II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 VITAMIN A

Vitamin A merujuk pada semua senyawa isoprenoid dari produk-

produk hewani yang mempunyai aktivitas all trans-retinol ( Rohman dan Ibnu,

2007). Menurut Almatsier (2009), vitamin A merupakan terminologi nama

generik yang menyatakan semua senyawa retinoid dan karotenoid (prekursor/

pro vitamin A) yang mempunyai aktivitas biologis seperti retinol. Bentuk

kimiawi senyawa retinoid berupa retinol (vitamin A bentuk alkohol), retinal

(aldehida), ester retinil dan asam retinoat. Menurut CE (2007) struktur kimia,

rumus empiris dan bobot molekul dari: retinol, retinil asetat, retinil propionat

dan retinil palmitat dapat dilihat pada Gambar 1 dan Tabel 1. Menurut

Eitenmiller dkk, (2008) sifat-sifat kimia-fisika dari retinol dan retinil palmitat

dapat dilihat pada Tabel 2.

CH3H3CCH3 CH3

OR

CH3

Gambar 1. Struktur molekul vitamin A alkohol (retinol) dan ester vitamin A (ester retinil)

Tabel 1. Rumus empiris dan bobot molekul dari vitamin A alkohol (retinol)dan ester vitamin A (ester retinil)

Nama zat R Rumus empiris Bobot MolekulRetinol Retinil asetatRetinil propionatRetinil palmitat

HCO-CH3 CO-C2H5

CO-C15H31

C20H30OC22H32O2C23H34O2C30H40O2

286,5328,5 342,5 524,9

Sumber: CE (2007)

2.1

6

Tabel 2. Sifat-sifat Kimia Fisika Retinol dan Retinil PalmitatSifat Kimia Fisika Retinol Retinil PalmitatBentuk Kristal kuning Kristal, amorf atau cairan

kental berwarna kuningRumus Kimia Bobot Molekul

C20H30O286,46

C36H60O2524,88

Kelarutan Larut dalam: metanol, etanol, propanol, kloroform, eter, hidrokarbon, minyak

Larut dalam: metanol, etanol, propanol, kloroform, eter, hidrokarbon, minyak.

Absorbsi UV:� maks. (etanol)E (1%, 1cm)

325 nm1845

325 nm940

Flourosensi:� eksitasi� emisi

325 nm470 nm

325 nm470 nm

Sumber: Eitenmiller dkk (2008)

Vitamin A pada umumnya stabil terhadap panas, asam, dan alkali,

namun mempunyai sifat yang mudah teroksidasi oleh udara dan akan rusak

bila dipanaskan pada suhu tinggi bersama udara, sinar, dan lemak yang sudah

tengik (Winarno, 2008). Menurut Favaro dkk, (1991) di dalam Hariyadi

(2011) vitamin A yang difortifikasikan ke dalam minyak goreng stabil selama

6-9 bulan jika disimpan dalam wadah tertutup dan terlindung dari cahaya,

vitamin A relatif stabil setelah proses penggorengan.

Menurut CE (2007), aktifitas vitamin A dinyatakan dalam Retinol

Ekivalen (R.E.), 1 mg R.E. sebanding dengan aktifitas 1 mg All-trans retinol.

Aktifitas ester retinol lain dihitung secara stoikiometris, sehingga didapat 1

mg R.E. vitamin A sebanding dengan: 1,147 mg all-trans-retinyl acetate,

1,195 mg all-trans-retinyl propionate dan 1,832 mg all-trans palmitate. Unit

Internasional atau International Units (IU) juga digunakan untuk menyatakan

aktifitas vitamin A. 1 IU Vitamin A ekivalen dengan aktivitas 0,300 �g All-

trans retinol. Aktifitas retinol ester lain dihitung secara stoikiometris,

sehingga didapat 1 IU vitamin A sebanding dengan aktifitas: 0,334 �g all-

trans-retinyl acetate, 0,359 �g all-trans-retinyl propionate, dan 0,550 �g all-

trans palmitate.1 mg R.E. sebanding dengan 3333 IU.

TTTabeSifaBen

RumBobKeKeKel

AbAbAbAbAbAAAbAbbbbAbAbAbAbAbAbAbAbbbAbbbAbbAbAbAbAbAbAbAbAbbAbAbAbAbAbAbbbAbAAbbAbAbAbbAbAAbAbAbAbbbbbAAAbAbAAbbAAAAbbbAAAAbAAbbbAbAbbbbAAAAAbbAAAbAbbbAAAbbbbbAbbbA s��������������������������������������������������������������������������������������������������������� mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmE EE EE EEEE EEEEEEE E EE E E EEEEE EEEEEEEEEEEE EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE (((((

FlFlFlFlllllFlllllllllFlFlFlllllllllllllllllllllllllllllllllloooouooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo������������������������������������������ ekeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee��������������������������������������������������������������������������� emeeeeeeeeeeeeee

SSSSS

nnnnamamamammmmmmmmmammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmu

bbibilalalalalalalalallalaallalalaalalalaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaalaaaaallaaalaaaalaaaa d

teeengngngngngngngnggngngngngngngnngngngnggngngnnnngngnngnnggnngngngngngngnnnngnggggngnnggggngnnggngnngnggngnnnnnnngnngnggnnnggnngnggnngggnggnnnnngggnnnnggggggggggi

