Iman Permana

5/11/2018 Iman Permana - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/iman-permana-55a232b70e896 1/12

Studi Mutasi A3243G DNA Mitokondria dan Pewarisannya

pada Penderita Diebetes Melitus Tipe 2 Menggunakan PCR-RFLPIman Permana Maksum*, Toto Subroto*, Anas Subarnas**,

Budhi Prihartanto**Amelia Fauziana*, Neti*

*Jurusan Kimia FMIPA Unpad

** Jurusan Farmasi FMIPA UnpadJalan Raya Jatinangor-Sumedang Km 21

Jatinangor, Jawa Barat

ABSTRAK

Diabetes mellitus tipe 2 (DM tipe 2) merupakan salah satu penyakit kronis yang

banyak terjadi di Indonesia dengan jumlah penderita yang semakin meningkat. Keterlibatan

faktor genetik dan faktor lingkungan menjadikan studi genetik mengenai penyakit ini menjadi

sangat penting. Salah satu bentuk DM tipe 2 ini adalah Maternal Inherited Diabetes and

Deafness (MIDD) yang disebabkan oleh adanya mutasi DNA mitokondria (mtDNA).

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi mutasi heteroplasmi A3243G pada gen

tRNALeu mtDNA manusia Indonesia dan pewarisannya pada penderita DM tipe 2 dengan

memanfaatkan teknologi PCR-RFLP ( Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragments

Length Polymorphism). Sampel yang digunakan adalah sel darah yang diambil secara acak

dari 101 subjek manusia Indonesia penderita DM tipe 2 dan dua generasi keturunan dari

sampel positif mutasi A3243G. mtDNA diisolasi dari sel limfosit, dan gen tRNALeu mtDNA

diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan primer D1/D2. Fragmen 294 pb hasil PCR

dimurnikan dengan metode presipitasi etanol dan dikarakterisasi dengan menggunakan enzim

restriksi ApaI untuk mengidentifikasi mutasi A3243G. Hasil penelitian ini menunjukkan

adanya mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria penderita diabetes

mellitus tipe 2 di Indonesia dengan tingkat prevalensi 2% dan tidak dapat mendeteksi mutasi

pada dua generasi selanjutnya dikarenakan tingkat mutasi heteroplasmi yang rendah .

PENDAHULUAN

Faktor genetik sangat berperan dalam timbulnya penyakit diabetes mellitus tipe 2

selain karena faktor lingkungan. Gen-gen pada DNA mitokondria manusia (mtDNA) menjadi

salah satu kemungkinan penyebab diabetes mellitus tipe 2 karena fosforilasi oksidatif yang

terjadi di mitokondria memainkan peranan yang penting dalam sekresi insulin oleh sel β

pankreas saat terjadinya respon glukosa dan nutrien yang lainnya dalam tubuh [Kadowaki et

Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya

pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

1



al ., 1994]. Mutasi gen pada mtDNA ini menyebabkan suatu bentuk diabetes tipe 2 yang

dikenal dengan MIDD (Maternal Inherited Diabetes and Deafness). Bentuk diabetes ini

dikarakterisasi oleh diagnosis pada usia di atas usia 25 tahun, terjadi gangguan pada sekresi

insulin dan sering diikuti oleh melemahnya indera pendengaran [Malecki et al ., 2001].

Beberapa penelitian mengenai mutasi gen mtDNA yang berhubungan dengan diabetes

mellitus tipe 2 ini telah dilakukan di berbagai populasi di Jepang, Korea, China, Prancis,

Australia, Inggris, Belanda dan Polandia dan terdapat beberapa mutasi gen yang telah

dilaporkan, diantaranya yang paling banyak ditemukan adalah mutasi titik A3243G pada gen

tRNALeu [Malecki et al ., 2001; Ohkubo et al ., 2001 ; Lee et al ., 1997; Froguel & Hager, 1995;

Ng et al ., 2001; t’Hart et al ., 1994; and Saker et al ., 1997]. Mutasi ini terjadi pada sisi

pengikatan DNA mitokondria untuk protein promotor terminasi transkripsi pada batas antara

RNA ribosom 16S dan gen tRNALeu. Mutasi ini tidak hanya mempengaruhi sintesis dari

tRNALeu tetapi juga menggangu mekanisme pengikatan faktor terminasi transkripsi, yang

dapat menyebabkan terganggunya sintesis dari protein-protein mitokondria [Kadowaki et al .,

1994].

