ISOLASI BAKTERI Bacillus thuringiensis DARI TANAH

DAN PENGUJIAN TOKSISITASNYA TERHADAP ULAT

GRAYAK (Spodoptera litura)

IKRA ALMA KHUDRA

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

ABSTRAK

IKRA ALMA KHUDRA. Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis dari Tanah dan Pengujian

Toksisitasnya terhadap Ulat Grayak (Spodoptera litura). Di bawah bimbingan NISA

RACHMANIA MUBARIK dan IMAN RUSMANA.

Bacillus thuringiensis (Bt) diketahui dapat menghambat pertumbuhan larva Lepidoptera

seperti ulat grayak (Spodoptera litura), yang menyebabkan banyak masalah di bidang pertanian.

Penghambatan aktivitas Bt disebabkan racun protein kristal yang diproduksi selama fase sporulasi.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi Bt dari berbagai contoh tanah dan uji toksisitas terhadap

larva ulat grayak instar kelima. Dua isolat berhasil diisolasi dari sampel tanah yaitu isolat 47 dan Lot 2. Isolat-isolat termasuk bakteri Gram positif, berbentuk batang, memiliki endospora

subterminal, dan kristal protein. Morfologi koloni isolat berbentuk bulat, berwarna putih, dan

tepian berkerut. Kedua isolat diuji dengan ulat grayak instar kelima dengan metode celup.

Toksisitas isolat lebih tinggi tetapi tidak berbeda secara signifikan jika dibandingkan dengan Bt

pembanding subsp. aizawai dan kontrol negatif. Kontrol negatif memiliki persentase kematian

yang cukup tinggi yaitu 72,5%.

Kata kunci: isolasi, Bacillus thuringiensis, Spodoptera litura, kristal protein.

ABSTRACT

IKRA ALMA KHUDRA. Isolation of Bacillus thuringiensis Bacteria from Soil and Test of

Toxicity to Armyworm (Spodoptera litura). Under direction of NISA RACHMANIA MUBARIK

and IMAN RUSMANA.

Bacillus thuringiensis (Bt) is known to inhibit growth of Lepidoptera larvae such as

armyworm (Spodoptera litura) larvae which cause many problem in agriculture. Inhibition activity

of Bt due to protein crystal toxin produced during sporulation phase. This study was aimed to

isolate Bt from various soil samples and to test its toxicity to the armyworm fifth instar larvae.

Two isolates was isolated from soil samples i.e. 47 and Lot 2 isolates. The isolates are Gram

positive rod-shaped, had subterminal endospores and crystals of proteins. Colony morphology of the isolates was round, white, and corrugate edge. Both of isolates were tested to the fifth instars of

armyworm larvae by immersion method. The toxicity of isolates was higher however it was not

significantly different with positive control (Bt subsp. aizawai) and the negative control. The

negative control had high percentage of mortality up to 72.5%.

Key words: isolation, Bacillus thuringiensis, Spodoptera litura, protein crystal.

ISOLASI BAKTERI Bacillus thuringiensis DARI TANAH

DAN PENGUJIAN TOKSISITASNYA TERHADAP ULAT

GRAYAK (Spodoptera litura)

IKRA ALMA KHUDRA

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Judul Skripsi : Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis dari Tanah dan Pengujian

Toksisitasnya terhadap Ulat Grayak (Spodoptera litura)

Nama : Ikra Alma Khudra

NIM : G34070065

Disetujui:

Pembimbing I

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.

NIP 19671127 199302 2 001

Pembimbing II

Dr. Iman Rusmana, M.Si.

NIP 19650720 199103 1 002

Diketahui,

Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.

NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga

karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis dari Tanah dan Pengujian Toksisitasnya terhadap Ulat Grayak (Spodoptera litura)” ini dilakukan

mulai Februari 2011 sampai dengan Agustus 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Nisa Rachmania Mubarik dan Bapak Iman

Rusmana atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Ucapan terima kasih juga disampaikan

kepada Ibu Kanthi Arum Widayati sebagai wakil komisi pendidikan atas saran dan diskusi yang

diberikan. Selanjutnya ungkapan terima kasih kepada Kak Jonatan, Mba Echa, Mba Maisya, Nia,

Susan, Adian, Rina, Yakub, Nita, Gesty, Anggi, Aya, Atun, Hokie, Debie, Faizal, Ari, dan seluruh

staf Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, serta teman-teman yang selama ini ikut

membantu terlaksananya penelitian ini khususnya di Biologi angkatan 44. Terima kasih juga untuk

keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan.

Bogor, Desember 2011

Ikra Alma Khudra

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pariaman Provinsi Sumatera Barat pada tanggal 12 November 1989

dari pasangan Alinurdin. A, S.Pd. dan Malidarni, M.Pd. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara.