(201

6666-9 b

vvvvitam

M

EEEEkiv

AAAAktif

mmmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgggggmgmgggmgmggmgmggggggggggmggmggmgmgmgggmgmgmggmmggggggggggggggggggggggggggg R R RRR R R

111,1,1,,1,,,,,1,1,,1,11,,1,,,,,,,,,,1,,,,1,,,1,,,,11919191991919191191919919199191991919191199991919111919991191119191999911911111111991119911991911119111191111119119191999111119919999995

Innnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntetetetetetetetetetetetetetetetetetetetetettetetetettetetettetetetetetetteteteetetteteteteeetetetteeeteeettettettetteteeeeeeeeerrnrrr

aaakakkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkktttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttifififififiififififififififfififiifififfffifififififiifififififiiffffifiiififfiffififiiifffiiiififfffffiffifififfffffiiffiiffififffiffffiiiiiii iiii

trrrrrrrrananananananannananananannaaaaaanannnnnnanananananananaanaannnnnanannannnnannnnnnannnnnnnannnnnnnnnnnnnnnannnanaaanaaannsssssssssssssssssssss

ssseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeehhihhihihihihihihihihhhhihhhhhhhihhihiihhhhhihihihihhihiiihihihhiihhhhhihhiihhih nnn

trrrrrrrrrrrrrrrrrranananananaaanaananaaaananananannnaaaananaaaaaaananaaaaaaaanannnaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa sss

trrrrrrrrrrrrrrraanananananananananaananananaananananananaaanananannanaananananaanaananaananananaaanananananannananannanaaanaaaaanaaaanaaanaananannanaaananaaanannnnaananaanannaaa sss

7

Aktifitas vitamin A ditentukan dengan tujuan untuk menghitung jumlah

yang dibutuhkan pada pembuatan konsentrat. Menurut BP Commision (2009),

aktivitas vitamin A palmitat ditetapkan dengan cara menimbang 25-100 mg

vitamin A dengan akurasi 0,1 %, dilarutkan dengan menggunakan 5 mL

pentana dan diencerkan dengan 2-propanol hingga diperolah konsentrasi 10 -

15 IU/mL. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang yang

menghasilkan serapan maksimum pada 326 nm. Aktivitas vitamin A dihitung

dalam satuan internasional unit (IU) per gram dengan persamaan:

A326 = Absorbansi pada panjang gelombang 326 nm

V = total volume pengenceran untuk mendapatkan kadar 10 – 15 IU/mL

1900 = faktor untuk mengkonversi absorbansi spesifik ester retinol menjadi

IU per gram

m = bobot substansi yang di uji (dalam gram).

Vitamin A merupakan zat gizi yang penting (esensial) bagi manusia,

karena zat gizi ini tidak dapat disintesa oleh tubuh, sehingga harus dipenuhi

dari luar. Vitamin A penting untuk kesehatan mata dan mencegah kebutaan

dan yang lebih penting lagi vitamin A meningkatkan daya tahan tubuh. Anak-

anak yang cukup mendapatkan vitamin A, bila terkena diare, campak atau

penyakit infeksi lainnya maka penyakit-penyakit tersebut tidak mudah men-

jadi parah, sehingga tidak membahayakan jiwa anak. Dengan adanya bukti-

bukti yang menunjukkan peranan vitamin A dalam menurunkan angka

kematian, maka selain untuk mencegah kebutaan, pentingnya vitamin A saat

ini lebih dikaitkan dengan kelangsungan hidup, kesehatan dan pertumbuhan

anak (Depkes, 2009a). Fungsi vitamin A didalam tubuh adalah untuk diferen-

siasi sel penglihatan, spermatogenesis, perkembangan embrio, imunitas,

mempengaruhi indra perasa, pendengaran, nafsu makan, serta pertumbuhan

(Bagriansky dan Ranum, 1998). Fungsi lain dari vitamin A adalah membantu

memelihara penglihatan di dalam gelap dan mencegah rabun senja serta

xeropthalmia, untuk pertumbuhan, dibutuhkan dalam pertumbuhan tulang dan

mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

8

perkembangan gigi, sebagai koenzim dalam sintesis glikoprotein, memiliki

fungsi seperti hormon steroid, diperlukan untuk pembentukan tiroksin dan

pencegahan goiter, sintesis protein dan sintesis kortikosteron dari kolesterol,

serta sintesis normal dari glikogen (Berdarnier dkk, 2002).

Angka kecukupan gizi untuk vitamin A biasanya dinyatakan dalam satuan

retinol ekivalen (RE). Satu RE setara dengan 1 mikrogram retinol atau 6

mikrogram beta karoten atau 12 mikrogram beta karoten campuran. Status

vitamin A dikatakan baik jika konsentrasi vitamin A dalam hati sebesar 20

mikrogram/gram. Penggunaan setiap harinya adalah sekitar 0,5% dari

persediaan tersebut. Konsumsi vitamin A yang baik adalah jika setengahnya

bisa disimpan didalam tubuh (Muhilal, Jalal dan Hardiansyah, 1998). Angka

kecukupan gizi vitamin A rata-rata yang dianjurkan perhari dapat dilihat pada

Tabel 3.

