ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STEROID DARI KALUS SOLANUM...

SKRI PSI

DJOKO TRIWAHONO

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STEROID DARI

KALUS SOLANUM W RIGHTII BENTH

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA

1 98 8

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STEROID... DJOKO TRIWAHONO

ISOLASI DAN IDENTIFIERSI STEROID DARI KALUS SOLANUM WRIGHTII BENTH

SKRIPSIDIBUAT UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR

MENCAPAI GELAR SARJANA FARMASI

i r;;f! A i i i U o A K c r r y \ ? i

i C n A E A V A _ _ Djoko Triwahono ”058010337

Disetujui oleh pembimbing

PADA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA

1988 Y n

/



KATA PENGANTAR

Puji syukur bagi Allah Yang Maha Kuasa yang telah me- limpahkan berkatNya dan memperkenankan saya untuk dapat menyelesaikan tugas akhir, guna mememuhi syarat-syarat dalam mencapai gelar sarjana farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Pada kesempatan ini, saya ingin menyampaikan rasa te- rima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak DR. Gunawan Indrayanto sebagai pembimbing, yang penuh kesabaran serta kesungguhan hati telah berkenan meluangkan waktunya untuk membimbing, memberi pengarahan dan dorongan moral selama saya melakukan penelitian hingga seleaainya penulisan tugas akhir ini.

Kepada P.T. New Interbat Surabaya, yang telah memberikan fasilitas pemakaian alat kromatografi gas untuk penye- lesaian penelitian ini.

Kepada Ketua Jurusan Biologi Farmasi dan Kepala Labo- ratorium Bioteknologi, Fakultas Farmasi Universitas Air - langga, yang telah memberikan segala fasilitas yang saya pergunakan untuk melakukan penelitian ini hingga selesai, serta segenap karyawan Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga atas segala bantuan yang diberikan.

ii



Kepada orang tua, saudara dan sahabat saya serta semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu. yang telah membantu dalam mempersiapkan dan menyediakan segala fasilitas dalam penelitian ini.

Kiranya Allah yang adalah adil dan berlimpah kasih setia berkenan membalas segala jasa dan baik budi yang telah diberikan.

Surabaya, Januari 1988

Penyusun,

iii



DAFTAR ISIhalaman

KATA PENGANTAR .................................. iiDAFTAR ISI ...................................... ivDAFTAR TABEL ................................... viiDAFTAR GAMBAR ................................... viiiDAFTAR LAMP IRAN ................................. xBABI PEMDAHULUAN .....'........... ............ 1II TINJAUAN PUSTAKA ............................. 3

1. Tinjauan kultur jaringan tanaman. ........ 31.1. Penerapan metoda kultur jaringan

tanaman .............................. 31.2. Penerapan metoda kultur jaringan

tanaman untuk produksi metabolit sekunder ......................... .... 4

2. Tinjauian tentang steroid .................. 52.1. Penggolongan steroid .............. 6

2.1.1. Golongan steroid dengan atom karbon tidak lebih dari dua* puluh satu ................ .... 6

2.1.2. Golongan steroid dengan atom karbon lebih dari dua puluhsatu .......................... 6

2.2. Sterol ........................... .... 82.3- Saponin steroid ...................... 8

3. Tinjauan tentang Solanum wrightii Ilenth. 94 . Tinjauan tentang kromatografi ......... 10

4-1. Kromatografi lapisan tipis ....... 114.2. Kromatografi kolom ............... 12

iv



BABIII

halaman4.3. Kromatografi gas ................... 13

ALAT, BAHAN DAN METQDA PENELITIAN .......... 161. Alat-alat yang digunakan ................ 16

1.1. Alat untuk pembuatan media dan sterilisasi media ....................... 16

1.2. Alat untuk isolasi dan identifikasi steroid ............................ 16

2. Bahan-bahan yang digunakan .............. 162.1. Bahan penelitian ................... 162.2. Media yang'digunakan dalam penelitian 162.3. Pisang yang digunakan untuk campuran

pacfa media ......................... 182.4. Bahan kimia yang digunakan untuk iso

lasi ............................... 182.5. Bahan pembanding yang digunakan iden-

tifikasi steroid ................... 183 . Tahapan kerja........................... 18

3.1. Pembuatan media .................... 183 .2 . Kultivasi kalus .................... 193.3. Persiapan bahan untuk isolasi steroid 203.4. Isolasi steroid dari sampel ........ 203.5. Pemeriksaan terhadap hasil isolasi .. 233.6. Pemurnian hasil isolasi dengan kroma-

tografi kolom ...................... 243.7. Pemeriksaan terhadap zat hasil isola

si yang telah dimurnikan ........... 253.7.1. Pemeriksaan dengan reaksi war-

na .......................... 253.7.2. Pemeriksaan dengan kromatogra-

fi lapisan tipis ............ 263 .7 .3 . Pemeriksaan dengan kromatogra-

fi gas .................... 27

a* x l 1 * \f B R P U S T A K A A * . 1

'• N IT B R S 1 T A S A I R L A N O * *

S U R A B A Y * ----



IV HASIL PENELIT1AN ......................... 291. Hasil isolasi steroid dari kalus Solanum

wrightii Benth......................... 292. Hasil pemeriksaan terhadap hasil isolasi. 29

2.1. Hasil pemeriksaan terhadap hasil isolasi dengan kromatografi lapisan tipis ............................... 29

2.2. Hasil pemeriksaan terhadap ifraksi petroleum eter dengan kromatografi lapisan tipis ....................... 29

3. Hasil pemurnian steroid terhadap hasil i- solasi dari kalus Solanum wrightii Benth dengan cara kromatografi kolom ......... 35

4 . Hasil pemeriksaan terhadap kristal hasil pemurnian .............................. 384.1. Hasil pemeriksaan dengan reaksi war-

na ................................ 384.2. Hasil pemeriksaan dengan kromatogra

fi lapisan tipis .................. 384.3. Hasil pemeriksaan dengan kromatogra

fi gas ............................ 43V 'PEMBAHASAN ................................ 48VI KESIMPULAN................................ 50VII SARAN-SARAN ............................... 51VIII RINGKASAN ............................ 52IX DAFTAR PUSTAKA ............................ 53

BAB halaman

vi



DAFTAR TABEl

I. Penggolongan steroid berdasarkan strukturnya 7II. Komposisi kimiawi media Murashige dan Skoog ... 17III. Hasil kromatografi lapisan tipis dari ekstrak

kalus Solanum wrightil Benth dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat ................... 30

IY. Hasil kromatografi lapisan tipis dari fraksi petroleum eter dengan penampak nada anisaldehid a- sam sulfat .................................. 31

Y. Hasil pemeriksaan dengan reaksi warna terhadapkristal hasil pemurnian ..................... 38

YI. Hasil kromatografi lapisan tipis terhadap kristal hasil pemurnian dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat ............................ 39

