ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI EKSTRAK · PDF file4.3 Hasil Fraksinasi Ekstrak Metanol Akar...

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI EKSTRAK

METANOL AKAR TUMBUHANLasianthus reticulatusBlume.

SKRIPSI

RATU FENI CHAIRUNNISA

108102000046

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JANUARI 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI EKSTRAK

METANOL AKAR TUMBUHAN

Lasianthus reticulatus Blume.

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RATU FENI CHAIRUNNISA

108102000046

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JANUARI 2013

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Ratu Feni Chairunnisa

NIM : 108102000046

Tanda Tangan :

Tanggal :

vi

ABSTRAK


Program Studi : Farmasi

Judul :Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri Ekstrak Metanol Akar

Tumbuhan Lasianthus reticulatus Blume.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa aktif antibakteri dari ekstrak

metanol akar Lasianthus reticulatus Blume. Serbuk akar Lasianthus reticulatus

diekstraksi secara maserasi bertingkat dimulai dengan n-heksan, etil asetat, dan

metanol. Ketiga ekstrak diuji aktivitas antibakterinya terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dengan metode bioautografi. Dari hasil biaoutografi

diketahui bahwa ekstrak metanol mengandung banyak senyawa yang memiliki

aktivitas antibakteri. Senyawa antibakteri yang terdapat dalam ekstrak metanol

selanjutnya diisolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan kromatografi

lapis tipis preparatif. Pemisahan secara berulang menghasilkan senyawa yang

berdasarkan analisa 1H-NMR menunjukkan resonansi pada geseran kimia (δ)

0,86; 0,87; 0,877; 1,23; 1,28; 1,36; dan 5,35 ppm. Spektra ini mengindikasikan

senyawa hidrokarbon alifatik.

Kata-kata kunci: Lasianthus reticulatus Blume, bioautografi, senyawa antibakteri,

isolasi.

vii

ABSTRACT

Name : Ratu Feni Chairunnisa

Program Study : Farmasi

Title :Isolation of Antibacterial Active Compounds on Methanol

Extract of Root on Lasianthus reticulatus Blume.

This study aimed to isolate antibacterial active compounds of methanol extract of

the root Lasianthus reeticulatus Blume. Dry powder of this root was extracted by

using n-hexane by maceration method followed by ethyl acetate and then

methanol extraction. Those extracts were tested for antibacterial activity against

Staphylococcus aureus by using bioautography method. On the bioautography

results that methanol extract has the most antibacterial active compounds. The

antibacterial active compound on extract was further separated by coloumn

chromatography and thin layer chromatography preparative. Separation repeatedly

results a compound and based on 1H-NMR spectrum showed resonance at

chemical shift (δ) 0.86, 0.87, 0.877, 1.23, 1.28, 1.36, and 5.35 ppm. This spectrum

suggesting that this compound is aliphatic hydrocarbon.

Keywords: Lasianthus reticulatus Blume, bioautography, antibacterial

compounds, isolation.

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur ke hadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan

karunia-Nya saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan

dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi

pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada kesempatan ini, saya mengucapkan terima kasih kepada:

(1) Bapak Dr. Andria Agusta sebagai pembimbing pertama dan Ibu Ismiarni

Komala, M.Sc., PhD., Apt sebagai pembimbing kedua, yang memiliki

andil besar dalam proses penyelesaian tugas akhir saya ini.

(2) Bapak Prof. Dr. (h) dr. Mk. Tadjuddin SP And, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4) Ibu Hertina, Bapak Arif Nurkanto, M.Si, Ibu Dra. Yuliasri Jamal, M.Sc,

Ibu Dra. Praptiwi, Kang Asep, Mas Toni, dan seluruh staf peneliti dan

teknisi di Bidan Botani dan Bidang Mikrobiologi , Pusat Penelitian

Biologi LIPI yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu

saya selama melakukan penelitian ini.

(5) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan.

(6) Rekan-rekan seperjuanganku, Putri, Ade, Yuni, Septi, Agung, Krisna, Mba

Ummul, Chyntia, Rahma, dan Fajri yang selalu berbagi baik suka maupun

duka.

(7) Teman-teman sepermainanku, Puser, Yanti, Intan, Sera, Lia, Ndaru dan

Winda yang selalu memberi saya semangat dan dukungan, serta Anggoro

dan EXO yang selalu dapat menghibur dikala saya lelah.

ix

(8) Kedua orang tua saya, ayahanda TB. Muqtafi dan Ibunda Mistuti Hairani,

atas do’a dan jerih payah keduanya, kebahagiaan kalian adalah

kebahagiaan saya.

Akhir kata, saya berharap Allah SWT membalas segala kebaikan semua

pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi

pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, 20 Januari 2013

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 108102000046

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul:

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI EKSTRAK METANOL

AKAR TUMBUHAN Lasianthus reticulatus Blume.

untuk dapat diakses melalui Digital Library Perpustakaan Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas

sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal : 28 Januari 2013

Yang menyatakan,

(Ratu Feni Chairunnisa)

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .......................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... v

ABSTRAK ....................................................................................................... vi

ABSTRACT .................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR. ................................................................................... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..................... x

DAFTAR ISI ..................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv

BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ........................................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................ 2

1.4 Manfaat Penelitian .......................................................................... 2

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 3

2.1 Tinjauan Umum Lasianthus reticulatus ......................................... 3

2.2 Metode Isolasi Senyawa Bahan Alam ............................................. 4

2.2.1 Metoda Ekstraksi ................................................................... 4

2.2.2 Kromatografi ......................................................................... 5

2.3 Bioautografi .................................................................................. 10

2.4 Antibiotik ...................................................................................... 10

2.5 Bakteri Patogen ............................................................................. 12

2.6 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur .............................. 13

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN ...................................................... 14

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................... 14

3.2 Bahan Tumbuhan .......................................................................... 14

3.3 Alat dan Bahan ............................................................................. 14

3.4 Prosedur Kerja .............................................................................. 15

3.4.1 Maserasi Akar Ginseng Hitam ............................................ 15

3.4.2 Bioautografi Antibakteri ...................................................... 15

3.4.2.1 Sterilisasi Alat .......................................................... 15

3.4.2.2 Pembuatan Medium ................................................. 16

3.4.2.3 Pembiakkan Bakteri Uji ........................................... 16

3.4.2.4 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji ............................. 16

3.4.2.5 Pembuatan Media Bioautografi ............................... 16

3.4.2.6 Pembuatan Larutan Kloramfenikol ......................... 17

3.4.2.7 Penyiapan Plat Kromatografi ................................... 17

3.4.2.8 Uji Bioautografi Antibakteri .................................... 17

3.4.3 Isolasi ekstrak akar Lasianthus reticulatus .......................... 17

3.4.3.1 Kromatografi Lapis Tipis ........................................ 17

3.4.3.2 Kromatografi Kolom ............................................... 18

3.4.3.3 KLT Preparatif .......................................................... 18

xii

3.4.4 Analisis Struktur Kimia dengan NMR ................................ 19

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 20

4.1 Hasil Ekstraksi .............................................................................. 20

4.2 Hasil Uji Antibakteri Ekstrak Akar L. reticulatus .......................... 21

4.3 Hasil Fraksinasi Ekstrak Metanol Akar L. reticulatus ................... 24

4.4 Identifikasi Senyawa Murni .......................................................... 29

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 30

5.1 Kesimpulan ................................................................................... 30

5.2 Saran ............................................................................................. 30

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 31

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

4.1 Hasil Ekstraksi Akar Lasianthus reticulatus .......................................... 20

4.2 Hasil Kromatografi Kolom dengan Fase Diam Sephadex-LH20 ........... 24

4.3 Hasil Kromatografi Kolom Fraksi 5 ....................................................... 25

4.4 Hasil Kromatografi Kolom Fraksi 4 ....................................................... 26

4.5 Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif .............................................. 28

4.6 Hasil Spektroskopi 1H-NMR ................................................................... 29

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Kromatografi Kolom ....................................................................... 7

Gambar 2.2 Kromatografi Lapis Tipis ................................................................. 9

Gambar 2.3 Struktur Umum Kloramfenikol ...................................................... 11

Gambar 2.4 Penghambatan Sintesis Protein Bakteri Oleh Kloramfenikol ......... 12

Gambar 4.1 Profil KLT Ekstrak Akar Tumbuhan Lasianthus reticulatus ......... 21

Gambar 4.2 Hasil Uji Antibakteri Ekstrak Akar Tumbuhan L. reticulatus ....... 22

Gambar 4.3 Hasil KLT Preparatif ...................................................................... 27

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kerangka Kerja ......................................................................... 33

Lampiran 2. Ekstraksi Akar Lasianthus reticulatus ...................................... 34

Lampiran 3. Uji Bioautografi Antibakteri ..................................................... 35

Lampiran 4. Isolasi dan Identifikasi Struktur Kimia Akar L. reticulatus ..... 36

Lampiran 5. Hasil Fraksinasi KLT ekstrak metanol fase diam Sephadex ..... 38

Lampiran 6. Hasil Fraksinasi KLT Fraksi 5 dan Fraksi 4 ............................. 39

Lampiran 7. Hasil Fraksinasi KLT Preparatif ............................................... 40

Lampiran 8. Hasil Spektrum 1H-NMR ......................................................... 42

Lampiran 9. Alat-alat yang Digunakan Dalam Isolasi dan Uji Antibakteri ... 47

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang kurang lebih 75% dari keseluruhannya

merupakan hutan yang terkenal dengan keanekaragaman tumbuhannya, terutama

tumbuhan obat-obatan (Susiarti et al., 2005). Saat ini penduduk di Indonesia,

terutama di daerah pedesaan, masih menggunakan tumbuhan yang dipercaya

dapat menyembuhkan penyakit atau hanya sekedar untuk menjaga kesehatan

mereka sebagai pengganti obat sintesis. WHO pada tahun 2008 mencatat bahwa

68% penduduk dunia masih menggantungkan sistem pengobatan tradisional yang

mayoritas melibatkan tumbuhan untuk menyembuhkan penyakit dan lebih dari

80% penduduk dunia menggunakan obat herbal untuk mendukung kesehatan

mereka (Saifudin, 2011).