Penulis lulus dari SMP Negeri 1 Pariaman pada tahun 2004, kemudian melanjutkan

pendidikan di SMA Negeri 1 Pariaman dan lulus tahun 2007. Setelah itu, penulis lulus seleksi

masuk jurusan Biologi di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk

IPB).

Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar

dan Mikrobiologi Dasar pada tahun 2010-2011. Selama di perkuliahan penulis menjadi anggota

organisasi mahasiswa daerah “Ikatan Pelajar Mahasiswa Minang” (IPMM) IPB. Penulis juga

pernah mengikuti berbagai seminar dan pelatihan seperti Seminar “Grand Opening Leadership

and Enterpreneurship School IPB 2009”, Seminar dan workshop PKM (Program Kreativitas

Mahasiswa) BEM FMIPA IPB Tahun 2009, dan terakhir Seminar PKM “Explore Your Creativity with PKM” IPB tahun 2011.

Pengalaman kepanitiaan penulis adalah sebagai panitia Lomba Cepat Tepat Biologi 2009,

panitia divisi publikasi dan dokumentasi SPIRIT (FMIPA Sport and Art contest) 2009, panitia

masa perkenalan departemen dan fakultas mahasiswa baru MPF dan MPD “G-FORCE 45”, panitia

divisi acara “Biologi Interaktif 2009”, dan sebagai ketua pelaksana “Biodiversity Biologi 44

2010”.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. vii

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................................. vii

PENDAHULUAN

Latar Belakang .................................................................................................................. 1

Tujuan .............................................................................................................................. 1

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................................................ 1 Bahan dan Alat ................................................................................................................. 1

Metode ............................................................................................................................. 1

Isolasi Bakteri Bt dari Berbagai Sampel Tanah.. ...................................................... 1

Peremajaan dan Pengamatan Mikrob ...................................................................... 1

Penyiapan Suspensi Isolat Bt untuk Uji Toksisitas. ................................................. 2

Pengujian Toksisitas Isolat Bt terhadap Ulat Grayak. ............................................. 2

HASIL

Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis dari Tanah. ............................................................... 2

Kurva Turbiditas Pertumbuhan Isolat Bt.. .......................................................................... 4

Aplikasi Isolat Bt terhadap Ulat Grayak. ............................................................................ 4

PEMBAHASAN.......................................................................................................................... 5

SIMPULAN ................................................................................................................................ 6

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 6

LAMPIRAN ................................................................................................................................ 8

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Perolehan isolat Bacillus dan persentase bakteri penghasil kristal protein dari sampel tanah ....... 2 2 Karakter morfologi isolat Bt hasil isolasi dan Bt pembanding .................................................... 3

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 (a) Sel Bt isolat 47, (b) sel Bt isolat Lot 2, (c) Bt pembanding subsp. aizawai,

dan (d) isolat Bt pembanding pakistani ..................................................................................... 3

2 (a) Kurva turbiditas pertumbuhan isolat 47, dan (b) kurva pertumbuhan isolat Lot 2 .................. 4

3 Diagram persentase kumulatif mortalitas larva ulat grayak instar lima sampai hari ke-4...............4

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Alur metode isolasi ................................................................................................................... 9

2 Koloni (a) isolat 47 dan (b) Lot 2 ........................................................................................... 10

3 Hasil pewarnaan Gram isolat (a) 47 dan (b) Lot 2 pada perbesaran 1000x ................................ 10

4 Hasil pengukuran kekeruhan biakan pada panjang gelombang 620 nm ..................................... 10

5 Aplikasi isolat ke ulat grayak .................................................................................................. 11

6 Ulat yang mati akibat perlakuan isolat pada hari ke-4 setelah perlakuan.................................... 11

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang Bakteri Bacillus thuringiensis (Bt)

merupakan salah satu jenis bakteri yang dapat

diisolasi langsung dari tanah, kotoran, dan

bagian tumbuhan, termasuk bakteri Gram

positif, membentuk spora dan fakultatif

saprofit tanah (U.S. EPA 1998). Bakteri ini

dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang

dapat membunuh hama beberapa golongan

serangga seperti Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera dan

Mallophaga (Bravo et al. 1998). Bt dapat

menghasilkan senyawa protein yang dapat

merusak saluran pencernaan hama serangga

salah satunya hama ulat grayak (Spodoptera

litura).

Ulat grayak adalah salah satu hama yang

bersifat polifag atau dapat menyerang

berbagai jenis tanaman pangan, sayuran, dan

buah-buahan. Hama ini termasuk ke dalam

famili Noctuidae dan Ordo Lepidoptera (Ginting 1991). Ulat grayak tersebar luas di

daerah dengan iklim panas dan lembab dari

subtropis sampai daerah tropis. Berdasarkan

data Direktorat Perlindungan Tanaman

(2008), serangan ulat grayak pada tanaman

kedelai di Indonesia mencapai 1.316 ha pada

tahun 2006.

