ISOLASI DAN PENAPISAN SITOTOKSISITAS KAPANGENDOFIT TANAMAN OBAT DARI KABUPATEN LOMBOK TIMUR

ISOLATION AND SCREENING CYTOTOXICITY OF ENDOPHYTICFUNGI ISOLATED FROM MEDICINAL PLANT ORIGINATED

FROM EAST LOMBOK.

ABSTRAKTelah dilakukan isolasi kapang endofit dari tanaman obat yang diambil

dari kabupaten Lombok Timur, propinsi Nusa Tenggara Barat. Hasil isolasi

menggunakan metode sterilisasi permukaan dan media Corn meal malt extract

agar menghasilkan 75 isolat kapang endofit yang terdiri dari 57 isolat dari

sampel daun dan 18 isolat dari sampel batang yang berasal dari 34 jenis

tanaman obat. Hasil isolasi menunjukkan tingkat kolonisasi kapang pada daun

mencapai 70 % dari total sampel, sedangkan tingkat kolonisasi pada batang

hanya 32 % dari total sampel. Dari 75 isolat kapang yang berhasil diisolasi telah

dilakukan penapisan sitotoksisitas terhadap 36 kapang hasil isolasi dari tanaman

obat di Lombok Timur. Semua isolat dikultivasi dalam media potato dextrose

yeast extract selama 10 hari. Kaldu kultivasi dibagi menjadi tiga, masing-masing

diekstraksi dengan butanol, etil asetat dan dikhlorometana. Ekstrak kasar yang

sudah dipekatkan diuji aktivitas sitotoksisitasnya terhadap Artemia salina dengan

menggunakan metode Brine shrimp lethality test. Penapisan pertama dengan

konsentrasi ekstrak 1000 mg/L mendapatkan 9 ekstrak aktif dari 108 ekstrak

yang diuji. Penapisan lanjutan terhadap 9 ekstrak dengan menghitung LC50

menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat dari isolate ENLT 74.3d.2 adalah ekstrak

yang menunjukkan aktivitas tertinggi dibandingkan ekstrak yang lain dengan

LC50 sebesar 30,21 mg/L. Kapang ENLT 74.3d.2 diisolasi dari tanaman Cibotium

barometz dan secara morfologi sesuai dengan deskripsi fungi Curvularia lunata.

Kata kunci : kapang endofit, tanaman obat, Cibotium barometz, Curvularia

lunata, BSLT, Artemia salina

30

ABSTRACTIsolation of endophytic fungi from medicinal plant originated from East

Lombok, West Nusa Tenggara has been conducted. Seventy five endophytic

fungi have been isolated from 34 medicinal plants that consist of 57 isolate from

leave sample and 18 isolate from stem. The isolation result showed that

colonization endopyhitic fungi in leave (70%) was higher compared to stem

(32%) from total samples. Thirty six isolates from total 75 isolates were screened

for citotoxicity. Isolates were cultivated in potato dextrose yeast extract medium

for 10 days. Fermentation broth was extracted using buthanol, ethyl acetate and

dichloromethane. Crude extracts were assayed citotoxicity activity against

Artemia salina using Brine shrimp lethality test method. First screening using

1000 mg/L concentration of crude extract showed that 9 extracts were active out

of 108 extracts assayed. Further screening for the 9 active extracts using LC50

showed that ethyl acetate extract from fungus ENLT 74.3d.2 was the most active

compared to the others with LC50 of 30,21 mg/L. Fungus ENLT 74.3d.2 was

isolated from Cibotium barometz and morphological descript as Curvularia

lunata.

Key words : endophytic fungi, pharmaceutical plant, Cibotium barometz,

Curvularia lunata, BSLT, Artemia salina

PENDAHULUANTanaman obat telah dikenal sebagai sumber metabolit sekunder yang

bersifat bioaktif. Sejak dari jaman prasejarah hingga era kimia modern sekarang

ini terbukti senyawa yang berbasis metabolit tanaman mempunyai peranan yang

sangat besar dalam bidang pengobatan. Lebih dari 50% dari senyawa kimia

baru yang didaftarkan ke Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat

sebagai senyawa anti kanker, anti migrain, dan anti alergi adalah senyawa

metabolit tanaman dan turunannya. (Cragg et al., 1999). Di Indonesia sendiri

telah ada 283 spesies tanaman yang telah diregistrasi ke Badan POM dan

digunakan dalam pengobatan tradisional (Pramono, 2002).

