Ik Lab Biologi Tanah Ub 11_7 Agustus 2012

INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH

JURUSAN TANAH FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2012

Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB

i

INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH

JURUSAN TANAH FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

Kode Dokumen : 0040206200

Revisi : 3

Tanggal : 08 Oktober 2012

Diajukan oleh : Tim Unit Jaminan Mutu

Ketua

ttd

Dr.Ir. Sugeng Prijono, MS

Dikendalikan Oleh : Sekretaris Jurusan

ttd

Dr.Ir. Sugeng Prijono, SU.

Disetujui oleh : Ketua Jurusan

ttd

Prof.Dr.Ir. Zaenal Kusuma, SU


ii

DAFTAR ISI

Halaman

LEMBAR PENGESAHAN………………………………………. i

DAFTAR ISI …………………………………………………….. ii

DAFTAR GAMBAR……………………………………………… iii

I. ANALISA LIGNIN………………………………………… 1

II. ANALISA POLIPHENOLIC….……………………..….. 3

III. FRAKSIONASI BOT METODE POM………………… 6

IV. PENGAMATAN DAN IDENTIFIKASI

MAKROFAUNA TANAH: CACING TANAH DAN RAYAP…………………………………………………….…

8

V. PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH METODE SLIDE CONTACT……………………..…….

12

VI. ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN……….. 15

VII. PENGAMATAN MIKORIZA…………………………….. 20

VIII.ISOLASI DAN PEMURNIAN RHIZOBIUM…...…… 31


iii

DAFTAR GAMBAR

No Uraian Halaman

Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan

organik berdasarkan ukuran partikel

(Particulate Organic Matter = POM)……….

7 Gambar 2 Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah

dan Rayap di Lapangan…………………………

9 Gambar 3 Morfologi Ekto, Endo, dan Ektendo

Mikoriza………………………………………………

22

Gambar 4 Karakteristik Morfologi Spora Genus Gigaspora……………………………………………

23

Gambar 5 Sistem Perakaran yang Terinfeksi oleh

Mikoriza Menunjukkan Eksternal Hifa……..

24 Gambar 6 Koloni VAM Masuk Melalui Titik E dan

Menyebar ke dalam Jaringan Akar………….

24

Gambar 7 Karakteristik Penciri Morfologi Spora Genus Glomus……………………………………..

26

Gambar 8 Karakteristik Morfologi Spora Genus

Scutellospora……………………………………….

27 Gambar 9 Karakteristik Morfologi Spora Genus

Entrohospora……………………………………….

28

Gambar 10 Karakteristik Morfologi Spora Genus Sclerocystis………………………………………….

28

Gambar 11 Karakteristik Morfologi Spora Genus Acaulospora…………………………………………

29

Gambar 12 Bintil Akar pada Tanaman Kedelai dan

Irisan Melintang Bintil Akar……………………

33

Gambar 13 Arah Penggoresan Jarum Ose, pengolesan suspensi bintil akar pada media MEK +

Kongo Red (A) dan penggoresan jarum isolasi (B)…………………………………………….

36

Gambar 14 Rhizobium sp. pada agar YEMA……………. 37


1

ANALISA LIGNIN (0040207501)

II.

1. Ruang Lingkup

Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang

akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter konsentrasi Lignin.

2. Alat dan Bahan A. Bahan pereaksi

1. Acid detergent solution

8 g CTAB ( cetylmethyl-ammonium bromide) dilarutkan dalam 400 ml H2SO4, 0.5 ( larutkan 28 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai mencapai volume 1000

ml), 2. Antifoam solution

2.5 ml silicon antifoam 30% dilarutkan dalam 100 ml aquadest. Silicon antifoam : 30 ml silicon antifoam dilarutkan dalam 100 ml aquadest, dan

3. H2SO4 72% Larutkan 720 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai mencapai volume 1000 ml.

3. Referensi

Prosedur Layanan Analisa Laboratorium dan Panduan Analisa

Biologi Tanah.

4. Definisi

-

5. Uraian Prosedur

1. Timbang 0.5 g contoh tanaman (WI) dan tambahkan 25 ml acid detergent solution dan 1 ml antifoam ke dalam 250 ml botol volumetric,

2. Panaskan sampai T = 150oC selama 1 jam, setelah mendidih (turunkan suhu pada awal terjadinya pembuihan

dan dikocok sambil digoyang untuk beberapa waktu),

I.


2

3. Kemudian disaring dalam filter glass crucible ( W2) dan cuci

dengan aceton ( 1 kali saja) dan disusul dengan air panas sampai tidak berwarna,

4. Crucible dan isinya di oven pada T = 105oC selama 24 jam

dan didinginkan dalam desikator dan timbang ( W3), 5. Crucible dan isinya ditempatkan dalam beaker glass dan

tambahkan H2SO4 72% secukupnya sampai setengah dari

volume crucible dan didiamkan selama 3-4 jam, 6. Gunakan vacum pump untuk membilas / menyedot dan

setelah bersih dibilas dengan air panas sampai tidak asam (

tidak berwarna dan tidak berbuih), 7. Crucible dan isi dioven pada T = 105oC selama 24 jam,

dinginkan dan timbang ( W4), sedangkan isinya diabukan

pada T = 500oC untuk waktu 4-5 jam, dinginkan dan timbang ( W5 ).

Perhitungan:

ADF ( % ) = ( W3 – W2) X 100 W1

ADL (%) = (W4 – W5) X 100 W1

Keterangan :

ADF : Acid Detergent Fiber ADL : Acid Detergent Lignin W : Weight (g)


3

ANALISA POLIFENOL (0040207502)

III.

1. Ruang Lingkup

Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan

parameter konsentrasi polyphenolic.

2. Alat dan Bahan

A. Alat Spectronic T21, Cuvet, Tabung Reaksi, Pipet, Labu Ukur, Beaker Glass 100 ml, Timbangan Digital Mettler, Botol

Semprot, Water Bath dan Kertas Saring Whatman No.42

B. Bahan Pereaksi

1. Methanol 50 % Larutkan 101.01 ml methanol 99% dalam 200 ml aquadest.

2. Sodium Carbonat ( Na2CO3 17%) 25.5 g Na2CO3 dalam 124.5 ml aquadest dilarutkan dalam beaker glass.

3. Sodium tungstate ( Na2WO4) 4. Asam orthophosphoric. 5. Asam phosphomolybdic.

6. Asam tannic. 7. Reagent Folin-Denis

25 g sodium tungstate + 5 g asam phosphomolybdic dan 12.5 asam orthophosphoric dimasukkan ke dalam 250 ml botol volumetrik yang berisi 187.5 ml aquadest.

Kemudian di reflux selama 2 jam dan diencerkan untuk 250 ml dengan menggunakan aquadest.

3. Referensi Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.

4. Definisi

-

II.