VII. Hasil kromatografi gas terhadap kristal hasilpemurnian .................................... 43

Tabel halaman



D.AITAR GAMB.AR

Gambar halaman1. Struktur inti molekul steroid ................. 62. Struktur molekul kolesterol dan ^sitosterol ... 83. pembagian sapogenin steroid ................... 94* Alat kromatografi gas ......................... 155. Isolasi steroid dari kalus Solanum wrightii Benth 2?6. Kromatogram dari fraksi petroleum eter dengan si

tosterol sebagai pembanding dan fasa gerak n-heksana ; etil asetat = 8 : 2 ..................... 32

7. .Kromatogram dari fraksi petroleum eter dengan sitosterol sebagai pembanding dan fasa gerak kloroform : etil asetat = 9 : 1 ..................... 33

8. Kromatogram dari fraksi petroleum eter dengan sitosterol sebagai pembanding dan fasa gerak benze-na : aseton = 15 : 1 ........................... 34

9. Hasil kromatografi lapisan tipis dari kromatografi kolom terhadap fraksi petroleum eter ........ 36

10. Hasil kromatografi lapisan tipis dari kromatografi kolom terhadap fraksi aseton ................ 37

11. Kromatogram dari kristal hasil pemurnian dengan sitosterol sebagai pembanding dan fasa gerak n-heksana : etil asetat = 8 : 2 ................ 40

12. Kromatogram dari kristal hasil pemurnian dengan sitosterol sebagai pembanding dan fasa gerak kloroform : etil asetat = 9 : 1 ................... 41

viii



13. :Kromatogram dari kristal hasil pemurnian de - ngan sitosterol sebagai pembanding dan fasagerak benzena : aseton = 15 : 1 ............ 42

14. Hasil kromatografi gas dari campuran sterol sebagai pe mb an ding.......................... 44

15. Hasil kromatografi gas terhadap kristal hasil pemurBHiam.........*........................ 45

16. Kalus solamun wrightii Bentto yang ditumbufekaB.pada media Wa.rashige da& skoog, yang dimodi - fikasi denigaBt penaeibabaB: pisartg amfeoBi meatato . 46

17. Sel kalus Solatium wrighitii B:emth dettgan pea - ■hesaraac 100 kali ....................... .. . 47

Gambar halaman

ix



I.

Lampiran

Pereaksi anisaldehid asam sulfat .......... 56

DAFTAR LAMPIRAN

halaman

x



PENDAHULUANBAB I

Senyawa steroid mempunyai peranan yang penting dalam dunia pengobatan. Disajnping senyawa steroid digunakan sebagai bahan baku pembuatan kontrasepsi oral, turunan dari senyawa steroid banyak digunakan untuk obat-obatan korti- kosteroid, seperti anti radang, anti alergi, juga untuk kardiotonik ( digitoksin ), vitamin dan antibiotik (1,2').

Banyak dari senyawa-senyawa steroid ini merupakan metabolit sekunder dari tanaman. Untuk mendapatkan metabolit sekunder dapat dilakukan dengan cara mengisolasi dari tanaman. Jenis tanaman yang banyak menghasilkan metabolit sekunder golongan steroid, adalah : Dloscorea sp., Solanum sp., Costus sp., Trigonella sp. (1).

Sehubungan dengan makin terbatasnya sumber-sumber bahan baku untuk isolasi, kesulitan dalam teknik penanaman, lahan yang tersedia semakin terbatas, maka pada akhir-akhir ini banyak dari kalan^an ilmuwan untuk mencari alternatif lain dalam penyediaan metabolit sekunder tanaman, yaitu dengan sistem atau metoda kultur jaringan tanaman (3).

Sampai saat ini, telah banyak laporan penelitian tentang kandungan metabolit sekunder tanaman dari metoda kultur jaringan tanaman. Alkaloid kinin dan kinidin telah dapat diisolasi dari kultur Cinchona succirubra dan Cincho -

- 1 -



- 2 -

na led&eriana, baik dari jaringan daun, akar maupun pucuk batangnya (4).Dengan kultur Dioscorea deltoidea telah dapat diproduksi diosgenin hingga diperoleh kadar sampai 7,8 % (5).Hasil penelitian Indrayanto (1983), diketahui bahwa dalam kultur Solanum laciniatum, Costus speciosus, Solatium wrightli terbukti menghasilkan steroid (6).

Solanum wriphtii Benth termasuk salah satu jenis Solanum yang mempunyai kandungan solasodin relatif tinggi, yang diakumulasi pada bagian buah (7). Adanya perbedaan • sumber explan, kondisi kultur dan medi’a dimana kultur tersebut diturnbuhkan, dapat mempengaruhi kadar dan jenis me - tabolit yang dihasilkan. Pada kultur Solanum wri/?htii Benth dari strain Universitas Tubingen, mengandung sterol*triterpen tetapi tidak mengandung solasodin dan diosgenin (6).

Berdasarkan uraian di atas, maka tujuan penelitian i- ni adalah mengisolasi dan mengidentifikasi jenis steroid yang dihasilkan kultur Solanum wrlghtii Benth strain dari • Universitas Airlangga.

Adapun dalam penelitian ini dilakukan isolasi oengan *tiga macam pelarut, pemurnian kristal dengan cara kromatografi kolom serta identifikasi kristal dengan reaksi warna, kromatografi lapisan tipis dan kromatografi gas.

Diharapkan dari penelitian ini dapat memberikan gam - baran .jenis steroid yang dihasilkan kalus Solanum wrightii Benth.



TINJiiUAN PUSTAKA

Tin.jauan kultur jaringan tanamanKultur jaringan berdasarkan teori sel yang dikemuka-

kan oleh Schwann dan Schleiden (1838), menyatakan bahwa sel tumbuhan merupakan satuan biologis terkecil yang mampu melakukan aktivitas metabolisme, reproduksi dan tumbuh. Dari teori tersebut timbul teori Toti Potensi Sel tumbuhan yang menyatakan bahwa semua sel tumbuhan mengandung semua informasi genetik yang sama, sehingga apabila sel tumbuhan ditanam pada media yang sesuai mampu tumbuh menjadi tumbuhan baru '

Kultur jaringan dapat didefinisikan sebagai bagian/ jaringan tanaman yang telah dipisahkan dari tanaman asalnya dan ditumbuhkan dalam keadaan steril pada suatu medium artifisial dan sel-selnya mampu tumbuh serta mengada - kan pembelahan. Kultur dapat berupa kultur organ tertentu yang telah terdiferensiasi dan sel-sel meristematik yang belum terdiferensiasi atau yang disebut kultur ka - lus <1C».