Penelitian ilmiah juga banyak sudah melaporkan aktivitas tanaman obat

yang selama ini digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai bioaktif

antikanker. Mengkudu hutan Morinda elliptica (Jasril et al., 2003); kepel

31

Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook (Purwantiningsih et al., 2010), sukun

Artocarpus altilis (Arung et al., 2009) adalah beberapa tanaman obat tradisional

yang sudah dibuktikan secara ilmiah mampu menghambat pertumbuhan sel

kanker.

Pemilihan tanaman sebagai sumber isolat kapang endofit menjadi faktor

yang menentukan untuk mendapatkan mikroba dan senyawa bersifat bioaktif.

Tanaman obat menurut Strobel dan Daisy (2003) adalah salah satu sumber

isolat mikroba endofit yang menjanjikan. Tanaman obat yang mempunyai

sejarah pemakaian lokal oleh penduduk setempat diyakini mempunyai metabolit

sekunder yang spesifik, dan diharapkan menjadi inang bagi kapang endofit yang

juga mampu menghasilkan metabolit yang mempunyai aktifitas spesifik. Atas

dasar pertimbangan tersebut dalam penelitian ini dipilih tanaman obat yang

sudah diketahui sejarah pemakaiannya sebagai sumber isolasi kapang endofit.

Disamping jenis tanaman, lokasi tumbuh tanaman juga mempengaruhi kapang

endofit yang diperoleh. Tanaman yang tumbuh dengan keragaman hayati tinggi

dilaporkan akan mempunyai kemungkinan lebih besar untuk menghasilkan

kapang endofit yang spesifik.

Pada bagian pertama penelitian ini, telah dilakukan eksplorasi kapang

endofit tanaman obat dari beberapa lokasi di Kabupaten Lombok Timur, yang

terletak di lereng Gunung Rinjani. Di daerah ini termasuk dalam kawasan yang

mempunyai keragaman baik flora maupun fauna yang merepresentasikan

daerah di bagian barat garis Wallacea maupun bagian timur (Rhee et al., 2004).

Oleh karena itu, Lombok merupakan area yang menarik untuk dijadikan sebagai

lokasi pengambilan contoh tanaman obat sumber untuk isolasi kapang endofit.

Sampel tanaman obat diambil berdasarkan petunjuk penduduk lokal yang

mengetahui khasiat masing-masing tanaman yang diambil sebagai sampel. Hal

ini dilakukan karena penduduk lokal yang lebih mengetahui pemanfaatan

tanaman tersebut untuk pengobatan secara lokal. Penapisan bioaktivitas

dilakukan terhadap isolat kapang yang berhasil diisolasi. Metode uji biologis

umum yang banyak digunakan untuk penapisan awal sifat sitotoksisitas suatu

senyawa adalah uji kematian larva udang laut atau brine shrimp lethality test

(BSLT). BSLT merupakan metode yang murah dan sederhana dan hasilnya

mempunyai korelasi yang positif dengan aktivitas anti tumor (McLaughlin et al.,

1998; Anderson et al., 1991). Pada bagian ini dilaporkan hasil isolasi dan.,

32

penapisan awal (prescreening) hasil isolasi kapang endofit tanaman obat dari

daerah Lombok Timur Nusa Tenggara Barat.

CARA KERJAPengambilan sampel tanaman dan isolasi kapang

Pengambilan sampel tanaman dan isolasi kapang dilakukan sesuai

dengan metode yang disampaikan dalam bab METODOLOGI PENELITIAN, sub

bab SAMPEL DAN LOKASI bagian penanganan sampel serta CARA KERJA

bagian isolasi kapang endofit.

Kultivasi isolat kapang endofit hasil isolasiKultivasi dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE

PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian kultivasi kultur vegetatif dan

kultivasi kultur produksi. Kultur produksi dilakukan dengan pada media PDY

dengan volume 200 mL di dalam Erlenmeyer 500 mL.