Tabel 3. Angka Kecukupan Gizi Vitamin AKelompok Usia (tahun) Angka Kecukupan (RE)Bayi 0-0,5 0,5-1

375400

Anak-anak1-2 2-6 6-10

400450500

Pria10-12 12-70

500600

Wanita 10-70 500Wanita Hamil 800Wanita Menyusui0-6 bulan> 6 bulan

850850

Sumber: FAO/WHO (2001) dalam Muhilal dan Sulae-man (2004)

2.2 MINYAK GORENG SAWIT

Menurut Badan POM (2006), minyak goreng (frying oil atau frying fat)

adalah: minyak dan lemak yang digunakan untuk menggoreng yang diperoleh

dari proses rafinasi/pemurnian (refining/purifying) minyak nabati dalam

bentuk tunggal atau campuran. Karakteristik dasar minyak goreng meliputi:

ppperke

ffufufungs

pppenc

ssserta

A

rrretino

mmmimimimmimimiimimimimiimimimimimiimiimimimimimiimimimimimimimimmimiimiimimimmimimimimimiimiimiiimimiimimiimimimmmimmiiimimmmmmmiimikrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkrrkrkrkkrrkrkrkrrkrkkrkrkrkrkrkrkrrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkkrkrkrkrrkkkkrkrkkrkkrkrrkkkkkkrkrkrkrkkrrkrrkrrkrrkrrrkrkrkkrrrkkkrr

vvvivitatatatatatatatatatatatatatatataaataatatataaaaaaaatataaataaataaaaaataaaattaaaaatataaaataaattaaatataaaaaaaaataaaaaaattaaataataaaattttaammmmmmmmmmmm

mmmimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiikrkkkkkkrkrkrkrkrkrkrkkkkrkkrkkrkkkkkkkrkkkkkkrkkkkkkkrkkkrkrkkkkkkkkrkkkkkkkkkkrkkkrrkkkrkkkkkrkrkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk

ppepeeeeersrsrsrsssrsrsrrsrrsrsrsrrssrsrrrsrssrrsrsrsssrsrsrrrrssssrrsrrrsssrsrsrrsssrssssssrssssrsssssrrrsrssssssrrrrrrrrse

bbbisasasasasasasasasaasasasasassasaaaaaaaaasasaaaaasasaasaaaaaaasasasasaassasaasaassaaasaasaasassaassaassaasss

kkkekeeeecucccucucuccuccucucuucucucuccucucccucucucuucucucucucuccuucccuucuucuucuccuuccccucucccucuucucucuccccccuuccucucccccuccuccccccccc k

TTTTabababababbababbbabababababbbabababbbabbbbabbabababbababbbabbababbababbbbbbbbbabbbbbbbbababbbababbbbbbabbbbbababbabbbbabbbbabbbbabbbbbabbbbabbabbabbbabbbbbbabbbbbeeee

2.2 MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMININININININININININNININNNINNININNNININNNNINNNNININNNNNINNIIIIIINNINIIINNNIIIIINNNNIIINIINNNNNNNNN

aaadadddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddalalalllalalalalallalalalalalllalaalalllalaallllallllaallallllalallalalallllaallaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

dddadaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaariririririiriririririiriririrriiririiiiriririririririiriririiriiiiirirriiriiiriiiiiiririiririiririirririrrirrirrrrrrriiirirrrrr

bbebeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeentntntntnntnnnntnnnnntnttnntnntnntntnttntnttntuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuu

9

kadar air tidak lebih dari 0,15 %, kadar asam lemak bebas tidak lebih dari 0,3

%, kadar asam lemak linoleat tidak lebih dari 2 % dan bilangan peroksida

tidak lebih dari 10 mek O2/kg.

Minyak kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm Oil/RBDPO)

adalah: minyak yang diperoleh dari hasil proses rafinasi/pemurniaan minyak

kelapa sawit mentah. Karakteristik dasar minyak kelapa sawit meliputi:

bilangan penyabunan 190 mg KOH/g, bilangan iod 50 Wijs hingga 55 Wijs,

titik leleh 33 oC hingga 39 oC dan bilangan peroksida tidak lebih dari 10 mek

O2/kg (Badan POM, 2006).

Minyak olein kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm Oilein)

adalah fraksi cair minyak kelapa sawit berwarna kekuningan yang diperoleh

dari hasil proses rafinasi/pemurniaan minyak olein kelapa sawit mentah

(Crude Palm Oil/CPO) atau fraksinasi minyak kelapa sawit yang sudah dirafi-

nasi (RBD palm oil). Karakteristik dasar minyak olein kelapa sawit meliputi

titik leleh/lebur tidak lebih dari 30oC, bilangan iod tidak kurang dari 56 Wijs,

bilangan penyabunan 194 mg KOH/g hingga 202 mg KOH/g dan bilangan

peroksida tidak lebih dari 10 mek O2/kg (Badan POM, 2006).

