ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI DESULFURISASI DARI TANAH...

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI DESULFURISASI

DARI TANAH PERTAMBANGAN BATUBARA ASAL

SUMATERA SELATAN DENGAN PENGAYAAN

DIBENZOTHIOPHENE DAN BATUBARA

NASTI SUSANTI

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2011 M/1432 H

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI DESULFURISASI

DARI TANAH PERTAMBANGAN BATUBARA ASAL

SUMATERA SELATAN DENGAN PENGAYAAN

DIBENZOTHIOPHENE DAN BATUBARA

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

NASTI SUSANTI 107095003427

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2011 M/1432 H

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI DESULFURISASI DARI TANAH PERTAMBANGAN BATUBARA ASAL

SUMATERA SELATAN DENGAN PENGAYAAN DIBENZOTHIOPHENE DAN BATUBARA

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

NASTI SUSANTI 107095003427

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Megga Ratnasari Pikoli, M. Si Irawan Sugoro, M. Si NIP. 19720322 200212 2002 NIP. 19761018 200012 1001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Biologi

DR. Lily Surayya Eka Putri, M. Env. Stud. NIP. 19690404 200501 2005

PENGESAHAN UJIAN

Skripsi berjudul “Isolasi dan Seleksi Bakteri Desulfurisasi dari Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan dengan Pengayaan Dibenzothiophene dan Batubara” yang ditulis oleh Nasti Susanti, NIM 107095003427 telah diuji dan dinyatakan LULUS dalam sidang Munaqasyah Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta pada tanggal 6 September 2011. Skripsi ini telah diterima sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu (S1) Program Studi Biologi.

Menyetujui,

Penguji 1, Penguji 2,

DR. Lily Surayya Eka Putri, M. Env. Stud. Dini Fardila, M. Si. NIP. 19690404 200501 2005 NIP. 19800330 200901 2009

Pembimbing 1, Pembimbing 2,

Megga Ratnasari Pikoli, M. Si Irawan Sugoro, M. Si NIP. 19720322 200212 2002 NIP. 19761018 200012 1001

Mengetahui,

Dekan Ketua

Fakultas Sains dan Teknologi Program Studi Biologi

Dr. Syopiansyah Jaya Putra, M. Sis Dr. Lily Surayya Eka Putri, M. Env. Stud. NIP. 19680117 200112 1001 NIP. 19690404 200501 2005

PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN KEASLIAN SKRIPSI INI BENAR-BENAR HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, September 2011

Nasti Susanti NIM. 107095003427

NASTI SUSANTI

Isolasi dan Seleksi Bakteri Desulfurisasi dari Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan dengan Pengayaan Dibenzothiophene dan Batubara

JAKARTA 2011 M / 1432 H

ABSTRAK

NASTI SUSANTI. Isolasi dan Seleksi Bakteri Desulfurisasi dari Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan dengan Pengayaan Dibenzothiophene dan Batubara. Skripsi. Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 2011. Pembakaran batubara menghasilkan emisi sulfur yang menyebabkan pencemaran lingkungan seperti hujan asam. Batubara mengandung senyawa sulfur organik heterosiklik salah satunya adalah dibenzothiophene (DBT) yang sulit untuk dihilangkan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat bakteri yang mampu melakukan desulfurisasi batubara dengan pengayaan DBT dan batubara. Tahapan penelitian terdiri dari isolasi dan seleksi berdasarkan pola pertumbuhan dan kemampuan desulfurisasi DBT. Hasil isolasi bakteri desulfurisasi (IBD) diperoleh sebanyak 22 isolat bakteri. Isolat-isolat bakteri tersebut memiliki kemampuan desulfurisasi DBT yang berbeda-beda. Isolat bakteri yang terseleksi adalah isolat 15N, 26N dan 34N berdasarkan pertumbuhan pada medium MSM-DBT agar. Seleksi lebih lanjut pada medium MSM-DBT cair diketahui bahwa isolat 15N memiliki kemampuan desulfurisasi DBT tertinggi dengan nilai absorbansi sulfat rata-rata 0,559. Hasil pengukuran desulfurisasi DBT pada isolat 15N selama fase eksponensial sebesar 0,000032 mM atau sebesar 3% dari jumlah DBT awal. Kata kunci : Bakteri, batubara, desulfurisasi, dibenzothiophene dan isolasi

ABSTRACT

NASTI SUSANTI. Isolation and Selection Bacterial Desulphurization of Soil Coal Mining in South Sumatra with the Enrichment Dibenzothiophene and Coal. Undergraduated Thesis. Biology Departement. Faculty of Science and Technology. Syarif Hidayatullah State Islamic University Jakarta. 2011.

Coal burning produces sulfur emission that causes environmental pollution such as acid rain. Coal contains heterocyclic organic sulfur compounds such as dibenzothiophene (DBT), which are difficult to remove. Purpose of this research was to get bacterial isolates which are capable of doing desulfurization DBT with the enrichment DBT and coal. Stages of research were isolation and selection based on growth patterns and DBT desulfurization ability. The results showed that 22 of the isolates could desulfurize DBT and coal containing media. All of the isolates had different ability of DBT desulfurization. The selected bacteria were 15N, 26N and 34N based on the growth in MSM-DBT solid medium. Further selection in MSM-DBT liquid medium showed isolate of 15N had the highest ability to DBT desulfurization with sulfate absorbance value of 0,559 on average. The DBT desulfurization by isolate 15 N during the exponential phase was 0,000032 mM which was equivalent to 3%. Key word : Bacteria, coal, desulphurization, dibenzothiophene and isolation

i

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT Yang Maha Kuasa, atas segala

rahmat, hidayah, inayah dan karuniaNya yang tak terhingga sehingga skripsi ini

dapat Penulis selesaikan. Shalawat serta salam semoga senantiasa tercurah kepada

Nabi Muhammad SAW yang memperjuangkan kesempurnaan agama ini hingga

akhir hayat.

Skripsi dengan judul “Isolasi dan Seleksi Bakteri Desulfurisasi dari

Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan dengan Pengayaan

Dibenzothiophene dan Batubara” disusun sebagai salah satu syarat dalam

menyelesaikan program studi S1 pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidaytullah Jakarta.

Pada kesempatan ini Penulis ingin menyampaikan terima kasih yang tidak

terhingga kepada pihak-pihak yang telah membantu baik secara langsung maupun

tidak langsung dalam penyusunan skripsi, yaitu :

1. Dr. Syopiansyah Jaya Putra, M. Sis., selaku Dekan Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Dr. Lily Surayya Eka Putri, M. Env. Stud., selaku Ketua Program Studi

Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Dini Fardila, M.Si., selaku Sekretaris Program Studi Biologi Fakultas

Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

ii

4. Megga Ratnasari Pikoli, M. Si., selaku pembimbing I dan Irawan Sugoro,

M. Si., selaku pembimbing II yang senantiasa memberikan ilmu

bermanfaat, nasehat serta pengalaman yang berarti, semoga semuanya

menjadi bekal Penulis di masa depan kelak.

5. Ibunda dan Ayahanda tercinta serta adikku tersayang, terima kasih atas

kasih sayang yang luar biasa, motivasi dan doa yang tidak pernah putus

untuk Penulis.

6. Nani Radiastuti, M. Si., Reno Fitri, M. Si dan Rina Hidayati Pratiwi. M.

Si., selaku penguji pada seminar proposal dan seminar hasil, serta Dr. Lily

Surayya Eka Putri, M. Env. Stud dan Dini Fardila, M. Si., selaku penguji

dalam sidang munaqasyah, terima kasih atas semua saran yang telah

diberikan demi kesempurnaan penyusunan skripsi ini.

7. Seluruh Dosen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, terima kasih atas ilmu dan nasehat

yang selama ini telah diberikan kepada Penulis.

8. Sayyid Haedar Amuli, seseorang yang telah memberikan motivasi, kasih

sayang, doa, bantuan serta mengajarkan penulis untuk memahami banyak

hal dalam kehidupan ini, terima kasih karena telah memberikan banyak

warna baru dalam kehidupan Penulis.

9. Nur Amaliah Solihat, saudari seperjuangan selama penelitian, terima kasih

atas semangat yang senantiasa diberikan.

10. Mba Puji, Mba Ida dan Kak Bahri, terima kasih atas semua bantuannya

selama penelitian di laboratorium.

iii

11. Teman-teman Biologi angkatan 2007 yang tidak bisa disebutkan satu

persatu, terima kasih telah memberikan dukungan kepada penulis dan tetap

semangat untuk terus melanjutkan perjuangan ini.

12. Saudara-saudaraku di IRMA Jami Nurul Mutaqien Esti, Eli, Ika, Teh Siti,

Deni, A’Adi, Bayu dan lain-lain, terima kasih atas semangat dan bantuan

yang senantiasa diberikan kepada penulis.

Penulis hanya bisa berdoa semoga semua amal baik dan bantuannya

mendapat balasan yang sesuai dari Allah SWT.

Tidak ada manusia yang luput dari kesalahan dan kekhilafan, demikian

pula dengan penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat

membangun sangat diharapkan demi penyempurnaan skripsi ini.

Jakarta, September 2011

Nasti Susanti

iv

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR …………………………………………………. i

DAFTAR ISI ………………………………………………………….... iv

DAFTAR TABEL …………………………………………....………... vii

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………... viii

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………... ix

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang ……………………………………………..…... 1

1.2. Perumusan Masalah ……………...………………………..…… 5

1.3. Hipotesis ……………………...…………………...………..….. 5

1.4. Tujuan …………………………………………………..……… 5

1.5. Manfaat ……………………………………………………….... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Sulfur dalam Batubara ……………….………………………… 6

2.2. Biodesulfurisasi Sulfur Organik ….……………………………. 8

2.3. Dibenzhothiophene (DBT) …………………………………….. 10

2.4. Jalur Metabolisme Biodesulfurisasi Sulfur Organik …………… 11

2.5. Bakteri dalam Biodesulfurisasi Sulfur Organik .……………….. 12

2.6. Isolasi dan Seleksi Bakteri ……………………………………... 14

2.7. Kerangka Berpikir ……………………………………..……….. 16

v

BAB III METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................... 17

3.2. Alat dan Bahan ............................................................................. 17

3.2.1. Alat .................................................................................... 17

3.2.2. Bahan ................................................................................. 17

3.3. Cara Kerja .................................................................................... 18

3.3.1. Persiapan Sampel ............................................................... 19

3.3.2. Pembuatan Medium ............................................................ 19

3.3.2.1. Medium Minimal Salts Medium (MSM)-DBT … 19

3.3.2.2. Medium Trypticase Soy Agar (TSA) ………….. 20

3.3.3. Pengayaan Sampel Tanah .................................................. 20

3.3.4. Isolasi Bakteri Total (IBT) ……. …..…………………… 20

3.3.5. Isolasi Bakteri Desulfurisasi (IBD) ………………..……. 21

3.3.5.1. Isolasi Bakteri Desulfurisasi Langsung (IBDL)... 21

3.3.5.2. Isolasi Bakteri Desulfurisasi Tidak Langsung/

Diperkaya (IBDTL) .............................................

21

3.3.6. Pemurnian Isolat ................................................................ 22

3.3.7. Seleksi Isolat Bakteri ......................................................... 22

3.3.7.1. Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium

MSM-DBT Agar .................................................

22

3.3.7.2. Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium

MSM-DBT Cair ................................................

23

vi

3.3.8. Analisa Hasil Desulfurisasi DBT dari Bakteri Terseleksi

dengan Menggunakan UV-Vis Spectrophotometer .........

24

3.3.9. Analisis Data ..................................................................... 24

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Isolasi Bakteri ………………………………….………… 25

4.1.1. Hasil Isolasi Bakteri Total (IBT) ....................................... 29

4.1.2. Hasil Isolasi Bakteri Desulfurisasi (IBD) .......................... 30

4.2. Hasil Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT

Agar .............................................................................................

34

4.2. Hasil Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT

Cair .............................................................................................

36

4.2.1. Pertumbuhan Bakteri ........................................................ 36

4.2.2. pH medium ....................................................................... 38

4.2.3. Desulfurisasi DBT ............................................................ 40

4.3. Hasil Pengukuran DBT ................................................................ 42

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan ................................................................................. 44

5.2. Saran ............................................................................................ 44

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 45

LAMPIRAN ............................................................................................. 50

vii

DAFTAR TABEL

Hal Tabel 1. Jenis Serta Persentase Senyawa Sulfur di dalam Batubara ........ 8 Tabel 2. Karakteristik Isolat Bakteri ....................................................... 26 Tabel 3. Hasil Uji Seleksi Isolat Bakteri Desulfurisasi pada Medium

MSM-DBT Agar ……………………………………………… 35

viii

DAFTAR GAMBAR

Hal Gambar 1. Model Struktural Batubara Keras ……………………. 6 Gambar 2. Jenis-Jenis Sulfur Organik yang Diidentifikasi dalam

Batubara ………………………………………………

7

Gambar 3. Struktur Kimia DBT ……………...………………….. 10 Gambar 4. Biodesulfurisasi dengan Jalur 4S …………………….. 12 Gambar 5. Kerangka Berpikir ……………………………………. 16 Gambar 6. Skema Penelitian …………………………………….. 18 Gambar 7. Kemunculan Isolat Bakteri Total Selama Waktu

Pencuplikan ........................................................…..