Ekstraksi senyawa aktif hasil kultivasi isolat kapang endofitEkstraksi dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE

PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Ekstraksi senyawa aktif. Ekstraksi

dilakukan pada tabung sentrifuse kapasitas 15 ml dengan volume kaldu kultivasi

masing-masing 6 ml. Pelarut organik yang digunakan adalah butanol, etil asetat

dan dikhlorometan.

Penapisan aktivitas biologis ekstrak pelarut organik dari isolat kapangendofitPenapisan aktivitas biologis dilakukan dengan menggunakan metode BSLT

sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA

KERJA bagian Uji aktivitas biologis dengan metode brine shrimp lethality test

(BSLT). Pada penapisan awal, aktivitas dilihat dengan menentukan prosen

kematian larva udang pada konsentrasi ekstrak 100 mgl/L. Apabila jumlah larva

A. salina yang mati lebih besar dari 90% maka ekstrak dapat dianggap aktif dan

mempunyai potensi untuk dilakukan penapisan lebih lanjut. Pada penapisan

lanjutan aktivitas ekstrak dilihat dengan menentukan median konsentrasi lethal

(LC50) dari masing-masing ekstrak aktif hasil penapisan awal. Prosen kematian

33

larva udang dihitung pada 3 konsentrasi yang berbeda, yaitu : 25, 50 dan 100

mg/L. LC50 dihitung dengan membuat grafik log konsentrasi terhadap prosen

kematian larva udang. Persamaan yang diperoleh pada grafik digunakan untuk

menentukan pada konsentrasi berapa ekstrak dapat menyebabkan kematian

larva udang sebanyak 50 %.

Identifikasi morfologi kapang aktifIdentifikasi morfologi kapang endofit dilakukan sesuai dengan cara kerja pada

bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Identifikasi morfologi

kapang

HASIL DAN PEMBAHASANIsolasi kapang endofit dari tanaman obat

Kapang endofit diisolasi dari bagian batang dan daun tanaman obat

sumber isolat. Batang dan daun disterilisasi permukaan untuk menghilangkan

mikroba yang ada pada permukaan tanaman, sehingga diharapkan mikroba

yang tumbuh pada media adalah kapang yang berada dalam jaringan tanaman.

Kapang yang di[ilih untuk dimurnikan ke dalam media PDA adalah kapang yang

tumbuh minimal setelah 2 hari inkubasi pada media CMM. Hal ini dilakukan

untuk meminimalkan kemungkinan mengisolasi kapang yang tumbuh dari

permukaan bagian tanaman.

Hasil isolasi kapang endofit dari 34 sampel tanaman obat disajikan dalam

Tabel 1. Isolasi menghasilkan total 75 kapang endofit yang terdiri dari 57 (76%)

berasal dari sampel daun dan 18 (24 %) berasal dari batang. Kolonisasi kapang

endofit berdasarkan perhitungan menurut Tomita et al., (2003) dan Khan et al.,

(2007) menunjukkan pada daun kolonisasi mencapai 70,58 %, sedangkan

kolonisasi kapang pada batang hanya 32,35 % (Lampiran 1). Radu dan Kqueen

(2002) juga melaporkan hasil bahwa kolonisasi kapang endofit di daun tanaman

obat yang disambil sampelnya dari Malaysia mencapai 90,9 %, jauh lebih besar

dibandingkan dengan tingkat kolonisasi di batangnya. Akan tetapi hasil yang

berbeda diperoleh oleh Tomita (2003) dan Sun et al (2008). Tomita melaporkan

frekuensi kolonisasi kapang endofit pada dahan tanaman obat yang diambil dari

Hokaido mencapai 73 % pada dahan dengan umur kurang dari 1 tahun, dan

mencapai 93.7-100 % pada dahan/batang yang berumur lebih dari 1 tahun.

34

Khan et al., (2007) melaporkan dari sampel daun yang diambil dari sekitar

Universitas Karachi frekuensi kolonisasinya 0%, sedangkan dari sampel batang

frekuensi kolonisasinya 2,5 %. Sun et al., (2008) melaporkan hasil isolasi

kapang endofit tanaman obat dari Kebun Raya Beijing, frekuensi kolonisasi

kapang pada daun berkisar 2-17,5 % sedangkan batang yang berumur 1 tahun

frekuensi kolonisasi berkisar 12-75%, batang berumur 3 tahun frekuensi

kolonisasinya mencapai 86-100%.