Penelitian ini merupakan bagian dari upaya untuk mendapatkan data base varian

normal dan tidak normal mtDNA manusia Indonesia dan produk translasinya dengan

memanfaatkan teknologi PCR. Pada penelitian sebelumnya telah ditemukan 67 variasi

nukleotida mtDNA 41 manusia Indonesia normal baik pada daerah penyandi maupun non

penyandi, yaitu pada posisi 5.042-6384 (fragmen X), 11.580-13.200 (fragmen F), 15.978-

16.420 (fragmen M) urutan Anderson [Triraharjo, 1998; Puspasari, 1998; Gaffar, 1998;

Rachmayanti, 2000; Wayan, 2001; Maksum, I.P., 2002].Selanjutnya dilakukan penelitian

mengenai analisis urutan nukleotida manusia Indonesia yang mempunyai hubungan keluarga

menurut garis keturunan ibu. Penelitian tersebut menganalisis pola variasi urutan nukleotida

0,4 kb daerah D-loop mtDNA pada tiga generasi segaris keturunan ibu yang mempunyai

homologi 100 % [Maksum, 2003].

Pada penelitian ini, analisis mutasi A3243G gen tRNALeu akan dikembangkan ke

penggunaan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dan diharapkan dapat

mendeteksi mutasi heteroplasmi yang terjadi dan pewarisannya ke generasi berikutnya melalui

segaris keturunan ibu sehingga potensi mutasi tersebut dapat terdeteksi pada usia muda.



2



METODE PENELITIAN

Bahan dan penyiapan mtDNA templat

Sampel diambil dari darah 101 penderita diabetes mellitus (DM) tipe 2 manusia

Indonesia dan dua keturunan segaris keturunan ibu dari sampel positif mutasi A(3243)G. 101

Sampel penderita DM tipe 2 tersebut dianalisis dengan PCR-RFLP untuk dipelajari mutasi

A(3243)G yang menunjukkan fenotip MIDD. Sebagai kontrol digunakan sampel darah

manusia normal.

MtDNA templat disiapkan menggunakan metode lisis sel limfosit dengan bufer lisis

yang terdiri atas Tris-HCl 50 mM pH 8,5; EDTA 1 mM pH 8,0; proteinase K 0,04 mg/mL,

dan tween-20 0,5% [Noer, et al ., 1994]. Sebelumnya sel limfosit diperoleh dengan cara

mencuci sampel darah sebanyak 500 µ L dengan 500 µ L bufer TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0;

EDTA 1 mM, pH 8,0), pencucian dilakukan secara berulang sampai diperoleh pelet putih.

Lisis sel dilakukan dengan metode maniatis.

Amplifikasi mtDNA secara in vitro (PCR)

Amplifikasi fragmen 294 pb gen tRNALeu mtDNA dilakukan dengan teknik PCR

menggunakan primer D1/D2. Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA Polymerase 1

unit, mtDNA templat hasil lisis, sepasang primer masing-masing 1 µ M, bufer PCR 10x (Tris-

HCl 10 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM, Triton x-100 0,1%), dNTP 200 µ M, MgCl2 2 µ M dan

ddH2O steril. Proses PCR akan dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler 30

siklus. Tahap awal PCR adalah denaturasi awal yang akan dilakukan pada suhu 94 oC selama 5

menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga

tahap yaitu denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, penempelan primer (annealing ) pada

suhu 56oC selama 30 detik, dan perpanjangan primer (extension) pada suhu 72oC selama 50

detik. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan proses extension pada suhu 72oC selama 10

menit [Zhang et al ., 2001]. Hasil dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v)

dengan DNA marker pUC19/ HinfI dan visualisasi dengan bantuan lampu ultra violet.