4

5. Uraian Prosedur

Membuat Standart: 1. Siapkan 0,1 mg/ml asam tannic. 2. Larutkan 0.01 g asam tannic dalam 100 ml botol volumetrik

dengan aquadest. 3. Pipet 0,1,2,3,4,5 dan 6 ml dari 0.1 mg/ml asam tannic

dimasukkan dalam 50 ml cuvet yang berisi 20 ml aquadest.

4. Tambahkan 2.5 ml reagent Folin- Denis dan 10 ml Na2CO3 17% dan kemudian dibaca dengan spectrophotometer, absorbance 760 nm.

Cara Kerja:

1. Timbang 0.75 g contoh tanaman dan diekstrak dengan 20

ml methanol 50% dalam beaker glass 100 ml kemudian tutup dengan para film atau aluminium foil.

2. Didihkan dalam water bath pada T = 70-80oC selama 1 jam dan hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring (Whatman No. 42) dan dibilas dengan menggunakan

methanol 50 % kemudian diencerkan sampai 50 ml dalam botol volumetrik ( konsentrasi = 15 mg/ ml ).

3. Pipet 1 ml hasil ekstraksi ke dalam cuvet 50 ml dan

tambahkan 20 ml aquadest, 2.5 ml reagent Folin Dennis dan 10 ml Na2CO3 ( sodium carbonat 17%), kemudian encerkan sampai 50 ml dengan menggunakan aquadest

dan diamkan selama 20 menit. 4. Baca dengan menggunakan Spectrophotometer,

absorbance 760 nm.

Perhitungan :

1. Carilah persamaan regresi dari larutan standart.

2. Tentukan TAE sampel dan TAE blanko (X) berdasarkan

persamaan regresi diatas.

Keterangan: TEP : Total Extractable polyphenols (mg) TAE : Tannic Acid Equivalent (mg)

W : weight of sample (g)


5

Tabel Pengamatan :

A. Tabel Pengamatan

X Y XY X2 Y2

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

∑ =

Catatan : X = konsentrasi larutan standart (mg/ml), Y = absorbance

Sampel Y bacaan TAE sampel

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


6

FRAKSIONASI BAHAN ORGANIK TANAH METODE POM (0040207503)

I.

1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mempelajari dinamika karbon dalam tanah, melalui

pemisahan partikel bahan organik tanah berdasarkan distribusi ukuran partikel dengan menggunakan Metode POM (Particulate Organic Matter)

2. Alat dan Bahan

1. Satu set ayakan basah : ukuran kasa 2 mm, 250 μm,

150 μm dan 50 μm.

2. Tanah segar.

3. Na hexametaphosphate (hanya untuk tanah liat).

3. Referensi

Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.

4. Definisi Fraksi BOT berukuran pasir (5.0 mm – 2.0 mm) biasanya lebih labil daripada BOT berukuran liat dan debu (Tiesen dan

Steward, 1983). Bahan organic tanah yang mempunyai ukuran pasir selanjutnya oleh Cambardella dan Elliot (1992) disebut dengan bahan organic berukuran partikel (particulate organic matter = POM). Prinsip penetapan fraksi BOT berdasarkan ukuran partikel adalah menentukan jumlah absolute dan proporsi relative C

dan N dari partikel organic dalam tanah. Metode penetapan fraksi POM dari TSBF (Okalebo, 1993) adalah metode yang relative cepat, murah dan tidak menimbulkan pencemaran

lingkungan karena hanya menggunakan air. Klasifikasi ukuran partikelnya sedikit berbeda dengan POM dari Cambardella dan Elliot (1992); pada teknik dari TSBF POM adalah fraksi BOT

berukuran 50-250 nm. POM adalah fraksi bahan organic yang

III.


7

mudah didekomposisi, oleh karena itu dalam mempelajari

dinamika C fraksi ini sangat penting untuk ditetapkan. Mengingat pentingnya fraksi BOT dalam mempelajari dinamika C di daerah tropis, maka pemilihan teknik penetapan fraksi

BOT yang murah dan cepat dengan hasil yang baik sangat dibutuhkan.

5. Uraian Prosedur a. Ambil 25 g subsample tanah segar kemudian tentukan

kandungan air tanahnya. Bila tanah yang dimiliki adalah

tanah kering udara, maka tanah harus dibasahi terlebih dahulu pada kapasitas lapang selama 1-2 minggu, kemudian tetapkan kadar air tanahnya.

b. Atur ayakan diatas mesin kocok dengan urutan ayakan 2 mm diatas 250 μm, 150 μm, 50 μm, yang terbawah adalah

penampung. c. Timbang 500 g contoh tanah basah (segar) dan letakkan

pada ayakan ukuran kasa 2 mm, pengayakan basah dapat

dimulai. d. Setelah 20 menit ambil semua partikel yang terdapat pada

ayakan 2 mm, 250 μm, 150 μm, dan 50 μm secara

terpisah. e. Keringkan masing-masing fraksi tersebut dalam oven pada

suhu 650C selama 24 jam, timbang berat keringnya dan

tetapkan kandungan C dan N nya. f. Tetapkan juga total C dan N dari total tanah.

Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan organic berdasarkan ukuran partikel (Particulate Organic Matter = POM)


8

PENGAMATAN DAN IDENTIFIKASI

MAKROFAUNA TANAH : CACING TANAH DAN RAYAP

(0040207504)

1. Ruang Lingkup

Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan pengamatan biodiversitas makrofauna (cacing tanah dan rayap) masing-masing menggunakan

metode monolit yang dimodifikasi oleh BGBD (2005) dan metode transek.

2. ALAT dan BAHAN Alat yang diperlukan meliputi: 1. Cetok,

2. Nampan (4 buah), 3. Pinset serangga, 4. Kuas lukis,

5. Bingkai kuadrat dari besi ukuran 25 x 25 x 10 cm, 6. Frame 50 cm x 50 cm 7. Pensil 2B,

8. Kertas HVS yang telah dipotongi untuk label, dan 9. Botol film.

Bahan: 1. Formalin 4% 2. Ethanol 70%

3. Air bersih 3. REFERENSI


4. DEFINISI Fauna tanah berperanan penting dalam mempertahankan: ketersediaan hara (misalnya mikoriza dan rhizobium),

porositas dan infiltrasi air tanah (misalnya cacing tanah). Dengan demikian, laju limpasan permukaan dan erosi bisa dikurangi sehingga produktivitas tanah dan tanaman dapat

IV.


9

dipertahankan. Untuk itu pemahaman akan pentingnya peran

fauna tanah dalam proses-proses biologi tanah sangat diperlukan. Metode monolit untuk pengambilan sampel cacing tanah

diadopsi dari prosedur ASB (Swift and Bignell, 2001) yang dimodifikasi (BGBD, 2005). Fungsinya adalah untuk mengkoleksi cacing tanah dan makroarthropoda.