Tabel 1 Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari bagian tanaman obat

Nama Tanaman Isolasi KapangDaun Batang

Nona Makan Sirih (Clerodendromthomsonae Balf F) 1 -Belimbing Star ( Averrhoa carambola L) - -Dadap ( Erythirna subumbrans (Hask.) Merr) 1 1Jambu Biji (Psidium guajava, Linn.) 2 2Kemangi (Ocimum santumL) - -Kembang Sepatu (Hibiscus rosa-sinensis L) 1 1Tapak Dara (Catharantus roseus (L.) G. Don) - 1Patikan Kerbau (Euphorbia hirta, Linn) - 1Lengkuas (Alpinia galanga, Linn., Willd) - 2Jengger ayam (Celosia cristata ) 4 -Mengkudu (Morinda citrifolia, Linn.) 1 1Pare (Momordica charantia L) 1 1Pegagan (Centella asiatica, (Linn), Urb) 5 -Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.] Lamk) 2 -Bayam Duri (Amaranthus Spinousus, Linn.) 1 -Jarak Pagar (Jatropha curcas) 1 1Bangle (Zingiber purpureum Roxb) - 1Krokot (Portulaca leavis, Wall) - 1Bandotan (Ageratum conyzoides L.) 4 -Pakis (Cibotium barometz) 3 -Jamplung (Calophylum inophylum) - 4Kunyit (Curcuma longa Linn.) 1 -Serai (Cymbopogon nardus (L.) Rendle) 1 1Bunga Pukul Empat (Mirabilisjalapa Linn.) 4 2Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis (L) Vahl) 3 2Katu (Sauropus androgynus (L,) Merr.) 5 -Lemboke/Awar-awar (Ficus septica Burm.L) 2 -Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) 2 -Meniran (Phylanthus urinaria, Linn.) - 1Tembelekan (Lantana camara Linn.) - -Beluntas (Pluchea indica (L.) Less.) 4 2Alpukat (Persea gratissima Gaertn) 3 -Daruju (Acanthus Ilicifolius) 2 1Sangitan (Sambucus javanica Reinw) 1 -

35

Dari laporan beberapa peneliti yang menghitung frekuensi kolonisasi

kapang endofit pada tanaman obat, terlihat bahwa apabila sampel tanaman

berbatang keras (Tomita et al., 2003 dan Sun et al., 2008) maka frekuensi koloni

akan lebih besar pada batang dibandingkan dengan daun. Frekuensi koloni akan

meningkat dengan meningkatnya umur batang yang digunakan sebagai sampel.

Dalam penelitian ini kebanyakan tanaman obat yang digunakan sebagai sampel

adalah tanaman perdu, dan apabila tanaman keras diambil batang yang masih

muda. Hal ini yang dapat menjelaskan mengapa frekuensi koloni pada daun

lebih tinggi dibandingkan koloni pada batang, seperti yang dilaporkan oleh Radu

dan Kqueen (2001).

Penapisan sitotoksisitas awal dengan metode BSLTMetabolit sekunder mikroba adalah salah satu bahan alam penting sebagai

sumber bahan baku obat. Untuk dapat mengidentifikasi senyawa bioaktif yang

dihasilkan oleh mikroba perlu dilakukan penapisan. Menurut Vlietinck dan Apers

(2004) penapisan terdiri dari beberapa tahap yang terdiri dari: pra penapisan,

penapisan, pengawasan dan penapisan sekunder. Pra penapisan dilakukan

untuk mendapatkan kandidat senyawa bioaktif dengan cara cepat. Suatu

methode dapat digunakan untuk prapenapisan apabila metode tersebut dapat

dilakukan secara cepat, mudah, terpercaya, murah, sensitif dan hanya

memerlukan bahan dalam jumlah sedikit (Ghisalberti, 2008).