Serangan tersebut terus meningkat seiring

peningkatan produksi tanaman. Besarnya

kerugian yang ditimbulkan akibat hama ulat

grayak terhadap pertanian menyebabkan perlunya dilakukan usaha-usaha untuk

menanggulangi masalah ini.

Biopestisida yang diproduksi dari isolat

Bt merupakan salah satu alternatif yang sangat

menjanjikan terhadap gangguan hama ulat

grayak. Biopestisida tidak menyebabkan

kerusakan lingkungan, spesifik membunuh

hama ulat grayak, mudah terdegradasi oleh

lingkungan, dan dapat dinaikkan patogenisitas

nya dengan teknik rekayasa genetika (Khetan

2001).

Pengendalian hayati hama ulat grayak dengan menggunakan toksin Bt ini perlu

dilakukan karena dampak yang ditimbulkan

oleh penggunaan pestisida kimiawi cukup

besar. Dampak negatif tersebut antara lain

mematikan serangga bukan sasaran,

menyebabkan resistensi serangga terhadap

bahan aktif insektisida kimia tertentu,

menyebabkan terjadinya resurgensi hama,

serta dapat menimbulkan pencemaran

lingkungan (Situmorang et al. 1993).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mengisolasi

bakteri Bt dari berbagai sampel tanah serta

menguji toksisitasnya terhadap ulat grayak (S.

litura).

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan

Februari 2011 sampai Agustus 2011 di Labo-

ratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah sampel

tanah dari Kabupaten Sukadana-Lampung,

Tabanan-Bali, Lempake-Kalimantan Timur;

media Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth

(NB), daun talas untuk makanan ulat, larutan

Tween 80, aquades steril. Ulat grayak untuk

perlakuan diperoleh dari Departemen Hama

dan Proteksi Tanaman IPB. Alat-alat

laboratorium yang digunakan ialah cawan

Petri, vortex, laminar, autoklaf, penangas, mikroskop cahaya, spektrofotometer, pipet

mikro, serta peralatan lain yang biasa

digunakan di laboratorium mikrobiologi.

Metode

Isolasi Bakteri Bt dari Berbagai

Sampel Tanah. Isolasi dilakukan dengan cara

mensuspensikan 3 gram contoh tanah ke

dalam 30 ml garam fisiologis 0,85% steril

dalam botol Schott. Suspensi tersebut

kemudian dikocok dengan alat pengocok

selama beberapa menit, kemudian diberikan perlakuan panas pada suhu 80 oC selama 10

menit. Selanjutnya suspensi diencerkan serial

sampai pengenceran 10-4 dengan garam

fisiologis. Dari masing-masing pengenceran

10-3 dan 10-4 secara aseptik diambil suspensi

sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet

mikro dan dicawankan dengan metode cawan

sebar pada medium NA dengan dua kali

ulangan. Cawan-cawan tersebut selanjutnya

diinkubasikan dengan posisi terbalik pada

suhu 28 0C selama 48 jam (Rusmana & Hadioetomo 1994).

Peremajaan dan Pengamatan Mikrob.

Koloni hasil sebar yang terpisah dengan baik,

diamati menggunakan mikroskop cahaya

dengan perbesaran 1000 kali. Bakteri yang

memiliki ciri khas bakteri Bt yaitu memiliki

kristal protein di dalam sel, kemudian digores

dengan metode kuadran di cawan NA dan

dipindahkan ke agar-agar miring NA untuk

stok.

2

Penyiapan Suspensi Isolat Bt untuk

Uji Toksisitas. Jumlah sel dari isolat bakteri

yang sudah didapat, dihitung jumlah selnya

menggunakan metode cawan sebar dan

turbidimetrik. Jumlah sel yang diperoleh

dari hitungan cawan tersebut dibandingkan

dengan nilai OD (optical density) pada

panjang gelombang 620 nm menggunakan

spektrofotometer sehingga didapat kurva

standar isolat. Selain itu dilakukan

pengukuran kurva pertumbuhan isolat Bt hasil isolasi untuk mengetahui waktu spora

diproduksi secara maksimal.

Pengujian Toksisitas Isolat Bt

terhadap Ulat Grayak. Pengujian

dilakukan dengan memberi makan 10 larva

S. litura instar lima untuk masing-masing

isolat uji dengan potongan daun talas yang

telah dicelupkan dalam suspensi isolat

bakteri umur 52 jam dan larutan Tween 80

lalu selama beberapa menit dibiarkan kering

udara. Perlakuan ini dibuat lima kali ulangan.

Sebagai kontrol digunakan potongan-

potongan daun yang dicelup ke dalam

akuades steril, sedangkan pembanding

digunakan potongan-potongan daun yang

dicelup ke dalam suspensi B. thuringiensis

subsp. aizawai. Larva-larva uji ditempatkan

pada wadah plastik yang ditutup dengan

kain kasa.