Metode standar untuk pengambilan contoh rayap di lapangan adalah metode transek semi kuantitatif 100 m X 2 m yang bisa disederhanakan menjadi 20 x 2 m. Data yang dihasilkan dari

pengukuran dengan metode semi kuantitatif transek merupakan data kualitatif bukan merupakan nilai mutlak. Namun data ini memiliki tingkat keakuratan tinggi. Metode transek

dideskripsikan pertama kali oleh Jones dan Eggleton (2000).

5. URAIAN PROSEDUR Skema pengambilan contoh makrofauna tanah (cacing tanah dan rayap) dapat dilihat pada Gambar 2.

Keterangan :

Monolit Cacing Tanah dengan ukuran (0,5 x 0,5) m2 diambil pada kedalaman 0-10 cm dan 10-20 cm

Monolit Cacing Tanah dengan ukuran (0,3 x 0,3) m2 diambil pada kedalaman 0-10 cm, 10-20 cm dan 20-30 cm

1. Monolith cacing tanah (0.5x0.5 m2) 2. Transek semi kuantitatif untuk pengambilan contoh rayap

Gambar 2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap dalam satu transek pengamatan di lapangan

5 m

40

m

5 m 5 m 5 m 10

m

10

m


10

A. Cara Kerja Pengambilan Sampel Cacing Tanah

dengan Metode Sampling Monolit Pada setiap plot 200 m2 dalam suatu sistem penggunaan lahan ditentukan 4-6 titik monolit cacing tanah. Pada 1 plot

hutan ditentukan 4 monolit cacing tanah yakni 1 monolit berukuran 25 cm x 25 cm x 10 cm dan 3 monolit lainnya berukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm (Gambar 2), sedangkan

pada lahan pertanian misalnya perkebunan sawit diambil 6 monolit masing-masing dengan ukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm dan jarak antar monolit 5 m. Pengambilan contoh

monolit dilakukan pada lapisan (1) seresah, di atas tanah mineral (2) tanah kedalaman 0-10 cm, (3) tanah kedalaman 10-20 cm, dan (3) tanah kedalaman 20-30 cm.

Semakin banyak monolit yang dibuat dalam plot pengamatan atau transek berukuran (40 x 5) m2 akan

semakin akurat untuk memberikan gambaran sebaran populasi sampel cacing tanah dalam plot yang diamati.

B. Cara Kerja Pemilahan Sampel Cacing Tanah dengan Metode Hand Sortir 1. Lapisan tanah yang diperoleh dari tiap monolit per

lapisan kedalaman dimasukkan ke dalam nampan. 2. Setiap cacing yang ditemukan diambil secara manual

(hand sortir). 3. Cacing tanah tidak langsung dimasukkan ke dalam

ethanol 70% tetapi terlebih dahulu dimasukkan ke dalam nampan yang sudah diisi air. Tujuan perlakukan

ini pertama, untuk menghilang tanah yang menempel pada tubuhnya. Kedua, cacing dimasukkan dalam nampan kedua yang berisi etanol 70 % untuk relaksasi.

Ketiga, cacing dimasukkan dalam formalin 4% selama beberapa detik hingga tubuhnya kaku. Keempat, cacing

tanah siap dimasukkan dalam botol film yang berisi ethanol 70 % dan sudah diberi label.

C. Cara Pengambilan Sampel Rayap 1. Tali sepanjang 20 m ditarik dan dipasang di permukaan

tanah sebagai garis tengah transek (midline of transect). Jaraknya dari sub-plot pengambilan monolit adalah 8 meter. Pemilihan lokasi untuk transek dilakukan dengan mempertimbangkan jarak terhadap


11

monolit, dan kemiringan lahan. Transek diletakkan

sejajar kontur. 2. Transek dibagi dalam 4 seksi berukuran 5 x 2 m

(selanjutnya disebut seksi 1, seksi 2, seksi 3, seksi 4).

Tiap seksi dibagi oleh garis tengah transek menjadi 8 sub seksi yaitu S1 kiri dan kanan, S2 kiri dan kanan, S3 kiri dan kanan, S4 kiri dan kanan. Satu orang kolektor

bekerja di satu seksi. 3. Dalam setiap sub seksi digali 6 monolit kecil berukuran

12 x 12 x 10 cm. Pada lima menit pertama, kolektor

menggali monolit 1, tanah dimasukkan ke dalam nampan. Pengambilan contoh rayap dilakukan secara in situ dengan hand sortir.

4. Contoh rayap yang diperoleh, baik dari kasta pekerja maupun prajurit, dimasukkan ke tabung film berisi

etanol 70 % dan diberi label. Kolektor diberi waktu 5 menit untuk menggali, memilah, memilih dan mengkoleksi contoh ke dalam tabung film sekaligus

memberikan label. Setelah lima menit pertama berlalu, kolektor segera pindah ke monolit berikutnya. Sehingga total waktu yang dibutuhkan untuk menyelesaikan

pengambilan contoh pada 6 monolit kecil adalah 30 menit.

5. Selama lima belas menit berikutnya, dilakukan

pengambilan contoh pada lokasi alam kecil (micro sites) yang diperkirakan representatif untuk mendapatkan rayap untuk tiap sub seksi, misalnya:

a. Pada tanah yang terdapat remukan dan sisa-sisa lapukan kayu

b. Posisi samping kayu-kayu mati, tunggul

c. Pada tanah dengan akumulasi humus yang tebal di bawah pohon, dan diantara perakaran.

d. Disamping sarang rayap, gundukan, dan sarang karton, jalan rayap pada pepohonan dan sarang-sarang di atas pohon hingga ketinggian 2 m di atas

permukaan tanah.


12

PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH

METODE SLIDE CONTACT (0040207505)

1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan pengamatan mikroorganisme dalam tanah

menggunakan metode slide kontak. 2. Alat dan Bahan

1. Tabung reaksi 25 ml untuk pengenceran, 2. Gelas slide yang disterilkan dengan api sebelum digunakan.

3. Larutan Bengal Rose Fenol: larutan 1.0 g Bengal Rose dan 0.01g CaCl2.2H2O dalam 100 ml akua-fenol 5% .

3. Referensi Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Iswandi Anas.1989. Petunjuk Laboratorium, Biologi Tanah dalam Praktek,

Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.

4. Definisi

Cara slide kontak adalah pengamatan mikroorganisme tanah

yang menempel pada gelas slide yang dibenamkan ke dalam tanah selama beberapa waktu. Tujuan dari cara slide kontak ini adalah untuk mengamati populasi mikroorganisme tanah

dalam keadaan alami. Pemindahan mikroorganisme ke dalam gelas slide memungkinkan pengamatan yang baik karena

menghilangkan kesalahan yang disebabkan oleh adanya partikel tanah. Pembenaman gelas slide dilakukan secara hati-hati ke dalam

tanah, untuk mendapatkan sampel mikroorganisme tanah dilakukan dengan cara menggosokkan bongkah tanah pada permukaan slide tersebut. Pada waktu gelas slide dibenamkan

untuk beberapa waktu di dalam tanah, kelompok organisme yang dapat menempel pada permukaan slide dapat diamati. Bila dikerjakan dengan hati-hati seandainya ada pembentukan

5 v.