McLaughin et al., (1998) melaporkan bahwa metode pengujian ekstrak

terhadap larva udang yang disebut dengan brine shrimp lethality test (BSLT)

adalah metode pra penapisan untuk aktivitas antikanker. Larva Artemia salina

dianggap mewakili organism zoologis untuk uji lethalitas secara in vivo. Hasil uji

yang mereka lakukan untuk membandingkan uji letalitas terhadap A. salina dan

uji hambatan proliferasi terhadap karsinoma nasofaring menunjukkan adanya

korelasi positif dari sifat toksisitas senyawa uji terhadap kedua jenis uji.

Cash (1994) di dalam Kanwar (2007) melaporkan hasil uji komparasi

aktivitas enzim yang terdapat di dalam A. salina dan jaringan hati tikus yang

secara spesifik memecah dinukleosida tetrafosfat. Semua substrat enzim yang

berasal dari purin maupun pirimidin dinukleosida tetrafosfat ternyata

menunjukkan Vmaks dan Km yang sama, baik untuk enzim yang berasal dari A.

salina maupun hati tikus. Inhibisi oleh nukleotida terhadap enzim yang berasal

36

dari keduanya juga menunjukkan hasil yang sama. Hasil uji tersebut mendukung

hasil uji yang dilakukan oleh McLaughlin et al., (1998) untuk dapat

menggunakan A. salina sebagai uji pra screening untuk senyawa antikanker.

Tabel 2 Orientasi konsentrasi penapisan sitotoksisitas dengan metode BSLT

Kode isolat PelarutOrganik

Uji BSLT (% kematian A. salina)

1000

mg/L

100 mg/L 10 mg/LENLT 35. 3d. 2 Butanol 93.33 93.33 6.67

Etil asetat 93.33 93.33 3.33Diklorometan 93.33 13.33 13.33

ENLT 41. 5d Butanol 86.67 73.33 20.00Etil asetat 86.67 90.00 13.33Diklorometan 90.00 46.67 13.33

ENLT 35. 3d. 1 Butanol 100.00 100.00 3.33Etil asetat 100.00 100.00 20.00Diklorometan - 3.33 -

Meyer et al. (1982) melaporkan bahwa suatu ekstrak tanaman dianggap

sebagai bioaktif apabila ekstrak tersebut memiliki nilai LC50 lebih kecil atau sama

dengan 1000 mg/L, pendekatan yang sama juga dilakukan oleh Amara et al.

(2008) untuk penapisan ektrak kasar dari tanaman obat. Berdasarkan hasil yang

dilaporkan oleh Meyer et al. (1982) dan Amara et al. (2008) maka dilakukan

orientasi konsentrasi pengujian untuk ekstrak bahan aktif dari kapang endofit

dengan melihat angka mortalitas larva udang yang dikenai perlakuan ekstrak

bahan aktif kapang endofit.

Hasil orientasi konsentrasi pada Tabel 2 menunjukkan hasil yang berbeda

dengan laporan Meyer et al. (1982) dan Amara et al. (2008). Hasil uji pada

konsentrasi 1000 mg/L ternyata semua ekstrak menunjukkan tingkat kematian

larva diatas 90 %. Hasil pengujian menunjukkan bahwa pemakaian konsentrasi

ekstrak kasar pada konsentrasi 1000 mg/L tidak selektif digunakan untuk

menapis ekstrak bahan aktif dari kapang endofit. Dari hasil ini dapat ditarik

asumsi bahwa bahan aktif dari ekstrak kasar tanaman konsentrasinya lebih kecil

dibandingkan bahan aktif dalam ekstrak kasar fungi. Berdasarkan hasil tersebut

penapisan awal bioaktifitas ekstrak kapang dengan metode BSLT dilakukan

pada konsentrasi 100 mg/L.

37

Tabel 3 Hasil penapisan toksisitas metabolit sekunder kapang endofit padakonsentrasi 100 mg/L

Kode isolat Uji BSLT(% kematian )