Tumbuhan obat adalah tumbuhan yang satu atau setiap organnya memiliki

zat yang dapat digunakan untuk tujuan terapeutik atau prekursor untuk sintesis

obat-obatan yang bermanfaat (Sofowora, 1982). Berbagai tanaman obat dan

ribuan tanaman berpotensi obat di Indonesia mengandung beraneka ragam jenis

senyawa kimia alami yang memiliki berbagai efek farmakologis dan bioaktivitas

(Saifudin, 2011).

Tumbuhan obat dapat ditemukan di seluruh wilayah di Indonesia. Tidak

hanya yang ditanam secara sengaja, namun tumbuhan obat juga dapat ditemukan

di hutan. Hutan Kalimantan Tengah merupakan salah satu hutan tropis di

Indonesia yang memiliki keanekaragaman tumbuhan yang memiliki senyawa

yang berpotensi sebagai obat. Banyak tumbuhan yang dimanfaatkan sebagai obat-

obatan oleh masyarakat sekitar, baik untuk menyembuhkan penyakit maupun

hanya untuk menjaga kesehatan mereka.

Lasianthus sp. termasuk ke dalam famili Rubiaceace. Menurut Jaime (2006) yang

diacu dari Choudhury M. D dan K. D. Choudhury, tumbuhan yang termasuk ke

dalam famili Rubiaceae yang tumbuh pada iklim tropis dan subtropis kebanyakan

digunakan sebagai obat-obatan tradisional. Lasianthus sp. merupakan tumbuhan

yang telah dimanfaatkan di beberapa wilayah di Indonesia sebagai

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

tumbuhan obat. Lasianthus reticulatus Blume., atau masyarakat sekitar

biasa menyebutnya dengan ginseng hitam, telah ditemukan di hutan Kalimantan

Tengah. Sampai saat ini belum ada laporan mengenai kandungan kimia maupun

aktifitas biologis dari tumbuhan ini.

Antibiotik merupakan suatu substansi yang dihasilkan oleh satu

mikroorganisme yang dalam jumlah yang sangat sedikit dapat menghambat

pertumbuhan jasad renik lain (Pelczar and Chan, 2007). Antibiotik yang

digunakan saat ini memiliki banyak efek samping, dan banyak antibiotik yang

resisten terhadap beberapa jenis bakteri (Warsa, 1993).

Berdasarkan uraian di atas maka dilakukan penelitian isolasi dan uji

aktivitas antibakteri dari komponen kimia ekstrak metanol akar tumbuhan

Lasianthus reticulatus yang diperoleh dari Kalimatan Tengah. Uji antibakteri

dilakukan terhadap bakteri Staphylococcus aureus dengan menggunakan metode

bioautografi, kemudian spot yang yang aktif sebagai antibakteri diisolasi dan

diidentifikasi struktur kimianya.

1.2 Rumusan Masalah

a. Apakah ekstrak metanol akar Lasianthus reticulatus memiliki aktivitas

antibakteri tehadap Staphylococcus aureus?

b. Bagaimanakah stuktur kimia dari senyawa aktif antibakteri yang tedapat

dalam ekstrak metanol akar Lasiantus reticulatus?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa aktif

antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dari ekstrak metanol akar Lasianthus

reticulatus.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah dapat memberikan informasi ilmiah

mengenai senyawa kimia tumbuhan Lasianthus reticulatus yang memiliki

aktivitas antibakteri yang dapat dijadikan sebagai landasan ilmiah penggunaan

tumbuhan ini sebagai obat tradisional.

3


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Lasianthus reticulatus

Lasianthus sp. termasuk ke dalam famili Rubiaceae dengan lebih dari

180 spesies, dan lebih dari 160 spesies ditemukan di hutan tropis Asia, 20

spesies di Afrika, 1 spesies di Australia, dan 3 spesies di Amerika tropis. Di

Asia, Lasianthus sp. tersebar di beberapa Negara yaitu Malaysia, Indonesia,

Brunei, Filipina, Papua Nugini, Singapura, dan Pulau Solomon (Zhu et al.,

2012). Di Indonesia, nama lain dari Lasianthus sp. adalah Lambuku. Bagian

tumbuhan yang biasa digunakan dalam pengobatan adalah akar dan daun

(DepKes, 1986). Di Tanjung Jabung Barat, Jambi, Lasianthus sp. dikenal

dengan nama daerah daun cucuk. Masyarakat sekitar memanfaatkannya

sebagai obat lemah syahwat dengan cara akar direbus dan diminum (Susiarti

et al., 2005). Beberapa spesies dari Lasianthus sp. telah diisolasi dan dianalisis

kandungan kimianya. Lasianthus fordii Hance. (Takeda et al., 2003), dan L.

acuminatissimus Merr. (Briggs et al., 2006) telah dilaporkan memiliki

kandungan senyawa glikosida, alkaloid, steroid, dan flavonoid. L. lucidus

Blume dilaporkan memiliki kandungan saponin, glikosida, flavonoid, minyak

dan lemak (Choudhurry M. D and K. D. Choudhurry, 2011).

Salah satu spesies dari Lasianthus sp. adalah Lasianthus reticulatus.

Tumbuhan ini tersebar di beberapa Negara yaitu Thailand, Malaysia

(Peninsular, Borneo), Singapura, Indonesia (Sumatra, Jawa, Kalimantan,

Sulawesi), Brunei, dan Filipina (Palawan) (Zhu et al, 2012). Di Kalimantan

Tengah tumbuhan ini dikenal dengan nama ginseng hitam. Tumbuhan

Lasianthus reticulatus dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Kelas : Equisetopsida

Sub Kelas : Magnolidae

Super Ordo : Asteranae

Ordo : Gentianales

Famili : Rubiaceae

4


Genus : Lasianthus Jack

Spesies : Lasianthus reticulatus Blume

(http://www.tropicos.org/Name/100213300)

2.2 Metoda Isolasi Senyawa Bahan Alam

2.2.1 Metoda Ekstraksi

Ekstraksi merupakan peroses penarikan senyawa-senyawa kimia dari

bahan alam seperti tanaman, maupun hewan dengan menggunakan pelarut

organik. Menurut Voigt (1994) yang diacu dari Saifudin (2011), ada

beberapa jenis ekstrak yaitu ekstrak cair, ekstrak kental dan ekstrak kering.

Ekstrak cair jika hasil ekstraksi masih bisa dituang dengan kadar air lebih

dari 30%. Ekstrak kental jika memiliki kadar air antara 5-30 %. Ekstrak

kering jika mengandung kadar air kurang dari 5%.

Proses persiapan ekstraksi yaitu dimulai dari penyiapan sampel yang

disortir dari pengotor, kemudian dicuci hingga bersih dan dikeringkan pada

suhu ruang. Setelah kering, sampel digiling hingga menjadi serbuk yang

kemudian dilanjutkan dengan proses ekstraksi (Tiwari et al., 2011).

Berdasarkan Departemen Kesehatan RI (2000), metode ekstraksi

dengan menggunakan pelarut dibagi menjadi dua, yaitu:

1. Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia dengan

menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau

pengadukan pada temperatur ruang.

b. Perkolasi

Merupakan ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada

temperatur ruang. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan,

tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya

(penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh

ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

2. Cara panas

http://www.tropicos.org/Name/100213300

5


a. Refluks

Adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif

konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan

pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga

dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.

b. Soxhlet

Adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi

kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya

pendingin balik.

c. Digesti

Adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu

secara umum dilakukan pada temperatur 40-50oC.

d. Infus

Adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur

terukur 96-98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit).

e. Dekok

Adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan

temperatur sampai titik didih air.

Pelarut yang biasanya digunakan dalam ekstraksi bahan alam berupa

pelarut organik atau air. Dalam prosesnya, pelarut berdifusi ke dalam sel,

kemudian metabolit sel tersebut terlarut ke dalam pelarut, hingga pada

akhirnya berdifusi keluar sel menjadi ekstrak yang kaya akan metabolit sel.

Setelah proses maserasi, ampas dan pelarut dipisah (disaring).

2.2.2 Kromatografi

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan di mana senyawa yang akan

dipisahkan didistribusikan antara dua fase, salah satunya adalah fase diam dan

yang lain adalah fase gerak yang bergerak dalam arah tertentu.

6


Kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung

beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: (1)

kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2)

kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus

(adsorpsi, penjerapan), dan (3) kecenderungan molekul untuk menguap atau

berubah ke keadaan uap (keatsirian). Pada sistem kromatografi, campuran

yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan demikian rupa sehingga

komponen-komponennya harus menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut

(Gritter et al., 1991)

Kromatografi analitik biasanya dipakai pada tahap permulaan untuk

semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika

diperlukan fraksi murni campuran (Gritter et al., 1991).