29 Gambar 8. Kemunculan Isolat Bakteri Desulfurisasi Selama

Waktu Pencuplikan dengan Metode IBDL …......…..

31 Gambar 9. Kemunculan Isolat Bakteri Desulfurisasi Selama

Waktu Pencuplikan dengan Metode IBDTL ………...

32 Gambar 10. Pertumbuhan Isolat Bakteri Terseleksi ………...…… 37 Gambar 11. Nilai pH Medium Isolat Bakteri Terseleksi …….…... 39 Gambar 12. Nilai Absorbansi Sulfat Isolat Bakteri Terseleksi …... 41 Gambar 13. Analisa Hasil Desulfurisasi DBT Isolat 15N dengan

Menggunakan Spektrofotometri UV-Visible .................

43

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Hal Lampiran 1. Komposisi media ………………………………………. 49 Lampiran 2. Kehadiran isolat-isolat bakteri hasil isolasi tanah

pertambangan batubara asal Sumatera Selatan dengan pengayaan DBT dan batubara …………………...……

50 Lampiran 3. Contoh morfologi koloni isolat-isolat bakteri hasil

isolasi tanah pertambangan batubara asal Sumatera Selatan ……………………………………….………...

51 Lampiran 4. Hasil pewarnaan isolat-isolat bakteri hasil isolasi tanah

pertambangan batubara asal Sumatera Selatan ………..

53 Lampiran 5. Hasil uji seleksi isolat bakteri desulfurisasi pada

medium MSM-DBT agar ……………………..……….

56 Lampiran 6. Hasil uji seleksi isolat bakteri desulfurisasi pada

medium MSM-DBT cair ..…...…………………..……

58 Lampiran 7. Analisis hasil desulfurisasi DBT Isolat 15N dengan

menggunakan UV-Vis Spectrophotometer ………….…

59 Lampiran 8. Kurva standar DBT …………………………………... 60 Lampiran 9. Output SPSS 16. MANOVA dan Duncan ………...…... 61

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kebutuhan manusia terhadap sumber daya energi akan terus mengalami

peningkatan seiring dengan berkembangnya sektor industri, transportasi dan

perumahan. Sebagian kebutuhan energi diperoleh dari penggunaan bahan bakar

fosil seperti batubara dan minyak bumi (Tanaka, 1999). Batubara di Indonesia

merupakan salah satu bahan bakar fosil yang melimpah. Tahun 2005 Indonesia

menduduki peringkat ke-2 di dunia sebagai negara pengekspor batubara. Data

pada tahun 2009 menunjukkan bahwa Indonesia memiliki cadangan batubara

sebesar 4,968 juta ton atau 0,5% dari total cadangan batubara dunia. Sumber daya

dan cadangan batubara Indonesia sebesar 104,8 miliar ton dan 18,8 miliar ton

(ESDM, 2009).

Berdasarkan lokasi, sumberdaya batubara Indonesia sebagian besar berada

di pulau Sumatera dan Kalimantan. Pulau Sumatera merupakan lokasi

sumberdaya batubara terbesar di Indonesia. Cadangan batubara di pulau Sumatera,

sebagian besar lokasinya berada di Sumatera Selatan. Sumber batubara di

Sumatera Selatan cukup besar sekitar 22,24 miliar ton (48% dari total sumber

daya batubara di Indonesia). Namun, kualitas batubara Sumatera Selatan

umumnya rendah dari jenis lignit hingga subbituminous, karena memiliki

kandungan sulfur yang cukup tinggi yaitu, lebih dari 2% (ESDM, 2009).

2

Pembakaran batubara menghasilkan emisi sulfur yang menyebabkan

pencemaran lingkungan. Kandungan sulfur pada batubara saat dibakar akan

bergabung dengan oksigen untuk membentuk sulfur dioksida (SO2) yang dapat

menyebabkan polusi udara dan hujan asam (Prayuenyong, 2002). Sulfur dalam

batubara hadir dalam dua bentuk yaitu, sulfur anorganik dan sulfur organik,

namun sulfur organik lebih sulit untuk dihilangkan daripada sulfur anorganik.

Sulfur organik dalam batubara terikat secara kovalen ke dalam struktur yang besar

dan kompleks pada molekul batubara serta terdistribusi di dalam substansi

batubara (Constanti et al., 1994).

Metode terbaik untuk membatasi jumlah sulfur dioksida (SO2) yang

dipancarkan ke atmosfer adalah dengan mengurangi jumlah sulfur dalam batubara

sebelum pembakaran yang disebut dengan desulfurisasi. Penyingkiran sulfur pada

batubara dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode, yaitu fisika, kimiawi,

dan biologis (Koizumi, 1984). Hidrodesulfurisasi merupakan sebuah teknik

fisikokimia yang telah diterapkan sebagai metode konvensional untuk

menghilangkan sulfur di seluruh dunia. Namun, proses hidrodesulfurisasi ini

memiliki beberapa kelemahan, yaitu membutuhkan biaya operasional yang tidak

sedikit, memproduksi produk yang berbahaya dan mempengaruhi struktur

batubara. Selain itu, prosesnya tidak bekerja baik pada sulfur organik, khususnya

sulfur poliaromatik heterosiklik salah satunya adalah dibenzhothiophene (DBT)

(Monticello, 1998).

Dewasa ini banyak diupayakan penanganan desulfurisasi secara biologis

menggunakan mikrooorganisme sebagai alternatif, yang disebut dengan

3

biodesulfurisasi. Proses ini memiliki banyak keuntungan dibandingkan dengan

proses fisika dan kimia konvensional, yaitu proses dilakukan dalam kondisi ringan

dengan tidak ada reaksi produk berbahaya, dapat mereduksi sulfur organik serta

struktur batubara tidak terpengaruh (Monticello, 1998).

Pemanfaatan bakteri untuk biodesulfurisasi sedang dikembangkan dan

banyak dikaji sebagai penanganan alternatif untuk mengatasi kandungan sulfur

pada batubara terutama kandungan sulfur organik yang sulit untuk dihilangkan

(Kayser et al., 1993). Penggunaan bakteri dinilai efektif digunakan dalam proses

desulfurisasi sulfur anorganik dan organik pada batubara. Penelitian yang

dilakukan Bozdemir et al. (1996) menunjukkan bahwa Rhodococcus erythropolis

IGTS8 dapat menghilangkan 55,2 % sulfat, 20 % pirit, 23,5 % sulfur organik dan

30,2 % sulfur total dari batubara lignit dalam waktu 96 jam. Beberapa spesies

bakteri lainnya juga telah diisolasi dan diketahui memiliki kemampuan dalam

proses desulfurisasi sulfur organik pada bahan bakar fosil seperti

Corynebacterium. sp, Gordona. sp, Bacillus. sp, Pseudomonas. sp dan

Rhodococcus. sp (Zhongxuan et al., 2002).

Proses biodesulfurisasi dapat berjalan maksimal jika menggunakan bakteri

yang memiliki kemampuan tinggi dalam proses desulfurisasi. Salah satu upaya

yang dilakukan untuk memperoleh bakteri desulfurisasi tersebut adalah dengan

melakukan isolasi dan seleksi bakteri desulfurisasi dari lokasi yang tercemar

sulfur. Bakteri sulfur dapat ditemukan pada tempat di mana komponen sulfur

tereduksi berada, seperti endapan, tanah, permukaan perairan baik kondisi aerob

maupun anaerob, serta di daerah sekitar gunung berapi seperti daerah sekitar

4

kawah (Holt et al., 1994). Menurut Zhongxuan et al. (2002) bakteri yang mampu

mendesulfurisasi DBT dapat diisolasi dari berbagai macam tanah yang tercemar

sulfur.

Mikroorganisme yang terdapat dalam jumlah kecil pada suatu lingkungan

alami relatif sulit untuk diisolasi, sehingga perlu digunakan medium pengayaan.

Medium memberikan nutrisi dan kondisi lingkungan yang menunjang

pertumbuhan organisme tertentu, namun tidak cocok bagi pertumbuhan organisme

lain. Menurut Dick (1992) pada isolasi mikroorganisme pengoksidasi sulfur perlu

dilakukan penambahan komponen sulfur tereduksi. Hal ini dilakukan untuk

memperpendek fase adaptasi (fase lag), sehingga pertumbuhannya relatif menjadi

lebih cepat.

Pada penelitian isolasi bakteri desulfurisasi dari tanah pertambangan

batubara asal Sumatera Selatan ini dilakukan pengayaan komponen sulfur

tereduksi yaitu DBT dan batubara. DBT dapat mewakili senyawa sulfur organik

yang terdapat dalam bahan bakar fosil (Oda dan Otha, 2002). Penambahan DBT

dan batubara ini dilakukan untuk memaksimalkan bakteri desulfurisasi yang

terisolasi. Batubara yang mengandung sulfur ditambahkan untuk menjaga agar

bakteri tetap teradaptasi karena nantinya akan diaplikasikan pada proses

biodesulfurisasi batubara (Prayuenyong, 2002). DBT telah digunakan sebagai

model sulfur heterosiklik poliaromatik untuk isolasi dan karakterisasi bakteri yang

mampu mengubah senyawa sulfur organik yang ditemukan dalam berbagai bahan

bakar fosil (Izumi et al., 1994).

5

1.2. Perumusan Masalah

1. Apakah dengan pengayaan DBT dan batubara bakteri desulfurisasi dapat

diisolasi dari tanah pertambangan batubara asal Sumatera Selatan?

2. Bagaimanakah kemampuan desulfurisasi dari isolat-isolat bakteri

desulfurisasi yang diperoleh melalui pengayaan DBT dan batubara?

1.3. Hipotesis

1. Bakteri desulfurisasi dapat diisolasi dengan pengayaan DBT dan batubara

dari tanah pertambangan batubara asal Sumatera Selatan.

2. Isolat-isolat bakteri desulfurisasi yang diperoleh melalui pengayaan DBT

dan batubara memiliki kemampuan desulfurisasi yang tinggi.

1.4. Tujuan

1. Memperoleh isolat bakteri desulfurisasi dari tanah pertambangan batubara

asal Sumatera Selatan dengan pengayaan DBT dan batubara.

2. Mengetahui kemampuan desulfurisasi dari isolat-isolat bakteri

desulfurisasi yang diperoleh.

1.5. Manfaat

Hasil penelitian ini diharapkan memperoleh isolat bakteri yang dapat

dikembangkan dalam bioteknologi desulfurisasi bahan bakar fosil sehingga

mendukung penggunaan bahan bakar ramah lingkungan.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Sulfur dalam Batubara

Sulfur dalam batubara hadir dalam dua bentuk yaitu sulfur anorganik dan

sulfur organik. Sulfur anorganik dalam batubara terutama terdiri dari sulfit dan

sulfat. Beberapa bentuk sulfit yang biasanya ditemukan dalam batubara, antara

lain pirit (FeS2), sphalerit (ZnS), galena (PbS), arsenopirit (FeAsS) dan lain-lain.

Bentuk sulfat yang biasa ditemukan dalam batubara, antara lain barit (BaSO4),

gipsum (CaSO4.2H2O), kalsium sulfat anhidrit (CaSO4), serta sejumlah besi sulfat

dan lain-lain (Calkins, 1994). Pirit pada umumnya merupakan sulfur anorganik

yang memiliki ukuran lebih besar dan tidak terikat pada molekul batubara.

Partikel dari pirit tersebar secara acak sebagai matriks dan berada dalam bentuk

kristal-kristal kubus pada seluruh bagian batubara (Gambar 1).

Gambar 1. Model struktural batubara keras (Wise, 1981)

7

Berbeda dengan sulfur anorganik, sulfur organik dalam batubara terikat

secara kovalen ke dalam struktur yang besar dan kompleks pada molekul batubara

serta terdistribusi di dalam substansi batubara sehingga sulit untuk dihilangkan

secara fisik ataupun kimia (Constanti et al., 1994). Menurut Klein et al. (1994)

sulfur organik pada batubara terdapat dalam bentuk senyawa alifatik, aromatik

atau heterosiklik, yang dapat diklasifikasikan ke dalam empat kelompok, yaitu :

1. Thiol alifatik atau aromatik (merkaptan, thiofenol)

2. Sulfida alifatik, aromatik atau campuran (thioeter)

3. Disulfida alifatik, aromatik atau campuran (dithioether)

4. Senyawa heterosiklik atau tiofena yang sejenis (dibenzothiophene)

Kandungan sulfur di dalam batubara bervariasi bergantung pada wilayah

batubara tersebut berasal (Prayuenyong, 2002). Kandungan sulfur dalam

batubara secara umum sesuai dengan Tabel 1.