Minyak stearin kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm

Stearin) adalah fraksi padat minyak kelapa sawit yang berwarna kekuningan

yang diperoleh dari hasil proses rafinasi/pemurnian stearin kelapa sawit

mentah (Crude Palm Stearin) atau fraksinasi minyak kelapa sawit yang sudah

dirafinasi (RBD palm oil). Karakteristik dasar minyak olein kelapa sawit

meliputi: titik leleh/lebur tidak kurang dari 44oC dan bilangan iod tidak lebih

dari 48 Wijs (Badan POM, 2006).\

Minyak sawit (palm oil) berbeda dengan minyak inti sawit (palm kernel

oil). Minyak sawit diperoleh dari daging buah kelapa sawit bagian mesokarp,

sedangkan minyak inti sawit diperoleh dari biji buah kelapa sawit. Minyak

kelapa sawit diperoleh melalui proses ekstraksi secara rendering atau penge-

presan dan proses pemurnian yang terdiri atas pengendapan dan pemisahan

gum, netralisasi, pemucatan dan deodorisasi. Secara umum minyak kelapa

sawit mempunyai karakteristik warna kuning pucat sampai jingga tua,

10

memiliki aroma yang sedap dan stabil atau tahan terhadap ketengikan

(Winarno, 2008).

Melalui proses rafinasi, pemucatan dan penghilangan bau atau disingkat

RBD (Refined, Bleached, Deodorized), minyak kelapa sawit dapat diubah

menjadi produk yang bernilai tinggi. Proses rafinasi dan fraksinasi

menghasilkan minyak yang tidak berwarna, jernih dan bersih dari kotoran

yang dikenal dengan RBD oil. Kehilangan beta karoten yang terkandung

dalam minyak kelapa sawit banyak terjadi selama proses-proses tersebut

berlangsung (Muchtadi, 1996).

Menurut Olson (1990), minyak kelapa sawit yang tidak mengalami

proses penjernihan dan bleaching memiliki warna merah karena banyak

mengandung karoten (� dan � karoten) dalam jumlah yang banyak.

Kandungan karotenoid sebanyak 0,5 mg/mL minyak kelapa sawit. Kebutuhan

vitamin A pada anak usia pra-sekolah dapat dicukupi dari konsumsi 7 mL

minyak kelapa sawit merah per hari. Menurut Martianto, Marliyati dan

Komari (2007), walaupun memiliki kandungan karotenoid yang tinggi,

minyak kelapa sawit merah tidak dapat diterima dalam banyak penggunaan

karena warna merah yang kuat dan rasanya yang sangat khas.

Menurut Kemperin (2010), minyak goreng sawit adalah: bahan pangan

dengan komposisi utama trigliserida berasal dari minyak sawit, dengan atau

tanpa pengubahan kimiawi, termasuk hidrogenasi, pendinginan dan telah

melalui proses pemurnian dengan penambahan vitamin A. Komposisi minyak

goreng sawit terdiri atas bahan baku minyak sawit dan bahan tambahan

pangan (BTP) yang penggunaannya disesuaikan dengan ketentuan yang

berlaku untuk diizinkan penggunaannya pada minyak goreng sawit. Adapun

persyaratan mutu minyak goreng sawit sesuai dengan RSNI 3 Minyak goreng

sawit 2010 dapat dilihat pada Tabel 4

mmmmem

(WWin

RRRRBD

mmmmenjn

mmmmeng

yyyayaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaangngngngngngngngngngngngngngngngnggngngngngngngnngngngngngnnnngggngngngngngngnggnngnnngngnngnnnggnngngnnnggnngnnggngnggggggggngggnnggngnng

dddadaaaaalalalallalalalalalalalalalallalallalalalaalllllalalalalalalalllalllallllalalallalaalallallalalaaallaalallllaallalalaaallaaalalaaalllaallallllaalallaallllllalalaalllalammm

bbebeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeerlrlrlrlrlrlrlrrlrlrlrlrlllrllrlrlrlrlrllrrrlrlrlrrlrllllrrllllrlrlrlllrlrlllrllrlrllllrlrlrllrrllrlrlllrlrrlrrrrrlrllrlrrrrlrlrrlrrrrllrr aaaaaaaaaaaa

pprprrosososososoooosososoososoosoooosssossososooooooosssoooosooooosooosoosooosoooosoooosoooooooosoosooo e

mmmemeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeengnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

KKKaKaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaannnnndndnnnnnnnndnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

vvvivitatatatatataatatatattaatatataataatatattataatatatataaatattaaaataaataaaaaaaaaaaaaatattttaaattaaaaaaataaaaammmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

mmmimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiinynynynynynynynynnynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnynnnnnynnnnnnnnnnnnnnnnnnny

KKKoKooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooommmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

mmmimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiinnnnnynnnnnnynnynynynynnynnnynnynnnnnynnnnnnnnynnnynynnnnnnnnnyynynynnnnynynnnnnnnnnnnnnynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

kkkakaaaarerererrerererererererereererrreeerrerereereerrererrrerereerererreeeerrrrrrreeererrrrrrrererreerereerrrerrreerrrrererrrereererren

ddddeng

taaanpa

mmmmela

ggggoren

pppang

bbebeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeerllrlrlrrlrlrlrllrlrlrlrlrlllrlrlrlrlrlrlrllrrllrlrlrlrlrllrlrllrlrlrlrrlrlrlrllrlrrlrllrrlrrrrlrlrlrrllllrlrllllrllrrrrrrrrrlllrlrllrrlllaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

ppppepepepepepeepepepepepepeeepepepepepeeeepepepepepeepepepeeeeeeepeeeepepeeeeeeeppepeppepepeeepepeeepeepepepepeepepeepeeepeepeeeep rsrsrsrsrsrsrsrsrsrssrsrsrsrsrsssrsrsrsrrrrsssrsrrsrsrrsrrrsrsssssrsrrrsrsrssrsssrsssrsrssssssrssssssrssssrssy

sssaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaawiwwwwwwwwwwwwiwiwwiwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwiwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww t