Metode kromatografi dibagi menjadi tiga, yaitu:

a. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah metode pemisahan campuran

senyawa yang didistribusikan oleh fase gerak melewati fase diam.

Kromatografi kolom biasanya menggunakan gelas kaca silinder (kolom)

yang diisi dengan alumina atau gel silica sebagai fase diam. Sebagai fase

geraknya, yaitu pelarut tunggal atau campuran dari beberapa pelarut

yang akan bergerak membawa campuran senyawa melewati kolom.

Pelarut yang keluar kemudian dikumpulkan dan dapat dilakukan

pemisahan senyawa dengan mendeteksinya menggunakan plat kaca yang

dilapisi dengan silika (Gritter et al., 1991).

Kromatografi kolom dimulai dari penyiapan kolom buret yang

tinggi dan diameternya disesuaikan dengan jumlah sampel yang akan

dipisahkan. Masukkan sedikit kapas ke dalam kolom buret, kemudian

letakkan kolom buret pada statis sehingga posisi kolom buret tegak

lurus. Fase diam yang telah dikembangkan sebelumnya (dengan pelarut

yang akan digunakan sebagai eluen) dimasukkan ke dalam kolom buret

perlahan-lahan dan keran buret dibuka sehingga eluen dapat keluar dan

ditampung. Sampel dimasukkan ke dalam kolom buret lalu dialirkan

7


eluen sambil keran buret dibuka dan ditampung dengan tabung reaksi

atau vial (Braithwaite and Smith, 1999).

Gambar 2.1 Kromatografi kolom (Braithwate and Smith, 1999)

Pelarut yang digunakan harus murni. Pada elusi gradien polaritas

pelarut ditingkatkan secara kontinu ke pelarut yang lebih polar

(Braithwaite and Smith, 1999).

Fase diam yang biasa digunakan dalam kromatografi kolom

yaitu:

1. Silika gel

Silika gel adalah fasa diam yang paling sering digunakan

pada pemisahan bahan alam dan bersifat polar. Silika gel biasanya

digunakan pada pemisahan senyawa bahan alam berdasarkan

tingkat kepolarannya. Saat sampel dimasukkan, molekul polar akan

terikat ke fase diam, kemudian akan digantikan oleh molekul polar

dari eluen dan akan melewati kolom untuk di re-adsorbsi.

Pergantian tempat senyawa molekul ini berdasarkan kepolarannya.

Semakin polar molekul maka akan teradsorbsi semakin kuat dan

elusi akan berjalan dengan lambat (Braithwaite and Smith, 1999).

2. Sephadex LH-20

Biasanya sephadex LH-20 digunakan untuk pemisahan

senyawa berdasarkan berat molekul senyawa seperti steroid,

8


terpenoid, lipid dan peptida dengan berat molekul rendah (hingga 35

residu asam amino). Sifat fisika kimia sephadex LH-20 yaitu: 1)

memiliki bentuk seperti butiran manik-manik, 2) Adanya ikatan

silang dextran sehingga menghasilkan jaring hydroxypropylat dan

menghasilkan media kromatografi dengan karakter hidrofilik dan

lipofilik. Karena karakter gandanya ini, Sephadex LH-20

mengembang di dalam air dan beberapa pelarut organik. Karena

sifatnya yang unik, sephadex LH-20 dapat digunakan selama

pemurnian awal dengan pertukaran ion kinerja tinggi atau

kromatografi fase terbalik.

Pemisahan senyawa molekul ditentukan berdasarkan ukuran

pori dari butiran Sephadex LH-20. Senyawa dengan berat molekul

rendah akan masuk ke dalam pori dan migrasinya berjalan lambat.

Sementara senyawa dengan berat molekul besar akan bergerak

melewati butiran Sephadex LH-20 sehingga migrasi akan berjalan

lebih cepat melewati kolom.

b. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan kromatografi yang

berdasarkan proses adsorpsi. Fase diam dapat menggunakan silica atau

alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau aluminium. Fase

gerak atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campur

organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik. (Djide,

2003)

Prinsip dari kromatografi lapis tipis adalah suatu analit

bergerak naik atau melintasi lapisan fase diam (paling umum

digunakan gel silika), dibawah pengaruh fase gerak (biasanya

campuran pelarut organik), yang bergerak melalui fase diam oleh kerja

kapiler. Jarak pemindahan oleh analit tersebut ditentukan oleh afinitas

relatifnya untuk fase diam dengan fase gerak. Keunggulan dari KLT

adalah fleksibel dalam mendeteksi hampir semua senyawa, bahkan

9


beberapa senyawa anorganik, yang dapat didukung oleh penggunaan

reagen penampak (Watson, 2010).

Gambar 2.2 Kromatografi Lapis Tipis

Pemilihan eluen sebaiknya dimulai dari pelarut organik yang

non polar seperti heksana dan peningkatan kepolaran dengan etil

asetat atau pelarut yang lebih polar lainnya (Harborne, 1987).

Perilaku senyawa tertentu di dalam sistem kromatografi

tertentu dinyatakan dengan harga Rf. Angka ini diperoleh dengan

membagi jarak yang ditempuh oleh bercak linarut dengan jarak yang

ditempuh oleh garis depan pelarut. Keduanya diukur dari titik awal,

dan harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1 (Gritter et al., 1991).

c. KLT Preparatif

KLT perparatif adalah cara yang ideal untuk pemisahan

cuplikan kecil (50 mg sampai 1g) dari senyawa yang kurang atsiri.

Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga

diperoleh senyawa murni untuk meneliti bahan alam yang lazimnya

berjumlah kecil dan campurannya rumit. Cuplikan yang akan

dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi plat lapisan

besar (lapisan tebal sampai 1mm) dan dikembangkan secara tegak

lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi

beberapa pita. Penjerap yang mengandung pita dikerok dari plat kaca

(Gritter et al., 1991).

10


2.3 Bioautografi

Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi

bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis (KLT) atau

kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antibiotik,

antifungi, dan antiviral. Bioautografi juga dapat digunakan untuk mendeteksi

senyawa antibiotik yang belum diketahui yang mana dengan pereaksi warna

spesifik digunakan sebagai pembanding bioautografi sehingga kedua metode

tersebut saling melengkapi (Stahl, 1969).

Pada metode bioautografi, hal-hal yang dilakukan yaitu: (1) persiapan

dan penerapan bahan alam pada plat kromatografi lapis tipis; (2) persiapan dan

penerapan inokulum bakteri pada plat KLT; (3) inkubasi; dan (4) deteksi

pertumbuhan dengan uji pewarnaan (INT) dan pengukuran daya hambat

pertumbuhan bakteri. Plat KLT yang telah ditotol dengan bahan ektrak

dicelupkan ke dalam suspensi bakteri selama 5 detik, kemudian diinkubasi

selama 15-24 jam pada temperature 37oC. Setelah diinkubasi, plat disemprot

dengan larutan p-iodonitrotetrazolium (INT) lalu diinkubasi lagi selama 30

menit-4jam. Zona hambat terlihat dengan daerah bening di antara latar

belakang ungu. Larutan p-iodonitrotetrazolium (INT) digunakan sebagai

indikator pertumbuhan bakteri. INT digunakan karena selain dari hasilnya

yang baik dan kontras karena memberikan warna ungu juga penyiapannya

yang mudah yaitu cukup dilarutkan dalam etanol 70% (Choma, 2006; Valgas

et al., 2006).

Bioautografi merupakan metode yang dapat digunakan untuk skrining

ekstrak kasar dengan kelebihan mudah dilakukan, cepat, hasil bagus, dan

dapat dilakukan dengan sekaligus pada banyak sampel (Harborne, 1991).

2.4 Antibiotik

Antibiotik merupakan suatu substansi yang dihasilkan oleh satu

mikroorganisme yang dalam jumlah yang sangat sedikit dapat menghambat

pertumbuhan jasad renik lain (Pelczar and Chan, 2007). Antibiotik memiliki

banyak efek samping. Dari sekian banyak antibiotik yang telah berhasil

ditemukan, hanya beberapa saja yang cukup tidak toksik untuk dipakai dalam

11


pengobatan. Antibiotik yang kini banyak dipergunakan kebanyakan diperoleh

dari genus Bacillus, Penicillum dan Streptomyces (Warsa, 1993).

Antibiotik jenisnya sangat beragam dan digolongkan menjadi beberapa

kelompok. Tiap kelompok memiliki mekanisme kerja yang berbeda.

Antibiotik mengganggu (interfere) bagian-bagian yang peka di dalam sel,

yaitu: 1) sintesis dinding sel; 2) fungsi membran; 3) sintesis protein; 4)

metabolisme asam nukleat; dan 4) metabolisme intermedier (Chatim, 1993).

Kloramfenikol adalah salah satu antibiotik yang memiliki mekanisme

kerja dengan mengganggu sintesis protein bakteri. Kloramfenikol bersifat

bakteriostatik, aktif terhadap sejumlah kuman posititf dan negatif Gram,

riketsia dan klamidia (Chatim, 1993). Kebanyakan bakteri gram positif

dihambat pada konsentrasi 1-10 µg/mL, dan banyak bakteri gram-negatif

dihambat pada konsentrasi 0,2-5µg/mL. Haemophilus influenzae, Neisseria

meningitidis, dan beberapa strain bakteri juga rentan terhadap kloramfenikol,

dan mungkin bersifat bakterisidal (Katzung, 2008).