Butanol Etil asetat DiklorometanENLT 1.3d 53.33 100.00 10.00ENLT 6.6d.1 70.00 100.00 13.33ENLT 8. 2d 13.33 100.00 43.33ENLT 6.6d.2 - 80.00 90.00ENLT 11. 4d 86.67 90.00 -ENLT 11. 5d 76.67 90.00 86.67ENLT 12. 2d. 1 3.33 26.67 33.33ENLT 12. 3d. 1 13.33 93.33 16.67ENLT 7.2d.1 13.33 100.00 13.33ENLT 12. 3d. 2 26.67 80.00 3.33ENLT 18.4d. 1 23.33 66.67 36.67ENLT 18. 4d. 2 43.34 73.34 6.67ENLT 18. 5d. 2 - 6.67 - 3.33 6.67ENLT 18. 5d. 1 73.33 66.67 63.33ENLT 23. 5d 66.67 86.67 3.33ENLT 24. 3d 76.67 86.67 13.33ENLT 35. 3d. 2 93.33 93.33 13.33ENLT 41. 5d 73.33 90.00 46.67ENLT 20.2d 53.33 73.33 16.67ENLT 35. 3d. 1 100.00 100.00 3.33ENLT 39.3d.2 90.00 20.00 3.33ENLT 40.5d 33.33 26.67 6.67ENLT 42.8d 23.33 36.67 23.33ENLT 26. 4d 66.67 96.66 6.67ENLT 47. 3d 60.00 96.67 16.67ENLT 47 5d. 1 46.67 93.33 6.67ENLT 47. 5d. 2 86.67 63.33 13.33ENLT 49. 3d. 1 30.00 80.00 0.00ENLT 74. 3d.2 10.00 100.00 13.33ENLT 101.3d 40.00 100.00 10.00ENLT 90.4d.2 40.00 26.67 6.67ENLT 62.4d 60.00 36.67 66.67ENLT 108.4d.2 60.00 100.00 0.00ENLT 107.4d -3.33 36.67 76.67ENLT 79.2d.1 -3.33 53.33 66.67ENLT 67.4d.2 10.00 50.00 73.33

Tabel 3 menunjukkan hasil penapisan bioaktivitas awal kapang endofit

pada konsentrasi 100 mg/L. Hasil penapisan menunjukkan 9 ekstrak mampu

38

menyebabkan kematian larva lebih besar dari 90% pada konsentrasi 100 mg/L.

Sembilan ekstrak yang menunjukkan bioaktivitas terdiri dari 8 ekstrak yang disari

dengan etil asetat dan 1 ekstrak yang disari dengan butanol. Hasil penapisan ini

menunjukkan bahwa sebagian besar ekstrak bioaktif adalah ekstrak yang disari

dengan etil asetat. Beberapa penelitian sebelumnya melaporkan ekstrak butanol

(Kumala, et al., 2006) dan ekstrak etil asetat (Teles, et al., 2005; Guimaraes et

al., 2010; Qin et al., 2009) dari kapang endofit bersifat bioaktif antikanker. Dari

laporan yang sudah dipublikasikan sebelumnya lebih banyak ekstrak etil asetat

yang bersifat bioaktif dibandingkan dengan ekstrak butanol.

Aktivitas biologis suatu senyawa terjadi karena adanya interaksi molekul

senyawa aktif dengan gugus fungsional dari reseptor. Interaksi antara kedua

molekul tersebut dapat berlangsung karena adanya ikatan kimia tertentu didalam

molekul senyawa aktif (Purwanto dan Susilowati, 2000). Senyawa aktif yang

tersari oleh pelarut butanol adalah senyawa-senyawa yang bersifat polar.

Senyawa polar pada umumnya mengandung ikatan ionik atau kovalen. Albert

(1985) melaporkan bahwa senyawa dengan tingkat ionisasi yang tinggi pada

umumnya mempunyai sifat bakteriostatik sehingga bersifat antibiotik.

Sedangkan Raguse et al (2002) dan Powers dan Hancock (2003) juga

melaporkan aktivitas antibakteri dari peptida-peptida yang bersifat kationik.

Penapisan sitotoksisitas ekstrak dengan penetapan LC50 menggunakanmetode BSLT

Analisis median konsentrasi letal (LC50) adalah parameter yang lebih teliti

untuk penapisan bahan alam dengan metode BSLT. Dalam analisis tersebut

akan ditetapkan konsentrasi dari masing-masing ekstrak yang mampu

menyebabkan kematian 50% larva udang yang diuji. Sembilan ekstrak yang

diperoleh dari penapisan awal, dilakukan penapisan lanjutan dengan

menetapkan LC50 dari masing-masing ekstrak.