11

Tabel 4 RSNI 3 Persyaratan Mutu Minyak Goreng SawitNo. Kriteria Uji Satuan Persyaratan1 Keadaan1.1 Bau - Normal1.2 Rasa - Normal1.3 Warna (merah/kuning) (Lovibond 5,25

cell)maks. 5,0/50

2 Kadar air dan bahan menguap % (b/b) maks. 0,13 Asam lemak bebas (dihitung

sebagai asam palmitat)% maks. 0,3

4 Bilangan peroksida mek O2/kg maks. 10*5 Vitamin A IU/g min. 45*6 Minyak pelikan - negatif7 Cemaran logam7.1 Kadmium (Cd) mg/kg maks. 0,27.2 Timbal (Pb) mg/kg maks. 0,17.3 Timah (Sn) mg/kg maks. 40,0/250,0**7.4 Raksa (Hg) mg/kg maks. 0,058 Cemaran arsen (As) mg/kg maks. 0,1

Catatan:* pengambilan contoh di pabrik** dalam kemasan kaleng

2.3 FORTIFIKASI PANGAN

Menurut Soekirman (2003), kekurangan zat gizi mikro dapat diatasi

dengan berbagai pendekatan seperti diversifikasi pangan, suplementasi dan

fortifikasi pangan. Fortifikasi adalah penambahan satu atau lebih zat gizi

mikro tertentu ke dalam bahan pangan dengan tujuan utama adalah mening-

katkan mutu gizi makanan. Fortifikasi dapat bersifat sukarela maupun wajib.

Fortifikasi yang dilakukan secara sukarela adalah fortifikasi yang dilakukan

oleh produsen untuk meningkatkan nilai tambah produknya, sedangkan

fortifikasi wajib merupakan fortifikasi yang diharuskan dan terdapat dalam

undang-undang maupun peraturan pemerintah dengan tujuan melindungi

rakyat dari kurang gizi. Target utama dari fortifikasi wajib ini adalah

masyarakat miskin yang umumnya menderita kekurangan gizi mikro seperti

kekurangan yodium, zat besi, dan vitamin A. Bahan pangan yang dapat

dilakukan fortifikasi harus memenuhi beberapa kriteria yaitu:

1. Bahan pangan harus dikonsumsi oleh semua atau sebagian besar populasi

sasaran.

2. Bahan pangan harus dikonsumsi secara rutin dalam jumlah yang tetap.

2.2.2.22.22.2.2.2.222.2.2.2.2.22.2.2.2.2222222222.222222222.22222.2.22.2.222222222222222 333333

12

3. Rasa, penampakan dan bau bahan pangan yang difortifikasi tidak boleh

berubah.

4. Zat yang digunakan untuk fortifikasi harus stabil pada kondisi yang

ekstrim seperti pemasakan, pemrosesan, pengangkutan dan penyimpanan

5. Harga bahan pangan hasil fortifikasi tidak naik secara berarti.

Menurut Soekirman (2003) syarat-syarat bahan pangan yang akan

dilakukan fortifikasi adalah produsen yang memproduksi dan mengolah bahan

pangan tersebut terbatas jumlahnya, tersedianya teknologi fortifikasi untuk

bahan pangan yang dipilih dan bahan pangan tersebut tetap aman untuk

dikonsumsi dan dan tidak membahayakan kesehatan.

Menurut Martianto (2011), minyak goreng merupakan bahan pangan

yang diproduksi secara terpusat dan dikonsumsi secara luas oleh masyarakat,

sehingga dapat dipakai sebagai alternatif bahan pangan untuk difortifikasi.

Fortifikasi vitamin A ke dalam minyak goreng sawit perlu dilakukan dengan

alasan: (1) Produk makanan Indonesia sebagian besar menggunakan minyak

goreng; (2) Untuk mengurangi penyakit akibat KVA, maka perlu adanya

kebijakan yang tepat untuk menanggulangi masalah KVA; (3) Salah satu

kebijakan yang ditempuh adalah fortifikasi vitamin A dalam minyak goreng,

dan (4) Pemerintah akan menetapkan standar yang mewajibkan kepada

seluruh produsen minyak goreng sawit untuk melakukan fortifikasi vitamin A

ke dalam produknya.

Menurut Hariyadi (2011), fortifikasi vitamin A pada minyak goreng

dapat dilakukan dengan alasan: (1) Vitamin A dan pro-vitamin A sangat

mudah larut dalam minyak goreng; (2) Vitamin A umumnya lebih stabil

dalam minyak goreng dari pada dalam bahan pangan lainnya; (3) Minyak

goreng (lipida) membantu proses absorbsi dan pemanfaatan vitamin A; (4)

Minyak goreng digunakan oleh masyarakat luas; (5) Teknologinya tersedia

dan sederhana, dan (6) Biaya fortifikasi terjangkau.