13

spora maka spora tersebut dapat diusahakan agar tetap utuh.

Demikian pula pengamatan terhadap sifat – sifat koloni, bahan yang digunakan mikroorganisme sebagai sumber energi dan responnya terhadap faktor lingkungan dan sebagainya dapat

dilakukan. Cara ini mempunyai arti yang sangat penting dalam mengamati hubungan penyusunan dan morfologi

mikroorganisme dalam tanah. Pembuatan foto akan sangat berguna dalam penyampaian apa yang diperoleh. Dengan memanfaatkan gelas slide yang berbeda baik dari segi waktu

dan lama inkubasinya, maka urutan proses ekologi dari mikroorganisme dapat diamati dan dipelajari. Metode ini adalah metode kualitatif dan dengan cara ini isolasi

sukar dilakukan. Koloni berkembang sesuai pada tempatnya pada gelas slide. Bila isolasi dan identifikasi lebih lanjut

dikehendaki, hal ini dapat dilakukan akan tetapi tidak semua organisme dapat tumbuh pada media buatan. Pemasukan gelas slide ke dalam tanah akan mengubah keadaan alami

dengan terbentuknya permukaan yang baru untuk kolonisasi, akan tetapi pengaruhnya sukar dievaluasi.

5. Uraian Prosedur 1. Buatlah celah di dalam tanah dengan mengusahakan sedikit

mungkin gangguan pada tanah. Untuk ini dapat digunakan

pisau. 2. Masukkan dengan hati-hati gelas slide dengan arah vertikal,

sampai tersisa kira-kira 1.5 cm dari permukaan tanah.

Tekan kembali tanah ke arah gelas slide. 3. Gelas slide diinkubasi sesuai dengan waktu yang

dikehendaki, biasanya sekitar 1-3 minggu.

4. Bersihkan permukaan gelas slide sebelah atas dari tanah, kemudian tarik gelas slide dari belahan yang tidak

terganggu dengan mengangkat gelas slide tersebut secara hati-hati. Setelah agregat tanah yang menempel pada gelas slide dilepaskan, kering udarakan gelas slide

tersebut. Dengan bantuan aliran air, partikel tanah yang menempel pada permukaan tanah yang tidak terganggu dilepaskan dengan hati-hati sampai hanya ada lapisan tipis

yang tertinggal. Bersihkan permukaan gelas slide pada belahan yang terganggu dengan kain basah yang steril. Lengketkan mikroorganisme tanah pada gelas slide dengan


14

membiarkan gelas slide tersebut kering udara dan

panaskan di atas nyala api. 5. Tempatkan gelas slide di atas bejana air yang mendidih dan

basahi selama 6 sampai 10 menit dengan Bengal Rose

Fenol. Bila perlu tambahkan Bengal Rose Fenol agar gelas slide tersebut tidak kering. Buang kelebihan pewarna dengan mencuci gelas slide dengan air sampai tidak ada

pewarna yang tercuci bersama air cucian. 6. Keringkan gelas slide tersebut dan amati gelas slide dengan

menggunakan mikroskop.


15

ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN

(0040207506)

1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan isolasi mikrobia dari lingkungan.

2. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang diperlukan dalam kegiatan pembuatan

media dan sterilisasi secara aseptik yakni Erlenmeyer, cawan petri, kertas payung, plastik wrapping, kapas, benang kasur,

autoklaf, Media TPC sebagai media isolat total mikrobia, Nutrien Agar (NA) sebagai media isolat bakteri, Potato Dextrose Agar (PDA) sebagai media isolat fungi.

Berikut ini alat dan bahan yang diperlukan untuk sterilisasi dengan pembakaran Jarum oose, bunsen, korek api, media padat dalam cawan petri (berisi Na/PDA).

Sedangkan alat dan bahan berikut ini digunakan dalam sterilisasi dengan Panas basah Bertekanan Tinggi (autoklaf): Media PDA dan NA dalam tabung reaksi, cawan petri steril,

kertas payung, kapas, benang kasur dan inkubator. Alat dan bahan yang diperlukan dalam isolasi mikrobia dari lingkungan:

1. Sampel air rendaman bahan kompos. 2. Aquades steril dalam erlenmeyer (45 ml) 3. Aquades steril dalam tabung reaksi (9 ml)

4. Media Nutrien agar (NA) 5. Media Potato Dextrose Agar (PDA)

6. Oose

3. Referensi


4. Definisi Mikrobia yang berasal dari lingkungan, berada dalam populasi campuran. Mikrobia di alam sangat jarang berada dalam

VI.


16

spesies tunggal. Dalam bidang bioteknologi, ketersediaan

biakan murni sangatlah penting. Selain itu pemeliharaan kemurnian isolat selama penyimpanan juga sangat perlu mendapatkan perhatian, karena berkaitan dengan

didapatkannya produk atau metabolit tertentu dari suatu spesies tunggal yang hanya dapat dipelajari apabila spesies tunggal mikroba terpisah dari populasi campuran. Untuk itu

perlu dilakukan isolasi/pemisahan untuk mendapatkan mikroba biakan murni. Untuk melakukan isolasi mikroba alat-alat yang digunakan

dalam kegiatan di laboratorium harus disterilisasi. Sterilisasi adalah suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau media dari mikroba. Hal ini diperlukan agar mikroba yang

ingin ditumbuhkan, diamati dan diisolasi terbebas dari mikroba lain. Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat atau

bahan terbebas dari mikroba, baik dalam bentuk sel vegetatif maupun spora. Dengan kata lain dalam bahan dan alat yang akan digunakan tidak didapatkan mikroba yang tidak

diharapkan kehadirannya, baik yang menggangu atau merusak media. Sterilisasi terdiri dari beberapa cara. Pemilihan cara sterilisasi ditentukan berdasarkan sifat alat

atau bahan yang akan disterilisasi dan tujuan sterilisasi. Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan teknis aseptis untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak

diinginkan, karena setiap benda yang digunakan maupun pekerja dilaboratorium dapat menjadi kontaminasi.

5. Uraian Prosedur 1. Prosedur umum yang harus diperhatikan dalam teknik

aseptis yakni :

a. Disinfektan area kerja. Meja yang akan digunakan terlebih dahulu diberi disinfektan untuk membunuh

mikroorganisme yang ada. b. Jarum oose. Pemindahan mikroorganisme dari kultur

cair maupun padat ke medium lain membutuhkan jarum

oose. Sterilisasi dari jarum oose ini dengan cara membakar jarum tersebut dengan api bunsen hingga berwarna merah. Sterilisasi ini dilakukan sebelum

maupun setelah jarum digunakan. c. Mulut tabung. Sterilisasi pada mulut tabung reaksi atau

erlenmeyer dapat dilakukan dengan membakar mulut


17

tabung setelah tutup kapas dibuka dan sesaat sebelum

menutup kembali. d. Cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk

melakukan inokukasi maupun setelah ditutup, tepi

cawan petri didekat di api bunsen. Selama inokulasi, bagian cawan petri yang terbuka, didekatkan ke api bunsen untuk mencegah kontaminasi mikroba yang

berasal dari udara.