Gambar 2. Jenis-jenis sulfur organik yang diidentifikasi dalam batubara (Shennan, 1996)

8

Tabel 1. Jenis serta persentase senyawa sulfur di dalam batubara

Unsur Persentase

Sufur organik 0,31 – 3,09 %

Sulfur pirit 0,06 – 3,78 %

Sulfur sulfat 0,01 – 1,06 %

Total sulfur 0,42 – 6,47 %

(Sumber : Speight, 1994)

2.2. Biodesulfurisasi Sulfur Organik

Sulfur merupakan senyawa yang secara alami terkandung dalam bahan

bakar fosil, namun keberadaannya tidak diinginkan karena dapat menyebabkan

berbagai masalah, termasuk di antaranya korosi pada peralatan proses, meracuni

katalis dalam proses pengolahan, bau yang kurang sedap atau produk samping

pembakaran berupa gas buang yang beracun seperti sulfur dioksida (SO2) dan

menimbulkan polusi udara serta hujan asam (Hidayat et al., 2006).

Penyingkiran sulfur pada batubara dapat dilakukan dengan tiga metode,

yaitu fisika, kimiawi dan biologi. Metode komersial yang mutakhir saat ini untuk

menghilangkan senyawa sulfur adalah hidrodesulfurisasi. Hidrodesulfurisasi

merupakan sebuah teknik fisikokimia yang telah diterapkan sebagai metode

konvensional untuk menghilangkan sulfur di seluruh dunia. Metode ini

menggunakan tekanan tinggi (10-17 atm) dan temperatur tinggi (200-425oC)

dalam melakukan prosesnya, dimana sulfur akan diubah menjadi hidrogen sulfida

(Monticello, 1998). Namun, proses kimia atau hidrodesulfurisasi ini memiliki

beberapa kelemahan yaitu membutuhkan biaya operasional yang tidak sedikit,

memproduksi produk yang berbahaya dan mempengaruhi struktur batubara.

9

Selain itu, prosesnya tidak bekerja baik pada sulfur organik, khususnya sulfur

poliaromatik heterosiklik. Salah satunya adalah DBT yang biasa digunakan

sebagai model dari senyawa heterosiklik yang mengandung sulfur organik untuk

penelitian biodesulfurisasi (Zhongxuan et al., 2002).

Sulfur dalam batubara hadir dalam dua bentuk yaitu sulfur anorganik dan

sulfur organik, berbeda dengan sulfur anorganik yang mudah dihilangkan dengan

cara fisika dan kimia, sulfur organik dalam batubara terikat secara kovalen ke

dalam struktur yang besar dan kompleks pada molekul batubara serta terdistribusi

di dalam substansi batubara sehingga sulit untuk dihilangkan secara fisik ataupun

kimia (Constanti et al., 1994). Oleh karena itu, saat ini penelitian tentang

biodesulfurisasi lebih banyak difokuskan pada desulfurisasi sulfur organik.

Sebagian besar kerja biodesulfurisasi telah menunjukkan hasil desulfurisasi yang

baik dimulai dengan DBT atau senyawa pengganti golongan alkilnya (Takashi

dan Izumi, 1999).

Dewasa ini banyak diupayakan penanganan desulfurisasi secara biologis

menggunakan mikrooorganisme sebagai alternatif yang disebut dengan

biodesulfurisasi. Proses ini memiliki banyak keuntungan dibandingkan dengan

proses fisika dan kimia konvensional, yaitu proses dilakukan dalam kondisi ringan

dengan tidak ada reaksi produk berbahaya, dapat mereduksi sulfur organik serta

struktur batubara tidak terpengaruh (Monticello, 1998). Pemanfaatan bakteri

untuk biodesulfurisasi sedang dikembangkan dan banyak dikaji sebagai

penanganan alternatif untuk mengatasi kandungan sulfur pada batubara terutama

kandungan sulfur organik yang sulit untuk dihilangkan (Kayser et al., 1993).

10

Beberapa spesies bakteri telah diisolasi dan diketahui memiliki kemampuan dalam

proses biodesulfurisasi sulfur organik pada bahan bakar fosil seperti

Corynebacterium. sp, Gordona. sp, Bacillus. sp, Pseudomonas. sp dan

Rhodococcus. sp (Zhongxuan et al., 2002).

2.3. Dibenzhothiophene (DBT)

Dibenzothiophene (DBT) adalah sulfur heterosiklik yang ditemukan pada

minyak mentah dan batubara (Kirimura et al., 2001) (Gambar 3).

Gambar 3. Struktur kimia DBT (Kirimura et al., 2001)

Permasalahan proses biodesulfurisasi pada batubara yang saat ini

dilakukan adalah sulitnya menghilangkan kandungan sulfur organik. Oleh karena

itu, penelitian biodesulfurisasi saat ini lebih banyak difokuskan pada penghilangan

kandungan sulfur organik. Biodesulfurisasi sulfur organik banyak menggunakan

DBT sebagai senyawa model. DBT dipandang secara luas sebagai senyawa model

yang dapat mewakili pecahan senyawa sulfur organik aromatik pada batubara dan

minyak mentah (Gilbert et al., 1998). DBT telah digunakan sebagai model sulfur

heterosiklik poliaromatik untuk isolasi dan karakterisasi bakteri yang mampu

mengubah senyawa sulfur organik yang ditemukan dalam berbagai bahan bakar

fosil (Izumi et al., 1994).

11

2.4. Jalur Metabolisme Biodesulfurisasi Sulfur Organik

Sebagian besar proses biodesulfurisasi sulfur organik menunjukkan hasil

yang baik. Hal ini ditandai dengan berkurangnya kadar DBT pada bahan bakar

fosil (Takashi dan Izumi, 1999). Menurut Zhongxuan et al. (2002), pengurangan

kadar DBT pada bahan bakar fosil selama proses biodesulfurisasi memiliki dua

jalur yang berbeda yaitu jalur Kodama dan jalur 4S. Jalur Kodama dianggap tidak

sesuai karena pada jalur ini dihasilkan senyawa sulfur yang larut air, yang mana

kemudian tidak tersedia untuk pembakaran dan oleh karena itu akan

menghilangkan nilai kalori dari bahan bakar. Salah satu cincin homosikllik dari

DBT rusak dalam jalur Kodama, namun sulfur tetap dalam bentuk organik sebagai

3-hidroksi-2-formylbenzothiophene (HFBT) (Bressler dan Fedorak, 2001).

Jalur lain untuk menghilangkan sulfur adalah dengan jalur 4S. Jalur 4S

merupakan penemuan baru yang ditemukan oleh Institute of Gas Technology

(IGT) pada tahun 1988. Mereka mengisolasi dua bakteri yang dapat

menghilangkan sulfur dari DBT secara selektif. Penelitian lebih lanjut

menunjukkan bahwa isolat tersebut dapat mengoksidasi DBT menjadi DBT

sulfoxide, kemudian menjadi DBT sulfone, 2-hydroxydiphenyl atau 2,2-biphenol

dan sulfat, sementara struktur karbon tetap utuh (Kevin et al., 1996) (Gambar 4).

Melalui jalur 4S, DBT berubah menjadi 2-HBP dan sulfit. Dalam jalur ini struktur

karbon yang dilepaskan utuh sebagai 2-HBP sehingga nilai bahan bakar tidak

berkurang (Mohebali et al., 2006).

12

Gambar 4. Biodesulfurisasi dengan Jalur 4S (Zhongxuan et al., 2002)

Aplikasi biodesulfurisasi batubara di lapangan dengan menggunakan

bakteri pada jalur 4S perlu dilakukan setelah proses desulfurisasi sulfur anorganik

dengan menggunakan metode fisika dan kimia. Menurut Klein (1998), 90% sulfur

anorganik pada batubara dapat dihilangkan dengan cara desulfurisasi fisika seperti

dihancurkan, ditumbuk dan dicuci. Selanjutnya proses desulfurisasi dilanjutkan

dengan menggunakan bakteri. Hal ini dilakukan untuk desulfurisasi sulfur

organik yang sulit untuk dihilangkan dengan metode fisika dan kimia, salah

satunya adalah DBT (Prayuenyong, 2002).

2.5. Bakteri dalam Biodesulfurisasi Sulfur Organik

Biodesulfursasi sulfur organik pada awalnya dianggap gagal karena

bakteri yang diisolasi tidak bisa secara khusus menghapus sulfur dan

menyebabkan penurunan nilai karbon pada batubara. Perhatian awal telah

13

difokuskan pada penghapusan sulfur dari DBT karena senyawa ini merupakan

sulfur organik yang ditemukan pada sebagian besar bahan bakar fosil. Isolasi dan

karakterisasi Rhodococcus erythropolis IGTS8 (sebelumnya disebut Rhodococcus

IGTS8) menyebabkan kemajuan dalam penelitian biodesulfurisasi DBT

(Prayuenyong, 2002).

Beberapa mikroorganisme desulfurisasi DBT telah diisolasi, contohnya

Rhodococcus. sp IGTS8 (Gallagher et al., 1993), R. erythropolis D-1 (Izumi et al.,

1994), R. erythropolis H-2 (Ohshiro et al., 1996), R. erythopolis KA2-5-1 (Izumi

et al., 1994), Rhodococcus. sp SY1, yang sebelumnya diidentifikasi sebagai

Corynebacterium. sp (Omori et al., 1995), Mycobacterium. sp G3 dan Gordona

sp CYKS1 (Nekodzuka et al., 1997).

Bakteri yang saat ini paling banyak dipelajari dalam proses

biodesulfurisasi sulfur organik adalah dari genus Rhodococcus. Genus

Rhodococcus memiliki kemampuan untuk menghapus sulfur anorganik dan sulfur

organik dan akibatnya proses biodesulfurisasi saat ini telah banyak dilakukan

dengan menggunakan spesies ini (Prayuenyong, 2002). Spesies Rhodococcus

yang telah ditemukan diantaranya yaitu Rhodococcus erythropolis IGTS8 (Kayser

et al., 1993), R. erythropolis D-1 (Izumi et al., 1994), R. erythropolis H-2

(Ohshiro et al., 1996), Rhodococcus. sp SY1 (Omori et al., 1995) dan

Rhodococcus. sp ECRD-1 (Grossman et al., 1999). Diantara semuanya R.

erythropolis IGTS8 adalah yang paling banyak dipelajari. Berdasarkan penelitian

yang dilakukan oleh Bozdemir et al (1996) diketahui bahwa R. erythropolis

14

IGTS8 dapat menghilangkan 55,2 % sulfat, 20 % pirit, 23,5 % sulfur organik dan

30,2 % sulfur total dari batubara lignit selama 96 jam.

2.6. Isolasi dan Seleksi Bakteri

Populasi mikroorganisme di alam sangat banyak dan kompleks, baik yang

terdapat di udara, tanah, air dan substrat lainnya yang semuanya dapat diisolasi

(Pelczar dan Chan, 2005). Isolasi adalah proses untuk memperoleh

mikroorganisme dalam bentuk biakan murni untuk pertama kalinya. Proses ini

mencakup dua kegiatan yaitu memisahkan mikroorganisme yang diinginkan dari

substrat alaminya atau dari mikroorganisme kontaminan dan disertai usaha untuk

memperoleh mikroorganisme yang diinginkan dalam bentuk biakan.

Tujuan isolasi adalah untuk memperoleh mikroorganisme murni (tunggal)

dan mudah dikultivasi dengan harapan dapat menghasilkan produk dan sifat-sifat

unggul lainnya. Metode isolasi dibagi menjadi dua metode yaitu metode langsung

dan metode tidak langsung (diperkaya). Metode isolasi langsung adalah metode

pengisolasian mikroorganisme secara langsung dari sampel tanpa proses

pengayaan terlebih dahulu. Isolasi tersebut dapat didahului dengan pengenceran

atau tidak. Penanaman dilakukan pada medium padat dengan menggunakan

metode sebar. Metode tidak langsung (diperkaya) adalah metode yang dilakukan

untuk meningkatkan jumlah mikroorganisme yang diinginkan sehingga menjadi

lebih banyak daripada mikroorganisme lainnya dalam inokulum asli (Casida,

2001).