3333. R

b

4444. Z

e

5555. H

dddidiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiilalalalaalalalallalallalallallalalalalallalalallalalalalalalalalalllalllalalalllalallalalaalaalalaalalaaalaallaalallalalllalllalaaaaakkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk

ppapaaaaangngngngnnngnngngnngngnnngnnnnnnnnnnnnngnnngnnnnnnnnnnnnnnnnngnnnnnnnngnnngnnnnnnnngnnnnnnnnnnnnnngnnnngnnngnnnnnnnnnnnnnnnnngnnggggggggg

bbabaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaahahahhhahahahahhhahahahahahhhahahhahahahhhhhhhahhhhhhahhhhhhahhhahahhhhhahhhahahhhahhhhhahhaaahhahahhhhhaaahhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh n

dddidikokokokokokookokokokkokokookkokookkokokokokookokokkkkokokookokokkoooooooooooooooooookokkkookkkookkokkokokkkkkkoooooon

yyyayaaaaangnnngngngnngnngngngngngngngnngngnnngngngnngngngnngngnngngnnngnngngngngnnnggnnnnnngngnnnnnggnnngngnnnnnnggnngngnnnnngnnnnnnnnnnnng

ssseeehihihihihhihihiihihihihhhihihhhhihihihihihihihihihihhihihihhihihhhhiihihihhhihihhhhihhhhhhhhhhhihhhhhhhihhihhihihihhihhihhhihhhhhhhihhhhhhiihihihhhhhhhhhihhhiiinnnn

FFFoFooooooooooooooooooooooortrtrtrtrtrtrtrtrtrtrtrtrrtrrtrtrrrtrtrrtrrttrtrtrtrtrttrtrtrtrtrtrtrtrrrtrrtrrrtrrrrtrtttrtrttrtrtrrtrttrrrrrrrrrtrtrti

aaaalasasasasasasssasasasassaasasasassssaasasasassssasassassasssaaasaassssssaassssssasssssssssassassassasasssssssssassassssassaasssasaaaaaaaa

gggogooorereererererrerreereereeeerrerereerererereereeereereerreereereeeereerererrrrerrrerrrrrrrrrrrerrrerrrrrrrrrrrrrererrrrerrrrrr n

kkkekeeeebibibibibibibibibibibibbibibibibbibibibibibibibbibbibibibibibbbbbbbbbbibibibibbbiibbibibbibibbbibibibbibbibbbibibbiibibibibbbibbbbbbibibbbbbibbbbbbbbbbbbbbbbb jjjjj

kkkekeeebibibibibibbbibbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbibbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb jjj

ddddan

ssselur

kkkke da

ddddapat

mmmmuda

dddadaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaalallalallalalalaalalalalalaalalalalalallalallaalalalalalalaallalaalalaalallalalalalallaalallaalalallalaalaaalalaaaaalalaaaalaalllllaaaalalaaallaaammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

ggggogogogogogogogogogogogogogogogogoogoogogoogogoggooogogogoooogoooogooogoogoogooogoooogogogogooogoogoggoogoooogggogogggoogoooooogogoooogooogoog rerrererererererererererererereerererrrreeerererrerrrrerereeeerrrerrererreererrerererrereereeeerrerrreerereeren

MMMiMiMiMiMiMiMiMiMiMiiMiiMMMiiMMiMMMiMMMiiiiiiiiiMiiiMiMMiMiMMiMMMMMMMMMiinynynynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

dddadadadadaadaaadaaaadaadaaadadaaadaadaaadaaadaaaaaaaaaadaaaaaaaaadddadaaaaaaaadaadaaaaaaaaddaaaannnnnnnnnnnnnnn nn nnnnnnn nnnnnnnnn n nnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn s

13

2.4 METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR VITAMIN A

Secara umum pengujian vitamin A dalam bahan pangan terdiri atas 3

tahap yaitu: tahap saponifikasi, tahap ektraksi, tahap pemekatan atau

penguapan pelarut organik dan tahap pengukuran menggunakan instrumen.

Saponifikasi dilakukan dengan menggunakan kalium hidroksida dengan

pelarut campuran etanol dan air, penambahan zat anti oksidan (asam askorbat,

pirogalol, butil hidroksi toluena) dan pemanasan pada suhu 60–80oC

(Eitenmiller, 2008). Tahap ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut organik

seperti petroleum eter (Eitenmiller, 2008); eter, campuran etanol dengan tetra

hidrofuran (USP Convention 2008). Selanjutnya dilakukan pemekatan atau

penguapan terhadap pelarut organik yang digunakan, lalu dilarutkan kembali

dengan pelarut lainnya seperti metanol atau etanol dan selanjutnya siap untuk

ditetapkan kadarnya menggunakan instrumen seperti: spektrofotometri atau

kromatografi cair kinerja tinggi. Metode penetapan kadar vitamin A

menggunakan instrumen akan dijelaskan sebagai berikut:

2.4.1 Metode Spektrofotometri

2.4.1.1 Pengukuran secara langsung.

Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat

mempunyai absorbsi maksimal pada panjang gelombang antara 325

sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. Larutan vitamin A dalam

isopropanol absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimal

(�maks) dan pada dua titik, yaitu satu disebelah kanan �maks dan satunya

pada sebelah kiri �maks. Absorbansi pada �maks dikoreksi terhadap

senyawa pengganggu dengan menggunakan formula koreksi karena

senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Beberapa

pengganggu terutama pada minyak ikan adalah vitamin A2, kitol,

anhidro vitamin A dan asam polien. Pada vitamin A sintetik senyawa

pengganggunya adalah senyawa-senyawa antara (Rohman dan

Sumantri, 2007).