Gambar 2.3 Struktur Umum Kloramfenikol (Brunton et al., 2008)

Kloramfenikol menghambat sintesis protein pada bakteri, terutama

pada sel eukariotik. Kloramfenikol berikatan secara reversible pada subunit

ribosom 50S (di dekat situs pengikatan untuk antibiotic makrolida dan

klindamisin). Obat ini mencegah terjadinya ikatan ujung tRNA aminoasil yang

mengadung asam amino pada tempat akseptor di subunit ribosom 50S.

Interaksi yang terjadi antara peptidil transferase dengan susbtrat asam amino

terhalangi, sehingga menghambat terjadinya ikatan peptida (Brunton et al.,

2008).

12


Gambar 2.4 Penghambatan sintesis protein bakteri oleh kloramfenikol. Kloramfenikol

berikatan dengan subunit ribosom 50S pada tempat peptidiltransferase dan menghambat reaksi

transpeptidasi. Kloramfenikol berikatan dengan subunit ribosom 50S di dekat tempat kerja

klindamisin dan makrolida (Brunton et al., 2008).

2.5 Bakteri patogen

Bakteri adalah sel prokariotik yang khas, uniselular dan tidak

mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Sel-

selnya berbentuk bola seperti batang atau spiral. Bakteri memiliki diameter 0,5

– 1,0 µm dengan panjang 1,5 – 2,5 µm. Beberapa bakteri dapat merugikan

manusia, yaitu dapat menyebabkan penyakit (patogen) dan dapat merusak

makanan. Namun bakteri juga dapat memiliki beberapa manfaat seperti dapat

menambah kesuburan tanah, membuat senyawa-senyawa penting dalam

industri, dan dapat membuat makanan. Bakteri tersebar luas di dalam dan pada

permukaan bumi, di atmosfer, dan di lingkungan sehari-hari (Pelczar and

Chan, 2007).

Staphylococcus aureus adalah bakteri yang paling sering menimbulkan

penyakit pada manusia. Setiap jaringan ataupun alat tubuh dapat diinfeksi dan

menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda-tanda yang khas, yaitu

peradangan, nekrosis dan pembentukkan abses. Kuman ini berbentuk sferis,

bila bergerombol dalam susunan yang tidak teratur mungkin sisinya agak rata

karena tertekan. Diameter kuman antara 0,8 – 1,0 mikron. Kuman ini tidak

bergerak, tidak berspora dan postif Gram. Kuman ini dapat tumbuh pada suhu

optimum 35oC, dengan batas suhu pertumbuhan 15

oC dan 40

oC. Pertumbuhan

terbaik adalah pada suasana aerob, dapat juga bersifat anaerob fakultatif dan

13


dapat tumbuh dalam udara yang hanya mengandung hidrogen dan pH

optimum untuk pertumbuhan ialah 7,4. Pada lempeng agar, koloninya

berbentuk bulat, diameter 1-2 mm, cembung, buram, mengkilat dan

konsistensinya lunak dengan warna khas kuning keemasan dan intensitasnya

warnanya bervariasi (Warsa, 1993)

Untuk pengobatan infeksi akibat kuman ini dengan kasus yang ringan

dapat diberikan penisilin G. Pada infeksi yang berat atau diduga resisten

terhadap penisilin dapat diberikan metisilin atau derivat penisilin lain yang

resisten terhadap penisilinase. Pada penderita yang alergi terhadap penisilin

dapat diberikan sefalosporin, eritromisin, linkomisin, atau klindamisin.

Apabila resisten terhadap metisilin, dapat diberikan vankomisin, rifampisin,

atau fusidic acid yang dikombinasi dengan antibiotika lainnya (Warsa, 1993).

2.6 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur

Identifikasi struktur senyawa dilakukan untuk mengetahui jenis

senyawa dan menentukan struktur molekul dari senyawa yang telah diisolasi.

Metode elusidasi struktur dapat dilakukan dengan metoda Nuclear Magnetic

Resonance (NMR).

Spektroskopi NMR atau biasa disebut resonansi magnetik inti

berhubungan dengan sifat magnet dari inti atom. Dengan menggunakan NMR

akan diperoleh gambaran perbedaan sifat magnet dan berbagai inti yang ada

serta menduga letak inti tersebut di dalam suatu molekul.

Spektroskopi proton NMR (1H-NMR) memberikan informasi

mengenai susunan hidrogen dalam molekul. Pada dasarnya, spektroskopi

proton NMR merupakan sarana untuk menentukan struktur senyawa organik

dengan mengukur momen magnet atom hidrogennya. Pada kebanyakan

senyawa, atom hydrogen terikat pada gugus yang berlainan (seperti –CH2, -

CH3, -CHO, -NH2, -CHOH-) dan spektrum NMR proton merupakan rekaman

sejumlah atom hidrogen yang berada dalam keadaan lingkungan yang

berlainan tersebut (Harborne, 1987).


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan April - November 2012 dan bertempat di

Laboratorium Biosain, Puslit Biologi, LIPI Cibinong, Bogor.

3.2 Bahan Tumbuhan

Sampel akar Lasianthus reticulatus Blume diambil dari tumbuhan

yang berlokasi di Kalimantan Tengah pada bulan Maret 2011. Sampel

diidentifikasi jenisnya di Herbarium Bogoriensis, Puslit Biologi-LIPI Bogor.

3.3 Alat dan Bahan

a. Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain rotary

evaporator (Heidolph), labu evaporator (Duran), erlenmeyer (Pyrex),

neraca analitik, refrigerator (Sanyo), lemari asam, Laminar Air Flow

(LAF), autoklaf (Hirayama), cawan petri (Pyrex), inkubator (WTC

Binder), jarum ose, spreader, tabung reaksi (Pyrex), rak tabung reaksi,

oven, pipet tetes, vial, inkubator, shaker incubator, pinset, corong, freeze

dry (Eyela), spatula, kaca arloji, pendeteksi fluoresensi UV (Camag),

kolom kromatografi tinggi kolom 111 cm dengan diameter 4,5 cm; dan

tinggi kolom 61 cm dengan diameter 2,5 cm, plat KLT silica gel 60 F254

(Merck)

b. Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain n-heksan, etil

asetat, metanol, aqua bidest, Nutrient Agar (Criterion Hardy Diagnostic),

Nutrient Broth (DIFCO), Brain Heart Infussion (Merck), Agar (Wako),

Aquadest steril, kloramfenikol (Sigma), etanol, DMSO, pereaksi warna

Serium (IV) sulfat, pereaksi warna Vanillin-HCl, pereaksi warna Dragendorf,

Sephadex LH-20 (Merck), silica gel 60 (0,063-0,200 mm) 70-

15


230 mesh (Merck), kapas, seasand (Merck), celite (Merck), aseton,

larutan p-iodonitrotetrazolium violet (INT) (Sigma).

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Maserasi Akar Lasianthus reticulatus

Sampel akar Lasianthus reticulatus yang diperoleh dari Kalimantan

Tengah diambil dalam keadaan segar kemudian dioven pada temperatur

50oC selama 24 jam, lalu digunting hingga diperoleh ukuran yang lebih

kecil. Akar kemudian digiling hingga diperoleh serbuk akar ginseng hitam.

Serbuk akar ginseng hitam diekstraksi dengan cara maserasi

bertingkat, dimana penggantian pelarut dilakukan secara berturut-turut

dengan menggunakan pelarut n–heksan, etil asetat, kemudian metanol.

Sampel direndam dengan pelarut n-heksan sebanyak 500 mL dengan

pergantian pelarut sebanyak 3 kali selama 24 jam. Kemudian residu dari n-

heksan direndam dengan pelarut etil asetat sebanyak 500 mL dengan

pergantian pelarut sebanyak 3 kali selama 24 jam. Terakhir residu dari etil

asetat direndam dengan pelarut metanol sebanyak 500 mL dengan

pergantian pelarut sebanyak 5 kali selama 48 jam. Kemudian masing-masing

filtrat disaring dengan kapas dan dipekatkan dengan rotary evaporator

hingga diperoleh ekstrak kental.

Perhitungan rendemen ekstrak:

Rendemen ekstrak =

x 100 %

3.4.2 Bioautografi Antibakteri

3.4.2.1 Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dilakukan sesuai dengan bahan dan jenis masing-

masing alat. Alat yang akan disterilkan harus dalam keadaan bersih dan

kering. Tabung reaksi, vial, erlenmeyer ditutup mulutnya dengan

alumunium voil, dan petri dish dibungkus dengan plastik tahan panas

hingga rapat kemudian disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121oC

selama 20 menit. Sementara pinset, jarum ose disterilkan dengan cara

dipijarkan pada nyala api Bunsen.

16


3.4.2.2 Pembuatan Medium

a. Nutrient Agar (NA)

Pada pembenihan bakteri S. aureus pada agar miring

menggunakan medium Nutrient Agar (NA). Sebanyak 1,15 g serbuk

NA dilarutkan dalam 50 ml aquadest, kemudian disterilkan dalam

autoklaf pada temperatur 121o C selama 20 menit.

b. Nutrient Broth (NB)

Sebanyak 0,4 g serbuk NB dilarutkan dalam 50 ml aquadest,

kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121o C selama

20 menit.

c. Brain Heart Infussion dan Agar 0,9% (w/v) (BHI+A)

Sebanyak 3,7 g serbuk BHI dicampur dengan 0,9 g Agar dan

dilarutkan dengan 100 ml aquadest steril, kemudian disterilkan dalam

autoklaf pada temperatur 121o C selama 20 menit.