15

Proses yang terjadi pada media tidak langsung (diperkaya) akan

menghasilkan populasi campuran dan memberikan kondisi yang cocok untuk

mikroorganisme yang diharapkan, misalnya memberikan substrat khusus atau

memasukkan penghambat tertentu. Modifikasi medium tersebut berpengaruh

terhadap selektivitas mikroorganisme, namun dalam proses lebih lanjut akan

terjadi suksesi yang diikuti oleh pertumbuhan mikroorganisme lain (Hidayat et al.,

2006). Suksesi terjadi akibat proses inkubasi yang terlalu lama, akan tetapi apabila

terlalu cepat maka mikroorganisme yang terseleksi akan lebih sedikit, karena

belum beradaptasi dengan nutrien yang ada (Casida, 2001). Seleksi dilakukan

untuk mengetahui ciri-ciri yang lebih khusus atas isolat yang ditemukan dan

memilih sifat-sifat yang diinginkan atas isolat yang telah ditemukan dengan

berbagai pengujian (Hidayat et al., 2006).

16

2.7. Kerangka Berpikir

Gambar 5. Kerangka Berpikir

Sumber Energi Utama di Indonesia

Batubara (Bahan Bakar Fosil)

Pencemaran Lingkungan Meningkat

Emisi sulfur dioksida (SO2)

Desulfurisasi

Biologi Kimia Fisika

Mikroorganisme

Hujan Asam

Penyakit Pernafasan Akut dan Kronis

Tanah Mengandung Sulfur

Isolasi

Penambahan Komponen Sulfur

Tereduksi

Isolat Bakteri

Seleksi

Bakteri Desulfurisasi Potensial

Aplikasi Bahan Bakar Fosil Ramah Lingkungan

Batubara

DBT

17

BAB III

METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Maret sampai dengan Juni 2011.

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Laboratorium Terpadu

(PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat-alat utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri,

labu erlenmeyer, tabung reaksi, inkubator, timbangan analitik, vorteks, pH meter,

hot plate, magnetic stirer, mortar, saringan berukuran 100 dan 200 mesh,

mikroskop, kamera, autoklaf, rotary shaker, Laminar Air Flow Cabinet (LAFC),

Visible Spectrophotometer dan UV-Vis Spectrophotometer.

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah

pertambangan batubara yang berasal dari Sumatera Selatan, medium Minimal Salt

Medium (MSM), medium Trypticase Soy Agar (TSA), agar bubuk, batubara

bubuk berukuran 200 mesh, dibenzothiophene (DBT), Na4P2O7, NaCl 0,85%,

aquades, crystal violet, lugol, safranin, alkohol 96%, alkohol 70%, gliserol 20%,

BaCl 10% dan HCl 5%.

18

3.3. Cara Kerja

Gambar 6. Skema Penelitian

Persiapan sampel, alat dan bahan

Pembuatan medium

Isolasi bakteri total (IBT)

Sampel tanah pertambangan batubara (100 mesh)

Isolasi bakteri desulfurisasi (IBD)

Isolasi tidak langsung/ diperkaya (IBDTL)

Isolasi langsung (IBDL)

Pemurnian, pewarnaan dan pengamatan morfologi

Pemurnian, pewarnaan dan pengamatan morfologi

Uji lanjut isolat terpilih dengan pengukuran pengurangan kadar DBT

Analisis Data

Isolat-isolat bakteri total

Pengayaan sampel tanah (DBT + Batubara)

Pencuplikan tanah Hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28

Seleksi isolat-isolat bakteri desulfurisasi pada medium MSM-

DBT agar

Seleksi isolat terseleksi pada medium MSM-DBT cair

Isolat-isolat bakteri desulfurisasi

19

3.3.1. Persiapan Sampel

Sampel yang digunakan adalah tanah pertambangan batubara yang berasal

dari Sumatera Selatan. Sampel dihancurkan secara aseptis dengan menggunakan

mortar, lalu disaring dengan menggunakan saringan berukuran 100 mesh. Sampel

hasil saringan tanah pertambangan batubara inilah yang kemudian akan

digunakan.

3.3.2. Pembuatan Medium

3.3.2.1. Medium Minimal Salts Medium (MSM)-DBT

Medium Minimal Salts Medium (MSM) dibuat dengan cara menimbang

sebanyak 2 ml gliserol; 4 g NaH2PO4.H2O; 4 g K2HPO4.3H2O; 2 g NH4Cl; 0,2 g

MgCl2.6H2O; 0,001 g CaCl2.2H2O dan 0,001 g FeCl3.6H2O, ditambahkan aquades

hingga volumenya mencapai 1 liter, kemudian diaduk sampai homogen

(Gallagher et al., 1993).

Medium MSM-DBT dibuat dengan cara menambahkan batubara serbuk

sebanyak 10% (b/v) berukuran 200 mesh pada medium MSM. Batubara yang

ditambahkan sebelumnya sudah dicuci dengan menggunakan aquades. Medium

tersebut kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan

1,5 atm selama 15 menit. DBT disiapkan secara terpisah dari medium basal, DBT

dilarutkan dalam alkohol 70% hingga 10 mM, kemudian medium MSM steril

ditambahkan 0,1 mM DBT. Medium MSM-DBT ini adalah medium MSM-DBT

cair sedangkan untuk keperluan plating, medium tersebut ditambahkan 1,5% agar

(Maghsoudi et al., 2000).

20

3.3.2.2. Medium Trypticase Soy Agar (TSA)

Medium Trypticase Soy Agar (TSA) dibuat dengan cara menimbang 40 g

media (Lampiran 1), kemudian ditambahkan aquades hingga volumenya mencapai

1 liter dan dipanaskan hingga homogen. Medium tersebut kemudian disterilisasi

dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.

3.3.3. Pengayaan Sampel Tanah

Pengayaan sampel tanah pertambangan batubara dilakukan untuk

mengaktifkan bakteri desulfurisasi. Sampel tanah pertambangan batubara yang

telah dihaluskan (100 mesh) sebanyak 100 g dicampur dengan 10 g batubara

bubuk steril (200 mesh) dan 0,1 mM DBT di dalam beaker glass berukuran 500

ml, kemudian ditutup dengan menggunakan penutup yang terbuat dari kaca.

Pengayaan sampel tanah dilakukan selama + 30 hari pada suhu ruang. Selama

proses pengayaan tanah berlangsung kondisi tanah tetap dijaga kelembabannya,

dengan cara memberikan beberapa tetes aquades steril setiap hari. Pencuplikan

tanah dilakukan pada hari ke-0 (jam ke-3), 7, 14, 21 dan 28. Sampel tanah pada

waktu-waktu tersebut diambil untuk diisolasi dan dihitung komunitas bakteri total

dan bakteri desulfurisasi (Gallagher et al., 1993).

3.3.4. Isolasi Bakteri Total (IBT)

IBT dilakukan pada sampel tanah pertambangan batubara asal Sumatera

Selatan sebelum dan sesudah pengayaan DBT dan batubara. Sebanyak 1 g sampel

tanah pertambangan batubara (100 mesh) dimasukkan ke dalam 9 ml larutan

fisologis (NaCl 0,85%), kemudian dilakukan seri pengenceran, dengan cara

21

mengencerkan 1 ml sampel ke dalam 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%). Hasil

setiap seri pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada medium

TSA cawan dengan teknik sebar. Setelah itu, diinkubasi pada suhu ruang selama

48 jam.

3.3.5. Isolasi Bakteri Desulfurisasi (IBD)

IBD (pengguna DBT) dilakukan dengan dua cara yaitu metode langsung

dan tidak langsung/ diperkaya.

3.3.5.1. Isolasi Bakteri Desulfurisasi Langsung (IBDL)

Isolasi bakteri desulfurisasi langsung (IBDL) dilakukan dengan cara 10 g

tanah yang diperkaya dengan DBT dan batubara, dicampur dengan 90 ml sodium

pyrophosphat (Na4P2O7) 0,1% sebagai buffer, kemudian dikocok selama 20 menit

pada rotary shaker dengan kecepatan 200 rpm (Young et al., 2006). Setelah itu,

suspensi diencerkan dengan melakukan seri pengenceran, dengan cara

mengencerkan 1 ml sampel ke dalam 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%). Hasil

setiap seri pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada medium

TSA cawan dengan teknik sebar. Setelah itu, diinkubasi pada suhu ruang selama

48 jam.

3.3.5.2. Isolasi Bakteri Desulfurisasi Tidak Langsung/ Diperkaya (IBDTL)

Isolasi bakteri desulfurisasi tidak langsung/ diperkaya (IBDTL) dilakukan

dengan cara 5 g tanah yang diperkaya dengan DBT dan batubara dimasukkan ke

dalam erlenmeyer yang berisi 95 ml MSM-DBT. Kultur diinkubasi pada rotary

22

shaker berkecepatan 150 rpm pada temperatur ruang selama 3 hari. Kemudian

10% (v/v) kultur ini diinokulasi ke dalam medium baru dan diinkubasi kembali.

Hal ini dilakukan sampai tiga kali transfer, untuk memperkaya jumlah bakteri

(Kirimura et al., 2001). Pada kultur terakhir pengayaan, 1 ml sampel diambil

kemudian dilakukan seri pengenceran, dengan cara mengencerkan 1 ml sampel

ke dalam 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%). Hasil setiap seri pengenceran

diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada medium TSA cawan dengan

teknik sebar. Setelah itu, diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang.

3.3.6. Pemurnian Isolat

Seluruh isolat bakteri yang diperoleh dimurnikan sampai menghasilkan

isolat bakteri tunggal. Apabila dari proses isolasi menghasilkan isolat yang

bermacam-macam maka dipisahkan tiap isolat bakteri dengan cara mengambil

sebagian kecil koloni dengan menggunakan ose kemudian diinokulasikan pada

medium TSA cawan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Proses

pemurnian dilakukan sampai menghasilkan isolat bakteri yang murni atau tunggal,

yang diketahui dari pengamatan morfologi pada pewarnaan Gram. Koloni bakteri

yang telah dimurnikan disimpan sebagai kultur stok di dalam medium TSA miring

pada suhu 40C.

3.3.7. Seleksi Isolat Bakteri Desulfurisasi

3.3.7.1. Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Agar

Setiap isolat bakteri desulfurisasi yang diperoleh, pada medium TSA yang

berumur 1 hari diambil sebagian kecil koloni dengan menggunakan ose kemudian

23

diinokulasikan pada medium MSM-DBT agar cawan dan selanjutnya diinkubasi

pada suhu ruang selama 48 jam. Pertumbuhan setiap isolat bakteri diamati pada

medium MSM-DBT agar. Tiga isolat bakteri yang memiliki pertumbuhan

tertinggi pada media MSM-DBT agar disimpan sebagai kultur stok di dalam

medium MSM-DBT agar miring pada suhu 40C. Kultur tersebut digunakan

sebagai kultur untuk tahapan seleksi berikutnya.

3.3.7.2. Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Cair

Tiga isolat bakteri desulfurisasi yang memiliki pertumbuhan tertinggi pada

medium MSM-DBT agar yang berumur 1 hari diinokulasikan sebanyak satu ose

ke dalam 30 ml medium MSM-DBT. Kemudian diinkubasi pada rotary shaker

berkecepatan 120 rpm pada temperatur ruang selama 24 jam. Kultur inokulum

sebanyak 10% (v/v) diinokulasikan ke dalam 200 ml medium MSM-DBT dan

diinkubasi pada suhu ruang dengan agitasi 120 rpm. Pencuplikan dilakukan pada

jam ke-0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 untuk pengukuran enumerasi sel, pH dan

desulfurisasi DBT. Enumerasi sel dilakukan dengan cara mengukur total plate

count, pH diukur dengan pH meter.

Desulfurisasi DBT dilakukan dengan cara mengukur sulfat yang terbentuk.

Sulfat ditentukan dengan metode kekeruhan barium sulfat. Lima ml gliserol 20%

(v/v) dalam air ditambahkan ke dalam sampel cair dan dikocok dengan kuat

hingga homogen. Satu ml barium klorida 10% (v/v) dalam HCl 5% (v/v)

ditambahkan dan dikocok dengan kuat untuk memastikan presipitat barium sulfat

yang terbentuk tercampur merata dalam larutan gliserol. Kemudian aquades

ditambahkan sampai volume total 10 ml, dikocok merata dan diukur

24

kekeruhannya dengan Visible Spectrophotometer pada panjang gelombang 460

nm, terhadap larutan blanko (Gleen dan Quastel, 1953 dalam Burlage et al.,

1998). Isolat bakteri yang memiliki kandungan sulfat tertinggi akan di uji lanjut

untuk analisis hasil desulfurisasi DBT dengan menggunakan UV-Vis

Spectrophotometer.

3.3.8. Analisis Hasil Desulfurisasi DBT dari Bakteri Terseleksi dengan menggunakan UV-Vis Spectrophotometer Sampel sebanyak 3 ml selama pencuplikan pada fase eksponensial isolat

yang terseleksi diasamkan sampai pH 2 dengan menggunakan HCl 1 N. Setelah

itu sampel diukur kadar DBT dengan menggunakan UV-Vis Spectrophotometer

pada panjang gelombang 328 nm (Rhee et al., 1998). Konsentrasi kadar DBT

pada sampel diketahui dengan cara membandingkan nilai absorbansi dengan

kurva standar.