Karakterisasi hasil PCR dengan enzim ApaI (RFLP)

Pemurnian hasil PCR akan dilakukan dengan metode presipitasi etanol [Sambrook, et

al ., 1989]. Hasil PCR murni akan dikarakterisasi dengan enzim ApaI (15 unit) dalam bufer



3



10x yang diinkubasi pada suhu 37oC selama overnight . Hasil inkubasi akan dianalisis

menggunakan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) dengan DNA marker pUC19/ HinfI dan

dapat dilihat secara visual dengan bantuan lampu ultra violet.

Analisis Homologi daerah Hiper Variabel I D-Loop mtDNAPada penelitian ini amplifikasi 0,4 kb daerah D-loop menggunakan primer M 1/M2

[Aquadro and Greenberg, 1983]. Campuran reaksi PCR dilakukan di dalam tabung mikro

yang terdiri atas templat mt DNA hasil lisis, primer M1 /M2, bufer PCR 10 x, 2 unit enzim Taq

DNA Polymerase, dNTP dan ditambah ddH2O steril. Proses PCR dilakukan dengan mesin

Automatic Thermal Cycler 30 siklus. Tahap awal dari proses PCR adalah denaturasi awal yang

dilakukan pada suhu 94 °C selama 1 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan

masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu denaturasi yang dilakukan pada suhu 94 °C

selama 1 menit, annealing yang dilakukan pada suhu 50 °C selama 1 menit dan extention atau

polimerisasi pada suhu 72 °C selama 1 menit. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan

polimerisasi pada suhu 72 °C selama 4 menit. DNA hasil PCR disimpan pada suhu –20 °C.

Hasil amplifikasi dari proses PCR tersebut selanjutnya dianalisis dengan elektroforesis

gel agarosa 1,2 % (b/v) dengan penanda kontrol yang digunakan adalah pUC19/ HinfI .

Sekuensing

Sekuensing DNA merupakan tahapan akhir penentukan urutan nukleotida fragmen

hasil amplifikasi. Sekuensing dilakukan dengan metode Dideoksi Sanger menggunakan

Automatic DNA Sequencer yang berdasarkan pada metode Dye Terminator Labeling.

Tahapan sekuensing DNA yang dilakukan pada penelitian ini meliputi : (1) penyiapan

DNA templat, (2) proses amplifikasi melalui PCR dengan menggunakan primer universal T7,

(3) pemurnian DNA dengan kolom Sephadex G-50 , (4) elektroforesis pada gel

poliakrilamida, dan (5) pembacaan elektroforegram hasil sekuensing.

Direct Sequencing

Direct sequencing merupakan tahapan untuk menentukan urutan nukleotida fragmen

hasil amplifikasi dengan PCR tanpa melalui proses kloning. Metode sekuensing yang

digunakan sama seperti proses sekuensing biasa, tetapi ada beberapa perbedaan dalam



4



tahapan-tahapan reaksinya, yaitu pada penyiapan DNA templat dan proses amplifikasi dengan

PCR.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pemilihan dan Pengambilan Sampel Sel Darah dan Sel EpitelSampel adalah sel darah dari 101 subjek penderita diabetes mellitus tipe 2 di Rumah

Sakit Cimbuleuit, Rumah Sakit Pindad, Laboratorium Klinik Prodia, dan Laboratorium Klinik

Pramita, Bandung. Pemilihan sel darah sebagai sampel dikarenakan sel ini mempunyai jumlah

organel mitokondria yang cukup banyak [Thorpe, 1984]. Alasan lainnya adalah karena sampel

darah relatif mudah untuk diambil dan telah digunakan sebagai sampel pada penelitian yang

dilakukan oleh Ohkubo et al .[2001], Lee et al . [1997], dan Malecki et al. [2001] untuk

menganalisis mutasi A3243G mtDNA yang berhubungan dengan diabetes mellitus di Jepang,