Rancangan percobaan yang digunakan

ialah rancangan acak lengkap dengan 5 kali

ulangan. Pengamatan dilakukan terhadap

persentase kumulatif mortalitas ulat setiap

hari selama empat hari berturut-turut. Data

yang diperoleh kemudian disajikan di dalam

tabel persentase mortalitas dan dianalisis

melalui grafik mortalitas kumulatif.

HASIL

Isolasi Bakteri Bacillus thuringiensis dari Tanah. Hasil isolasi dari 15 sampel

tanah yang diperiksa didapatkan 453 koloni

bakteri dengan ciri-ciri seperti genus

Bacillus. Dua isolat (11,3%) dari total koloni

Bacillus yang diperiksa memiliki ciri-ciri

koloni dan mikroskopis mirip Bt (Tabel 1).

Koloni Bt secara umum memiliki ciri-ciri

berwarna putih, besar koloni 5-10 mm,

tepian sedikit berkerut atau bergelombang,

elevasi timbul, dan memiliki permukaan

yang kasar. Dua koloni yang memiliki kristal protein hasil isolasi tersebut berasal

dari sampel tanah asal Kabupaten Lempake-

Kalimantan dengan kode isolat 47, dan

sampel tanah dari Kabupaten Tabanan-Bali

dengan kode Lot 2 (Tabel 1).

Tabel 1 Perolehan isolat Bacillus dan persentase bakteri penghasil kristal protein dari sampel Tanah

Keterangan: *memiliki kristal protein

No Asal tanah Jumlah

sampel

Kode

sampel

tanah

Jumlah

endospora

Bacillus/gram

tanah

Koloni

Bacillus

yang

diamati

Bakteri

penghasil

kristal

protein

Persentase

isolat

Bt/isolat

Bacillus

1 Lampung 4 L1

L2 L3

L4

1,2x105

1,2x106

7,3x104

1,7x105

8

37 4

5

0

0 0

0

0

0 0

0

2 Kalimantan

Timur

8 43

44

45

46

47*

48

49

50

2,7x104

2,9x105

2,4x106

1,4x105

3,7x104

4,7x105

1,3x105

3x104

8

32

84

25

11

84

21

9

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

9

0

0

0

3

Bali 3 Lot 1

Lot 2*

Lot 3

5,3x105

5,3x105

9,3x108

32

43

50

0

1

0

0

2,3

0

Total 15 453 2 11,3

3

Sementara itu sampel dari tanah

Lampung dengan kode isolat L1 sampai L4

tidak didapatkan satupun koloni Bacillus

yang memiliki kristal protein. Sebelumnya

pada tahap isolasi dilakukan renjatan panas

dengan suhu 80 0C selama 10 menit untuk

mematikan sel vegetatif bakteri serta

mematahkan dormansi endospora sehingga

koloni-koloni yang tumbuh pada media NA

semuanya berasal dari endospora (Rusmana

& Hadioetomo 1994). Secara mikroskopis, dapat dilihat

bentuk sel bakteri yang diduga Bt hasil

isolasi memiliki bentuk sel batang, memiliki

kristal protein, panjang 3-5 µm, dan lebar 1-

2 µm. Ciri-ciri ini sama dengan Bt subsp.

aizawai dan pakistani yang digunakan

sebagai pembanding (Gambar 1).

Sel-sel bakteri hasil isolasi yang diduga

Bt, memiliki kristal protein yang terletak

bersebelahan dengan letak spora yang

subterminal (Tabel 2). Pengamatan lekapan

basah isolat di bawah mikroskop cahaya

dilakukan pada jam ke-48 ketika isolat-isolat

telah mengalami sporulasi.

Hasil pengamatan karakter morfologi

menujukkan bentuk koloni yang sama

dengan Bt pembanding yaitu koloni

berbentuk bulat, tepian berkerut, elevasi

timbul, permukaannya kasar, dan berwarna

putih. Pengamatan mikroskopis di bawah mikroskop cahaya perbesaran 1000x

memperlihatkan bentuk sel batang. Isolat 47

memiliki bentuk sel batang namun agak

pendek. Sel menghasilkan endospora

berbentuk oval dengan letak subterminal.

Hasil preparat lekapan basah terlihat bakteri

Bt bersifat motil dan termasuk ke dalam

bakteri Gram positif dengan pewarnaan

Gram.

Gambar 1 (a) Sel Bt isolat 47, (b) isolat Lot 2, (c) Bt pembanding subsp. aizawai dan (d) Bt sp.

pakistani. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 1000x.

K= kristal, S= endospora.