2. Prosedur Sterilisasi

A. Pembuatan Media dengan sterilisasi secara Aseptik Cara kerja:

a) Media TPC, Nutrien Agar dan Potato Dextrose Agar

ditimbang masing-masing 2 gram. b) Masing-masing media dilarutkan dalam aquades 100

ml. c) Dilarutkan sampai mendidih. d) Masukkan dalam erlenmeyer dan ditutup dengan

kapas. e) Semua bahan dan alat dimasukkan dalam autoklaf

selama 15 menit dengan tekanan 1 atmosfir, dan

dengan suhu 1210C. B. Sterilisasi dengan pembakaran Cara kerja:

a) Nyalakan lampu bunsen, atur nyala api secara maksimal.

b) Ambil jarum oose, bakar mulai dari bagian pangkal

kawat oose secara perlahan menuju ujung kawat jarum oose. Pembakaran jarum oose ini dilakukan sampai kawatnya merah membara.

c) Goreskan masing-masing jarum oose tersebut pada permukaan media padat dalam cawan petri.

d) Inkubasi media tersebut pada 300C selam 48 jam. e) Amati mikroba yang tumbuh.

C. Sterilisasi dengan Panas Basah Bertekanan Tinggi

(autoklaf) Cara Kerja: 1. Tutup tabung reaksi yang berisi media dengan kapas,

beberapa tabung diikat jadi satu dan bagian tutupnya dibungkus dengan kertas payung. Sisakan satu tabung untuk tidak disterilkan.


18

2. Isi autoklaf dengan aquades sampai permukaan air

dibawah ansang autoklaf. 3. Masukkan semua alat dan bahan kedalam autoklaf. 4. Tutup autoklaf dan kencangkan setiap mur pada

penutupnya sampai kencang. 5. buka klep pada pengatur tekanan uap air, dan

biarkan sampai mendidih.

6. Tutup klep tersebut setelah air mendidih dan media disterilkan selama 15 menit pada suhu 1210C dan tekanan 1 atmosfir.

7. Setelah selesai sterilisasi maka matikan autoklaf dan tunggu sampai dingin.

8. Buka autoklaf dan tunggu sampai media agak dingin

(450C). 9. Tuangkan media (PDA dan NA) pada cawan petri

steril. 10. Inkubasi media tersebut selama 48 jam dengan

suhu 380C.

11. Amati pertumbuhan mikroba.

3. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan

Teknik isolasi/pemisahan dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: melakukan pengenceran berseri dilanjutkan dengan mebiakkan pada media yang sesuai yaitu dengan

metode cawan tung (pour plate) dan cawan gores (streak plate) Cara Kerja :

1. Pembuatan Seri Pengenceran Bahan yang akan dijadikan sebagai bahan pembuatan isolat merupakan air rendaman yang berasal dari bahan

kompos kampus yang telah diinkubasi kemudian direndam selama 7 hari, diambil sebanyak 5 ml

kemudian secara aseptis masukkan ke dalam 45 ml aquades steril. Kemudian dilakukan homogenitas dengan memvortek sampel. Sampel yang telah

homogen ini disebut dengan pengenceran 10-1. Dari sampel ini diambil 0,1 ml dan dimasukkan kedalam cawan Petri steril dan ditambahkan dengan media yang

sesuai. Dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan secara aseptis dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril dan dihomogenasi dengan vortek.


19

Pengenceran ini disebut dengan pengenceran 10-2. Dari

pengenceran ini diambil 1 ml sampel untuk dimasukkan pada tabung reaksi berisi aquades berikutnya. Dan 0,1ml dimasukkan kedalam cawan petri steril. Dengan

cara yang sama akan didapatkan pengenceran 10-3 dan seterusnya sampai pada pengenceran 10-6.

2. Metode Cawan Tuang (pour plate) Masing –masing pengenceran berseri tersebut, diambil 0,1 ml sampel dan dimasukkan dalam cawan petri steril.

Untuk mengisolasi bakteri maka ditambahkan dengan media Nutrien Agar, sedangkan untuk mengisolasi jamur ditambahkan media Potato Dextrose Agar.

Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk bakteri selama 24 jam sedangkan untuk jamur dilakukan

inkubasi selama 3 x 24 jam.

3. Metode Cawan Gores (steak plate)

Media Nutrien Agar dan Potato Dextrose agar dituangkan secara aseptis kedalam cawan petri steril. Biarkan memadat. Setelah media memadat, sampel dari

pengenceran berseri diambil dengan menggunakan oose dan dilakukan teknik penggoresan. Sampel yang digores cukup satu oose. Sebelum berpindah dari satu

kuadran ke kuadran berikutnya oose disterilkan terlebih dahulu, selanjutnya penggoresan dilanjutkan kembali . Dua metode ini dilakukan secara bergantian agar dapat

diketahui metode mana yang dapat menghasikan banyak bakteri.

4. Penyimpanan Biakan Murni Biakan murni (isolat) yang diperoleh dari tiga tahap,

selanjutnya dapat disimpan pada jangka waktu yang lama, dengan cara memindahkan kedalam media agar miring (slant agar) yang mengandung media yang

sesuai (Nutrien agar atau Potato Dextrose agar).


20

PENGAMATAN MIKORIZA

(0040207507)

1. Ruang dan Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mempelajari dan mengamati mikoriza.

2. Alat dan Bahan 2.1 Koleksi mikoriza di lapangan

- Bor tanah, - Plastik, - Spidol permanen dan

- Cooling box.

2.2 Pengambilan spora Mikoriza dengan Wet Sieving

2.3 Identifikasi Spora - Mikroskop - Cawan Petri

- Aquadest

2.4 Perhitungan persentase infeksi mikoriza - Mikroskop, - Beaker glass, - Petridish,

- Tanaman dan tanah yang diamati, - KOH 10%, HCl 2% dan Trypan blue 0.05% dalam

laktofenol.

1. Pisau 7. Cawan petri

2. Kantong Plastik 8. Contoh Tanah

3. Blender tanah 9. Aquadest

4. Penyemprot 10. Mikroskop

5. Tabung silinder 11. Air gula konsentrasi 60%

6. Saringan bersusun (diameter kisi 710 µm, 250 µm, 105 µm dan 53 µm)

VII.