Korea, dan Polandia. Sampel diambil secara acak dari penderita yang positif diabetes mellitus

tipe 2 dengan rentang usia 25 tahun ke atas. Tetapi pada penelitian Shanske et al. (2004)

menemukan bahwa sel darah memiliki persentase heteroplasmi yang lebih rendah dan sedimen

urin memiliki persentase heteroplasmi lebih tinggi dibandingkan darah, begitu juga

dibandingkan dengan rambut, kulit dan mukosa. Bersasarkan penelitian tersebut, maka

diambil sampel darah dan sampel urin dari sampel positif mutasi A(3243)G menggunakan

PCR-RFLP dengan enzim restriksi ApaI dimana dua keturunannya segaris keturunan ibu ikut

dianalisis pola pewarisan mutasi A(3243)G pada penelitian ini.

Amplifikasi Templat mtDNA secara Invitro dengan PCR

Templat mtDNA hasil lisis selanjutnya diamplifikasi untuk mendapatkan gen tRNALeu

secara invitro dengan metode PCR menggunakan primer D/D2 [Zhang et al., 2002]. Hasil

PCR kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) menggunakan metode

EtBr staining seperti yang telah dilakukan Zhang et al . [2002] juga merujuk pada Sambrook et

al . [1989] dan sebagai penanda kontrol digunakan (marker ) pUC19 /Hinf I. Semua sampel

memberikan hasil amplifikasi fragmen DNA berukuran 294 pb gen tRNALeu

mtDNA.

Karakterisasi Templat mtDNA hasil PCR dengan ApaI

Sebanyak 200 ng DNA hasil pemurnian selanjutnya dikarakterisasi dengan 15 unit

enzim restriksi ApaI untuk mengetahui adanya mutasi A3243G mtDNA karena mempunyai



5



sisi pengenalan nukleotida GGGCCC. Dalam volume total 50 µ L campuran templat mtDNA,

enzim, bufer dan ddH2O diinkubasi pada suhu 370C selama overnight .

Hasil inkubasi kemudian dianalisis kembali dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v)

dengan marker pUC19/Hinf I. Hasil elektroforesis hasil pemotongan enzim restriksi ApaIterhadap 101 sampel menunjukkan 2 sampel mempunyai mutasi A3243G. Hal ini ditunjukkan

oleh adanya 3 pita hasil karakterisasi elektroforesis gel agarosa, 2 pita hasil pemotongan

enzim restriksi ApaI, dan 1 pita utuh 294 pb (dapat ditunjukkan pada Gambar 2).

Gambar 1Fragmen hasil PCR-RFLP. Karakterisasi hasil PCR-RFLP 7 sampel (lajur 2-8) dengan

elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) menggunakan penanda kontrol pUC/Hinf I (lajur 1).

Sampel pada lajur 5 menunjukkan adanya 3 pita yaitu fragmen utuh 294 pb , berikut 2 pita

182 pb dan 112 pb dibawahnya yang diperkirakan merupakan hasil pemotongan enzim

restriksi ApaI.

Terpotongnya fragmen mtDNA 294 pb gen tRNALeu oleh enzim restriksi ApaI menjadi

2 fragmen 182 pb dan 112 pb menunjukkan adanya mutasi A3243G pada sampel tersebut. Hal

ini terjadi karena mutasi A3243G menyebabkan terbentuknya 6 nukleotida sisi pengenalan

enzim restriksi ApaI pada urutan pasang basa 3242-3247, yaitu GGGCCC, sedangkan untuk

subjek normal mempunyai urutan GAGCCC pada posisi tersebut. Masih adanya pita utuh 294

pb pada sampel hasil PCR-RFLP yang terpotong oleh enzim restriksi ApaI menandakan bahwa

mutasi tersebut bersifat heteroplasmi, yang artinya dalam sel terdapat campuran antara

mtDNA yang termutasi dan mtDNA yang normal.