2.4

14

2.4.1.2 Pengubahan retinol atau akseroftol menjadi anhidroakseroftol

Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan

bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. Metode

Budowski dan Bondi, akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol

dalam pelarut benzen dengan katalisator asam toluen-p-sulfonat pada

temperatur kamar. Kenaikan absorbansi pada 399 nm merupakan hasil

dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang

terkandung. Reaksi ini dapat dihentikan dengan penambahan alkali.

Pengukuran absorbansi pada 358 nm, 377 nm dan 399 nm dalam

benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian

akseroftol yakni dengan melihat bahwa A399 nm/A377 nm sebesar 0,868

dan A358 nm/A377 nm sebesar 0,692 (Rohman dan Sumantri, 2007).

2.4.1.3 Metode Maleat anhidrat untuk isomer vitamin A

Maleat anhidrat bereaksi dengan all-trans dan 9-cis isomer

vitamin A menghasilkan senyawa yang tidak memberikan warna biru

ketika diuji dengan menggunakan antimon (III) klorida. Potensi

kehilangan terhadap all-trans dan 9-cis isomer dapat terjadi, sehingga

perlu dilakukan dua kali pengukuran nilai antimon (III) klorida,

pertama untuk isomer campuran dan setelah penghilangan kedua

isomer tersebut. Dari perbedaan nilai pengukuran ini, maka komposisi

isomer dalam campuran dan potensi biologisnya dapat ditentukan.

2.4.1.4 Penentuan secara simultan retinol (vitamin A1) dan dehidro-

retinol (vitamin A2)

Prinsip dari metode ini adalah perbedaan panjang gelombang

maksimum dan nilai ekstinsi dari masing-masing vitamin A1 dan A2.

Vitamin A1 mempunyai panjang gelombang maksimum pada 326 nm

sedangkan vitamin A2 mempunyai panjang gelombang maksimum

pada 351 nm.

15

2.4.2 Metode kolorimetri

2.4.2.1 Metode Carr-Price

Metode Carr-Pierce mencakup perlakuan vitamin A dengan

antimon (III) klorida; warna biru yang timbul memberikan serapan

maksimum pada panjang gelombang 620 nm dan mematuhi hukum

Lambert-Beer. Antimon (III) klorida yang digunakan sebagai reagen

penghasil warna bersifat korosif, dan membutuhkan penanganan secara

khusus dan kadang-kadang menyebabkan kerusakan terhadap peralatan

spektrofotometer. Dilihat dari formasi antimon (III) klorida, zat ini

sulit untuk untuk dibersihkan dari kuvet dan juga peralatan preparasi.

Warna biru yang timbul sangat tidak stabil dan pengukuran absorbansi

harus dilakukan antara 5-10 detik dari penambahan reagen (Rohman

dan Sumantri, 2007).

2.4.2.2 Pengukuran secara spektrofotometri dengan menggunakan

Asam trifluoro asetat

Asam trifluoro asetat bereaksi dengan vitamin A dan turunannya

sehingga mengasilkan warna biru yang memberikan serapan maksi-

mum pada panjang gelombang 616 nm. Reaksi warna yang terjadi

mematuhi hukum Lambert-Beer pada kisaran konsentrasi vitamin A

sebesar 10-6 dan 10-5 M (Libman, 1966).

2.4.2.3 Pengukuran secara spektrofotometri dengan menggunakan

gliserol diklorohidrin aktif

Gliserol diklorohidrin aktif bereaksi dengan vitamin A dalam

kloroform untuk menghasilkan warna ungu yang stabil dan mem-

punyai serapan maksimum pada panjang gelombang 555 nm. Reaksi

warna yang terjadi mematuhi hukum Lambert-Beer pada kisaran yang

lebar. Intensitas warna yang timbul 1/3 jika dibandingkan dengan

intensitas warna biru dari metode Carr-Pierce yang menggunakan

antimon (III) klorida. Reaksi bergantung pada suhu pengujian dan

disarankan pembuatan kurva kalibrasi dan analisis sampel dilakukan

pada suhu yang sama (Libman, 1966).

16

2.4.2.4 Pengukuran dengan menggunakan Asam fosfotungstat

Vitamin A dalam kloroform bereaksi dengan asam fosfotungstat

dalam etil asetat dengan adanya asetat anhidrat maka menghasilkan

warna biru dan memberikan serapan maksimum pada panjang gelom-

bang 620 nm. Reaksinya mematuhi hukum Lambert-Beer. Pada pema-

nasan dengan suhu 50°C menggunakan penangas air, warna biru yang

ada akan berubah menjadi biru keunguan, ungu, dan akhirnya menjadi

merah dan mempunyai serapan maksimum pada 530 nm. Warna merah

yang timbul juga mematuhi hukum Lambert-Beer dan cocok untuk

pengujian vitamin A, akan tetapi metode ini kurang sensitif untuk

bahan dengan kadar vitamin A rendah (Libman, 1966).