21

3. Referensi


4. Definisi

Mikroorganisme yang hidup dalam tanah dikenal dalam beberapa kelompok, yaitu kelompok patogen, non-patogen;

parasit, non-parasit; saprofit; dan epifit, dengan berbagai macam bentuk interaksi yang terjadi antara mikro organisme

itu sendiri atau dengan makro organisme (tumbuhan tingkat tinggi). Salah satu mikroorganisme menguntungkan yang berasosiasi

(bersimbiosis) dengan akar tanaman yaitu mikoriza (Myches = jamur, Rhiza = akar), yang berperanan penting dalam meningkatkan ketersediaan dan serapan P oleh tanaman.

Manfaat utama yang didapat dari adanya simbiosis tersebut adalah saling mendukung dalam memenuhi kebutuhan hidupnya. Jamur (myches) membutuhkan karbohidrat yang

dapat diperoleh dari tanaman inang, sementara tanaman memperoleh hara P dalam jumlah yang lebih banyak. Jamur dibedakan menjadi dua kelompok besar yaitu jamur

yang hidup di permukaan akar (ekto-mikoriza) dan yang hidup di dalam korteks akar (endo-mikoriza) yang juga dikenal sebagai Vesicular-Arbuscular Mycorhiza (VAM). Jamur memiliki

hypha atau miselium yang menembus jauh ke luar akar yang sangat bermanfaat untuk meningkatkan serapan P oleh tanaman inangnya. Berdasarkan pada morfologi sporanya,

VAM dibagi dalam enam genus yaitu : Glomus, Gigaspora, Acaulospora, Sclerocystis dan Scutellospora, Entrophospora.

Tipe-tipe mikoriza yang dikenal ada 3 (Gambar 3): Ektomikoriza, strukturnya terdiri dari selimut miselium yang menyelimuti akar yang sel korteksnya membesar dan hifa

cendawan yang masuk ke dalam ruang interselluler. Endomikoriza, strukturnya tidak membentuk selimut dengan hifa yang menginvasi sel korteks akar tanpa mematikannya.

Ektendomikoriza, strukturnya antara endo dan ektomikoriza.


22

Gambar 3. Morfologi Ekto, Endo, dan Ektendo Mikoriza

Jamur berkembang biak dengan jalan membentuk spora. Spora jamur yang ditemukan di dalam tanah dapat dipakai

sebagai salah satu indikator keberadaan mikoriza dalam suatu zone perakaran. Jumlah spora yang terbentuk dapat pula

digunakan sebagai indikasi keberadaan mikoriza dan pengenalan terhadap jenis mikoriza yang ada. Pengenalan lebih jauh dan mendalam adalah dengan mengamati bentuk,

ukuran, ornamen, ketebalan dan jumlah dinding spora serta warnanya (DeLa Cruz, 1989). Vesicular-Arbuscular Mycorhiza (VAM) merupakan

Zygomycetes yang berasal dari order Glomales. Di dunia berhasil diidentifikasi 150 spesies fungi yang berasosiasi dengan 70 % Angiosperm. Pengelompokan VAM secara

taksonomi menurut Morton dan Benny (1990) adalah sebagai berikut: ORDER

o SUBORDER Family

Genus


23

GLOMALES

o GIGASPORINAE Gigasporaceae

Gigaspora Scutellospora

o GLOMINEAE

Glomaceae Glomus Sclerocystis

Acaulosporaceae Acaulospora Entrophospora

Guna mengetahui peran mikoriza dalam meningkatkan serapan P oleh akar tanaman, maka diperlukan perhitungan tingkat infeksi mikoriza. Perhitungan persentase infeksi

dilakukan dengan metode yang dikembangkan oleh Nemec (1982), yaitu dengan pewarnaan akar tanaman yang terinfeksi mikoriza dan pengamatan di bawah mikroskop (Gambar 4, 5

dan 6).

Gambar 4. Karakteristik Morfologi Spora Genus Gigaspora

a. spora bergerombol, bentuk spora bulat hingga bulat telur

b. spora mikoriza dalam jaringan sel akar tanaman

A B


24

Gambar 5. Sistem Perakaran yang Terinfeksi oleh Mikoriza Menunjukkan Eksternal Hifa (yang ditunjukkan

dengan tanda panah) dengan Spora (S) yang Dihasilkan oleh Glomus mossae.

Gambar 6. Koloni VAM Masuk Melalui Titik E dan Menyebar ke dalam Jaringan Akar


25

5. Uraian Prosedur

5.1 Prosedur untuk kegiatan koleksi Mikoriza di lapangan

Cara Kerja :

a. Pilih jenis tanaman yang akan diambil contohnya, sebaiknya dilakukan pada musim penghujan. Untuk pengambilan contoh spora sebaiknya dilakukan pada

musim kemarau. b. Pegunakan bor tanah untuk mengambil contoh tanah.

Contoh tanah diambil pada jarak 0.5 m dan 1.0 m dari

batang tanaman, pada kedalaman 0-10, 10-20 dan 20-40 cm. Contoh tanah diambil sebanyak 200-250 g.

c. Masukkan contoh ke dalam kantong plastik, beri label

yang jelas dan masukkan ke dalam kotak es (cooling box).

5.2 Pengambilan contoh spora mikoriza dengan cara

pengayakan basah (Wet Sieving)

Cara Kerja : a. Ambil contoh tanah pada rizosfer (daerah perakaran)

tanaman semusim sebanyak 50 g, letakkan ke dalam

kantong plastik. b. Ambil 50 g contoh tanah, campur dengan 400 ml

aquadest untuk membuat suspensi dengan cara

diblender. c. Tuang suspensi tanah tersebut ke dalam saringan

bersusun (ukuran lubang 2 mm, 500 µm, 45 µm).

d. Bagian tanah yang tertinggal pada saringan paling atas hanya kerikil, pasir dan partikel-partikel organik besar. Ambillah saringan terbawah. Bilaslah dengan air kran

hingga yang keluar dari saringan adalah air yang jernih.

e. Endapan tanah halus yang masih tertinggal dalam saringan 45 µm dimasukkan dalam gelas beker sambil dibilas dengan aquades hingga mencapai 200 ml; aduk

dengan pengaduk kaca dantuang secara merata pada 12 tabung reaksi yang bisa untuk sentrifusi.

f. Tambahkan larutan gula 60 % kurang lebih 10 ml.

g. Sentrifus contoh tersebut selama 2 menit dengan kecepatan 2700 rpm.


26

h. Ambil bagian teratas (bening) yang merupakan

kumpulan spora VAM dengan menggunakan pipet isap, saring dan letakkan pada cawan petri, tambahkan sedikit aquadest. Amati spora mikoriza menggunakan

mikroskop.

5.3 Identifikasi Spora

Langkah-langkah dalam identifikasi spora adalah sebagai berikut: a. Siapkan mikroskop,

b. Letakkan cawan petri yang sudah diberi sedikit aquadest dan diberi spora mikoriza, dan

c. Amatilah dengan mikroskop dan cocokkan dengan

gambar pada kunci identifikasi untuk spora VAM.