Rendahnya tingkat heteroplasmi untuk mutasi A3243G pada gen tRNALeu mtDNA

pada penderita diabetes mellitus tipe 2 di dalam penelitian ini sama halnya dengan hasil yang



6



telah diteliti di berbagai negara, sedangkan apabila tingkat heteroplasmi yang tinggi biasanya

menimbulkan fenotip untuk penyakit lain, yaitu MELAS (Mitochondrial

Encephalomyophathy Lactic Acidosis and Stroke likes Episodes) atau komplikasi keduanya

[Urata et al ., 1998].

Selanjutnya, untuk sampel yang positif terdapat mutasi heteroplasmi A3243G

kemudian ditelusuri lebih lanjut mengenai data riwayat kesehatan dan silsilah keluarganya.

Hal ini dilakukan untuk mengamati gambaran klinis yang dimiliki oleh penderita DM tipe 2 di

Indonesia yang mempunyai mutasi tersebut, MIDD sendiri ditandai oleh diabetes non

obesitas, tidak mengalami ketoasidosis, dan adanya gangguan pada indera pendengaran

(ketulian), serta untuk membuktikan bahwa mutasi heteroplasmi ini diwariskan secara

maternal sehingga pada penelitian ini diharapkan dapat mendeteksi adanya mutasi

heteroplasmi yang diwariskan ke generasi berikutnya melalui segaris keturunan ibu sehingga

potensi mutasi tersebut dapat terdeteksi pada usia muda.

Studi pola pewarisan maternal mutasi A3243G gen tRNALeu mtDNA

Penyiapan templat mtDNA

Sampel dalam penelitian ini diambil dari penderita diabetes melitus tipe 2 yang positif

mutasi A3243G mtDNA pada penelitian tahun pertama yaitu sampel Yn sebagai generasi I

dan sampel keturunannya berdasarkan segaris ibu yaitu anak perempuan (Gc) sebagai generasi

II dan cucu perempuan (Ch) sebagai generasi III.

Gambar 2 Silsilah keluarga Yn. Sampel penelitian diambil dari sampel Yn sebagai generasi I dan

keturunannya yang segaris ibu yaitu anak perempuannya (Gc) sebagai generasi II dan cucu

perempuannya (Ch) sebagai generasi III.



7



Sampel yang digunakan sebagai templat mtDNA pada penelitian ini adalah sel limfosit

darah sampel Yn, Gc dan Ch dan sel epitel dari urin sampel Yn. Untuk mempelajari pola

pewarisan maternal mutasi heteroplasmi A3243G mtDNA pada tiga generasi segaris

keturunan ibu maka terlebih dahulu dilakukan analisis homologi daerah D-loop mtDNA

sebagai pembuktian keturunan berdasarkan segaris keturunan ibu.. Hasil analisis homologi

urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA sampel Yn dan Ch menunjukkan tingkat homologi

100% sedangkan tingkat homologi daerah D-loop mtDNA antara sampel Yn dan At adalah

96,6%.

Gambar 3 Hasil analisis homologi sampel Yn, Ch dan At dengan urutan nukleotida Anderson

(Cambridge) sebagai standar. Analisis homologi dilakukan dengan menggunakan program

Megalign DNASTAR. Tanda merah menandakan homologi 100%, tanda biru dan hijaumenunjukkan varian.

Analisis Mutasi A3243G mtDNA dengan metode PCR-RFLP Pada Tiga Generasi Segaris

Keturunan Ibu



8



Pada penelitian ini dilakukan analisis mutasi A3243G mtDNA dengan metode PCR-

RFLP terhadap keturunan sampel Yn berdasarkan segaris keturunan Ibu yaitu anak perempuan

(Gc) sebagai generasi II dan cucu perempuan (Ch) sebagai generasi III dari sampel Yn.