3.4.2.3 Pembiakkan Bakteri Uji

Bakteri uji S. aureus LIPI-MC diinokulasikan ke media Nutrient

Agar (NA) miring dengan menggunakan ose yang disterilkan dengan cara

dipijarkan pada nyala api bunsen, lalu diinkubasi pada temperatur 37oC

selama 24 jam.

3.4.2.4 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji S. aureus LIPI-MC diinokulasi ke media Nutrient Broth

(NB) sebanyak 1 ose yang telah disterilkan dengan cara dipijarkan pada

nyala api Bunsen, lalu diinkubasi di dalam shaker incubator dengan

temperatur 37oC kecepatan 100 rpm selama 24 jam.

3.4.2.5 Pembuatan media bioautografi

Suspensi bakteri uji S. aureus dalam media NB diambil sebanyak

10 mL, kemudian dicampur ke dalam campuran media BHI dan Agar

0,09% (w/v) dalam petri dish dan diratakan dengan spreader.

17


3.4.2.6 Pembuatan larutan kloramfenikol

Larutan kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 8 µg/mL.

Kloramfenikol ditimbang sebanyak 0,2 mg kemudian dilarutkan ke dalam

25 mL DMSO 10%.

3.4.2.7 Penyiapan plat kromatografi

Plat disimpan didalam oven pada temperatur 60oC selama 1 jam.

Kemudian masing-masing ekstrak (n-heksan, etil asetat dan metanol)

dengan konsentrasi 10 mg/mL ditotol pada plat yang berbeda sebanyak

20µL dan dielusi dengan pelarut yang sesuai, yaitu untuk ekstrak n-heksan

menggunakan campuran pelarut n-heksan – etil asetat (4:1), untuk ekstrak

etil asetat dengan campuran pelarut etil asetat – n-heksan (4:1), dan untuk

ekstrak metanol dengan campuran pelarut diklorometan-metanol-air

(8:2:1). Kemudian ditotol dengan ekstrak yang tidak dielusi di samping

ekstrak yang telah di elusi sebelumnya. Pada plat yang berbeda, ditotolkan

kloramfenikol sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 8 µg/mL. Plat

disimpan di dalam desikator hingga siap untuk digunakan.

3.4.2.8 Uji bioautografi antibakteri (Choma, 2006; Valgas, et al, 2006)

Plat yang telah disiapkan sebelumnya dicelupkan selama 5 detik

ke dalam media BHI dan Agar yang telah dicampur dengan suspensi

bakteri uji, kemudian disimpan di dalam petri dish, lalu diinkubasi selama

16 jam pada temperatur 37oC. Kemudian plat disemprot dengan larutan p-

iodonitrotetrazolium violet (INT), lalu diinkubasi selama 1 jam pada

temperatur 37oC. Aktivitas inhibisi terlihat dengan terbentuknya zona

bening dengan latar belakang warna ungu pada plat.

3.4.3 Isolasi ekstrak akar Lasianthus reticulatus (Kromatografi)

3.4.3.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mencari kondisi

pemisahan yang baik. Ekstrak ditotol pada plat kromatogram kemudian

dielusi dengan pelarut yang sesuai, dimana senyawa pada plat

18


kromatogram dapat terpisah dengan baik. Ekstrak n-heksan dielusi dengan

pelarut n-heksan-etil asetat (4:1), ekstrak etil asetat dielusi dengan pelarut

etil asetat-n-heksan (4:1), dan ektrak metanol dielusi dengan campuran

pelarut diklorometan-metanol-air (8:2:1). Selanjutnya plat kromatografi

diamati di bawah sinar UV dan disemprot dengan pereaksi warna serium,

vanillin-HCl, atau dragendorf untuk memperjelas pola kromatogramnya.

Peraksi serium merupakan pereaksi warna untuk senyawa secara umum,

pereaksi warna vanillin-HCl merupakan pereaksi spesifik untuk senyawa

golongan flavonoid, dan pereaksi warna dragendorf spesifik untuk

senyawa golongan alkaloid.

3.4.3.2 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom yang digunakan yaitu kromatografi kolom

dengan fasa normal, dimana fasa diamnya Sephadex LH-20 yang

menggunakan kolom buret dengan tinggi 111 cm dan diameter 4,5 cm.

Fase gerak yang digunakan yaitu etanol 96% dengan laju alir 5 mL/menit,

ditampung ke dalam tabung reaksi sebanyak 30 mL yang menghasilkan 14

fraksi. Fraksi yang dihasilkan kemudian dilakukan kromatografi kolom

lebih lanjut dengan fase diam Silica gel 60 yang menggunakan kolom

buret dengan tinggi kolom 61 cm dan diameter 2,5 cm. Fase gerak yang

digunakan yaitu campuran dari pelarut n-heksan dan etil asetat dengan laju

alir 5 mL/menit dan ditampung ke dalam tabung reaksi sebanyak 30 mL.

Untuk fraksi 5 menggunakan fase gerak n-heksan-etil asetat (5:1) yang

menghasilkan 11 fraksi. Untuk fraksi 4 menggunakan fase gerak n-heksan-

etil asetat (3:1) yang menghasilkan 14 fraksi. Fraksi 4.5; 5.3; 5.4; 5.5; 5.6;

5.7; 5.8 dan 5.9 dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif.

3.4.3.3 KLT preparatif

Hasil fraksinasi dengan kolom kromatografi yaitu fraksi 4.5; 5.3;

5.4; 5.5; 5.6; 5.7; 5.8 dan 5.9 dilanjutkan KLT preparatif dengan

menggunakan plat KLT ukuran 20x10 cm dan n-heksan-etil asetat (2:1)

sebagai fasa geraknya.

19


3.4.4 Analisis struktur kimia dengan NMR

Identifikasi senyawa dilakukan dengan spektroskopi Proton NMR (1H-NMR)

JEOL 500 MHz.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil ekstraksi

Sebanyak 170,6 g sampel diekstrak dengan cara maserasi bertingkat

dengan tingkat polaritas pelarut yang berbeda. Pelarut yang digunakan yaitu n-

heksan (non-polar), etil asetat (semi-polar) dan metanol (polar). Hal ini

dilakukan karena belum diketahuinya kepolaran dari senyawa aktif antibakteri

tersebut, sehingga diharapkan dapat menarik senyawa dengan tingkat

kepolaran yang berbeda secara maksimal.

Tabel 4.1 Hasil ekstraksi akar Lasianthus retuculatus Blume

Nama ekstrak Berat

(gram)

Warna Bentuk Rendemen

(% b/b)

Ekstrak n-heksan 0.29 Cokelat Pasta, lengket 0,17

Ekstrak etil asetat 0,61 Hijau pekat Pasta, lengket 0,35

Ekstrak metanol 2,06 Cokelat

pekat

Pasta, lengket 1,20

Hasil ekstraksi menunjukkan bahwa pelarut metanol dapat menarik

senyawa lebih maksimal dari pada pelarut n-heksan dan etil asetat. Hal ini

menunjukkan bahwa senyawa polar terekstrak lebih banyak daripada senyawa

non-polar dan semi-polar.

Kemudian dari masing-masing ekstrak tersebut dianalisis menggunakan

kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mencari eluen terbaik yang digunakan untuk

uji bioautografi antibakteri dan kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan

untuk ekstrak n-heksan yaitu n-heksan-etil asetat (4:1), ekstrak etil asetat yaitu etil

asetat-heksan (4:1), dan ekstrak metanol yaitu diklorometan-metanol-air (8:2:1).

Pelarut ini digunakan karena menghasilkan pemisahan secara jelas antara

komponen yang satu dengan yang lainnya dari masing-masing ekstrak. Kemudian

plat KLT di semprot dengan pereaksi warna Serium (IV) sulfat, Vanillin-HCl dan

21


Dragendorf untuk memperjelas pola kromatogram dan identifikasi

golongan senyawa.

a. Ekstrak n-heksan

b. Ekstrak etil asetat

c. Ekstrak metanol

Gambar 4.1 Profil KLT ekstrak akar tumbuhan Lasianthus reticulatus yang disemprot dengan

penampak noda (dari kiri ke kanan) Serium (IV) sulfat, Vanilin-HCl, dan Dragendorf.

Penyemprotan dengan Serium (IV) sulfat merupakan pereaksi semprot

untuk senyawa secara umum memberikan warna kuning; hijau dan ungu untuk

ekstrak n-heksan, warna coklat; kuning; jingga; dan biru untuk ekstrak etil

asetat, warna coklat; kuning dan ungu untuk ekstrak metanol. Penyemprotan

dengan Dragendorf yang spesifik untuk senyawa golongan alkaloid

memberikan hasil yang negatif untuk masing-masing ekstrak, sedangkan

penyemprotan dengan pereaksi semprot Vanillin-HCl yang spesifik untuk

senyawa golongan flavonoid memberikan warna hijau; kuning; biru dan ungu

untuk ekstrak n-heksan, warna ungu; hijau; dan kuning untuk ekstrak etil

asetat, warna coklat; ungu; dan biru untuk ekstrak metanol.