Tabel 2 Karakter morfologi isolat Bt hasil isolasi dan Bt pembanding

No Isolat Bt Morfologi

koloni Bentuk sel

Endospora Gram Motilitas

Bentuk Letak

1

2

3 4

47

Lot 2

Bt aizawai Bt pakistani

Bulat

Bulat

Bulat Bulat

Batang pendek

Batang

Batang Batang

Oval

Oval

Oval Oval

Subterminal

Subterminal

Subterminal Subterminal

+

+

+ +

Motil

Motil

Motil Motil

a b

c d

K

S

K

S

K

S

K

S

10 µm

10 µm 10 µm

10 µm

4

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

OD

620 n

m

Waktu (jam)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

OD

620 n

m

Waktu (jam)

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

47

Lot 2

Bt aizawai

kontrol negatif

Hari

mort

alit

as(%

)

Gambar 2 (a) Kurva turbiditas pertumbuhan

isolat 47, dan (b) Lot 2.

Kurva Turbiditas Pertumbuhan Isolat

Bt. Berdasarkan kurva turbiditas pertumbuhan di atas dapat dilihat aktivitas pertumbuhan

bakteri isolat, baik isolat 47 maupun Lot 2

mengalami fase eksponensial pada jam ke-4

sampai jam ke-8.

Setelah jam ke-8 pertumbuhan mencapai

fase stasioner sampai akhir pengukuran kurva

yaitu pada jam ke-36. Pada saat mencapai fase

stasioner (jam ke-8) dilakukan penghitungan

jumlah sel dengan metode cawan sebar.

Jumlah sel isolat pada saat stasioner mencapai

1,56x107 sel/ml untuk isolat 47, dan 1,5x107

sel/ml untuk isolat lot 2.

Aplikasi Isolat Bt terhadap Ulat

Grayak. Isolat yang digunakan untuk

perlakuan ialah isolat-isolat yang berumur 52

jam. Hal ini dimaksudkan agar kristal protein

sudah terbentuk di dalam sel. Kristal protein

akan terbentuk seiring terjadinya sporulasi.

Pada pengamatan sebelumnya, isolat-isolat

baru mengalami fase sporulasi setelah jam ke- 48.

Aplikasi isolat kepada ulat grayak

dilakukan selama empat hari. Kemudian ulat

yang mati dengan ciri-ciri akibat perlakuan Bt

seperti tubuh berwarna coklat hitam,

mengkerut, melengkung, kering dan kaku

diamati dan dilihat persentase kumulatif

kematiannya.

Pemberian isolat tampak efektif pada hari

ke-1 hingga hari ke-2. Persentase kematian

ulat pada hari ke-1 mencapai 17,5% (sampel 47) dan 22,5% (sampel Lot 2). Pada hari ke-2,

kematian ulat mencapai 35% (sampel 47) dan

42,5% (sampel Lot 2). Jika dibandingkan

dengan kontrol negatif dan Bt pembanding,

hasil ini cukup baik sampai hari ke-2.

Memasuki hari ke-3 hasil pemberian isolat

tampak tidak sesuai dengan dugaan

sebelumnya karena persentase kematian ulat

kontrol cukup besar mencapai 62,5%.

Hasil pemberian perlakuan isolat terhadap

ulat grayak pada hari keempat dapat menyebabkan mortalitas ulat sampai 95%

untuk isolat 47 dan 87,5% untuk isolat Lot 2,

sementara persentase mortalitas ulat yang

diberi perlakuan Bt pembanding subsp.

aizawai lebih rendah dari isolat yaitu 85%

(Gambar 3). Perlakuan kontrol negatif

memiliki presentase kematian yang cukup

besar yaitu sampai 62,5% pada hari ke-3 dan

72,5% pada hari ke-4.

Gambar 3 Diagram persentase kumulatif mortalitas larva ulat grayak instar lima sampai hari ke-4.

a.

b.

47

Lot 2

Bt aizawai

Kontrol negatif

5

PEMBAHASAN

Bakteri Bacillus merupakan bakteri yang

umum menghuni tanah dan memiliki

endospora. Endospora merupakan bentuk

dorman bakteri-bakteri tertentu dan bersifat

tahan terhadap suhu tinggi, sinar ultraviolet, sinar-X, bahan kimia, dan pengeringan. Selain

adanya endospora, beberapa Bacillus seperti

halnya B. thuringiensis memiliki strktur yang

disebut kristal protein. Kristal protein ini

adalah ciri khas bakteri Bt. Kemampuannya

membentuk kristal (tubuh paraspora)

bersamaan dengan pembentukan spora, yaitu

pada waktu sel mengalami sporulasi. Kristal

tersebut merupakan kompleks protein yang

mengandung toksin (δ-endotoksin) yang

terbentuk di dalam sel 2-3 jam setelah akhir fase eksponensial dan baru keluar dari sel

pada waktu sel mengalami autolisis setelah

sporulasi sempurna (Trizelia 2001).

Kristal protein tersusun dari subunit-

subunit protein yang berbentuk batang atau

halter, mempunyai berat molekul 130 – 140

kDa yang berupa protoksin. Protoksin akan

menjadi toksin setelah mengalami hidrolisis

dalam kondisi alkalin di dalam saluran

pencernaan serangga. Hidrolisis ini

melepaskan protein kecil dengan berat

molekul sekitar 60 kDa dan bersifat toksik (Trizelia 2001).