1.1. Penerapan metoda kultur jaringan tanamanMetoda kultur jaringan tanaman berkembang sejak

White (1934) berhasil membuat kultur jaringan dari akar tomat ( Solanum lycopersicum ) dan Gautheret telah membuktikan bctapa pentingnya peranan zat pe -



- 4 -

ngatur tumbuh auksin, yaitu IAA ( indole-3-aceticacid ) dan vitamin B dalam pertumbuhan kultur sel' . Sejak itu metoda kultur jaringan tanaman banyak digunakan dalam penelitian dasar pada bidang biokimia, ge- netika, fisiologi, biotransformasi senyawa berkha - siat

Adapun kelebihan metoda kultur jaringan tanaman bila dibandingkan metoda konvensional, yaitu ;- pertumbuhan cepat dan tidak terpengaiuh oleh musim dan letak geografis

- bebas dari pengaruh mikroba dan insekta- pertumbuhan sel dan proses metabolisme dapat dikon- trol, terutama untuk pengembangan produktivitas

- perubahan prekusor ( bahan dasar ) berlabel yang se- ngaja ditambahkan ke dalam media dapat dimonitor dengan cepat

Sedangkan kekurangannya adalah :1. sel yang tumbuh heterogen2. kondisi media dan lingkungan harus steril 3* bahan pembuat media mahalDengan adanya kelebihan dan kekurangan dari metoda ini, maka perlu pertimbangan beaya untuk produksi ko- mersial.

1.2. Penerapan metoda kultur .jaringan tanaman untuk produksi metabolit sekunder

Salah satu tujuan dikembangkannya metoda kulturjaringan tanaman adalah untuk produksi metabolit sekunder. Hal ini untuk mengatasi kesulitan-kesulitan

(2)



- 5 -

dalam memproduksi metabolit sekuhder yang bermanfa- at bagi kehidupan manusia yang berasal dari tanaman Adapun metabolit sekunder dari kultur sel tanaman yang diketahui adalah : steroid, terpenoid, sapogenin, alkaloid, flavonoid dan sebagainya^11’12^.

Metabolit sekunder yang dihasilkan dengan metoda kultur jaringan tanaman mungkin identik dengan tanaman asalnya, senyawa yang sama sekali berbeda dari tanaman asalnya atau bahkan tidak mampu memproduksi senyawa spesifik dari tanaman asalnya. Sedang- kan kadar yang dihasilkan dapat sama, lebih besar maupun lebih kecil bila dibandingkan dengan kadar pada tanaman asalnya

Indrayanto (1983), berhasil melakukan isolasi dan identifikasi betulinadehid, yaitu suatu triterpen perantara pada biosintesa asam betulir>ut dari kultur Solanum laciniatum, dimana sebelumnya st-nyawa ini belum pernah ditemukan pada tanaman Solanum sp^^. Sedangkan pada kultur sel Solanum mammogum tidak di-

(p)temukan solasodin v ',

2. Tin.jauan tentang steroidSenyawa steroid adalah suatu senyawa organik yang

berinti siklopentanoperhidrofenantren. Di alam terdapat dalam tanaman ( suku Solanaceae, liliaceae dan Schorphu- lariaceae ). Molekulnya mempunyai inti yang merupakan fu- si tiga sikloheksana dan satu siklopentana dengan 17 buah atom karbon.



- 6 -

Struktur inti molekul steroid yang jenuh disebut gonan. Semua golongan steroid dianggap turunan gonan yang menga- lami substitusi, oksidasi atau dehidrogenasi

Gambar : 1. Struktur inti molekul steroid

Disamping steroid digunakan sebagai bahan kontrasepsi, turunan steroid banyak digunakan sebagai kardiotonik ( digitoksin ), vitamin dan antibiotika

Steroid pada umumnya larut dalam pelarut organik yang non polar seperti kloroform dan eter, serta tidak larut dalam pelarut polar seperti air dan alkohol.

2.1. Penggolongan steroidBerdasarkan strukturnya steroid dibagi menjadi

dua golongan, yaitu ;2.1.1. Golongan steroid dengan atom karbon tidak le-

bih dari dua puluh satu disebut steroid seder- hana.

2.1.2. Golongan steroid dengan atom karbon lebih dari dua puluh satu, misalnya sterol, sapogenin, alkaloid steroid dan lain-lain seperti yang tercantum pada tabel I.



- 7 -

TABEL : IPenggolongan steroid berdasarkan strukturnya



- 8 -

2.2. Sterol (15,16,17)Berdasarkan asalnya, sterol dibagi menjadi em-

pat golongan, yaitu zoosterol yang berasal dari he- wan seperti kolesterol, serta phytosterol yang berasal dari tanaman seperti stigmasterol, sitosterol. Mikosterol berasal dari jamur seperti ergosterol, sedangkan marinsterol berasal dari organisme lautseperti kalinasterol, stellasterol dan desraosterol.

Gambar : 2. Struktur molekul kolesterol dan sitosterol

2-3. Saponin steroidSaponin steroid merupakan senyawa glikosida

yang mengandung aglikon sapogenin, berkonjugssi dengan oligosakarida melalui gugus 3 - jShidroksi. Oligosakarida dapat berupa heksosa ( glukosa ) maupun pentosa ( silosa ) berjumlah sampai dengan enam unit

Glikosida saponin bersifat dapat membentuk bu- sa yang mantap bila larutannya dalam air dikocok, berasa pahit, racun terhadap ikan dan dapat menghe- molisa darah.



- 9 -

Beberapa sterol (y& sitosterol dan stigmasterol)dan sapogenin steroid dapat digunakan untuk sintesisobat kontrasepsi. Noretisteron dan etinil estradioldapat disintesis dari diosgenin dan sitosterolPembagian sapogenin steroid menurut Tarigan (1980)

(19)dapat dilihat sebagai berikut •

Sapogenin steroid (alam)

Gambar : 3. Pembagian sapogenin steroid

3. Tinjauan tentang Solanum wrightii BenthSolanum adalah' suatu marga tanaman yang banyak turn -

buh di daerah tropika. Di Indonesia jumlah Solanum mencapai 71 jenis, sedangkan di pulau Jawa diperkirakan ter - dapat dua puluh tujuh jenis

Salah satu jenis dari Solanum tersebut adalah Sola - num wrightii Benth. Kedudukan klasifikasi tanaman ini menurut Lawrence, yaitu :



- 10 -

Divisio : SpermatophytaSub divisio : AngiospermaeClass : Dicotyledoneae

: TubifloraeOrdoSub ordo :• SolanineaeFamilia : SolanaceaeGenus : SolanumSpecies : Solanum wrightii Benth

Kandungan Solanum wrightii Benth yang relatif tinggi ada-

Solanum wrightii Benth merupakan tanaman berbentuk pohon yang berasal dari lJeru. Sinonim dari Solanum wrightii Benth adalah Solanum grandiflorum.

Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran, yang bergantung pada perbedaan migrasi masing-masing komponen campuran melalui suatu fasa diam di bawah pengaruh suatu pelarut yang bergerak yakni fasa gerak.Istilah kromatografi asal mulanya dicetuskan oleh sarjana biologi Rueia Michael Tswett, untuk melukisknr. suatu cara pemisahan zat-zat warna daun yang diadsorpnikan pada kal- sium karbonat.Semua pemisahan kromatografi didasarkan pada, bahwa kom - ponen-komponen suatu campuran terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan-perbandingan yang berlainan antara senyawa yang satu dan yang lain.

lah solasodin yang diakumulasi pada bagian buah



- 11 -

Berdasarkan sifat dari fasa diam dapat digolongkanmenjadi dua cara kromatografi, yaitu :- Kromatografi adsorpsi

Kromatografi adsorpsi adalah kromatografi dimana fasa diam yang digunakan berupa zat padat.Contoh : kromatografi lapisan tipis, kromatografi gas

padat- Kromatografi partisiKromatografi partisi adalah kromatografi dimana fasa diam yang digunakan berupa zat cair.Contoh ; kromatografi kertas, kromatografi gas cair

4.1. Kromatografi lapisan tipis (2?»25,26)Mekanisme dari kromatografi lapisan tipis ada

lah adsorpsi, yaitu merupakan kekuatan tarik mena- rik antara molekul adsorben ( sebagai fasa diam ) dengan molekul zat yang akan diadsorpsi. Molekul-molekul zat yang diadsorpsi lemah oleh fasa diam akan terbav/a oleh fasa gerak ke atas, se - hingga memberikan noda di atas. Sedangkan molekul- molekul zat yang diadsorpsi kuat oleh fasa diam a- kan memberikan noda di bawah.