4.2 Hasil uji antibakteri ekstrak akar Lasianthus reticulatus Blume

Skrining aktivitas antibakteri dari sampel dilakukan dengan

menggunakan metode bioautografi. Metode ini dilakukan dengan cara

mencelupkan plat kromatogram yang sebelumnya telah ditotol dengan

masing-masing ekstrak dan dielusi dengan eluen yang sesuai dengan masing-

masing ekstrak tersebut ke dalam media yang mengandung bakteri uji, di

mana bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus. Bakteri ini

22


digunakan dalam uji dikarenakan bahwa bakteri ini merupakan salah satu

penyebab infeksi pada manusia. Kemudian plat tersebut diinkubasi selama 16

jam, lalu plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet (INT)

dan diinkubasi kembali selama 1 jam. INT digunakan sebagai indikator

pertumbuhan bakteri, di mana terjadi reaksi enzimatik sehingga terbentuk

warna ungu yang menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. INT digunakan

sebagai indikator karena hasilnya yang lebih kontras daripada menggunakan

indikator yang lain. Selain itu persiapannya yang mudah yaitu dilarutkan ke

dalam etanol 70% atau aquadest steril.

Senyawa pada plat kromatogram yang memiliki aktivitas antibakteri

akan muncul sebagai daerah bening di antara latar belakang ungu. Hasil

bioautografi antibakteri menunjukkan adanya beberapa spot dengan daerah

bening pada plat kromatogram dari ketiga ekstrak tersebut. Hal ini

menunjukkan bahwa ketiga ekstrak tersebut memiliki aktivitas sebagai

antibakteri. Hasil dibandingkan dengan profil KLT masing-masing ekstrak

dan kontrol positif kloramfenikol dengan konsentrasi 0,8 µg/mL.

a. Ekstrak n-heksan

b. Ekstrak etil asetat

23


c. Ekstrak metanol

d. Kloramfenikol 8µg/mL

Gambar 4.2 Hasil uji antibakteri ekstrak tumbuhan akar Lasianthus reticulatus

Plat kromatogram ekstrak n-heksan menunjukkan daerah bening pada

beberapa tempat yang ditunjukkan dengan nilai Rf, yaitu mulai dari titik awal

penotolan hingga Rf 0,35 dan Rf 0,53, di mana daerah hambat terbesar pada

Rf 0,13 dan 0,35. Ekstrak n-heksan yang tidak dielusi tidak menunjukkan

daerah bening. Pada plat kromatogram ekstrak etil asetat menghasilkan daerah

daerah bening yang melebar hingga setengah plat. Hal ini dikarenakan

senyawa yang terkandung dalam ekstrak etil asetat memiliki aktivitas

antibakteri yang besar terhadap Staphylococcus aureus. Namun masih dapat

terlihat daerah bening yang terbentuk dengan baik yaitu pada Rf 0,55 hingga

Rf 0,89. Ekstrak etil asetat yang tidak dielusi menunjukkan daerah bening

namun terjadi pelebaran. Pada plat kromatogram ekstrak metanol

menghasilkan daerah bening hampir seluruh jalur elusi ekstrak, yaitu dimulai

dari titik penotolan ekstrak hingga Rf 0,88. Ekstrak metanol yang tidak dielusi

menunjukkan daerah bening dengan diameter 0.85 cm. Sementara

kloramfenikol dengan konsentrasi 8 µg/mL menunjukkan daerah bening

dengan diameter 0,55 cm.

Dari hasil bioautografi tersebut, ekstrak metanol memiliki senyawa

paling banyak aktif antibakteri kemudian dilanjutkan untuk diisolasi dengan

kromatografi kolom.

24


4.3 Hasil fraksinasi ekstrak metanol akar Lasianthus reticulatus Blume

Ekstrak metanol sebanyak 1,22 gram difraksinasi dengan kromatografi

kolom menggunakan Sephadex LH-20 sebagai fase diam dan etanol 96%

sebagai fase gerak. Sephadex LH-20 ini digunakan untuk memisahkan

senyawa berdasarkan ukuran molekulnya, di mana senyawa dengan berat

molekul besar akan bermigrasi lebih cepat dan senyawa dengan berat molekul

kecil migrasinya lebih lambat karena senyawa ini akan terperangkap di dalam

gel. Fase gerak dialirkan terus-menerus dan hasil kolom ditampung ke dalam

tabung reaksi. Kemudian bercak dan Rf yang sama digabungkan sehingga

diperoleh 14 fraksi. Hasil fraksinasi dielusi dengan pelarut diklorometan-

metanol-air (8:2:1) yaitu sesuai dengan pelarut yang digunakan pada uji

antibakteri. Hasil fraksinasi dari kromatografi kolom dapat dilihat pada tabel

4.2. Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis ekstrak metanol dapat dilihat pada

lampiran 5.

Tabel 4.2 Hasil kromatografi kolom ekstrak metanol dengan fase diam Sephadex

LH-20 dan fase gerak etanol.

No. Fraksi Bobot (mg) No. Fraksi Bobot (mg)

1. I 67,1 8. VIII 27,2

2. II 35,3 9. IX 20,5

3. III 68,2 10. X 140,3

4. IV 110,1 11. XI 48,4

5. V 223,6 12. XII 14,2

6. VI 379,4 13. XIII 30.9

7. VII 27,5 14. XIV 26.9

Dari hasil kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa senyawa belum

terpisah secara sempurna pada semua fraksi, yaitu adanya lebih dari satu senyawa

dalam satu fraksi dan jarak antar senyawa sangat rapat. Dari gambar hasil

kromatografi lapis tipis yang dibandingkan dengan hasil bioauotografi

menunjukkan bahwa senyawa yang aktif antibakteri paling banyak terdapat pada

fraksi 5 dan fraksi 4 dimana pada sinar UV 366 nm berpendar sangat terang

dengan Rf 0,86 dan 0,74. Hasil bioautografi ekstrak metanol menunjukkan bahwa

25


aktifitas antibakteri dimulai dari titik awal penotolan ekstrak hingga batas Rf 0,88.

Fraksi 5 dilakukan kromatografi kolom lebih lanjut yaitu dengan berat sampel

223,6 mg dan dicari kondisi elusi terbaik sehingga digunakan pelarut n-heksan-etil

asetat (5:1) sebagai fase gerak dan silica gel G60 sebagai fase diam. Silica gel

bersifat polar dan digunakan untuk pemisahan berdasarkan tingkat kepolaran

senyawa molekul. Hasil fraksinasi dari kromatografi kolom dapat dilihat pada

tabel 4.3. Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis ekstrak metanol dapat dilihat

pada lampiran 6.

Tabel 4.3 Hasil kromatografi kolom fraksi 5 ekstrak metanol dengan fase diam silica gel-

60 dan fase gerak n-heksan : etil asetat (5:1).


1. 5.1 13,1 7. 5.7 14,6

2. 5.2 7,1 8. 5.8 7,6

3. 5.3 8,6 9. 5.9 5,4

4. 5.4 15,1 10. 5.10 15,5

5. 5.5 13,9 11. 5.11 3,7

6. 5.6 19,4

Pada gel silika masih terdapat senyawa yang terikat dan tidak dapat turun

dengan pelarut yang digunakan sehingga dibilas dengan pelarut metanol dan

didapatkan bobot 195,5 mg. Dari hasil kromatografi lapis tipis menunjukkan

bahwa senyawa belum terpisah secara sempurna pada semua fraksi, yaitu adanya

lebih dari satu senyawa dalam satu fraksi. Komponen yang diduga aktif

antibakteri terdapat pada fraksi 5.3 hingga 5.9, namun pada fraksi-fraksi tersebut

belum ada komponen yang murni secara kromatografi lapis tipis.

Berdasarkan hasil kromatografi kolom dengan sephadex sebelumnya

menunjukkan fraksi 4 juga memiliki senyawa aktif antibakteri berdasarkan uji

bioautografi. Oleh karena ini dilakukan fraksinasi terhadap fraksi 4.

Fraksi 4 dengan berat sampel 110,1 mg dan dicari kondisi elusi terbaik

sehingga digunakan pelarut n-heksan-etil asetat (3:1) sebagai fase gerak dan silica

gel-60 sebagai fase diam. Dengan menggunakan sistem dua fasa ini diharapkan

26


senyawa molekul akan terpisah lebih baik berdasarkan tingkat kepolarannya.

Kemudian bercak dan Rf yang sama digabungkan sehingga diperoleh 19 fraksi.

Fraksi 4.5 s/d fraksi 4.10 digabung menjadi satu yaitu menjadi fraksi 4.5 karena

berdasarkan kromatografi lapis tipis menghasilkan noda dengan Rf yang sama,

sehingga keseluruhannya menjadi 14 fraksi. Hasil fraksinasi dari kromatografi

kolom dapat dilihat pada tabel 4.4. Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis

ekstrak metanol dapat dilihat pada lampiran 6. Hasil kromatografi lapis tipis

menunjukkan bahwa senyawa belum dapat terpisah secara sempurna, yaitu masih

ada lebih dari satu senyawa dalam satu fraksi dan jarak antar senyawa tersebut

masih terlalu rapat.

Tabel 4.4 Hasil kromatografi kolom fraksi 4 ekstrak metanol dengan fase diam silica gel-

60 dan fase gerak n-heksan : etil asetat (3:1).