Gambar 4 Elektroforegram hasil PCR-RFLP dari Generasi II dan III dari sampel Yn yang positif mutasi A3243G mtDNA pada penelitian sebelumnya. Karakterisasi hasil PCR-RFLP 2

sampel (lajur 2 dan 3) dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) menggunakan penanda

kontrol pUC /Hinf 1 (lajur 3). Sampel Gc dan Ch tidak menunjukkan adanya fragmen

tambahan selain fragmen 294 pb.

Dari hasil PCR-RFLP ini ternyata tidak terdeteksi mutasi A3243G mtDNA pada generasi

II dan III yang segaris keturunan ibu. Tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA pada

generasi II dan III ini disebabkan level heteroplasmi rendah dan metode PCR-RFLP tidak

sensitif mutasi heteroplasmi tersebut. Urata et al . (2001) menyatakan identifikasi mutasi

A3243G dengan metode PCR-RFLP menggunakan enzim ApaI dan penandaan etidium

bromida hanya mendeteksi level heteroplasmi 5-10% sedangkan diabetes melitus yang

disebabkan mutasi A3243G mtDNA memiliki level heteroplasmi 1-2%. White et al . (2004)

menyatakan bahwa limit deteksi PCR-RFLP fluoresens adalah hingga heteroplasmi 5%,

sedangkan untuk metode PCR-RFLP dengan elektroforesis gel agarosa dan penandaan etidium

bromida hanya dapat mendeteksi mutasi dengan sensitivitas hanya 20% dan konsisten dengan

penelitian lain yaitu Hancock et al . (2002). Faktor lain yang menyebabkan tidak terdeteksinya

mutasi A3243G mtDNA pada generasi II dan III dikarenakan jaringan yang digunakan sebagai

sumber templat untuk analisis mutasi bukan berasal dari jaringan yang terserang sehingga

level heteroplasmi A3243G pun sangat rendah pada jaringan tersebut dan tidak terdeteksi

dengan metode PCR-RFLP. Mutasi A3243G mtDNA bersifat heteroplasmi dan level



9



heteroplasmi tertinggi terdapat pada jaringan yang terserang. Oleh karena itu, sampel uji yang

paling baik adalah jaringan yang terserang Pada penyakit MIDD, jaringan yang terserang dan

memiliki mutation load A3243G mtDNA tertinggi adalah sel β -pankreas sedangkan jaringan

ini bukan merupakan jaringan yang umum digunakan sebagai sampel untuk diagnosis.

Sehingga permasalahannya adalah dibutuhkan suatu metode yang dapat mendeteksi mutasi

A324G mtDNA dengan tingkat heteroplasmi yang sangat rendah.

Selain itu, tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA pada generasi II dan III

disebabkan mutation load (level ambang kritis dari mtDNA mutan) pada sampel generasi II

dan III belum terlampaui dimana sel belum mengekspresikan kerusakan rantai respirasi

mitokondria [Attardi et al ., 1995]. Terdapat bukti bahwa ciri klinis pada penyakit mitokondria

berkaitan dengan mutation load pada individu yang terserang [Chinnery et al ., 1997].

Oleh karena itu, perlu dikembangkan teknik analisis mutasi A3243G mtDNA dengan

tingkat heteroplasmi sangat rendah yang dapat dijadikan sebagai metode diagnosis rutin

sehingga dapat digunakan untuk mendiagnosis secara dini penyakit yang diakibatkan mutasi

A34243G mtDNA.

KESIMPULAN

Dari hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan hingga saat ini, maka dapat ditarik kesimpulan

sebagai berikut:1. Dengan teknologi PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dan teknologi DNA

rekombinan menunjukkan adanya mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu

DNA mitokondria penderita diabetes mellitus tipe 2 di Indonesia dengan tingkat

prevalensi 2%.

2. Metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dengan penandaan EtBr dan

karakterisasi dengan elektroforesis agarosa 2% tidak dapat mengidentifikasi mutasi

heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria dari dua generasi segaris

keturunan ibu dari penderita diabetes melitus tipe 2 di Indonesia yang positif mutasi

A3243G mtDNA.

DAFTAR PUSTAKA



10



Anonymous. 2002. Konsensus pengelolaan diabetes melitus tipe 2 di indonesia2002.PERKENI. Bandung

Froguel, P., Hager, J. 1995. Human diabetes and obesity: tracking down the genes. Tibtech.

13: 52-55.

Kadowaki, T., Kadowaki, H., Mori, Y., Tobe, K., Sakuta, R., Suzuki, Y., Tanabe, Y., Sakura,

H., Awata, T., Goto, Y., Hayakawa, T., Matsuoka, K., Kawamori, R., Kamada, T., Horai, S.,

Nonaka, I., Hagura, R., Akanuma, Y., Yazaki, Y. 1994. A subtype of diabetes mellitusassociated with a mutation of mitochondrial DNA. NEJM . 330: 962-968.

Lee, H.C., Song, Y.D., Li, H., Park, J.O., Suh, H.C., Lee, E., Lim, S., Kim, K., Huh, K. 1997.Mitochondrial gene transfer ribonuclaic acid (tRNA)Leu(UUR) 3243 and tRNALys 8344 mutations

and diabetes mellitus in Korea. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82 (2):

372-374.

Maksum, I.P. 2002. Tiga mutasi spesifik yang lestari daerah D-loop DNA mitokondriamanusia indonesia pada tujuh generasi segaris keturunan ibu. Tesis. Bidang Studi Magister

Kimia Program Pascasarjana ITB.

Malecki, M., Klupa, T., Wanic, K., Frey, J., Cyganek, K., Sieradzki, J. 2001. Search for

mitochondrial A3243G tRNALeu mutation in Polish patients with type 2 diabetes mellitus.Med Sci Monit . 7(2): 246-250.

Ng, M.C., Lee, S.C., Ko, G.T.C., Li, J.K.Y., So, W.Y., Hashim, Y., Barnett, A.H., Mackay,

I.R., Critchley, J.A.J.H., Cockram, C.S., Chan, J.C.N. 2001. Familial early-onset type 2diabetes in China patients. Diabetes Care. 24: 663-671.

Noer, A.S., Martasih, F., Mulyani, S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M.1994. Analisisvariasi urutan nukleotida D-loop mtDNA manusia dari beberapa daerah di Indonesia, Proc. 1st

joint seminar on chemistry UKM-ITB, Malaysia.

Ohkubo, K., Yamano, A., Nagashima, M., Mori, Y., Anzai, K., Akehi, Y., Nomiyama, R.,Asano, T., Urae, A., Ono, J. 2001. Mitochondrial gene mutations in the tRNALeu(UUR) region

and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan. Clinical Chemistry. 47: 1641-1648.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, vol.

1,2,3,. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York

‘tHart, L.M., Lemkes, H.H., Heine, R.J., et al . 1994. Prevalence of maternally inherited

diabetes and deafness in diabetic population in the Netherlands. Diabetologia. 37: 1169-70.

Thorpe, N.D. 1984. Cell biology. John Wiley & Sons Inc. New York Urata, M., Wakiyama,M., Iwase, M., Yoneda, M., Kinoshita, S., Hamasaki, N., Kang, D. 1998. New sensitive

method for the detection of the A3243G mutation of human mitochondrial deoxyribonucleic



11



acid in diabetes mellitus patients by ligation mediated polymerse chain reaction. Clinical Chemistry. 44 : 2088-2093.

Zhang yong, Li Jianfeng, Wang fengyan. 2001. The study of A3243G and G13513A

mitochondrial DNA pointmutation in patients with cerebral infartion, Chin Med J ., 114 (10):

129-135.



12

Iman Permana

Documents

Transcript of Iman Permana