Fasa diam yang banyak digunakan adalah silika gel, sedangkan fasa gerak dapat digunakan pelarut tunggal atau campuran beberapa macam pelar.ut yang disesuaikan dengan campuran zat yang akan dipisahkan.



- 12 -

Untuk menunjukkan komponen zat yang dipisahkan, dapat menggunakan lampu ultra violet atau pereaksi penampak noda yang sesuai.Dari kromatogram yang diperoleh dapat diketahui warna noda yang terjadi, kemudian dihitung harga Rfnya dimana harga Rf ini dibandingkan denga.i pembanding*

Jarak yang ditempuh zatRf ----------------------------------Jarak yang ditempuh fasa gerak

4.2. Kromatografi kolom (22,23)Kromatografi kolom terdiri dari medium padat

yang diisikan ke dalam sebuah kolom. Setelah campuran zat yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom, pelarut dilewatkan melalui kolom tersebut.

Kromatografi kolom dapat digunakan untuk pemisahan, pemurnian dan analisis suatu campuran senyawa berdasarkan salah satu mekaaisme adsorpsi, partisi, penukar ion dan filtrasi gel.

Fasa diam yang sering digunakan adalah alumi - nium oksid ( alumina ) dan silika gel.Pengisian adsorben ke dalam kolom harus seragam dan kompak, sebab bila tidak seragam dan kompak dapat menyebabkan aliran pelarut tidak teratur. Ada dua cara pengisian adsorben ke dalam kolom yaitu cara kering dan cara basah.- Pengisian adsorben cara keringSejumlah kecil adsorben dimasukkan ke dalam kolom dan dibiarkan turun dengan mengetuk-ngetuk kolom



- 13 -

sampai tingginya konstan. Cara ini diulang-ulang hingga didapatkan ketinggian yang dikehendaki. Segumpal kecil glass wool diletakkan di ujung kolom untuk mencegah pengotoran permukaan oleh adsorben. Kemudian kolom dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan untuk eluasi.

- Pengisian adsorben cara basahAdsorben dan pelarut dicampur sampai membentuk suspensi, kemudian diisikan ke dalam kolom. Adsorben dibiarkan turun dan membentuk endapan di dasar kolom. Selama pendiaman, pelarut dikeluar - kan dan ditambah suspensi lagi. Demikian seterus- nya hingga didapatkan ketinggian yang dikehendaki. Selain itu dapat juga dengan cara memasukkan dulu eluen ke dalam kolom, kemudian ditambah dengan suspensi adsorben dalam eluen atau adsorben kering.

Selama eluasi, eluen yang keluar ditampung dalam volume-volume kecil, kemudian masing-masing eluen dianalisa.

4.3- Kromatografi gas (22»24,25)Kromatografi gas adalah suatu cara analisa yang

dapat digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organik, seperti asam, basa, alkohol, keton, alka - loid dan lain-lain.Ada dua jenis kromatografi gas, yaitu kromatografi gas padat dan kromatografi gas cair.



- 14 -

Untuk kromatografi gas padat sebagai fasa diam adalah zat padat, sedangkan kromatografi gas cair se - bagai fasa diam adalah zat cair. Sebagai fasa gerak kedua jeni's kromatografi gas tersebut adalah gas. Keuntungan dari kromatografi gas antara lain :- Gas mempunyai kecepatan yang tinggi, sehingga waktu pemisahan cepat

- Dapat digunakan untuk analisa kualitatif maupun kuantitatif

- Sangat sensitif-, sehingga hanya memerlukan sampel sedikit

prinsip kerja dari kromatografi gasSampel diinjeksikan ke dalam ruang injektor.

Sampel tersebut akan menguap karena pemanasan pada ruang injektor. Selanjutnya sampel yang berupa gas akan terbawa oleh aliran gas pembawa, masuk ke dalam kolom. Di dalam kolom komponen-komponen dari sampel akan dipisahkan, kemudian komponen-komponen tersebut dideteksi oleh detektor. Jadi pemisahan dari sampel terjadi antara gas sebagai fasa gerak dan zat cair sebagai fasa diam. Senyawa yang mem - punyai afinitas rendah terhadap fasa aiam akan keluar lebih dahulu, sedangkan senyawa dengan afinitas besar terhadap fasa diam akan keluar dari ko - lom kemudian.



- 15 -

Gambar : 4, Alat kromatografi gas

Keterangan gambar :1. Gas pembawa2. !Pengatur tekanan3. Tempat penyuntikan4. Kolom5. Detektor6. Flowmeter7. Amplifier8. Intregator9. Rekorder10. Oven



ALAT, BAHAN DAN METODA PENELITIAN

1. Alat-alat yang digunakan1.1. Alat untuk pembuatan media dan sterilisasi media

- Autoklaf 25 1 ( American Portable Autoclve WAP Co Inc )

- PH meter Pisher- Laminar air flow cabinet

1.2. Alat untuk isolasi dan identifikasi steroid- Labu alas bulat- Pendingin balik- Bejana kromatografi- Kromatografi Gas Shimadzu tipe 9A- Lempeng Jadi Kieselgel 60 ^254’ Merck

2. Bahan-bahan yang digunakan2.1. Bahan penelitian

Sebagai bahan digunakan kalus Solanum wrightii Benth, diperoleh dari Laboratorium Bioteknologi Pa- kultas Parmasi Universitas Airlangga, Surabaya.