3.3.9. Analisis Data

Data enumerasi, pH medium dan nilai absorbansi sulfat dianalisis secara

deskriptif ditampilkan dalam bentuk kurva dengan program excel 2007 serta di

analisis varian multivariate (MANOVA) dengan bantuan SPSS 16 dilanjutkan

dengan uji Duncan taraf 5 %.

25

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Isolasi Bakteri

Proses isolasi bakteri dari tanah pertambangan batubara asal Sumatera

Selatan dilakukan dengan pengayaan dibenzothiophene (DBT) dan batubara.

Isolasi yang dilakukan terdiri atas dua macam yaitu isolasi bakteri total (IBT) dan

isolasi bakteri desulfurisasi (IBD). Dua puluh empat jenis isolat bakteri terisolasi

dari IBT dan 22 jenis isolat bakteri terisolasi dari IBD. Dua belas jenis isolat

bakteri yang terisolasi, baik pada IBT maupun IBD diketahui memiliki kesamaan

morfologi, yaitu isolat 1N, 2N, 6N, 7N, 8N, 9N, 10N, 12N, 14N, 15N, 21N dan

26N. Jadi, keseluruhan isolat yang diperoleh berjumlah 34 jenis isolat bakteri.

Deskripsi karakteristik seluruh isolat bakteri dapat dilihat pada Tabel 2 dan

Gambar isolat bakteri dapat dilihat pada Lampiran 3 dan 4. Berdasarkan

pengamatan morfologi, isolat bakteri yang diperoleh sebagian besar berbentuk

kokus yang saling lepas, sedangkan sebagian kecil berbentuk basil. Sebagian

besar isolat bakteri yang diperoleh memiliki karakteristik Gram negatif. Pada

Tabel 2 dapat dilihat bahwa setiap jenis isolat bakteri tidak selalu muncul pada

setiap waktu pencuplikan. Beberapa isolat bakteri muncul lebih dari sekali dalam

waktu pencuplikan, misalnya isolat 8N. Isolat 8N muncul paling banyak

dibandingkan dengan isolat lainnya, yaitu 12 kali selama waktu pencuplikan,

dimana terisolasi 4 kali pada IBT dan 8 kali pada IBD (Lampiran 2). Hal ini

menunjukkan bahwa isolat 8N dominan selama waktu pencuplikan dilakukan.

26

Tabel 2. Karakteristik isolat bakteri

Metode Isolasi Kode

Isolat

Jumlah Kemunculan

isolat Karakteristik Koloni Karakteristik Sel

IBT 3N 1

Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: kuning; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya rantai. Termasuk ke dalam Gram negatif

4N 1 Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya anggur. Termasuk ke dalam Gram negatif

5N 1 Bentuk koloni: irregular; Tepi: lobate; Elevasi: gunung; Permukaan:rough; Warna: putih; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya anggur. Termasuk ke dalam Gram negatif

11N 1 Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas : opaque.

Bentuk sel basil, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram positif

13N 1

Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: orange muda; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram negatif

16N 1 Bentuk koloni: bulat ; Tepi: entire; Elevasi: timbul; Permukaan: dull; Warna: kuning; Opasitas: opaque.

Bentuk sel basil, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram negatif

25N 1 Bentuk koloni: bulat ; Tepi: entire; Elevasi: gunung; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya anggur, termasuk ke dalam Gram positif

27N 1

Bentuk koloni: bulat dengan penebalan tepi; Tepi: entire; Elevasi: timbul; Permukaan: dull; Warna: kuning; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram positif

28N 1 Bentuk koloni: bulat ; Tepi: entire; Elevasi: gunung; Permukaan: dull; Warna: kuning; Opasitas: opaque.


36N 1 Bentuk koloni: irregular; Tepi: lobate; Elevasi: timbul; Permukaan: rough; Warna: putih; Opasitas: opaque.


37N 1

Bentuk koloni: bulat dengan penonjolan tengah; Tepi: entire; Elevasi: gunung; Permukaan: dull; Warna: putih susu; Opasitas: opaque.


39N 1

Bentuk koloni: bulat dengan tepi agak bening; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: kuning; Opasitas: opaque.


IBD

32N 1

Bentuk koloni: menyebar tidak teratur; Tepi: rough; Elevas : flat; Permukaan: rough; Warna: kuning agak bening; Opasitas: translucent

Bentuk sel basil, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram negatif

27

33N 3

Bentuk koloni: bulat dengan penonjolan ditepi; Tepi: entire; Elevasi: gunung; Permukaan: rough; Warna: kuning; Opasitas: opaque.




40N 1 Bentuk koloni: irregular; Tepi: lobate; Elevasi: timbul; Permukaan: rough; Warna: kuning; Opasitas: opaque.

Bentuk basil, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram negatif

41N 1

Bentuk koloni: menyebar tidak teratur; Tepi: irregular; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya anggur, termasuk ke dalam Gram positif

42N 2

Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: orange muda; Opasitas: opaque.


43N 2 Bentuk koloni: irregular; Tepi:lobate; Elevasi: gunung; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas: opaque.


46N 1 Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: timbul; Permukaan: rough; Warna: kuning; Opasitas: opaque.


49N 1 Bentuk koloni: irregular; Tepi:lobate; Elevasi: timbul; Permukaan: rough; Warna: kuning; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram positif


Bentuk kokus, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram negatif

Ter-isolasi pada

IBT dan IBD

1N

3

Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex ; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram positif

2N 2 Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: kuning; Opasitas: opaque.

Bentuk sel basil, susunannya rantai. Termasuk ke dalam Gram positif

6N 3

Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: kuning muda; Opasitas: opaque.

Bentuk sel kokus, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram negatif

7N 3

Bentuk koloni: irregular; Tepi: lobate; Elevasi: gunung; Permukaan: rough; Warna: kuning muda; Opasitas: opaque.


8N 12 Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: timbul; Permukaan: dull; Warna: putih; Opasitas: opaque.


9N 2 Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex ; Permukaan: dull; Warna: putih susu; Opasitas: opaque.

Bentuk sel basil, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram negatif

28

10N 10

Bentuk koloni: bulat; Tepi: entire; Elevasi: convex; Permukaan: dull; Warna: putih agak bening; Opasitas: opaque.

Bentuk sel basil, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram positif


Bentuk kokus, susunannya rantai, termasuk ke dalam Gram negatif

14N 3 Bentuk koloni: irregular; Tepi: entire; Elevasi: timbul; Permukaan: rough; Warna: kuning;Opasitas:opaque.

Bentuk kokus, susunannya tunggal, termasuk ke dalam Gram negatif




Bentuk sel basil, susunannya anggur, termasuk ke dalam Gram negatif


Bentuk sel kokus, susunannya anggur, termasuk ke dalam Gram negatif

Keterangan : entire : utuh; flat : datar; opaque : tidak tembus cahaya; convex : cembung; dull: tumpul; translucent: tembus cahaya; irregular: tidak beraturan;

lobate: berlekuk; rough: kasar

Dua belas isolat bakteri yang terisolasi pada IBT tidak terisolasi pada IBD.

Begitu pula sebaliknya, sepuluh jenis isolat bakteri hanya muncul pada IBD yaitu,

isolat 32N, 33N, 34N, 40N, 41N, 42N, 43N, 46N, 49N dan 50N. Hal tersebut

menunjukkan adanya pengaruh dari pengayaan DBT dan batubara yang dilakukan

pada sumber isolat. Pengayaan DBT dan batubara yang dilakukan pada sumber

isolat mampu memunculkan jenis isolat baru yang sudah berada pada sumber

isolat namun jumlahnya tidak dominan. Pengayaan DBT dan batubara yang

dilakukan merupakan penambahan komponen sulfur tereduksi pada sumber isolat

yang dapat memberikan kesempatan isolat bakteri yang tidak dominan pada

sumber isolat untuk tumbuh sehingga isolat bakteri dapat terisolasi. Hal ini

diperkuat dengan pernyataan Davis et al. (2005) yang menyatakan bahwa

penggunaan pengayaan pada sumber isolat adalah kebutuhan untuk

menumbuhkan populasi sel yang dapat terdeteksi dari tingkat awal yang sangat

29

rendah. Pengayaan pada sumber isolat memungkinkan perkembangbiakan

mikroba target sehingga dapat terisolasi dan dapat menekan pertumbuhan

mikroorganisme saingan yang tidak diinginkan.

4.1.1. Hasil Isolasi Bakteri Total (IBT)

IBT dilakukan untuk mengetahui jumlah bakteri total yang terdapat pada

tanah pertambangan batubara asal Sumatera Selatan sebelum dan sesudah

pengayaan DBT dan batubara. Sebanyak 24 isolat bakteri berhasil diisolasi dari

IBT. Isolat bakteri total yang berhasil diisolasi tersebut terisolasi pada waktu

pencuplikan yang berbeda-beda (Gambar 7).

Sebelum pengayaan DBT dan batubara dilakukan pada sumber isolat,

isolat bakteri yang berhasil terisolasi berjumlah 7 jenis, yaitu 1N, 2N, 3N, 4N, 5N,

Gambar 7. Kemunculan isolat bakteri total selama waktu pencuplikan (Keterangan : * = IBT pada tanah pertambangan batubara asal

Sumatera Selatan sebelum dilakukan pengayaan DBT dan batubara)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Sebelum* 0 7 14 21 28

Log

jum

lah

sel/

ml

Waktu Pencuplikan (Hari)1N 2N 3N 4 N 5 N 6 N 7 N 8 N 9 N 10 N 11 N 12 N

13 N 14 N 15 N 16 N 21 N 25 N 26 N 27 N 28 N 36 N 37 N 39 N

30

6N dan 7N. Ketujuh isolat bakteri tersebut tidak muncul kembali setelah

pengayaan DBT dan batubara, diduga isolat bakteri tersebut tidak dapat

beradaptasi dengan pengayaan yang dilakukan pada sumber isolat. Setelah

pengayaan DBT dan batubara pada sumber isolat selama waktu pencuplikan

terdapat empat isolat bakteri yang muncul dengan frekuensi lebih sering selama

pencuplikan (2–4 kali) dibandingkan dengan isolat lain, yaitu isolat 8N, 10N, 12N

dan 21N. Keempat isolat bakteri tersebut merupakan isolat bakteri yang juga

berhasil diisolasi dari IBD. Sebagian besar isolat bakteri lainnya hanya terisolasi

pada satu kali pencuplikan, diduga isolat bakteri tersebut tidak mampu bersaing

dan memanfaatkan sumber sulfur dan karbon yang berasal dari pengayaan DBT

dan batubara yang dilakukan pada sumber isolasi. Hal tersebut diperkuat dengan

semakin berkurangnya jumlah isolat bakteri yang terisolasi selama waktu

pencuplikan pada IBT.

4.1.2. Hasil Isolasi Bakteri Desulfurisasi (IBD)

IBD dilakukan untuk memperoleh isolat bakteri yang memiliki

kemampuan desulfurisasi sulfur organik, dalam hal ini adalah DBT. Metode IBD

dilakukan dengan dua cara, yaitu metode langsung (IBDL) dan tidak langsung/

diperkaya (IBDTL). Lima belas jenis isolat bakteri berhasil diisolasi dari IBDL

dan 14 jenis isolat bakteri diisolasi dari IBDTL (Lampiran 2). Tujuh jenis isolat

bakteri yang terisolasi, baik pada IBDL maupun IBDTL diketahui memiliki

kesamaan morfologi yaitu isolat 8N, 10N, 15N, 26N, 33N, 34N dan 43N. Jadi,

31

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 7 14 21 28

Log

jum

lah

sel/

ml

Waktu Pencuplikan (Hari)

1 N 2 N 7 N 8 N 10 N 15 N 21 N 26 N 32 N 33 N 34 N 41 N 42 N 43 N 46 N

keseluruhan isolat bakteri desulfurisasi yang diperoleh berjumlah 22 jenis isolat

bakteri.

Kehadiran semua isolat bakteri yang diperoleh dari IBDL dan IBDTL

tidak ditemukan secara seragam dalam waktu yang sama melainkan ditemukan

bervariasi selama waktu pencuplikan. Perbedaan kemunculan ini dapat disebabkan

oleh adanya kelompok bakteri tanah yang memiliki kemampuan pertumbuhan

yang lambat atau bakteri tersebut memiliki waktu adaptasi yang lama (Davis et al,

2005). Kehadiran isolat bakteri yang secara terus-menerus selama pencuplikan

menandakan adanya indikasi kemampuan desulfurisasi dalam mendegradasi

senyawa DBT (Zhongzuan et al., 2002).