Gambar 7. Karakteristik Penciri Morfologi Spora Genus Glomus


27

Keterangan:

A. Spora mikoriza dari genus Glomus yang berwarna putih B. Spesies Glomus clarum memiliki inner layer di bagian dalam dinding

sporanya (yang ditunjukkan dengan anak panah)

C. Sporocarp dari Glomus invermaium yang sudah mati sering kita jumpai di dalam lapisan tanah,

D. Spora Glomus invermaium yang masih hidup yang diambil dari dalam pot biakan

Gambar 8. Karakteristik Morfologi Spora Genus Scutellospora

Keterangan: A. Spora Scutellospora berwarna pputih yang didalamnya

terdapat bakal benih yang terlindung dalam lapisan

perlindungan yang kokoh B. Spora dari Scutellospora reticulata


28

Gambar 9. Karakteristik Morfologi Spora Genus Entrohospora

Gambar 10. Karakteristik Morfologi Spora Genus Sclerocystis


29

Gambar 11. Karakteristik Morfologi Spora Genus Acaulospora Keterangan: A. Spora Acaulospora memiliki lubang yang menembus dinding

sel bagian luar dan dalam; diamati dengan reagen Melzer B. Spora Acaulospora memiliki beberapa lapisan dinding sel

(ditunjukkan oleh tanda panah); diamati dengan

menggunakan reagen Melzer

5.4 Perhitungan Persentase Infeksi Mikoriza

Cara Kerja : a. Cuci contoh akar tanaman dengan bersih untuk

melepaskan semua kotoran dan misellium luar.

b. Rendam dalam KOH 10% pada suhu 90oC selama 1-2 jam.

c. Bilas contoh tersebut dengan air sebanyak 4 kali, untuk

menghilangkan kelebihan KOH yang menempel. d. Masukkan ke dalam HCl 2% selama 2 menit.


30

e. Tuangkan asam (dipisahkan dari akar) dan tambahkan

zat pewarna (0.05 % trypan blue dalam laktofenol). f. Rebus akar dalam zat pewarna tersebut selama 3 menit. g. Tuangkan (pisahkan) kembali pewarna dan laktofenol,

biarkan semalam. h. Periksa melalui mikroskop dengan meletakkan akar

yang telah diberi warna ke dalam gelas preparat.

Bulatan-bulatan berwarna gelap (biru jika digunakan trypan blue dan merah jika digunakan acid fuchsin) adalah vesikel yang saling bersambungan satu sama

lain, atau misellium-misellium yang beda warnanya dari sel-sel akar atau arbuskular.

Perhitungan persentase infeksi :

% infeksi= %100

diamatiyangakar

terinveksiyangakar


31

ISOLASI DAN PEMURNIAN RHIZOBIUM

(0040207508)

1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan kegiatan isolasi dan pemurnian Rhizobium.

2. Alat dan Bahan

2.1 Isolasi Bintil Akar

Alat dan bahan yang diperlukan untuk kegiatan ini meliputi:

- garpu tanah - cutter - botol film

- alat tulis - gunting - silika gell

- kertas label 2.2 Isolasi Rhizobium

Berikut ini alat-alat yang perlu disiapkan sebelum

memulai kegiatan isolasi Rhizobium : - Autoklave - Cawan petri

- Pengaduk - Spatula - Timbangan

- Jarum ose - Kotak transfer

- Bunsen - Vial yang dapat diautoklave - Hot plate

- Mortar - Cutter/gunting - Kertas label

- Erlenmeyer 500 ml - Tabung reaksi

VIII.


32

Bahan yang diperlukan pada tahap kegiatan ini meliputi : a) Bintil akar, b) Bahan media Yeast Extract Mannitol Agar,

c) K2HPO4 0.5 g d) MgSO47H2O 0.2 g e) NaCl 0.1 g

f) Mannitol 10 g g) Air ragi 100 ml h) Air destilata 900 ml

i) Agar bacto 15 g j) CaCO3 0.3 g k) Kongo red 10 ml (250 mg dilarutkan dalam 100 ml air

destilata) l) Bahan Air Ragi

- Ragi kue 100 g - Air dingin yang didiamkan 1-2 jam

m) Bahan Sterilisasi Nodul : H2O2 3-5 %

3. Referensi

Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa

Biologi Tanah. 4. Definisi

Bintil akar pada tanaman leguminosa merupakan petunjuk adanya simbiosis antara akar tanaman dengan bakteri bintil akar (Rhizobium sp.). Fungsi dari bintil akar ini adalah untuk

menambat nitrogen bebas dari atmosfer (rongga udara tanah). Isolasi bakteri Rhizobium sp. dilakukan dengan menggunakan tanah di daerah perakaran tanaman legum atau

dengan menggunakan bintil akar. Namun isolasi dengan menggunakan bintil akar lebih praktis dan lebih cepat bila

dibandingkan dengan isolasi dari tanah. Bintil akar seringkali harus diambil dari lokasi yang jauh dari laboratorium, untuk itu bintil akar harus mendapatkan perlakuan khusus agar bakteri

di dalamnya tidak mati. Berikut ini diuraikan tentang teknik koleksi bintil akar. Isolasi bakteri Rhizobium dilakukan pertama kali oleh

Beijerinck pada tahun 1888 dari bintil akar legum. Sampai saat ini sudah banyak diisolasi bakteri Rhizobium dari berbagai jenis legum dari berbagai tempat di seluruh dunia. Di dalam


33

bintil akar tidak hanya terdapat satu galur bakteri Rhizobium

saja, mungkin dua atau lebih galur hidup bersama-sama di dalam satu bintil akar. Galur Rhizobium. pada suatu tempat mungkin tidak terdapat di tempat lain. Dengan isolasi dan

pemurnian ini diharapkan dapat diperoleh galur-galur Rhizobium yang murni, efektif dan dapat di pindahkan dari satu tempat ke tempat lain dengan prektis dan biaya murah.

Dalam isolasi dan pemurnian ini digunakan media kaya manitol Ekstrak Khamir (MEK) di mana semua mikroorganisme (bakteri dan cendawan) dapat tumbuh di dalamnya. Sehingga

untuk mencegah kontaminasi, harus diperhatikan kebersihan dan kesterilan meja kerja dan pelaksana.

Gambar 12. Bintil Akar pada Tanaman Kedelai (a) dan Irisan

Melintang Bintil Akar (b) (K. Minamizawa of Tohoku University)

5. Uraian Prosedur 5.1 Isolasi Bintil Akar

Persiapan di laboratorium : a. Masukkan beberapa butir silika gell ke dalam botol film

secukupnya. Jumlah botol film yang dibawa ke

lapangan disesuaikan dengan kebutuhan, dan b. Periksa kembali kelengkapan peralatan sebelum

berangkat ke lapangan.