2.2. Media yang digunakan dalam penelitianMedia yang digunakan dalam penelitian adalah

media standar Murashige dan Skoog yang dimodifikasi dengan penambahan hormon kinetin dua ppm, ditambah 2,4 Dichloro phenoxyacetic acid 0,5 ppm dan ditam - bah pisang ambon mentah

BAB III

- 16 -



- 17 -

Komposisi kimiawi media Murashige dan Skoog dapat di-lihat di dalam tabel di bawah ini :

TABEL : IIKomposisi kimiawi media Murashige dan Skoog

Komponen Jumlah ( mg/1 )

nh4n o3 1650kno5 1900cacl2. 2H20 440MgSO^. 7H20 370

KH2P04 170PeS04. 7H20 27,8Na2EDTA. 4H20 37,3MnSO^. 4H20 22,3ZnS04. 7H20 8,6h 3b o3 6,2KI 0,83Na2Mo04- 2H20 0,25CuSO^. 5H20 0,025CoCl2- 6H20 0,025Mio - inositol 100Asam nikotinat 0,5piridoksin HCl 0,5Tiamin HCl 0,1Glisin 2Sukrosa 3 0.0 0 0.Agar 10.000



- 18 -

Agar yang digunakan adalah Bacto Agar, Difco Centri- fied', Difco Laboratories, Detroit Michigan, USA.Hormon 2,4 Dichloro Phenoxy Acetic Acid produkst Sigma,

2.3. Pisang yang digunakan untuk campuran pada mediaBuah pisang yang digunakan untuk campuran pada me

dia adalah buah pisang ambon mentah, diambil dari pasa-(?n\ran bebas, dengan kriteria sebagai berikut •

- Kulit buah seluruh permukaannya hijau dan bergetah- Daging buah keras- Irisan melintang daging buah bulat penuh ( siku-siku tidak ada )

Buah pisang sebelum dicampur dengan larutan media, dijLu- matkan dahulu demgan blender dan digunakan sebanyak 200 gram per satu liter media.

2.4. Bahan kimia yanig digunakan untuk isolasi- Petroleum eter 40 - 60 p.a. ( E. Merck )- Aseton p.a. (,E„ Merck )- Kloroform p.a. ( E. Merck )

2 • 5 • Bahan pembanding yang digunakan identiflkaa1 steroid- Sitosterol- Solasodin- Diosgenin

3. Tahapan kerja3.1. Pembuatan media

Media yang digunakan adalah media padat, cara pern -buatannya sesuai dengan metoda Murashige dan Skoog.Masing-masing komponen media dibuat larutan stok. Untuk memperoleh media dengan volume satu liter, dibuat dengan cara sebagai berikut :



- 19 -

- Bahan makronutrien dari larutan stok masing-masing sepuluh milliliter

- Bahan mikronutrien dari larutan stok masing-masing sepuluh milliliter

- Hormon kinetin dua ppm ditambah 2,4 Dichloro phe - noxyaceitic . acid 0,5 ppm

- Ditambahkan mio-inositol pada campuran larutan media

- Ditambah sukrosa dan pisang ambon mentah yang sudah dihaluskan, kemudian ditambah aquades sampai dipe - roleh volume satu liter media

- Larutan media dibuat dengan pH 5>7 - 5,8 dengan me- nambahkan larutan NaOH 0,1 N atau larutan HCl 0,1 N

- Setelah ditambah dengan agar 1 %, larutan dipanas - kan sampai mendidih

- Larutan dituang ke dalam botol kultur masing-masing 25 ml, kemudian masing-masing ditutup dengan aluminium foil rapat-rapat

- Disterilkan di dalam autoklaf dengan euhu 121°C selama 20 menit

- Disimpan di dalam ruang dengan suhu 20 - 25 °C

3.2. Kultivasi kalusUntuk mendapatkan kalus dalam jumlah banyak agar

cukup untuk diisolasi, maka kalus perlu ditumbuhkan(• diperbanyak ), dengan cara sebagai berikut :- Kalus dipotong-potong, kemudian dipindahkan ke da - lam botol kultur yang sudah berisi media



- 20 -

- Potongan kalus akan tumbuh dan membentuk kalus yang baru

- Semua pekerjaan di atas dilakukan secara aseptis di- laminar air flow cabinet

Pemanenan dilakukan setelah kalus berumur empat ming- gu

3.3. persiapan bahan untuk isolasi steroidXalus dipisahkan dari agar yang menempel, k’emu -

dian dikeringkan dilemari pengering pada suhu 40 sampai 60°C. Setelah kering kemudian diserbuk.

3*4* Isolasi steroid dari sampelDalam penelitian ini dilakukan isolasi steroid

dari kalus Solanum wrightii Benth, Metoda isolasi dari kalus ini digunakan literatur ya -fcu ;

Di'timbang 40 gram serbuk kalus, dimasukkan ke dalam labu alas bulat yang dilengkapi dengan pendingin balik, direfluks lima kali selama dua jam dengan pe - troleum eter 40 - 60 p.a. sebanyak 300 ml pada suhu 60 - 65°C, kemudian disaring.Filtrat ( fraksi ) petroleum eter dipisahkan dan re - sidu direfluks kembali dengan aseton sebanyak 300 ml selama dua jam pada suhu 80 - 85°C, yang dilakukan tiga kali.Fraksi aseton diuapkan. Residu dari fraksi aseton di- hidrolisa dengan 100 ml larutan HCl 2 N pada suhu 100°c, kemudian disaring.Setelah disaring, ampas dicuci dengan aquades sampai



- 21 -

netral, kemudian dibasakan dengan larutan NaOH 1 N, dicuci lagi dengan aquades dan dikeringkan dalam le- mari pengering dengan suhu 50°C.Setelah kering, kertas saring dan ampas direkluks tiga kali selama dua jam dengan kloroform sebanyak 300 ml.Filtrat ( fra.ksi ) kloroform diekstraksi tiga kali dengan kloroform, sedangkan ampasn.ya diekstraksi selama satu jam dengan kloroform.Dari masing-masing fraksi dikumpulkan dan diuapkan, kemudian dilakukan identifikasi dengan kromatografi lapisan tipis.Untuk fraksi yang memberikan hasil positif dilakukan pemurnian dengan kromatografi kolom.Secara skematis isolasi steroid dari kalus Solanum wrightli Benth dapat dilihat pada gambar 5.



- 22 -

Serbuk kalus, diekstraksi dengan petroleum eter ( PE ) lima kali

dua jam

Ekstrak PE diuapkan

Sterol bebas

.rtmpas diekstraksi dengan aseton tiga kali dua jam

Ekstrak aseton diuapkan

Glikosterin

------" 1Ampas direfluks dengan HCl 2N satu jam

Dinetralkan dengan NaOH IN, disaring

Ampas diekstraksi dengan kloroform satu jam

Ekstrak kloroform

Filtrat dikocok dengan kloro - form

Fasa kloroform

- Sapogenin steroid- Alkaloid Steroid

Gambar : 5. Isolasi steroid dari kalus Solanum wrightii Benth



- 23 -

3.5* Pemeriksaan terhadap hasil isolasiYang dilakukan dalam pemeriksaan terhadap hasil isolasi adalah pemeriksaan steroid secara kualitatif dengan kromatografi lapisan tipis dari masing-masing fraksi. Bahan yang digunakan :- Zat hasil isolasi- 7.at pembanding : sitosterol, solasodin, dioogenin- Fasa diam : kieselgel 60 F2^4 ( E. Merck )

dengan tebal lapisan 0, 20 mm- Fasa gerak : n-heksana : etil asetat = 8 : 2

kloroform ; etil asetat = 9 : 1

kloroform : metanol = 9 : 1 , 5

- Penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat

Cara pelaksanaannya, yaitu :Fraksi zat yang akan diperiksa ditoto'ikan ke lem-

peng fasa diam ( papan kromatografi ) disamping larutan zat pembanding sejumlah ul tertentu. Kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan eluen. pengembangan dihentikan setelah eluen mencapai jarak yang sudah ditentukan sebelumnya, lem - peng fasa diam ( papan kromatografi ) diangkat dan dibiarkan mengering di udara terbuka. Kemudian disemprot dengan penampak noda dan dipanaskan dalam oven pada suhu 100 - 105°C selama lima sampai sepuluh menit.Warna noda dan harga Rf yang diperoleh dibandingkan dengan warna noda dan harga Rf dari zat pembanding.