Pencuplikan pada hari ke-0 dengan metode langsung dari IBD dapat

mengisolasi 9 jenis isolat bakteri, dengan jumlah sel tertinggi dimiliki oleh isolat

2N (3x106 sel/ml). Dua isolat bakteri, yaitu isolat 1N dan 8N muncul kembali

Gambar 8. Kemunculan isolat bakteri selama waktu pencuplikan pada metode IBDL

32

0

12

3

4

5

6

7

89

0 7 14 21 28

Log

jum

lah

sel/

ml

Waktu Pencuplikan (Hari)6 N 8 N 9N 10 N 12 N 14 N 15 N 26 N 33 N 34 N 40 N 43N 49N 50 N

pada hari ke-7 dengan jumlah sel yang semakin bertambah. Pada hari ke-14

pencuplikan, 4 isolat lain terisolasi yaitu isolat 10N, 26N, 42N dan 46N, serta

pada pencuplikan ini pula 4 isolat bakteri yang terisolasi pada hari ke-0 muncul

kembali yaitu isolat 7N, 8N, 21N dan 42N. Kemunculan kembali keempat isolat

bakteri tersebut diduga karena melimpahnya sumber karbon hasil degradasi DBT

dan batubara yang dilakukan oleh isolat-isolat bakteri sebelumnya. Pada hari ke-

21 dan ke-28 pencuplikan, isolat bakteri yang tumbuh merupakan jenis bakteri

yang terisolasi pada hari-hari sebelumnya. Isolat bakteri yang terisolasi namun

hanya terisolasi pada satu kali pencuplikan seperti isolat 2N, 32N, 34N, 41N, 43N

dan 46N, disebabkan oleh ketidakmampuan bakteri tersebut untuk bersaing dan

memanfaatkan sumber sulfur dan karbon yang berasal dari pengayaan DBT dan

batubara.

Gambar 9.

Kemunculan isolat bakteri selama waktu pencuplikan pada metode IBDTL

33

Berdasarkan Gambar 9 terlihat bahwa jumlah sel isolat-isolat bakteri yang

diperoleh dari IBD dengan metode IBDTL lebih tinggi jika dibandingkan dengan

metode IBDL. Hal tersebut disebabkan pada IBDTL menggunakan medium

diperkaya yaitu, MSM-DBT cair yang mengandung DBT dan batubara, sehingga

populasi bakteri dapat diperbanyak karena mempunyai kesempatan untuk

berkembangbiak. Menurut Hidayat et al. (2006), isolasi mikroorganisme

menggunakan kultur cair diperkaya merupakan teknik yang berhasil

meningkatkan jumlah mikroorganisme yang diinginkan atau mengoptimalkan

pertumbuhan mikroorganisme yang lambat sehingga dapat menjadi lebih mudah

diisolasi.

Pencuplikan pada hari ke-0 terdapat 3 isolat bakteri yang terisolasi

dengan jumlah sel tertinggi dimiliki oleh isolat 10N (3x108 sel/ml) dan pada hari

ke-7 sebanyak 3 isolat yang berbeda juga berhasil terisolasi yaitu isolat 6N, 12N

dan 15N. Selanjutnya pada hari ke-14 dua isolat sebelumnya yaitu 8N dan 10N

terisolasi kembali. Tidak terisolasinya isolat 8N dan 10N pada hari ke-7

disebabkan oleh kondisi lingkungan yang tidak mendukung dan terbatasnya

nutrisi sehingga isolat bakteri tersebut mengalami masa dorman hingga tercipta

kondisi lingkungan yang mendukung untuk kehidupannya yaitu pada waktu

pencuplikan hari ke-14. Usaha mengamankan diri dari kondisi buruk lingkungan

menyebabkan bakteri membentuk spora terutama pada bakteri berbentuk batang

(Dwidjoseputro, 2005). Pencuplikan pada hari ke-21 terisolasi 2 isolat baru yang

muncul yaitu 40N dan 50N. Pencuplikan pada hari ke-28 isolat bakteri yang

tumbuh merupakan jenis isolat bakteri yang sudah terisolasi sebelumnya.

34

Kemunculan sebagian besar isolat bakteri yang terisolasi pada IBDTL cenderung

relatif lebih stabil. Hal ini ditandai dengan konsistennya kemunculan sebagian

besar isolat bakteri selama waktu pencuplikan.

4.2. Hasil Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Agar

Dua puluh dua isolat bakteri desulfurisasi yang diperoleh dari IBDL

maupun IBDTL diuji lanjut pada medium MSM-DBT agar. Seleksi pada medium

MSM-DBT agar hanya dilakukan pada isolat bakteri desulfurisasi yang telah

diperoleh. Hal ini disebabkan isolat bakteri tersebut diduga memiliki kemampuan

desulfurisasi DBT. Seleksi ini bertujuan untuk memperoleh bakteri yang memiliki

kemampuan potensial untuk mendegradasi DBT. Hasil seleksi menunjukkan

bahwa dari 22 isolat bakteri desulfurisasi, 15 isolat bakteri tumbuh pada medium

MSM-DBT agar sedangkan 7 isolat bakteri lainnya tidak dapat tumbuh (Tabel 3).

Tujuh isolat bakteri yang tidak tumbuh pada medium seleksi MSM-DBT

agar, pada saat proses isolasi tumbuh dengan baik. Hal ini diduga isolat bakteri

tersebut bersinergi dengan bakteri lain yang tumbuh saat isolasi. Sinergisme

adalah kehidupan bersama yang menyebabkan terjadinya suatu kemampuan untuk

melakukan perubahan kimia tertentu dalam substrat atau medium (Suharni et al.,

2007). Selain itu, beberapa isolat bakteri tersebut terisolasi dengan IBDL sehingga

kurang teradaptasi dengan DBT dan batubara yang terkandung dalam medium

MSM-DBT agar, seperti isolat 1N, 2N, 21N dan 46N.

35

Tabel 3. Hasil uji seleksi isolat bakteri desulfurisasi pada medium MSM-DBT agar

Keterangan : - : Koloni tidak tumbuh + : Koloni tumbuh sangat sedikit (< 50) + + : Koloni tumbuh sedikit (50-150) + + + : Koloni tumbuh banyak (151-300) + + + + : Koloni tumbuh sangat banyak (>300)

Isolat bakteri yang mengalami pertumbuhan pada medium MSM-DBT agar

sebagian besar adalah isolat bakteri yang terisolasi dengan IBDTL sehingga sudah

teradaptasi lebih baik dengan DBT dan batubara yang terkandung dalam medium

MSM-DBT agar. Isolat bakteri yang tumbuh pada medium MSM-DBT agar

memiliki kemampuan untuk mendegradasi DBT. Hal ini disebabkan

mikroorganisme yang dapat mendegradasi DBT memiliki 4 enzim yang bereaksi

pada jalur 4S, yaitu enzim DszA, DszB, DszC dan DszD. Enzim DszC dan DszD

No Kode Isolat Pertumbuhan 1 1N - 2 2N - 3 6N - 4 7N + + + 5 8N - 6 10N - 7 12N + + + 8 14N + + + 9 15N + + + +

10 21N - 11 26N + + + + 12 32N + + + 13 33N + + + 14 34N + + + + 15 40N + + + 16 41N + + + 17 42N + + 18 43N + 19 46N - 20 47N + + + 21 49N + + + 22 50N + + +

36

dapat mengoksidasi DBT menjadi DBT-sulfoxide dan DBT-sulfone, kemudian

enzim DszA dan DszD mengubahnya menjadi HBP-sulfonat dan selanjutnya

enzim DszB mengubahnya kembali menjadi HBP dan sulfit. Pada proses

selanjutnya sulfit akan teroksidasi menjadi sulfat (Kevin et al., 1996).

Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa setiap isolat bakteri yang tumbuh pada

medium MSM-DBT agar mengalami pertumbuhan yang berbeda-beda. Isolat

15N, 26N dan 34N mempunyai pertumbuhan yang lebih tinggi dibandingkan

dengan isolat bakteri lainnya. Isolat bakteri yang mempunyai pertumbuhan paling

tinggi diindikasikan mempunyai kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi

DBT. Oleh karena itu, ketiga isolat tersebut kemudian dipilih untuk diuji lanjut

pada tahap seleksi berikutnya yaitu seleksi pada medium MSM-DBT cair.

4.3. Hasil Seleksi Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Cair

Tiga isolat bakteri yang mempunyai pertumbuhan paling tinggi pada

medium MSM-DBT agar yaitu, isolat 15N, 26N dan 34N diseleksi lebih lanjut

pada medium MSM-DBT cair. Seleksi pada tahap ini dilakukan dengan

mengamati beberapa parameter selama bakteri tumbuh pada medium tersebut.

Parameter yang diamati adalah pertumbuhan bakteri, perubahan pH medium dan

desulfurisasi DBT.

4.3.1. Pertumbuhan Bakteri

Jumlah sel bakteri per unit waktu (jam) digambarkan dalam bentuk kurva

pertumbuhan. Berdasarkan hasil analisis varian multivariate (MANOVA) pada

37

0123456

789

10

0 4 8 12 16 20 24

Log

jum

lah

sel/

ml

Waktu (Jam)

Kontrol

15 N

26 N

34 N

taraf nyata 95%, pertumbuhan sel ketiga isolat berbeda nyata diantara waktu-

waktu yang berbeda (Lampiran 9). Hal ini dapat terlihat jelas pada setiap kurva

pertumbuhan masing-masing isolat yang berbeda-beda (Gambar 10).

Nilai pertumbuhan bakteri selama proses fermentasi pada semua isolat

bakteri berfluktuasi berkisar antara 104 hingga 1,7x109 sel/ml. Pola pertumbuhan

dari ketiga isolat bakteri hampir sama satu dengan yang lainnya, yang

membedakan hanya pada fase adaptasi yang hanya dialami oleh isolat 34N pada

jam ke-4 ditandai dengan pertumbuhan sel yang menurun. Hal ini disebabkan

pada fase ini mikroorganisme masih beradaptasi dengan lingkungannya sehingga

belum terjadi pertumbuhan mikroba secara signifikan (Pumphrey, 1996).

Selanjutnya ketiga isolat mengalami fase eksponensial yang ditandai

dengan meningkatnya jumlah sel bakteri hingga jam ke-16, namun fase

eksponensial isolat 26N berakhir lebih awal dibandingkan dengan dua isolat

Gambar 10. Pertumbuhan sel isolat bakteri terseleksi dalam media MSM-DBT cair diinkubasi pada suhu ruang dan agitasi 120 rpm

38

lainnya yaitu pada jam ke-12. Selain itu, pertumbuhan sel pada isolat 26N juga

lebih rendah dibandingkan dengan isolat lainnya. Berdasarkan hasil uji Duncan

pertumbuhan sel pada isolat 15N lebih tinggi secara nyata dibandingkan dengan

pertumbuhan sel pada kedua isolat lainnya (Lampiran 9). Hal ini disebabkan isolat

15N memiliki rata-rata jumlah sel tertinggi (5,1x108 sel/ml). Meningkatnya

jumlah sel setiap isolat pada fase eksponensial menandakan adanya degradasi

DBT dan batubara yang dilakukan oleh isolat bakteri untuk memperoleh sumber

sulfur dan karbon (Labana et al., 2004).

Pada jam ke-20 pada isolat 15N dan 34N dan jam ke-16 pada isolat 26N,

populasi memasuki akhir dari fase stasioner. Pada fase ini peningkatan biomassa

terjadi secara konstan, meskipun komposisi sel mungkin mengalami perubahan

(Pumphrey, 1996). Akhirnya ketiga isolat bakteri tersebut mengalami penurunan

jumlah sel hingga jam ke-24. Berkurangnya jumlah sel dapat disebabkan nutrisi

yang telah habis dan terbentuknya senyawa yang bersifat toksik bagi sel

(Pumphrey, 1996).

4.3.2. pH Medium

pH medium pada semua isolat menunjukkan terjadinya perubahan selama

inkubasi hingga jam ke-24 (Gambar 11). Berdasarkan hasil analisis varian

multivariate (MANOVA) pada taraf nyata 95%, perubahan pH medium pada

ketiga isolat bakteri berbeda nyata diantara waktu-waktu yang berbeda (Lampiran

9). Nilai pH medium selama proses fermentasi pada semua isolat bakteri

berfluktuasi berkisar antara 5,21 hingga 6,17.