Kristal protein ini disandikan oleh gen

yang dikenal sebagai gen cry. Sampai saat ini

hampir 300 gen cry telah diidentifikasi dan

diklasifikasikan ke dalam 51 kelompok dan

subkelompok berdasarkan kesamaan urutan

asam amino (Crickmore et al. 1998).

Pengklasifikasikan galur Bt didasarkan atas

metode fenotipik menggunakan serotipe H

yang memungkinkan diferensiasi galur

serotipe dan subspesies berdasarkan antigen flagellar (Moraga 2004).

Daya racun Bt juga berbeda pada setiap

inang. Hal ini disebabkan oleh gen cry yang

menyandikan kristal protein pada setiap galur

Bt. Gen cryI diketahui efektif untuk

mengendalikan hama Lepidoptera, gen cryII

untuk Diptera dan Lepidoptera, Coleoptera

(cryIII), Diptera (cryIV), atau Coleoptera dan

Lepidoptera (cryV). Selain itu pada beberapa

galur Bt juga terdapat gen cyt yang

menyandikan faktor cytolytic nonspesifik

(Crickmore et al. 1998). Hasil isolasi dari beberapa contoh tanah

yang telah dilakukan, didapatkan 453 koloni

bakteri dengan ciri-ciri seperti genus Bacillus.

Dua isolat (11,3%) dari total koloni Bacillus

yang diperiksa memiliki ciri-ciri koloni dan

mikroskopis mirip Bt. Rendahnya perolehan

bakteri hasil isolasi kemungkinan besar

dipengaruhi oleh kandungan spora bakteri

penghasil kristal di dalam contoh tanah dan

viabilitas sporanya. Dalam hubungannya

dengan habitat tersebut, diperlukan pengambilan sampel berulang kali karena

penemuan bakteri entomopatogenik pada

suatu saat tertentu dipengaruhi oleh banyak

faktor antara lain hujan dan berbagai faktor

lainnya. Ada kemungkinan pada saat

pengambilan sampel ditemukan bakteri

entomopatogenik di suatu tempat tertentu

tetapi pada saat lain tidak dapat ditemukan

lagi dan sebaliknya (Salaki 2009). Tingkat

kelembaban dan pencemaran tanah oleh polusi

udara dapat juga menjadi faktor sedikitnya perolehan spora Bt.

Perlakuan renjatan panas pada tahap

isolasi dilakukan untuk mematahkan dormansi

endospora dan mematikan sel-sel vegetatif

yang terdapat dalam contoh tanah yang akan

diperiksa. Bakteri Bt memiliki ciri koloni

seperti bewarna putih berbentuk bulat, tepian

berkerut atau bergelombang, elevasi timbul,

dan permukaannya kasar (Rusmana &

Hadioetomo 1994).

Hasil kurva turbiditas pertumbuhan

menunjukkan isolat-isolat mengalami akhir fase eksponensial pada jam ke-8 dan

dilanjutkan fase stasioner. Menurut

Sembiring & Fachmiasari (2004), bakteri

mencapai puncak pertumbuhan pada waktu

yang berbeda bergantung pada media

pertumbuhan yang digunakan. Fase

pertumbuhan eksponensial dapat juga berbeda

karena perbedaan kemampuan bakteri untuk

tumbuh pada jenis media pertumbuhan yang

tersedia.

Pembentukan kristal protein bersamaan waktunya dengan peristiwa sporulasi,

umumnya terjadi 2-3 jam setelah pertumbuhan

eksponensial berakhir (Sembiring &

Fachmiasari 2004). Berdasarkan pengamatan

yang telah dilakukan, isolat 47 maupun Lot 2

mengalami sporulasi pada jam ke-48.

Sporulasi ini diduga dipengaruhi oleh aktivitas

quorum sensing yang dimiliki bakteri

Bacillus.

Bakteri quorum sensing menghasilkan

dan mengeluarkan molekul sinyal yang

disebut autoinducers (AI) yang meningkat seiring konsentrasi sel. Pendeteksian AI akan

mengarah ke perubahan ekspresi gen. Bakteri

Gram positif dan Gram negatif menggunakan

komunikasi quorum sensing untuk meregulasi

berbagai kegiatan fisiologis seperti virulensi

bakteri patogen, simbiosis, kompetensi,

6

konjugasi, produksi antibiotik, motilitas,

sporulasi, dan, pembentukan biofilm (Melissa

& Bonnie 2001). Pada umumnya autoinducer

pada Gram positif menggunakan senyawa

peptida yang dihasilkan melalui jalur ATP

Binding Cassette (ABC) (Rukayadi & Hwang 2009).