Tabel 4 menunjukkan hasil penapisan berdasarkan LC50 dari 9 ekstrak

hasil penapisan awal. Hasil penapisan lanjutan tersebut menunjukkan bahwa

ekstrak menggunakan etil asetat dari kapang ENLT 74.3d.2 merupakan ekstrak

yang mempunyai nilai LC50 terkecil. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak

dari hasil penyarian menggunakan etil asetat dari kapang ENLT 74.3d.2

merupakan ekstrak yang paling aktif dan prospektif untuk dilakukan pemurnian

39

dan penapisan lebih lanjut. Isolat aktif ENLT 74.3d.2 didepositkan di koleksi

kultur Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT dan diberi kode BioMCC-FE00283.

Tabel 4 Hasil penapisan berdasarkan penetapan LC50

Kode isolat Pelarut LC50 (mg/L)

ENLT 6.6d.1 Etil asetat 58,74

ENLT 7.26.1 Etil asetat 66,07

ENLT 8.2d Etil asetat 110,59

ENLT 9.3d.1 Etil asetat 57,54

ENLT 35.3d.1 Butanol 77,62

ENLT 35.3d.1 Etil asetat 79,57

ENLT 74.3d.2 Etil Asetat 30,21

ENLT 101.3d Etil asetat 44,60

ENLT 108.4d.2 Etil asetat 46,47

Isolat aktif BioMCC-FE00283 adalah isolat yang diisolasi dari tanaman

pakis-pakisan (Cibotium barometz). Sampai saat ini belum ditemukan publikasi

tentang aktivitas kapang endofit yang diisolasi dari tanaman pakis. Tanaman

pakis secara tradisional digunakan untuk pengobatan reumatik dan paralisis.

Yang et al., (2007) melaporkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak umbi pakis

dengan etanol mengandung sterol, sedangkan Yuan et al., (2004) melaporkan

berhasil mengindetifikasi 12 jenis senyawa dari tanaman pakis. Kedua belas

jenis senyawa tersebut adalah asam palmitat, metil ester palmitat, asam linoleat,

asam oleat, metil ester stearat, etil ester stearat, 4′-Hidroksiasetanilid, Sukrose,C

asam lemak jenuh dengan jumlah C 27, protosatekhualdehid, β-sitosterol,

Vanillin, dan 3,4′,5,7-tetrahidroksflavon. Meskipun berhasil menidentifikasi

senyawa yang terdapat dalam C. barometz, akan tetapi mereka belum

melaporkan bioaktivitas dari masing-masing senyawa tersebut.

Identifikasi kapang aktifPengamatan dibawah mikroskop terhadap kapang BioMCC FE-00283

menunjukkan bahwa kapang tersebut mempunyai konidiofor yang tegak,

berwarna coklat, tidak bercabang dan lurus dengan panjang lebih dari 30 µm.

Sedangkan konidia berbentuk subelipsoidal yang terdiri dari 4 sekat, dimana

40

sekat kedua merupakan sekat yang paling lebar dengan dimensi 4-5 µm x 10-12

µm. Ciri-ciri morfologi kapang BioMCC FE-00283, terutama bentuk konidia yang

bersekat 4 adalah ciri spesifik dari genus Curvularia.

a b

c d

e f

g hGambar 11 Morfologi kapang BioMCC FE-00283 dibawah mikroskop dengan

perbesaran 1000 kali (a, b) dan morfologi Curvularia affininis (c), C.brachyspora (d), C. clavata (e), C. lunata (f), C pallescen (g) danC. prasadji (g) (Watanabe, 2002)

41

Perbandingan bentuk dan ukuran konidiofor dan konidia dengan spesies-

spesies genus Curvularia dan kapang BioMCC FE-00283 disajikan pada

Gambar 10. Apbila dibandingkan bentuk dan ukuran konidiofor maupun konidia,

morfologi kapang BioMCC FE-00283 paling mendekati dengan spesies C. lunata

dan C palescense, dilihat dari bentuk konidiofor yang berbeda dengan spesies

lain. Pembeda spesifik antar kedua spesies adalah panjang konidiofor, dimana C

lunata mempunyai panjang konidiofor adalah 160-300 µm sedangkan panjang

konidiofor dari C. palescense adalah berkisar 46 µm (Watanabe, 2002). Dari

hasil pengamatan dimensi morfologi, panjang konidiofor dari kapang BioMCC

FE-00283 yang terukur pada pengamatan mikroskop rata-rata lebih dari 60 µm.