39

Nilai pH awal medium fermentasi pada ketiga isolat menunjukkan nilai pH

berkisar antara 5,9 hingga 6,17 dan setelah itu mengalami penurunan hingga jam

ke-16. Penurunan pH pada medium disebabkan terjadinya proses desulfurisasi

yaitu pelarutan sulfur ke dalam media cair dalam bentuk ion sulfat (SO42-)

sehingga terbentuk asam sulfat (Hammel, 1996). Sulfat yang terbentuk diduga

merupakan hasil akhir degradasi DBT dan batubara pada medium yang dilakukan

oleh isolat bakteri. Berdasarkan jalur 4S, DBT akan dioksidasi oleh bakteri

menjadi DBT sulfone, 2-hydroxydiphenyl atau 2,2-biphenol dan sulfat (Kevin et

al., 1996). Berdasarkan hasil uji Duncan, perubahan pH medium yang ditumbuhi

isolat 26N lebih kecil secara nyata dibandingkan dengan medium yang ditumbuhi

oleh isolat-solat lainnya (Lampiran 9). pH medium pada isolat 26N lebih tinggi

dibandingkan dengan pH medium pada kedua isolat lainnya disebabkan

Gambar 11. Nilai pH medium isolat bakteri terseleksi dalam media MSM-DBT cair diinkubasi pada suhu ruang dan agitasi 120 rpm

5

5.2

5.4

5.6

5.8

6

6.2

6.4

0 4 8 12 16 20 24

pH M

ediu

m

Waktu (Jam)

Kontrol

I5 N

26 N

34 N

40

pertumbuhan sel yang tidak terlalu tinggi (Gambar 10) dan degradasi DBT lebih

sedikit (Gambar 12).

Setelah pencuplikan jam ke-16 terjadi kenaikan pH pada ketiga isolat

hingga akhir masa inkubasi (jam ke-24). Nilai pH yang meningkat disebabkan

lisisnya sel di dalam media kultur akibat mulai terbentuknya zat sisa metabolit

yang bersifat racun untuk sel. Sel yang mati di dalam media, kemudian

terdeaminasi kembali sebagai sumber nitrogen untuk metabolisme mikroba yang

masih bertahan sehingga terjadi efek buffering (Kirk, 1993). Hal ini didukung

dengan penurunan jumlah sel ketiga isolat bakteri pada waktu pencuplikan yang

sama (Gambar 10).

4.3.3. Desulfurisasi DBT

Nilai absorbansi sulfat pada semua isolat menunjukkan terjadinya

perubahan selama inkubasi hingga jam ke-24 (Gambar 12). Berdasarkan hasil

analisis varian multivariate (MANOVA) pada taraf nyata 95%, perubahan nilai

absorbansi sulfat pada ketiga isolat berbeda nyata diantara waktu-waktu

pengukuran yang berbeda. Kemampuan desulfurisasi DBT pada setiap isolat

bakteri dilakukan dengan cara mengukur sulfat yang terbentuk pada medium

fermentasi. Hal ini disebabkan hasil akhir proses desulfurisasi DBT yang

dilakukan oleh bakteri dengan jalur 4S adalah sulfat (Wang et al., 2004), dengan

demikian kandungan sulfat dapat dijadikan indikator terjadinya proses

desulfurisasi DBT.

41

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 4 8 12 16 20 24

Nila

i Abs

orba

nsi (

460

nm)

Waktu (Jam)

Kontrol

15 N

26 N

34 N

Nilai absorbansi sulfat pada ketiga isolat berfluktuasi antara 0,127 hingga

1,065. Nilai absorbansi sulfat pada ketiga isolat mengalami kenaikan pada awal

inkubasi dan selanjutnya mengalami penurunan. Isolat 26N dan 34N mengalami

kenaikan nilai absorbansi sulfat hingga jam ke-12, namun kenaikan nilai

absorbansi sulfat pada isolat 26N tidak signifikan. Sedangkan untuk isolat 15N

kenaikan nilai absorbansi sulfat terjadi hingga jam ke-16.

Berdasarkan hasil uji Duncan nilai absorbansi sulfat pada isolat 15N lebih

besar secara nyata dengan kedua isolat lainnya (Lampiran 9). Hal ini disebabkan

rata-rata absorbansi sulfat pada isolat 15N paling tinggi yaitu sebesar 0,559.

Tingginya nilai absorbansi sulfat pada isolat 15N karena tingginya degradasi DBT

pada medium. Hal ini diperkuat dengan tingginya pertumbuhan sel (Gambar 10)

dan penurunan pH (Gambar 11) yang signifikan pada isolat 15N. Menurut Young

Gambar 12. Nilai absorbansi sulfat isolat bakteri terseleksi dalam media MSM-DBT cair diinkubasi pada suhu ruang dan agitasi 120 rpm

42

et al. (2005) semakin tinggi kadar sulfat pada medium mengindikasikan bahwa

semakin tinggi pula degradasi DBT yang dilakukan oleh bakteri.

Penurunan nilai absorbansi sulfat pada isolat 26N dan 34N terjadi lebih

cepat yaitu pada jam ke-16, sedangkan isolat 15N baru mengalami penurunan

nilai absorbansi sulfat pada jam ke-20. Penurunan nilai absorbansi sulfat diartikan

dengan berkurangnya degradasi DBT dan menurunnya jumlah sel pada setiap

isolat (Gambar 10).

4.4. Hasil Pengukuran DBT

Kemampuan desulfurisasi DBT pada isolat terseleksi, yaitu isolat 15N

diketahui dengan melakukan pengukuran kadar DBT pada medium fermentasi

selama fase eksponensial menggunakan UV-Vis Spectrophotometer. Pengukuran

kadar DBT hanya dilakukan pada isolat 15N karena nilai absorbansi sulfat pada

isolat 15N paling tinggi dibandingkan dengan kedua isolat lainnya, serta didukung

oleh pertumbuhan sel dan perubahan pH medium yang paling tinggi pula.

Berdasarkan hasil pengukuran kadar DBT pada isolat 15N terlihat bahwa

terjadi penurunan kadar DBT pada saat inkubasi selama fase eksponensial

(Gambar 13). Pada awal jam ke-0 kadar DBT yang terkandung dalam medium

adalah 0,001033 mM dan pada akhir fase eksponensial (jam ke-16) kadar DBT

turun menjadi 0,001001 mM. Jadi, penurunan kadar DBT pada isolat 15N pada

saat inkubasi selama fase eksponensial adalah 0,000032 mM yang setara dengan

3% dari jumlah DBT awal. Penurunan kadar DBT ini sangat kecil, jika

dibandingkan dengan kemampuan desulfurisasi DBT bakteri lain yang telah

43

diteliti. Menurut penelitian yang dilakukan Izumi et al. (1993), Rhodococcus

erythropolis D-1 mampu mendegradasi DBT sebesar 7 mM selama 70 jam. Selain

itu diketahui pula Rhodococcus erythropolis IGTS8 dapat menghilangkan 55,2 %

sulfat, 20 % pirit, 23,5 % sulfur organik dan 30,2 % sulfur total dari batubara

lignit dalam waktu 96 jam (Bodzemir et al.,1996).

Rendahnya pengurangan kadar DBT pada isolat 15N diduga karena

pertumbuhan yang terbatas. Hal ini diduga karena keterbatasan jumlah sumber

nutrisi yang terdapat pada medium MSM-DBT cair yang digunakan, sehingga

pada saat sumber nutrisi tersebut pada medium berkurang maka pertumbuhannya

akan mengalami penurunan (Maghsoudi et al., 2000).

Gambar 13. Analisis hasil desulfurisasi DBT isolat 15N selama fase eksponensial dengan menggunakan UV-Vis Spectrophotometer

0.000995

0.001000

0.001005

0.001010

0.001015

0.001020

0.001025

0.001030

0.001035

0.001040

0 4 8 12 16

Kons

entr

asi D

BT (m

M)

Waktu (Jam)

44

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

1. Dua puluh dua isolat bakteri desulfurisasi berhasil diisolasi dari tanah

pertambangan batubara asal Sumatera Selatan dengan pengayaan DBT dan

batubara.

2. Isolat 15N memiliki kemampuan tertinggi mendegradasi DBT dengan

penurunan kadar DBT pada saat inkubasi selama fase eksponensial sebesar

0,000032 mM yang setara dengan 3% dari jumlah DBT awal.

5.2. Saran

Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut dalam hal nutrisi untuk

mengoptimalkan pertumbuhan isolat-isolat bakteri yang potensial hasil seleksi.

Isolat-isolat bakteri yang potensial tersebut perlu diidentifikasi dan selanjutnya

dilakukan pengaplikasian langsung pada batubara.

45

DAFTAR PUSTAKA

Bozdemir, T.O., T. Durusoy., E. Erincin & Y. Yurum. 1996. Biodesulfurization of Turkish lignites 1. Optimization of the growth parameters of Rhodococcus rhodochrous, a sulfur-removing bacterium. Fuel. 75(3): 1596-1600.

Bressler, D.C. & P.M. Fedorak. 2001. Identification of disulfides from the

biodegradation of dibenzothiophene. Appl. Environ. Microbiol. 67: 5084–5093.

Brock, T.D & M.T. Madigan. 1991. Biology of Microorganisms, 6th Edition.

Prentice-Hall International Inc. USA. Burlage, R.S., R. Atlas, D. Stahl., G. Geesey & G. Sayler (Eds.). 1998.

Techniques in Microbial Ecology. Oxford University Press. New York. Calkins, W.H. 1994. The chemical forms of sulfur in coal. A review Fuel. 73(4):

475-484. Casida Jr., L.E. 2001. Industrial Microbiology. New Age Int. Ltd. Pub. New

Delhi. Constanti, M., J. Giralt & A. Bordons. 1994. Desulphurization of

dibenzothiophene by bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 10: 510-516.

Davis, K.E.R., Joseph, S.J., & Janssen, P.H. 2005. Effects of growth medium,

inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 71: 826-834.

Dick, W.A. 1992. Sulfur Cycle dalam Encyclopedia of Microbiology. 4.

Academic Press Inc. USA. Dwidjoseputro. 2005. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. ESDM. 2009. Hand Book of Energy and Economic Statistics of Indonesia 2009.

http://www.esdm.org. Diakses pada tanggal 14 Febuari 2011, pk 20.15 WIB. Gallagher, J.R., E.S. Olson & D.C. Stanley. 1993. Microbial desulfurization of

dibenzothiophene : A sulfur-specific pathway. Journal FEMS Microbiology Letters. 107: 31-36.

46

Gilbert, S.C., J. Morton., S. Buchanan., C. Oldfield & A. McRoberts. 1998. Isolation of a unique benzothiophene desulphurizing bacterium, Gordona sp. strain 213E (NCIMB 40816) and characterization of the desulphurization pathway. Journal Microbiology. 144: 2545-2553.

Grossman, M.J., M.K. Lee., R.C. Prince., K.K. Garrett., G.N. George & I.J.

Pickering. 1999. Microbial desulfurization of a crude oil middledistillate fraction: Analysis of the extent of sulfur removal and the effect of removal on remaining sulfur. Appl. and Environ. Microbiol. 65(1): 181-188.

Hammel, K.E. 1996. Extracelluler free radicalbiochemistry of ligninolytic fungi.

New Journal Chem. 20: 195-198. Hidayat, M., M. C. Padaga & S. Suhartini. 2006. Mikrobiologi Industri. Andi.

Yogyakarta. Holt, J.G., N.R. Krieg., P.A.H. Sneath., J.T. Staley & S.T. Williams. 1994.

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition. Williams and Wilkins. Baltimore.

Izumi, Y., T. Ohshiro., H. Ogino., Y. Hine & M. Shimao. 1994. Selective

desulfurization of dibenzothiophene by Rhodococcus erythropolis D-1. Journal Appl. Environ. Microbiol. 60(1): 223-226.

Kayser, K.J., B.A. Bielaga-Jones., K. Jackowski., O. Odusan & J.J. Kilbane 1993.

Utilization of organosulphur compounds by axenic and mixed cultures of Rhodococcus rhodochrous IGTS8. Journal of General Microbiology. 139: 3123-3129.

Kevin, A.G., O.S. Progrebinsky., G.T. Mrachko., L. Xi., D.J. Monticello & C. H.

Squires. 1996. Molecular mechanisms of biocatalytic desulfurization of fossil fuels. Journal Nature Biotechnology. 14.

Kirimura, K., T. Furuya, Y. Nishi & Y. Ishii. 2001. Biodesulfurization of

dibenzothiophene and its derivatives through the selective cleavage of carbon-sulfur bonds by a moderately thermophilic bacterium Bacillus subtilis WU-S2B. Journal of Bioscience and Bioengineering. 91(3): 262-266.

Klein, J., M. Van Afferden., F. Pfeifer & S. Schacht. 1994. Microbial

desulfurization of coal and oil. Fuel Processing Technology. 40(2-3): 297-310.

47

Koizumi, J. 1984. Genetically Engineered Microorganism Exploitation for Bioleaching of Coal : Countermeasure to Acid Rain dalam Murooka, Y dan T. Imanaka (Eds). 1994. Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Application.