- 24 -

3.6. Pemurnian hasil isolasi dengan kromatografi kolom Bahan yang digunakan :- Zat hasil isolasi ( fraksi zat yang memberikan hasil positif terhadap kromatografi lapisan tipis )

- Fasa diam : kieselgel 60 1*254 ( ■E‘ Merck )( 230 - 400 mesh )

- Fasa gerak ♦ n-heksana : etil asetat = 8 : 2

Alat yang digunakan :Kolom kaca yang salah satu ujungnya dilancipkan

dan disambung dengan pipa yang terbuat dari bahan yangtidak dapat larut dalam pelarut organik.Pada pipa ini dipasang kran yang dapat dibuka dan di-tutup. panjang kolom lebih kurang tiga puluh centime -ter dan diameter dalamnya satu centimeter. Ujung bawahkolom diberi glass wool sebagai penyaring.Cara pelaksanaannya, yaitu :

Fasa diam dicampur dengan fasa gerak secukupnya,sehingga merupakan bubur yang dapat dituang dengan mu-dah. Kemudian dituang melalui corong ke dalam kolomsampai tidak timbul gelembung udara. Fasa diam yangdiperlukan sebanyak 100 - 200 kali bahan yang dimurni-kan. Setelah itu dibiarkan semalam untuk memampatkanfasa diam. Li atas kolom dipasang corong pisah sebagaitempat persediaan fasa gerak.

Bahan yang akan dimurnikan ditambah fasa geraksampai tepat larut, kemudian dimasukkan ke dalam kolomhingga membentuk suatu lapisan yang rata di atas fasa diam.



- 25 -

Setelah itu fasa gerak dialirkan turun dengan kece - patan yang diatur dan dijaga, agar tersedia fasa gerak setinggi kurang dari dua centimeter di atas fasa diam. Larutan yang keluar ditampung dalam botol se - banyak dua milliliter setiap kali penampungan. Pemoagian fraksi berdasarkan urutan keluarnya fasa gerak. Selanjutnya masing-masing fraksi dianalisa dengan kromatografi lapisan tipis.Fraksi-fraksi yang mempunyai harga Rf dan warna noda yang sama dikumpulkan, kemudian diuapkan.

3.7. Pemeriksaan terhadap zat hasil isolasi yang telah di- murnikanYang dilakukan dalam pemeriksaan terhadap zat hasil isolasi yang telah dimurnikan adalah :3.7.1. Pemeriksaan dengan reaksi warna

Bahan yang digunakan :- Kristal hasil pemurnian- zat pembanding : sitosterol, solasodin, di-

osgeninCara pelaksanaannya, yaitu :- Reaksi warna Liebermann - Burchard

Sedikit zat dilarutkan ke dalam dua milliliter kloroform, kemudian ditambahkan tiga tetes asam asetat anhidrat dan satu tetes asam sulfat pekat, dikocok pelan-pelan, maka akan terjadi warna biru. Warna dari zat ha -sil pemurnian dibandingkan dengan warna dari pembanding.



- 26 -

- Reaksi warna Salkowski (29)Sedikit zat dilarutkan ke dalam kloro -

form, kernudian ditambahkan asam sulfat pekat dengan volume yang sama, melalui dinding ta- bung reaksi dan dikocok pelan-pelan.Setelah ter.-jadi pemisahan, maka lapisan asam akan berwarna merah dan lapisan kloroform tidak berwarna.Warna dari zat hasil pemurnian dibandingkan dengan warna dari pembanding.

3.7.2. Pemeriksaan dengan kromatografi lapisan tipis Bahan yang digunakan :- Kristal hasil pemurnian- Zat pembanding : sitosterol, solasodin, di-

0sgenin- Fasa diam ; kieselgel 60 ^254 Merck)

dengan tebal lapisan 0, 2 0 mm- Fasa gerak : n-heksanajetil asetat= 8:2

kloroform:etil asetat= 9 : 1

benzena : aseton =1 5 : 1

kloroform: metanol • « 9 :1 , 5

- Penampak noda : pereaksi anisaldehid asamsulfat

Cara pelaksanaannya seperti pada pemeriksaan terhadap hasil isolasi dengan kromatografi lapisan tipis ( lihat 3 .5 . )•



- 27 -

3.7.3. Pemeriksaan dengan kromatografi gas Bahan yang digunakan :- Kristal hasil pemurnian- zat pembanding : campuran sterol yang terdi-

ri dari kolesterol, kampe - sterol, stigmasterol dan sitosterol

- Alat : Kromatografi Gas Shimadzu tipe 9A, dengan data prosesor CR3A, dengan kondisi operasional sebagai berikut :- Fasa diam : 0 V - 101 5 %- Materi pendukung s ChromosDrb W,

80 - 100 mesh- Suhu injektor- Suhu kolom- Suhu detektor- Detektor- Gas pembawa- Kecepatan aliran gas : 4-0 ml per me-

nit- Kolom s Gelas 3 m x 3 mm

Cara pelaksanaannya, yaitu :Kristal hasil pemurnian dilarutkan ke da -

lam kloroform, kemudian disuntikkan ke dalam ruang injektor dengan pertolongan jarum injeksi. Zat akan menguap karena pengaruh pemanasan pada ruang injektor.

300° C280°C, i.sot.ermal 300° 0

F.I.D.Nitrogen



- 28 -

Uap akan terbawa oleh gas yang mengalir, yang telah diatur kecepatan alirnya.Hasilnya diamati melalui detektor.



HASIL PENELITIANBAB IV

1, Hasil isolasi steroid dari kalus Solanum wrightii Benth Hasil isolasi steroid dengan menggunakan 40 gram

serbuk kalus Solanum wrightii Benth, diperoleh ekstrak kental yang berwarna coklat kuning dan setelah dilaku - kan pemurnian dengan kromatografi kolom diperoleh kristal berwarna putih ( dari fraksi petroleum eter ).

2• Hasil pemeriksaan terhadap hasil isolasi2.1. Hasil pemeriksaan terhadap hasil isolasi dengan

kromatografi lapisan tipis

Hasil pemeriksaan terhadap hasil isolasi dengan kromatografi lapisan tipis dari masing-masing fraksi tercantum pada tabel III. Dari tabel III diketahui, hanya fraksi petroleum eter dan fraksi aseton yang memberikan hasil positif.

2.2. Hasil pemeriksaan terhadap fraksi petroleum eter dengan kromatografi lapisan tipisHasil pemeriksaan terhadap fraksi petroleum, eterdengan kromatografi lapisan tipis tercantum padatabel IV dan dapat dilihat pada gambar 6, gambar 7dan gambar 8.