Hasil ini menunjukkan bahwa morofologi kapang BioMCC FE-00283 paling

mendekati dengan deskripsi dari kapang Curvularia lunata.

Kapang endofit C. lunata pernah dilaporkan berhasil diisolasi oleh

beberapa peneliti lain. Kharwar et al., (2008), melaporkan berhasil mengisolasi

C. lunata dari tanaman Catharanthus roseus (L) G.Don sedangkan Verma dan

Kharwar (2006) mengisolasinya dari daun nimba.

Dalam kaldu kultivasi senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang

biasanya berada dalam konsentrasi yang kecil dalam suatu cairan yang

mengandung sel kapang, medium maupun produk metabolit lainnya. Untuk

meningkatkan konsentrasi dari senyawa aktif, maka perlu dilakukan pemisahan

senyawa tersebut dari pengotornya. Pemisahan yang dimaksudkan untuk

pemurnian senyawa aktif pada dasarnya dilakukan untuk mengetahui senyawa

mana sebenarnya yang menunjukkan aktivitas dan untuk mengetahui karakter

biologis maupun kimia dari senyawa tersebut (Spainhour, 2005). Ekstrak yang

disari menggunakan etil esetat dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE 00283

menunjukkan aktivitas terbesar terhadap larva A. salina (Tabel 4), akan tetapi

belum diketahui senyawa apa yang berperan dalam aktivitas tersebut. Untuk

dapat menentukan senyawa yang berperan dalam aktivitas tersebut perlu

dilakukan pemurnian lebih lanjut terhadap ekstrak etil asetat dari kapang C.

lunata BioMCC FE 00283. Pemurnian dilakukan dengan panduan uji

sitotoksisitas agar dapat diperoleh fraksi maupun senyawa murni yang

mempunyai aktivitas sitotoksik. Pada bagian kedua dari penelitian ini akan

dilakukan pemurnian senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE

00283 dengan panduan uji BSLT dan uji sitotoksitas terhadap sel MCF-7 untuk

42

senyawa murninya. Disamping itu akan dilakukan identifikasi struktur senyawa

aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit C. lunata BioMCC FE 00283 yang

bersifat sitotoksik terhadap sel kanker MCF-7.

SIMPULANIsolasi kapang endofit tanaman obat dari Lombok Timur, Nusa Tenggara

Barat dilakukan dengan metode strerilisasi permukaan. Dari 34 jenis sampel

tanaman diperoleh 75 kapang endofit yang terdiri dari 57 dari sampel daun dan

18 dari sampel batang. Tingkat kolonisasi kapang pada daun mencapai 70% dari

total sampel, sedangkan tingkat kolonisasi pada batang hanya 32% dari total

sampel.

Metabolit sekunder dari 36 kapang endofit yang berhasil diisolasi diuji

bioaktivitasnya terhadap larva Artemia salina. Konsentrasi selektif untuk

penapisan ekstrak metabolit sekunder kapang endofit tanaman obat adalah

1000 mg/L. Penapisan awal terhadap 108 ekstrak metabolit sekunder kapang

menghasilkan 9 ekstrak yang dapat menyebabkan mortalitas 100 % terhadap

larva A. salina .

Penapisan lanjutan terhadap ekstrak aktif pada penapisan awal

dilakukan dengan menghitung LC50 ekstrak pada pengujian terhadap A. salina.

Penapisan lanjutan menghasilkan ekstrak hasil penyarian menggunakan etil

asetat dari kapang endofit ENLT 74.3d.2 dengan LC50 sebesar 30,21 g/L.

Kapang endofit ENLT 74.3d.2 diidentifikasi secara morfologi dibawah

mikroskop. Ciri-ciri morfologi kapang ENLT 74.3d.2 paling sesuai dengan

deskripsi morfologi kapang Curvularia lunata. Kapang aktif C. lunata disimpan

dalam koleksi kultur dan mendapatkan kode BioMCC FE-00283.