Pengaplikasian dilakukan terhadap 10

larva instar lima untuk setiap perlakuan. Ulat

grayak diberi makan daun talas yang

sebelumnya sudah dicelup ke dalam campuran

isolat dan 4% larutan Tween 80. Larutan ini

berfungsi untuk membantu melekatkan spora

dan kristal protein pada makanan ulat.

Suspensi isolat yang diberikan berumur 52

jam (waktu sporulasi) sehingga isolat

memiliki jumlah spora 107-108 spora/ml. Secara kumulatif pemberian perlakuan isolat

terhadap ulat grayak pada hari keempat dapat

menyebabkan mortalitas ulat sampai 95%

untuk isolat 47 dan 87,5% untuk isolat Lot 2,

sementara persentase mortalitas ulat yang

diberi perlakuan Bt pembanding subsp.

aizawai lebih rendah dari isolat yaitu 85%

(Gambar 3). Hal ini mungkin terjadi karena

subsp. Bt yang digunakan sebagai

pembanding adalah Bt subsp. aizawai yang

kurang efektif untuk membunuh Lepidoptera

(Sembiring 2004). Pada data perlakuan terlihat kontrol negatif memiliki presentase

kematian yang cukup besar yaitu sampai

62,5% pada hari ke-3 dan 72,5% pada hari ke-

4. Hasil ini kemungkinan disebabkan oleh

tidak terkontrolnya faktor lingkungan saat

pengaplikasian seperti suhu ruangan, cahaya,

dan kelembababan. Menurut Trizelia (2001),

radiasi UV sinar matahari dan suhu tinggi

menyebabkan kristal protein bersifat labil.

Selain itu pH permukaan daun yang tinggi

juga dapat menyebabkan daya racun Bt menurun.

Standar deviasi persentase pada hari ke-4

berkisar dari 5 sampai 9,5742 yang

menunjukkan data cukup beragam. Hal sama

terjadi pada hari ke-1 hingga ke-3 yang

memperlihatkan keragaman data yang cukup

besar. Untuk itu, aplikasi isolat terhadap hama

ulat dengan memperhatikan faktor eksternal

atau lingkungan bioassay perlu dilakukan

untuk mengetahui keefektifan toksisitas isolat

terhadap ulat grayak (S. litura).

Mekanisme toksisitas dimulai dari hari ke-1 sampai hari ke-4 setelah aplikasi. Kristal

protein yang masuk ke dalam saluran

pencernaan ulat bersama makanan, akan

diaktivasi oleh suasana basa yang terdapat

pada usus ulat. Kristal protein yang

mengandung d-toksin akan diubah menjadi

protoksin dan akhirnya menjadi toksin yang

teraktivasi. Kemudian toksin ini akan

menempel pada reseptor yang terdapat pada

sel epitelium usus ulat. Selanjutnya terjadi

perforasi membran usus dan ulat akan

mengalami gangguan pencernaan dan pada akhirnya akan mati.

Ulat yang mati akibat perlakuan Bt dapat

diamati dari ciri-ciri fisik seperti tubuh

berwarna coklat atau hitam, mengkerut,

melengkung, kering dan kaku. Menurut

Trizelia (2001), infeksi Bt tidak selalu

mematikan larva, larva masih mampu

bertahan hidup dan berhasil menjadi pupa dan

imago, tetapi imago yang terbentuk tersebut

biasanya berukuran kecil, cacat, lama

hidupnya lebih pendek dan kemampuan meletakkan telurnya berkurang atau mandul.

Hasil pemberian isolat tampak cukup baik

pada hari ke-1 sampai 2, namun pada hari ke-

3 dan ke-4 kontrol negatif memperlihatkan

hasil yang tidak sesuai dengan harapan.

Kontrol negatif memiliki nilai presenatase

kematian yang besar dibanding hari

sebelumnya.

SIMPULAN

Hasil isolasi Bacillus didapatkan 2 isolat

bakteri penghasil kristal protein dari total 453

isolat yaitu isolat 47 dan Lot 2 yang berasal dari Lempake Kalimantan Timur dan Tabanan

Bali. Isolat hampir sama dan sesuai dengan

ciri-ciri Bt pembanding aizawai dan pakistani

yaitu memiliki koloni berwarna putih, tepian

berkerut atau bergelombang, elevasi timbul,

dan permukaannya kasar. Toksisitas isolat-

isolat lebih tinggi namun tidak berbeda nyata

daripada Bt pembanding subsp. aizawai dan

kontrol negatif. Kontrol negatif memiliki

presentase kematian yang cukup tinggi yaitu

72,5%.

DAFTAR PUSTAKA

Bravo A et al.1998. Characterization of cry

genes in a Mexican Bacillus thuringiensis

galur collection. Appl Environ Microbiol

64: 4965-4972.

Crickmore N et. al. 1998. Revision of the

nomenclature for the Bacillus

thuringiensis pesticidal crystal proteins.

Microbiol Mol Biol Rev 62: 807–813.

Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan.