- 29 -



TABEL

I III

Hn8ll

kronat*£rafi lap

isan

tipis

dari

ekstra

k kal

us Solanyn

wrlAtli

Bentk

dengan

pen

anpak

noda

anisaldekid

asaa

svlfat

- 30 -

<N--

H

I I I

t— fO O m in •»•***o o o

1 1 1p a a

VO <VI O s ITv SO VO• V M Mo o o

1 1 1

t-CVJ•* m> •» •O O O O

Q>•HA

s*

I I I I

co in vo c j coc\j rn in vo v3 It •) A «to o o o o

8%

G

I

">0 t-, n coI •> *»o o

CVJ

C lO

VOin

ft6

a•to

at■HCO

JS

8*ofOo

■53■SCO

CVJ n">



- 31 -

T-ABEL : IVHasil kromatografi lapisan tipis dari fraksi petroleum eter dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat

Fasa gerakFraksi petroleum eter

Pembanding sitosterol

Warna noda Rf Warna noda Rf

n-heksana : etil asetat = 8 :2

biruungumerahungu

0,270,34*0,440,51

ungu 0,34

kloroform : etil asetat — 9 si

ungumerahmerah

*0,560,620,69

ungu 0,56

benzena : aseton = 15 : 1

ungubiruungu

0,37*0,43

0 , 5 0

biru 0,43

Keterang;an ;* * lif yang sama dengan pembanding



- 32 -

Gambar : 6. Kromatogram dari fraksi petroleum eter dengan sitosterol sebagai pembanding.Fasa diam ; Kieselgel 60 ^234 ( ■E* Merck )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : n-heksann : etil asetat = 8 : P Penampak noda; pereaksi anisaldehid asam sulfat

Keterangan :E : fraksi petroleum eter P : pembanding sitosterol K ; kristal



- 33 -

Gambar : 7. Kromatogram dari fraksi petroleum eter dengan sitosterol sebagai pembanding.Fasa diam : Kieselgel 60 $254. ( E* Merck )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : kloroform : etil asetat = 9 : 1 Penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat

Keterangan :E : fraksi petroleum eter P : pembanding sitosterol K : kristal



- 34 -

Gambar : 8 . Kromatogram dari fraksi petroleum eter dengan sitosterol sebagai pembanding.Fasa diam : Kieselgel 60 ( E. Merck )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : benzena : aseton = 15 : 1 Penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat

Keterangan :E : fraksi petroleum eter P : pembanding sitosterol



- 35 -

3. Hasil pemurnian steroid terhadap hasil isolasi dari kalus Solanum wrightii Benth dengan cara kromatografi kolom

Hasil pemurnian steroid terhadap hasil isolasi dari fraksi petroleum eter dengan cara kromatografi kolom diperoleh 40 fraksi. Selanjutnya dari masing-masing fraksi dilakukan pemeriksaan dengan kromatografi lapisan tipis. Fraksi-fraksi yang mempunyai harga Rf dan warna noda sama dikumpulkan, kemudian diuapkan.Dari fraksi-fraksi ini diperoleh kristal pada fraksi nomer delapan sampai nomer dua belas yang masih berwarna kekuningan.Setelah dilakukan pencucian dengan metanol dan rekrista- lisasi dengan kloroform-metanol diperoleh kristal ber v/arna putih.Sedangkan untuk fraksi aseton tidak diperoleh kristal. Hasil kromatografi lapisan tipis dari kromatografi.kolom terhadap fraksi petroleum eter dan fraksi aseton! dapat * dilihat pada gambar berikut ini :



ITomer fraksi -- *

Gambar 9« Hasil kromatografi lapisan tipis dari kromato - grafi kolom terhadap fraksi petroleum eter.Fasa diam : Kieselgel 60 F254 ( E * Merck )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : n-heksana : etil asetat = 8 : 2 Penampak noda ; pereaksi anisaldehid asam sulfat



- 37 -

n

7

t :

£ , Eh

o i 2 3 4 5 6 t o 9 i * i i i - u t * «•; i r f i t i ' t 1 9 r o » i ? ? ? :

Nomer fraksi

Gambar : 10. Hasil kromatografi lapisan tipis dari kromato - grafi kolom terhadap fraksi aseton.Fasa diam : Kieselgel 60 ^254. ( E> Merck )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak • kloroform : metanol » 9 # 1»5 penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat



- 38 -

4. Hasil pemeriksaan terhadap kristal hasil pemurnian4.1. Hasil pemeriksaan denrcan reaksi warna

Hasil pengamatannya tercantum pada tabel berikut :

TABEL : VHasil pemeriksaan dengan reaksi warna terhadap kristal hasil pemurnian

Zat, Li eb ermann-B ur chard Salkov/ski

Kristal biru Lapisan e.sam ber -warna merah, lapis-an kloroform tidakberwarna.

Pembanding biru Lapisan asam ber -sitosterol warna merah, lapis-

an kloroform tidakberwarna.

4.2. Hasil pemeriksaan dengan kromatografi lapisan tipis Hasil pemeriksaan terhadap kristal hasil pemurnian dengan kromatografi lapisan tipis tercantum pada tabel VI dan dapat dilihat pada gambar 11, gambar 1? dan gambar 13.



TABEL : VIHasil kromatografi lapisan tipis terhadap kristal hasil pemurnian dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat

Fasa gerakKristal Pembanding sito -

sterolWarna noda Rf Warna noda Rf

n-heksana : etil asetat * 8 : 2

ungu 0,33 ungu 0,33

kloroform : etil asetat = 9 : 1

ungu 0» 55 ungu 0,55

benzena s aseton - 15 s 1

ungu 0,31 ungu 0,31



- 40 -

Gambar : 11. Kromatogram dari kristal hasil pemurnian dengan sitosterol sebagai pembanding.Fasa diam : Kieselgel 60 $254. ( E * Merck )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : n-heksana : etil asetat = 8 : 2 Penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat

Keterangan :S : kristal hasil pemurnian P : pembanding sitosterol



- 41 -

Gambar : 12. Kromatogram dari kristal hasil pemurnian dengan sitosterol sebagai pembanding.Fasa diam : Kieselgel 60 $254. E* Merck )

dengan'tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : kloroform : etil asetat.= 9 : 1 penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat

Keterangan :S : kristal hasil pemurnian I :•pembanding sitosterol



- 42 -

Gambar : 13* Kromatogram dari kristal hasil pemurnian dengan sitosterol sebagai pembanding.Fasa diam : Kieselgel 60 1*254 ( Merc^ )

dengan tebal lapisan 0 , 2 0 mm Fasa gerak : benzena : aseton = 15 : 1 Penampak noda : pereaksi anisaldehid asam sulfat

Keterangan :S : kristal hasil pemurnian p : pembanding sitosterol



4 . 3 . Hasil pemeriksaan dengaji kromatografi gasHasil pemeriksaan dengan kromatografi gas terhadap kristal hasil pemurnian tercantum pada tabel VII, dapat dilihat pada gambar 14, gambar 15.