Pengumpulan bintil akar di lapangan : a. Tetapkan pohon yang akan diambil bintil akarnya,

(a) (b)


34

b. Bersihkan tumbuhan bawah yang tumbuh di sekitar

pangkal batang pohon yang akan diambil bintil akarnya, c. Periksa sekitar pangkal batang tersebut dengan

mengorek tanah menggunakan golok, apakah terdapat

bintil akar, d. Apabila tidak ditemukan maka dapat dilakukan

penggalian lebih dalam dengan menggunakan garpu

tanah, e. Setelah menemukan akar yang berbintil kemudian

potong akar tersebut dengan menggunakan gunting

atau cutter, f. Bersihkan tanahnya dengan hati-hati, pilih bintil-bintil

yang berukuran cukup besar dan masukkan ke dalam

tabung film yang sudah diisi silica gell dan tutup kembali (bintil akar yang baik adalah bintil yang bila

dibelah maka dalamnya berwarna merah jambu), dan g. Tempelkan kertas label pada tabung, sebutkan nama

kolektor, tanggal pengambilan, dan jenis pohon.

Catatan : Sebaiknya setelah sampai di laboratorium bintil akar langsung diisolasi, bila tidak langsung diisolasi simpan koleksi bintil akar dalam lemari pendingin tanpa

dikeluarkan dari dalam tabung film.

5.2 Isolasi Rhizobium di laboratorium

Prosedur Kerja :

A. Sterilisasi alat dan bahan 1. Sterilisasi semua peralatan yang akan digunakan.

2. Guntinglah kertas saring sesuai dengan ukuran gambar cawan petri, masukkan ke dalam cawan petri dan sterilisasi.

3. Siapkan air steril dalam erlenmeyer 250 ml. 4. Siapkan larutan garam fisiologis (0.1 g NaCl; 100 ml

aquades) steril dalam erlenmeyer 250 ml.

B. Pembuatan air ragi 1. Rendam 100 g ragi kue ke dalam 1 liter air dingin

2. Diamkan selama 1-2 jam 3. Autoklave selama 40-60 menit 4. Didiamkan supaya mengendap atau disentrifuse

C. Pembuatan media 1. Siapkan media mannitol ekstrak khamir (MEK) (10g

mannitol; 0,5g K2HPO4; 0.2g MgS04.7 H20; 0,1g


35

NaCl; 100 ml air ragi, 15 g Agar Bacto; air destilata

900 ml; dipanaskan untuk melarutkan agar bacto). 2. Bagilah media Agar MEK ke dalam 4 erlenmeyer 250

ml, tutuplah erlenmeyer tersebut dengan kapas dan

alumunium foil. 3. Siapkan larutan Kongo Red sebanyak 10 ml,

masukkan dalam botol vial yang dapat diautoclave.

4. Sterilisasi bahan-bahan di atas ke dalam autoclave pada tekanan 1 atm suhu 120o C selama 20 menit.

5. Setelah 20 menit, keluarkan bahan-bahan tersebut

dari autoclave. 6. Setelah media MEK agak dingin (belum membeku),

satu erlenmeyer ditambah dengan Kongo Red, kocok

sampai rata. 7. Tuangkan media MEK (3 erlenmeyer tanpa Kongo

Red dan 1 erlenmeyer ditambah Kongo Red) ke dalam cawan petri secara aseptik (dilakukan dalam kotak transfer) masing-masing cawan sebanyak 10

ml. 8. Setelah Agar MEK membeku, baliklah cawan petri

agar embun tidak menetes permukaan Agar MEK

tersebut.

D. Sterilisasi dan Isolasi Bintil Akar 1. Cucilah bintil akar dengan air yang mengalir untuk

menghilangkan tanah yang menempel pada permukaannya. Apabila kotoran sulit dihilangkan, dapat digunakan larutan tween 20.

2. Celupkan bintil-bintil akar tersebut ke dalam etanol 95% selama 5-10 detik. Cuci dengan air steril dalam gelas piala dan rendam dalam H2O2 3-5% selama 3-4

menit. 3. Untuk menghindari kontaminasi, kegiatan-kegiatan

berikut dilakukan di dalam kotak transfer. 4. Celupkan pinset dalam ethanol 95% kemudian bakar

ujung pinset beberapa lama pada bunsen agar steril.

5. Pindahkan bintil-bintil akar dengan menggunakan pinset steril ke dalam gelas piala yang berisi air steril untuk membilas H2O2 3-5% dan permukaan bintil

akar.


36

6. Buanglah air bekas bilasan bintil akar, gantilah

dengan air steril yang baru, untuk membilas. Ulangi pembilasan sampai 5 kali.

7. Biarkan bintil akar terendam dalam air steril.

8. Pindahkan bintil-bintil tersebut dengan menggunakan pinset steril ke dalam cawan petri yang berisi kertas saring steril.

9. Ambil satu bintil akar dan masukkan ke dalam mortar, hancurkan dengan menggunakan pengaduk steril atau ujung pinset steril. Tambahkan 1 tetes

larutan garam fisiologis. 10. Gunakan jarum ose untuk memindahkan suspensi

ke dalam cawan petri yang berisi media MEK yang

ditambah dan tanpa penambahan Kongo Red, oleskan secara zig-zag seperti pada Gambar 13 A.

11. Tuliskan kode isolat dan tanggal isolasi di atas kertas label, kemudian tempelkan pada cawan petri yang telah diolesi denqan suspensi bintil akar/

digores dengan jarum isolasi (Gambar 13 B), kode isolat sebaiknya mencerminkan asal daerah dan jenis pohon asal; misalnya PFMS: jenis pohon

Paraserianthes falcataria asal Malang Selatan). 12. Inkubasikan biakan dalam inkubator pada suhu

26oC dan amati pertumbuhan bakteri Rhizobium di

sepanjang garis-garis olesan/goresan. Inkubasikan selama 4-5 hari. Contoh hasil isolasi dan pemurnian Rhizobium pada media agar YEMA

Gambar 13. Arah Penggoresan Jarum Ose (A) Pengolesan suspensi bintil akar pada media MEK + Kongo Red, (B) penggoresan jarum isolasi

B A


37

Gambar 14. Rhizobium sp. pada agar YEMA (sumber: Purwanto)

E. Pemurnian biakan

1. Koloni-koloni bakteri Rhizobium yang terpisah dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi media MEK tanpa Kongo Red dengan menggunakan jarum

ose. Pengolesan dilakukan secara zig-zag (Gambar 13 A), satu cawan petri hanya untuk satu koloni.

2. Tuliskan kode isolat baru dengan menambah angka 1,

2, 3 dan seterusnya di belakang kode isolat pada waktu isolasi, dan tanggal pemurnian pada kertas label. Tempelkan pada cawan petri yang telah diberi

biakan Rhizobium. 3. Inkubasikan isolat di dalam inkubator pada suhu

26oC. Amati pertumbuhan bakteri Rhizobium. Apabila

masih terdapat koloni-koloni yang terpisah, lakukan pemurnian sekali lagi.

Ik Lab Biologi Tanah Ub 11_7 Agustus 2012

Documents

Transcript of Ik Lab Biologi Tanah Ub 11_7 Agustus 2012