2008. Laporan luas dan serangan hama dan penyakit tanaman pangan di

Indonesia. Jakarta: Direktorat

Perlindungan Tanaman Pangan.

7

Ginting BB. 1991. Mengenal Spodoptera

litura hama yang menyerang banyak

tanaman. Media Unika Majalah Ilmiah

Unika Santo Thomas Sumatera Utara 2:

26-35.

Khetan SK. 2001. Microbial Pest Control. New York: Marcel Dekker Inc.

Melissa BM, Bonnie LB. 2001. Quorum

sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 55: 165-199.

Moraga QE, Tovar, GE, Garcia VP, Alvarez

SC. 2004. Isolation, geographical

diversity and insecticidal activity of

Bacillus thuringiensis from soils in Spain.

Microbiol Res 159: 59-71

Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan

quorum sensing: suatu pendekatan baru dalam mengatasi infeksi bakteri.

Medicinus 22: 22-27.

Rusmana I, Hadioetomo RS. 1994. Isolasi

Bacillus thuringiensis berl. dari

peternakan ulat sutra dan toksisitasnya

terhadap larva Crocidolomia binotalis

zell. dan Spodoptera litura F. Hayati 21-

23.

Salaki CL, Situmorang J, Sembiring L. 2009.

Isolation and Characterization of

Indonesian indigenous bacteria (Bacillus

thuringiensis) which are potential for biological control agent against cabbage

heart caterpillar (Crocidolomia binotalis

Zell). Biota 1: 1-6.

Sembiring T, Fachmiasari AS. 2004.

Kombinasi ekstrak kedelai dengan tepung

jagung dan tapioka sebagai media

produksi kristal dan spora Bacillus

thuringiensis. J Tekno Indones 27: 33-49.

Situmorang J, Sembiring L, Sumarmi S. 1993. Eksplorasi bakteri entomopatogenik

sebagai agen pengendali hayati serangga

hama Plutella, Spodoptera dan Heliothis.

J Mat Sains. 1:1-10.

Trizelia. 2001. Pemanfaatan Bacillus

thuringiensis untuk pengendalian hama

Crocidolomia binotalis [disertasi]. Bogor:

Program Pascasarjana, Institut Pertanian

Bogor.

[U.S.EPA] United States Environmental

Protection Agency. 1998. Registration Eligibility Decission (RED) Bacillus

Thuringiensis. Prevention, Pesticides

,and Toxic Substances. Washington DC:

U.S. EPA.

8

LAMPIRAN

9

Lampiran 1 Alur metode isolasi

3 gram sampel tanah + 30 ml

garam fisologis 0.85 %

Dilakukan penyebaran di

cawan NA sebanyak 0.1 ml

dari pengenceran 10-3 dan 10-4

Diberikan renjatan panas 80o C

selama 10 menit

Dilakukan penggoresan di

cawan NA

Dilakukan pengamatan

mikroskopis

Perbesaran 1000 kali

Koloni Bacillus tidak terpisah

dengan baik

Pengenceran serial 10-2 – 10-4

(1 ml ke dalam 9 ml garam fisiologis 0.85%)

Koloni Bacillus terpisah

dengan baik

Sel mirip Bt (memiliki spora

dan kristal)

Dimurnikan dengan metode

cawan gores

Dipindahkan ke media agar

miring NA untuk stok

10

Lampiran 2 Koloni isolat (a) 47 dan (b) Lot 2

Lampiran 3 Hasil pewarnaan Gram isolat (a) 47 dan (b) Lot 2 pada perbesaran 1000x

Lampiran 4 Hasil pengukuran kekeruhan biakan pada panjang gelombang 620 nm

no jam

ke

47 Lot 2

tanpa rejatan

panas

rejatan

panas

tanpa rejatan

panas

rejatan

panas

1 0 0,001 0,001 0,002 0,002

2 2 0,033 0,033 0,023 0,023

3 4 0,147 0,147 0,115 0,115

4 6 0,66 0,66 0,436 0,436

5 8 1,077 1,077 0,878 0,878

6 10 1,097 1,097 0,987 0,987

7 12 1,162 1,162 1,018 1,018

8 14 1,149 1,161 1,021 1,038

9 16 1,146 1,192 1,021 1,123

10 18 1,134 1,18 1,034 1,184

11 20 1,119 1,154 1,037 1,183

12 22 1,108 1,171 1,022 1,163

13 24 1,075 1,134 0,991 1,131

14 26 1,077 1,143 0,986 1,128

15 28 1,051 1,114 0,961 1,1

16 30 1,108 1,139 1,008 1,162

17 32 1,107 1,148 1,011 1,167

18 34 1,107 1,189 1,007 1,174

19 36 1,104 1,221 1,007 1,179

(b) (a)

(b) (a)

11

Lampiran 5 Aplikasi isolat ke ulat grayak

Lampiran 6 Ulat yang mati akibat perlakuan isolat pada hari ke-4 setelah perlakuan