TABEL : VIIHasil kromatografi gas terhadap kristal hasil pemurnian

- 43 -

Zat Waktu retensi

Pembanding :- kolesterol- kampesterol- stigmasterol- sitosterol

16.00 menit20.00 menit2 1 . 5 0 menit24.50 menit

Kristal :- komponen I- komponen II- komponen III- komponen IV

16.00 menit 20, 50 menit22.00 menit25.00 menit



- 44 -

Gambar : 14* Hasil kromatografi gas dari campuran sterol sebagai pembanding.

Keterangan *:Alat : Kromatografi Gas Shimadzu tipe 9A, dengan data pro-

sesor CR3A Fasa diam : 0 V - 101 5 %Materi pendukung : Chromosorb W, 80 - 100 meshSuhu injektor : 300°CSuhu kolom ; 280°C, iso'termalSuhu detektor : 300°CDetektor : F.I.D.Gas pembav/a : NitrogenKecepatan aliran gas : 40 ml per menit Kolom : Gelas 3 m x 3 mm



- 45 -

Gambar : 15. Hasil kromatografi gas terhadap kristal hasil pe - murnian.

Keterangan :Alat : Kromatografi Gas Shimadzu tipe 9A, dengan data pro-

sesor CR3A Fasa diam : 0 V - 101 5 %Materi pendukung : Chromosorb W, 80 - 100 meshSuhu injektor : 300°CSuhu kolom ; 280°C, isotermalSuhu detektor : 300°cDetektor : F.I.D.Gas pembawa : NitrogenKecepatan aliran gas : 40 ml per menit Kolom : Gelas 3 m x 3 mm



- 46 -

Gambar : 16. Kalus Solanum wrightii Benth yang ditumbuhkan pada media Murashige dan Skoog, yang dimodifikasi dengan penambahan pi - sang ambon mentah



- 47 -

Gambar : 17. Sel kalus Solanum wrightii Benth dengan pembesaran 100 kali



BAB VPEMBAHASAN

Lari penelitian isolasi steroid diperoleh tiga fraksi, yaitu fraksi petroleum eter, fraksi aseton dan fraksi kloroform. Masing-masing fraksi dilakukan pemeriksaan secara kualitatif dengan kromatografi lapisan tipis, pada fraksi petroleum eter diperoleh tiga noda dengan fasa pe- rak kloroform : etil asetat = 9 : 1 dan benzena : aseton= 15 : 1 , sedangkan dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat = 8 : 2 diperoleh empat noda. Noda-noda tersebut ada salah satu yang mempunyai harga Rf dan warna noda sama dengan pembanding sitosterol. Hal ini raenunjukkan bahwa, . pada fraksi petroleum eter mengandung sterol. Selanjutnya untuk mendapatkan kristal sterolnya dilakukan dengan kromatografi kolom dan diperoleh kristal pada fraksi nomer ke 8 - 12, yang masih berwarna kekuningan. Setelah dila - kukan pencucian dengan metanol dan direkristalisasi de - ngan kloroform, maka didapatkan kristal berwarna putih.

Kristal hasil pemurnian dilakukan pemeriksaan secara kualitatif dengan reaksi warna, kromatografi lapjsan ti - pis dan kromatografi gas. Reaksi warna Liebermann - Bur - chard dan salkowski memberikan warna yang sama dengan pembanding sitosterol. Hasil kromatografi lapisan tipis diperoleh satu noda dengan warna dan harga Rf sama dengan pembanding sitosterol, dengan fasa gerak n-heksana : etil -

- 48 -



- 49 -

asetat = 8 : 2 diperoleh noda dengan harga Rf = 0,33, dengan fasa gerak kloroform : etil asetat = 9 : 1 diperoleh noda dengan harga Rf = 0,55, sedangkan dengan fasa gerak benzena : aseton = 15 : 1 diperoleh noda dengan harga Rf = 0,31. Kromatografi gas dilakukan untuk mengetahui kom - ponen dari sterol. Hasil kromatografi gas diperoleh empat puncak, dimana masing-masing pumcak merapunyai waktu re - tensi yang sama dengan waktu retensi pembanding sterol, yang terdiri dari kolesterol, stigmasterol, kampesterol, sitosterol. Dari waktu retensi dapat disimpulkan sterol hasil isolasi terdiri dari empat komponen. Untuk memasti- kan struktur dari komponen sterol dapat dilakukan pemeriksaan yang lain, yaitu dengan kromatografi gas - spektrofo - tometer massa.

Pada fraksi aseton diperoleh lima noda. Hasil pemurnian dengan kromatografi kolom tidak diperoleh kristal, sehingga pemeriksaan lebih lanjut tidak dilakukan.

Pada fraksi kloroform tidak diperoleh noda yang sama dengan pembanding solasodin maupun diosgenin, sehingga pemeriksaan lebih lanjut tidak dilakukan.



BAB VI KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat ditarik kesimpulan bahwa :Jenis steroid yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari kalus Solanum wrightii Benth adalah steroid golongan sterol yang terdiri dari empat komponen.

- 50 -



SARAN - SARANBAB VII

Dari keseluruhan penelitian dan hasil yang diperoleh, maka dikemukakan saran, yaitu :

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk memasti- kan struktur dari ke empat komponen sterol.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap senyawa yang ikut terekstraksi bersama sterol, misalnya triterpen.

- 51 -



BAB VIIIRINGKASAN

Telah dilakukan penelitian isolasi dan identifikasi steroid dari kalus Solanum wrightii Benth. Isolasi dilakukan dengan menggunakan tiga macam pelarut, yaitu petroleum eter, aseton dan kloroform sesuai dengan metoda Gu- nawan Indrayanto dan kawan-kawan.Untuk mendapatkan isolat murni atau kristal dari hasil i- solasi dilakukan dengan cara kromatografi kolom.

Kristal yang diperoleh, direkristalisasi dengan metanol-kloroform, kemudian diidentifikasi secara kualita-. tif dengan reaksi warna, kromatografi lapisan tipis dan kromatografi gas.

Hasil dari kromatografi lapisan tipis dengan menggunakan fasa. gerak n-heksana : etil asetat * 8 : 2 diperoleh satu noda "berwarna ungu dengan harga Rf = 0>33» de “ ngan fasa gerak kloroform : etil asetat = 9 : 1 diperoleh satu noda berwarna ungu dengan harga Rf = 0,55» sedangkan dengan fasa gerak benzena : aseton ® 15 : 1 diperoleh satu noda berwarna ungu dengan harga Rf = 0,31. Sebagai penampak noda digunakan pereaksi anisaldehid asam sulfat.

Hasil dari kromatografi gas diperoleh empat puncak, dimana masing-masing puncak mempunyai waktu retensi yang sama dengan waktu retensi zat pembanding sterol yang terdiri dari kolesterol, stigmasterol, kampesterol, sitosterol.

- 52 -



- 56 -

LAMPIRAN : I Pereaksi anisaldehid asam sulfat

R/ Anis aldehid 0,5 mlAsam asetat glasial 15 mlAsam sulfat pekat 5 mlMetanol 85 ml



ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STEROID DARI KALUS SOLANUM...

Documents

Transcript of ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STEROID DARI KALUS SOLANUM...