1. 4.1 21,4 8. 4.8 24,7

2. 4.2 6.7 9. 4.9 1,9

3. 4.3 8,8 10. 4.10 7,2

4. 4.4 2,7 11. 4.11 2,2

5. 4.5 17 12. 4.12 2,9

6. 4.6 1,9 13. 4.13 7,7

7. 4.7 1,5 14. 4.14 1,3

Hasil fraksinasi dari fraksi 4 dan fraksi 5 menunjukkan belum adanya noda

yang terpisah secara sempurna atau murni secara kromatografi lapis tipis, di mana

masih adanya lebih dari satu noda dalam satu fraksi. Dilihat dari kromatografi

lapis tipis dan jumlah senyawa yang sedikit, maka dilakukan kromatografi lapis

tipis preparatif terhadap fraksi yang diduga memiliki aktivitas antibakteri, yaitu

fraksi 4.5; fraksi 5.3; 5.4; 5.5; 5.6; 5.7; 5.8; dan 5.9. Setiap fraksi ditotol pada plat

kromatografi yang berbeda yang berukuran 20x10 cm dan dielusi dengan pelarut

n-heksan -etil asetat (2:1). Berdasarkan pola kromatogram yang ditunjukkan

dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm, fraksi 4.5 memperlihatkan 10 noda yang

terpisah, fraksi 5.3; 5.4; dan 5.5 memperlihatkan 12 noda dimana beberapa noda

memperlihatkan Rf yang sama terhadap noda yang lain di antara ketiga fraksi

27


tersebut sehingga digabung menjadi satu, dan fraksi 5.6; 5.7; 5.8; dan 5.9

memperlihatkan 16 noda dimana di antara keempat fraksi tersebut

memperlihatkan beberapa noda yang memiliki Rf sama terhadap noda yang lain

sehingga digabung menjadi satu. Masing-masing noda pada masing-masing plat

dikerok dengan spatula kemudian dimasukkan ke dalam labu dan dilarutkan

dengan pelarut aseton. Setelah itu disaring dengan kertas whatman dan diperiksa

pola kromatogramnya. Hasil menunjukkan bahwa ada beberapa fraksi yang

menghasilkan noda tunggal, dan fraksi yang aktif sebagai antibakteri yaitu fraksi

4.5.10; gabungan dari fraksi 5.3.6; 5.4.6; 5.5.6; dan gabungan dari fraksi 5.6.4;

5.7.8; 5.8.6; 5.9.8. Fraksi-fraksi tersebut digabung menjadi satu, kemudian

diuapkan dengan rotary evaporator sehingga menghasilkan bobot 2,3 mg,

kemudian dianalisa dengan KLT menggunakan eluen n-heksan-etil asetat (2:1)

sehingga didapatkan noda tunggal pada R5 0,45.

Hasil ini dibandingkan dengan uji bioautografi antibakteri dengan

menggunakan ekstrak kasar metanol dengan eluen n-heksan-etil asetat (2:1), di

mana daerah jernih yang terbentuk mulai dari titik penotolan hingga Rf 0,55.

Sementara senyawa yang murni secara KLT dengan menggunakan eluen yang

sama memiliki Rf 0,45. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang telah diisolasi

aktif antibakteri.

(a)

(b)

(c)

Gambar 4.3 Hasil KLT Preparatif gabungan dari fraksi 4.5.10; 5.3.6; 5.4.6; 5.5.6; dan gabungan

dari fraksi 5.6.4; 5.7.8; 5.8.6; 5.9.8, dideteksi dengan (a) pereaksi warna Vanilin, (b) UV 366nm

dan dibandingkan dengan hasil bioautografi dengan eluen heksan-etil asetat (2:1) (c)

28


Sampel yang murni secara KLT kemudian dilakukan analisa proton NMR

untuk identifikasi struktur kimianya. Hasil fraksinasi dari kromatografi lapis tipis

dapat dilihat pada tabel 4.5. Hasil kromatografi lapis tipis dapat dilihat pada

lampiran 7.

Tabel 4.5 Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis preparatif 4.5; 5.3; 5.4; 5.5; 5.6; 5.7;

5.8; dan 5.9.

No Fraksi Bobot No Fraksi Bobot No Fraksi Bobot

1. 4.5.1 2.3 mg 1. 5.3.1; 5.4.1 1.4 mg 1. 5.6.1; 5.7.1 ;

5.8.1; 5.9.1

1.5 mg

2. 4.5.2 3.2 mg 2. 5.5.1 3.5 mg 2. 5.7.2; 5.8.2 ;

5.9.2; 5.9.3

1.4 mg

3. 4.5.3 2.3 mg 3. 5.3.2; 5.4.2;

5.5.2

2.4 mg 3. 5.7.3; 5.7.4 1.3 mg

4. 4.5.4 2.7 mg 4. 5.3.3; 5.4.2;

5.5.3

1.6 mg 4. 5.9.4 0.5 mg

5. 4.5.5 2.8 mg 5. 5.3.4; 5.4.4;

5.5.4

1.3 mg 5. 5.7.5; 5.8.3 ; 5.9.5 0.7 mg

6. 4.5.6 2.1 mg 6. 5.3.5; 5.4.5;

5.5.5

2.3 mg 6. 5.6.2; 5.7.6 ;

5.8.4; 5.9.6

1.1 mg

7. 4.5.7 0.7 mg 7. 5.3.6; 5.4.6;

5.5.6

2.0 mg 7. 5.6.3; 5.7.7 ;

5.8.5; 5.9.7

1.8 mg

8. 4.5.8 2.7 mg 8. 5.3.7 2.3 mg 8. 5.6.4; 5.7.8 ;

5.8.6; 5.9.8

1.3 mg

9. 4.5.9 4.3 mg 9. 5.4.7; 5.5.7 5.2 mg 9. 5.6.5; 5.6.6 ; 5.7.9 1.5 mg

10. 4.5.10 1 mg 10. 5.3.8; 5.4.8;

5.5.8

4.4 mg 10. 5.8.7; 5.9.9 0.8 mg

11. 5.3.9; 5.4.9;

5.5.9

2.3 mg 11. 5.6.7; 5.7.10 ;

5.8.8; 5.9.10

1.5 mg

12. 5.3.10;

5.4.10;

5.5.10

1.4 mg 12. 5.6.8; 5.7.11 ;

5.8.9; 5.9.11

0.7 mg

13. 5.6.9; 5.6.10 ;

5.7.12; 5.8.10;

5.9.12

2.1 mg

14. 5.7.13; 5.8.11;

5.9.13

0.3 mg

29


4.4 Identifikasi senyawa murni

Senyawa yang murni secara kromatografi lapis tipis diidentifikasi struktur

molekul senyawanya dengan Spektroskopi Proton Nuclear Magnetic Resonance

(1H-NMR). Spektroskopi ini digunakan untuk mengetahui jumlah proton dalam

senyawa molekul.

Hasil spektrum proton NMR menunjukkan bahwa tidak adanya senyawa

golongan aromatik, karena geseran kimia dari spektrum hanya sampai pada 5,35

ppm.

Jika dilihat pada hasil spektrum proton NMR (lampiran 8) menunjukkan

geseran kimia pada 0,86; 0,87; 0,877 ppm memiliki jumlah atom hidrogen

sebanyak 3 (metil), pada 1,23; 1,28; 1,36 ppm memiliki jumlah atom hidrogen

sebanyak 2 (metilen), dan pada geseran kimia 5,35 ppm memiliki jumlah atom

hidrogen sebanyak 1 buah atom hidrogen (metin). Jika tinggi puncak metin

dibandingkan dengan tinggi puncak metil dan metilen, tinggi puncak metilen lebih

tinggi diibandingkan dengan tinggi puncak metil dan metin. Hal ini menunjukkan

jumlah metilen lebih banyak diikuti dengan jumlah metil dan metin.

Tabel 4.6 Hasil spektroskopi 1H-NMR

Geseran kimia (ppm) Prediksi

0,86 metil

0,87 metil

0,877 metil

1,23 metilen

1,28 metilen

1,36 metilen

5,35 metin

Berdasarkan data di atas, diduga senyawa tersebut termasuk golongan

senyawa hidrokarbon alifatik.


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari penelitian yang telah dilakukan dan diuraikan terhadap akar

tumbuhan Lasianthus reticulatus Blume ini dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut:

a. Ekstrak metanol akar tumbuhan Lasianthus reticulatus memiliki aktivitas

antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.

b. Senyawa hasil isolasi merupakan senyawa golongan hidrokarbon alifatik

yang aktif antibakteri.

5.2 Saran

a. Analisis lebih lanjut untuk penentuan struktur molekul senyawa.

Dibutuhkan jumlah sampel yang lebih banyak untuk ekstraksi.

31


DAFTAR PUSTAKA

Braithwaite, A., and F. J. Smith. 1999. Chromatographic Methods. Netherlands

Brunton L., Keith P., Donald B., and Iain B . 2008. Goodman & Gilman’s Manual

of Pharmacology and Therapeutics. Editor. New York: McGraw Hill

Chatim A. dan Suharto. 1993. Sterilisasi dan Disinfeksi dalam Buku Ajar

Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Binarupa Aksara, Jakarta.

Choma I. M. 2006. Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography of

Flumequine Residues in Milk. Journal of Liquid Chromatography &

Related Technologies Vol 29, p 2083-2093.

Choudhurry M. D., and K. D. Choudhurry. 2011. TLC Profiling of Lasianthus

lucidus Blume. (Rubiaceae). Assam University Journal of Science &

Technology : Biological and Enviromental Science Vol 7 Number I,

pg 114-117. India

Departemen Kesehatan RI. 1986. Senarai Tumbuhan Obat Indonesia. Jakarta

Djide M. N. 2003. Mikrobiologi Farmasi. UNHAS, Makassar

Gritter R. J., et al. 1991. Pengantar Kromatografi Ed 2. ITB, Bandung

Harborne J. B. 1987. Metode Fitokimia Edisi 2. ITB, Bandung.