Kirk, T.K., S. Croan, M. Tien, K.E. Murtagh & R.L. Farrell. 1986. Production of

Multiple ligninases by Phanerochaete chrysosporium: effect of selected growth conditions and use of mutant strain. Enzyme Microb. Technol. 8:27–32.

Labana, S., G. Pandey & R.K. Jain. 2005. Desulphurization of dibenzothiophene

and diesel oils by bacteria. Letters in Applied Microbiology. 40: 159-163. Maghsoudi, S., A. Kheirolomoom., M. Vossoughi., E. Tanaka & S. Katoh. 2000.

Selective desulfurization of dibenzothiophene by newly isolated Corynebacterium sp stain P32C1. Biochemical Engineering Journal. 5: 11-16.

Mohebali. G., A.S. Ball., B. Raseks & A. Kaytash. 2006. Biodesulfurization

potential of a newly isolated bacterium, Gordonia alkanivorans RIPI90A. Enzyme and Microbial Technology. 40: 578–584.

Monticello, D.J. 1998. Riding the fossil fuel biodesulfurization wave. Chemtech.

28(7): 38-45. Nekodzuka, S., T.N. Kambe., N. Nomura., J. Lu & T. Nakahara. 1997. Specific

desulfurization of dibenzothiophene by Mycobacterium sp. Strain G3. Biocatalysis and Biotransformation. 15(1): 17-27.

Oda, S & H. Otha. 2002. Biodesulfurization of dibenzhothiophene with

Rhodococcus erytropolis ATCC 53968 and its mutant in an interface bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering. 94(5): 474-477.

Ohshiro, T., T. Hirata & Y. Izumi. 1996. Desulfurization of dibenzothiophene

derivatives by whole cells of Rhodococcus erythropolis H-2. FEMS Microbiology Letters. 142(1): 65-70.

Omori, T., Y. Saiki., K. Kasuga & K. Kodama. 1995. Desulfurization of alkyl and

aromatic sulfides and sulfonates by dibenzothiophene desulphurising Rhodococcus sp. strain SY1. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 59: 1195-1198.

Pelczar, M.J. & E.C.S. Chan. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.

48

Prayuenyong, P. 2002. Coal biodesulfurization processes. Songklanakarin Journal Science Technol. 24(3): 493-507.

Pumphrey, B. 1996. Fermentation Basics. http://www.biocompare.com. Diakses

pada tanggal 21 Juli 2011,pk 20.15 WIB. Rhee, S.K., J. Chang., Y.K. Chang & H.N. Chang. 1998. Desulfurization of

dibenzothiophene and diesel oils by a newly isolated Gordona strain CYKS1. Journal Applied and Environmental Microbiology. 64(6): 2327-2331.

Shennan, J.L. 1996. Microbial attack on sulphur containing hydrocarbons:

Implication for the biodesulphurisation of oils and coals. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 67(2): 109-123.

Speight, J. G. 1994. The Chemistry and Technology of Coal, 2nd edition. Marcel

Dekker Inc. New York. Suharni, T.T., Nastiti, S.J. & Soetarto A.E.S. 2008. Mikrobiologi Umum.

Universitas Atma Jaya. Yogyakarta. Takashi, O. & Y. Izumi. 1999. Microbial desulfurization of organic sulfur

compounds in petroleum, Biosci. Journal Biotechnol. Biochem. 63(1): 1-9. Tanaka, S. 1999. Bulletin of The Japan Institute of Energy. Japan. Hal : 786-789. Wang, M., L. Wei., W. Da-hui & S. Yao. 2004. Desulfurization of

dibenzothiophene by a newly isolated Corynebacterium. sp ZD-1 in aqueos phase. Journal of Environmetal Sciences. 16(6): 1011-1015.

Wise, W. 1981. Coal, Water, Fuel Technology. Workshop US Dept. Energy.

Pittsburgh. ETCtr-Report-NO. BNL 51427. Young, R.F., S.M. Cheng & P.M. Fedorak. 2006. Aerobic biodegradation of 2,2’-

dithiodibenzoic acid produced from dibenzothiophene metabolites. Journal Appl. and Environ. Microbiol. 72(1): 491-496.

Zhongxuan, G., L. Huizhou., L. Mingfang., L. Shan., X. Jianmin & C. Jiayong.

2002. Isolation and identification of nondestructive desulfurization bacterium. Journal Science in China (Series B). 45(25).

51

1N

2N

3N

4N

5N 8N

7N

6N

13N

9N

10N

12N

16N

26N

25N

27N

28N 32N

21N

Lampiran 3. Contoh Morfologi Koloni Isolat-Isolat Bakteri Hasil Isolasi Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan (tumbuh pada medium TSA)

15N

14N 11N

52

33N

34N

36N

40N

39N

37N

41N

50N

49N

42N

46N

43N

53

Lampiran 4. Hasil Pewarnaan Gram Isolat-Isolat Bakteri Hasil Isolasi Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan

1 N (Gram Positif)

2 N (Gram Positif)

3 N (Gram Negatif)

4 N (Gram Negatif)

5 N (Gram Negatif)

6 N (Gram Negatif)

7 N (Gram Negatif)

8 N (Gram Negatif)

9 N (Gram Negatif)

10 N (Gram Positif)

11 N (Gram Positif)

12 N (Gram Negatif)

54

13 N (Gram Negatif)

14 N (Gram Negatif)

15 N (Gram Negatif)

16 N (Gram Negatif)

21 N (Gram Negatif)

25 N (Gram Positif)

26 N (Gram Negatif)

27 N (Gram Positif)

28 N (Gram Negatif)

32 N (Gram Negatif)

33 N (Gram Negatif)

34 N (Gram Negatif)

55

36 N (Gram Positif)

37 N (Gram Negatif)

39 N (Gram Positif)

40 N (Gram Negatif)

41 N (Gram Positif)

42 N (Gram Positif)

43 N (Gram Negatif)

46 N (Gram Positif)

49 N (Gram Positif)

50 N (Gram Negatif)

56

Lampiran 5. Hasil Uji Seleksi Isolat Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Agar

1N dan 2N 6 N dan 7 N

8 N dan 10 N 12 N dan 14 N

15 N dan 21 N 26 N dan 32N

57

33 N dan 34 N 40 N dan 41 N

42 N dan 43 N 46 N dan 47 N

49N dan 50 N

58

Lampiran 6. Hasil Uji Seleksi Isolat Bakteri Desulfurisasi pada Medium MSM-DBT Cair

No Isolat Bakteri Jam ke-

Log rata-rata jumlah sel/ml

Rata-rata pH

Rata-rata Nilai

Absorbansi Sulfat

1 Isolat 15 N 0 5,438 5,9 0,132 4 6,182 5,95 0,355 8 7,422 5,84 0,42

12 8,380 5,56 0,452 16 9,241 5,27 1,065 20 9,182 5,48 0,748 24 8,000 5,51 0,742

2 Isolat 26 N 0 4,033 5,94 0,127 4 5,461 5,96 0,179 8 6,288 5,94 0,241

12 6,716 5,96 0,233 16 6,623 5,87 0,186 20 5,400 5,9 0,111 24 4,300 5,89 0,223

3 Isolat 34 N 0 5,310 6,05 0,152 4 4,895 6,04 0,292 8 7,447 5,98 0,332

12 8,322 5,67 0,881 16 8,447 5,21 0,565 20 8,200 5,61 0,211 24 6,700 5,67 0,279

4 Kontrol 0 0 6,17 0,122 4 0 6,15 0,145 8 0 6,12 0,149

12 0 6,12 0,169 16 0 6,1 0,163 20 0 6,09 0,138 24 0 6,08 0,187

59

Lampiran 7. Analisis Hasil Desulfurisasi DBT Isolat 15N dengan

Menggunakan UV-Vis Spectrophotometer

Jam Ke- Nilai Absorbansi DBT

0 1,6721

4 0,9786

8 0,6955

12 0,2837

16 0,0690

60

Lampiran 8. Kurva Standar DBT

Gambar 1. Kurva standar DBT

Konsentrasi (%) Nilai Absorbansi DBT

0 0,0021

100 0,0032

200 0,0051

300 0,0073

400 0,0091

500 0,0112

600 0,0133

700 0,0145

61

Lampiran 9. Output SPSS 16. MANOVA dan Duncan

MANOVA

Source Dependent Variable

Type III Sum of Squares

df Mean Square F Sig.

Corrected Model

Sulfat 0,662 3 0,221 4,639 0,015

pH 0,677 3 0,226 6,987 0,003

Pertumbuhan 26,507 3 80836 6,565 0,004

Intercept Sulfat 0,161 1 0,161 3,392 0,083

pH 153,585 1 153,585 4,756 0,000

Pertumbuhan 123,095 1 123,095 91,457 0,000

Waktu Sulfat 0,173 1 0,173 3,633 0,034

pH 0,399 1 0,399 12,359 0,003

Pertumbuhan 9,534 1 9,534 7,083 0,016

Isolat Sulfat 0,489 2 0,245 5,142 0,018

pH 0,278 2 0,139 4,301 0,031

Pertumbuhan 16,973 2 8,487 6,305 0,009

Error Sulfat 0,809 17 0,048

pH 0,549 17 0,032

Pertumbuhan 22,881 17 1,346

Total Sulfat 4,462 21

pH 700,723 21

Pertumbuhan 1009,402 21

Corrected Total Sulfat 1,470 20

pH 1,226 20

Pertumbuhan 49,388 20

62

Uji Duncan (Pertumbuhan Sel) Uji Duncan (pH)

Uji Duncan (Absorbansi Sulfat)

Isolat N

alpha = 0,05

1 26N 7 0,1857 34N 7 0,3874 15N 7 Sig 0,123

Isolat N

alpha = 0,05

1 26N 7 5,5459 34N 7 7,0459 15N 7 Sig 0,051

Isolat N

alpha = 0,05

1 15N 7 5,6443 34N 7 5,7471 26N 7 Sig 0,413

49

Lampiran 1. Komposisi Media Medium Minimal Salts Medium (MSM)

Bahan Jumlah Gliserol NaH2PO4.H2O K2HPO4.3H2O NH4Cl MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O FeCl3.6H2O Aquades

2 g 4 g 4 g 2 g

0,2 g 0,001 g 0,001 g 1 liter

Medium Minimal Salts Medium-DBT (MSM-DBT) cair

Bahan Jumlah Gliserol NaH2PO4.H2O K2HPO4.3H2O NH4Cl MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O FeCl3.6H2O Aquades Batubara Dibenzothiophene (DBT)

2 g 4 g 4 g 2 g

0,2 g 0,001 g 0,001 g 1 liter

10% dari volume total (100 g) 0,1% dari volume total (1 g)

Medium Minimal Salts Medium-DBT (MSM-DBT) agar

Bahan Jumlah Gliserol NaH2PO4.H2O K2HPO4.3H2O NH4Cl MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O FeCl3.6H2O Aquades Batubara Dibenzothiophene (DBT) Agar

2 g 4 g 4 g 2 g

0,2 g 0,001 g 0,001 g 1 liter

10% dari volume total (100 g) 0,1% dari volume total (1 g)

1,5% dari volume total (15 g) Medium Trypticase Soy Agar (TSA)

Bahan Jumlah Pepton Soyton NaCl Dekstrosa K2HPO4 Agar Aquades

15 g 5 g 5 g

2,5 g 2,5 g 15 g

1 liter

50

50

Lampiran 2. Kehadiran Isolat-Isolat Bakteri Hasil Isolasi Tanah Pertambangan Batubara Asal Sumatera Selatan dengan Pengayaan DBT dan Batubara

PERLAKUAN HARI KODE ISOLAT

1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 9N 10N 11N 12N 13N 14N 15N 16N 21N 25N 26N 27N 28N 32N 33N 34N 36N 37N 39N 40N 41N 42N 43N 46N 49N 50N

IBT Sebelum* √ √ √ √ √ √ √

0 √ √ √ √ √ √ √ √ √

7 √ √ √

14 √ √ √ √ √ √ √

21 √ √

28 √ √ √ √

IBDL 0 √ √ √ √ √ √ √ √ √

7 √ √

14 √ √ √ √ √ √ √ √

21 √ √ √ √ √ √

28 √ √ √ √

IBDTL 0 √ √ √

7 √ √ √ √

14 √ √ √ √ √ √ √ √

21 √ √ √ √

28 √ √ √ √ √

TOTAL 3 2 1 1 1 2 3 12 2 10 1 3 1 3 5 1 5 1 6 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1

Keterangan : Sebelum* = IBT sebelum pengayaan DBT dan batubara pada sumber isolat IBT = Isolasi Bakteri Total IBDL = Isolasi Bakteri Desulfurisasi Langsung IBDTL = Isolasi Bakteri Desulfurisasi Tidak Langsung

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI DESULFURISASI DARI TANAH...

Documents

Transcript of ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI DESULFURISASI DARI TANAH...