

6525

.10771

.32

3.2. Spektrum massa

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 90: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

72

 

  Universitas Indonesia

 

Lampiran 4. Spektrum 13C NMR dari Fr11.32a

4.1. Spektrum pada konsentrasi 0 – 220 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 91: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

73

 

  Universitas Indonesia

 

4.2. Spektrum pada konsentrasi 50 – 150 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 92: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

74

 

  Universitas Indonesia

 

4.3. Spektrum pada konsentrasi 31-44 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 93: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

75

 

  Universitas Indonesia

 

Lampiran 5. Spektrum 1H-NMR dari Fr11.32a

5.1. Spektrum pada konsentrasi 0.0 -16.0 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 94: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

76

 

  Universitas Indonesia

 

5.2. Spektrum pada konsentrasi 1.0 -7.0 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 95: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

77

 

  Universitas Indonesia

 

5.3. Spektrum pada konsentrasi 3.3 – 4.2 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012

Page 96: ISOLASI, UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20314059-S43806-Isolasi, uji.pdf · i universitas indonesia isolasi, uji aktivitas antioksidan dan toksisitas

78

 

  Universitas Indonesia

 

5.4. Spektrum pada konsentrasi 5.2 – 6.9 ppm

Isolasi, uji..., Nurlisa Dwi Novianti, FMIPA UI, 2012