Pelczar M. J., and E. C. S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press,

Jakarta

Saifudin A., Viesa R., dan Hilwan Y. T. 2011. Standardisasi Bahan Obat Alam.

Graha Ilmu, Yogyakarta.

Silverstein R. M., and Francis X. W. 1998. Spectrometric Identification of

Organic Compounds Sixth Edition. John Wiley & Sons, Inc: USA

Sofowora A. 1982. Medicinal Plants and Traditional Medicine in Africa. John

Wiley & Sons Limited: New York

Stahl E. 1969. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. ITB, Bandung

Susiarti S., F. M. Setyowati, dan J. J. Afriastini. 2005. Studi Etnomedisinal

Masyarakat Melayu di Kabupaten Tanjung Jabung Barat, Jambi.

Journal of Tropical Ethnobiology Vol 11 No. 1, pg 111-124

Takeda et al. 2003. Lasianthionosides A-C, megastigmane glucosides from leaves

of Lasianthus fordii. Phytochemistry 65, pg 485-489. Japan

32


Tasdemir D., Ali A. D., Ihsan C., and Peter R. 2004. Evaluation of Biological

Activity of Turkish Plants. Rapid Screening for the Antimicrobial,

Antioxidant, and Acetylcholinesterase Inhibitory Potential by TLC

Bioautographic Methods. Pharmaceutical Biology Vol 42, pg 374-383.

Switzerland

Tiwari P., et al. 2011. Phytochemical Screening and Extraction: A Review.

Internationale Pharmaceutica Scienca Vol 1, pg 98-106. Punjab.

Valgas C., Simone M. D. S., Elza F. A. S., and Arthur S. J. 2007. Screening

Methods to Determine Antibacterial Activity of Natural Products.

Brazilian Journal of Microbiology Vol 38, pg 369-380. Brazil

Warsa U. C. 1993. Kokus Positif Gram dalam Buku Ajar Mikrobiologi

Kedokteran Edisi Revisi. Binarupa Aksara, Jakarta.

Watson D. G. 2010. Analisis farmasi Edisi 2. EGC, Jakarta

Wagman G. H., and Weinstein M. J. 1973. Chromatography of Antibiotics.

Journal of Chromatography. Elsefier: New York

Zhu H., M. C. Roos, and C. E. Ridsdale. 2012. A Taxonomic Revision of The

Malesian Species Of Lasianthus (Rubiaceae). Blumea 57, pg 1-102.

National Herbarium: Nederland

Zweig G., J. R. Whitaker, and Richard J. B. 1971. Paper Chromatography and

Electrophoresis Vol 2,. Academic Press, New York and London

http://www.tropicos.org/Name/100213300. Diakses pada tanggal 28 April 2012,

pukul 14:07

http://www.tropicos.org/Name/100213300

33


Lampiran 1. Kerangka Kerja

Uji bioautografi antibakteri

Ekstrak Akar

EtOAce

Ekstrak Akar

MeOH

Residu

Analisa struktur dengan NMR

Kromatografi kolom (isolasi ekstrak)

Purifikasi

F1 F2 F3 F4 F5 Fn

Sampel akar ginseng hitam

Maserasi dengan pelarut n-heksan 3x

Ekstrak Akar

Heksan

Maserasi dengan EtOAce 3x 24 jam

Maserasi dengan MeOH 5x

48 jam

Residu

Residu

Filtrat

Filtrat

Filtrat

34


Lampiran 2. Ekstraksi Akar Lasianthus reticulatus

Akar ginseng hitam

disortir dari pengotor

Digiling hingga

diperoleh serbuk

Maserasi dengan pelarut n-

heksan. (penggantian

pelarut dilakukan sebanyak

3 kali dalam waktu 24 jam,

atau hingga larutan bening)

Residu dimaserasi dengan

pelarut etil asetat.

(penggantian pelarut

dilakukan sebanyak 3

kali.dalam waktu 24 jam,

atau hingga larutan

bening)

Residu dimaserasi dengan

pelarut metanol.

(Penggantian pelarut

dilakukan sebanyak 5 kali

dalam waktu 48 jam, atau

hingga larutan bening)

Masing-masing filtrat

dipekatkan dengan

rotary evaporator

hingga diperoleh

ekstrak kental

Masing-masing

ekstrak di KLT.

Ekstrak n-heksan

dengan eluen n-

heksan - etil asetat

(4:1), ekstrak etil

asetat dengan eluen

etil asetat – n-heksan

(4:1), dan ekstrak

metanol dengan

eluen diklorometan-

metanol-air (8:2:1)

Uji Bioautografi

Antibakteri

35


Lampiran 3. Uji Bioautografi Antibakteri

Peremajaan

bakteri uji

dengan media

NA

Pembuatan suspensi

bakteri uji dengan

media NB

Pembuatan media

bioautografi dengan BHI

+ Agar 0,09% (w/v) +

suspensi bakteri uji

Masing-masing ekstrak (n-heksan,

etil asetat, metanol) ditotol pada plat

KLT yang berbeda dan di elusi

(ekstrak n-heksan dielusi dengan n-

heksan – etil asetat (4:1), ekstrak etil

asetat dengan etil asetat – n-heksan

(4:1), ektrak metanol dengan

diklorometan-metanol-air (8:2:1)).

Kloramfenikol ditotol pada plat

KLT yang berbeda.

Inkubasi pada

temperatur 37oC

selama 16 jam

Plat disemprot dengan INT,

kemudian diinkubasi

kembali selama 1 jam pada

temperatur 37oC

Pengamatan

Plat dicelupkan ke

dalam media

36


Lampiran 4. Isolasi dan Identifikasi Struktur Komponen Kimia Akar

Lasianthus reticulatus

Ekstrak metanol

akar Ginseng

hitam

Kromatografi kolom dengan fase diam

Sephadex LH-20, dan fase gerak etanol 96%

Purifikasi

NMR

F3 F1 F5 F7 F9 F11

F13

F2 F4 F6 F8 F10 F12 F14

Kromatograi kolom dengan fase diam silika

gel dan fase gerak n-heksan - etil asetat

37


(lanjutan)

F5

Kromatografi kolom dengan fase diam silika

gel 60, fase gerak n-heksan - etil asetat (5:1)

F5.1

F5.2

F5.3

F5.4

F5.5

F5.6

F5.7

F5.8

F5.9

F5.10

F5.11

KLT preparatif

F4.1

F4.2

F4.3

F4.4

F4.5

F4.6

F4.7

F4.8

F4.9

F4.10

F4.11

KLT preparatif

F4.14 F4.12

F4.13

F4

Kromatografi kolom dengan fase diam silika

gel 60, fase gerak n-heksan:etil asetat (3:1)

38


Lampiran 5. Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis ekstrak metanol

dengan fase diam sephadex LH-20 dan fase gerak etanol.

a. UV 366 nm

b. UV 254 nm

c. Pereaksi Serium (IV) sulfat

d. Pereaksi Vanillin-HCl

e. Pereaksi Dragendorf

39


Lampiran 6. Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis fraksi 5 dan fraksi 4

ekstrak metanol.

a. Fraksi 5

Sinar UV 366 nm

Fase gerak :

n-heksan : etil asetat (5:1)

Setelah disemprot dengann pereaksi

warna serium

b. Fraksi 4

Sinar UV 366 nm

Fase gerak:

n-heksan : etil asetat (3 : 1)

Setelah disemprot dengan pereaksi

warna Serium (IV) sulfat.

40


Lampiran 7. Hasil fraksinasi kromatografi lapis tipis preparatif fraksi 4.5;

5.3; 5.4; 5.5; 5.6; 5.7; 5.8; dan 5.9.

a. Fraksi 4.5 dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (2 : 1)

Sinar UV 366 nm

Sinar UV 254 nm


warna serium

b. Fraksi 5.3; 5.4; 5.5, dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (2 : 1)

Sinar UV 366 nm Sinar UV 254 nm

41


(lanjutan)


warna serium.

c. Fraksi 5.6; 5.7; 5.8; 5.9, dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (2 : 1)

Sinar UV 366 nm Sinar UV 254 nm


warna serium.

42


Lampiran 8. Hasil spektrum 1H-NMR

43


(lanjutan)

Hasil spektrum 1H-NMR dengan perbesaran 0,86 – 5,35 ppm.

44


(lanjutan)


45


(lanjutan)


46


(lanjutan)


47


Lampiran 9. Alat-alat yang digunakan dalam isolasi dan uji aktifitas

antibakteri

Gambar Keterangan Gambar Keterangan

Rotary

evaporator

(Heidolph)

Freeze dry

(Eyela)

Inkubator

(WTC Binder)

Laminar Air

Flow (LAF)

Kromatografi

kolom

d=4,5 cm ;t=

111cm

fase diam =

Sephadex LH-

20;

d= 2,5 cm;

t=61cm

fase diam silica

gel 70-230

mesh (0,063-

0,200 mm)

ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI EKSTRAK · PDF file4.3 Hasil Fraksinasi Ekstrak Metanol Akar...

Documents

Transcript of ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIBAKTERI EKSTRAK · PDF file4.3 Hasil Fraksinasi Ekstrak Metanol Akar...