2.4.2.5 Pengukuran secara kolorimetri dengan aluminium klorida

Metode ini mencakup reaksi larutan jenuh aluminium klorida

dalam kloroform anhidrat dengan vitamin A. Warna yang timbul

mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 618 nm dan

mematuhi hukum Lambert-Beer (Libman, 1966).

2.4.2.6 Pengukuran menggunakan asam fosfomolibdat

Metode ini melibatkan reaksi vitamin A dengan asam fosfo-

molibdat; warna biru yang timbul memberikan serapan maksimum

pada panjang gelombang 700 serta mematuhi hukum Lambert-Beer

(Libman, 1966).

2.4.3 Metode Spektrofluorometri

Berdasarkan sifat vitamin A yang dapat memberikan flourosensi,

maka vitamin A dalam bahan pangan yang telah diekstrasi dapat diu-

kur menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksi-

tasi 330 nm dan emisi 480 nm. Pengukuran dengan metode spektro-

fluorometri lebih spesifik dibandingkan cara spektrofotometri, karena

banyak senyawa yang memberikan serapan pada daerah UV, namun

tidak memberikan sifat flourosensi (Angustin dkk 1985).

2222.4.3

17

2.4.4 Metode Kromatografi

2.4.4.1 Pengukuran dengan kromatografi lapis tipis

Vitamin A dapat dipisahkan dengan komponen lainnya secara

kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam silika gel F254 dan fase

gerak campuran siklo heksana dan eter dengan perbandingan 4:1, noda

yang telah terpisah dideteksi menggunakan asam fosfomolibdat dan

bercak biru hijau yang terjadi menunjukkan adanya vitamin A.

Perkiraan harga Rf vitamin A dalam bentuk alkohol, asetat dan

palmitat berturut-turut adalah 0,1; 0,45 dan 0,7 (Depkes 1995). Untuk

mendeteksi noda vitamin A dapat juga digunakan larutan antimon (III)

klorida yang akan memberikan warna biru (Depkes 1979) atau

menggunakan UV pada pada panjang gelombang 254 nm (CE 2007).

Sebagai fase gerak selain menggunakan campuran siklo heksana dan

eter, juga dapat digunakan campuran siklo heksana dan etil asetat

dengan perbandingan 9:1 (Libman 1966).

2.4.4.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Vitamin A dapat ditetapkan kadarnya menggunakan KCKT

menggunakan kolom fase normal atau kolom fase terbalik. Dengan

menggunakan kolom fase normal, vitamin A ditetapkan kadarnya

menggunakan fase diam kolom silika, fase gerak n-heksana dan

dideteksi menggunakan UV 325-nm (USP Convention 2008). Sebagai

fase gerak dapat juga digunakan campuran heptana dan diisopropil

eter, 95:5; heksana dan dietil eter 98:2; 1-5 % 2-propanol dalam

heptana; heksana dan metil etil keton, 90:10 (Nollet 2000). Dengan

kolom fase terbalk, vitamin A ditetapkan kadarnya menggunakan fase

diam kolom C18, fase gerak campuran metanol dan air dengan

perbandingan 860:140 dan dideteksi menggunakan UV 328-nm atau

313-nm (AOAC International, 2005). Sebagai fase gerak dapat juga

digunakan campuran asetonitril dengan air 90:10 (Eitenmiller, 2008);

campuran asetonitril dengan air, 90:10 atau campuran metanol dengan

air, 80:20 (Augustin dkk 1985). Persiapan sampelnya terdiri atas

18

proses saponifikasi, ekstraksi, pemekatan dan melarutkan kembali

menggunakan pelarut yang sesuai.

2.5 INTRUMENTASI KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut

dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa

tertentu dalam suatu sampel. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan

senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis. KCKT merupakan

metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kuali-

tatif maupun kuantitatif (Rohman 2007).

Kromatografi adalah suatu prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu

proses migrasi difrensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau

lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah

tertentu dan di dalam zat tersebut menunjukkan perbedaan morbilitas disebab-

kan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran

molekul atau kerapatan muatan ion (Depkes 2009b)

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas komponen pokok yaitu

wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan

sampel kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung peng-

hubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Johnson, 1991).

Diagram blok untuk sistem kromatografi cair kinerja tinggi ditunjukkan pada

Gambar 2.

2.5 IIIINTR

ddddeng

ppepeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeemimmimimimimimimimimimimimimimmmmimimimimimimimimimmmmimimmmmimimiimimimimmimimimmimimmmmimimmimmmiimimimimmiiimiiimimmimmmmmmimimimmmmmmmimmm

teeertrtrtrtrtrrtrttrtrttrtrttrtrtrtrttrttrtrtrtttrttrtrtttttrtrrttrtrrtrtttrtttrtttrrrtttrtrttrrtttrtrtrtrttrtttttrtttrtrttttrrrrtrrttrtrtrtttrttttrrttteeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeen

ssseeenynynnnynynynynynnynynynynynynynynynynynynynynynnnnynynynnnynynynyynnnynnnynynynnnynynnynynynyyynnnnyyynynyyyyynynynyynnyyynynyyyyyyyyyya

mmmemeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeettttttttotottttttotttttttttttttttttottttttttttttttttttttttttttttt

taaatitititititittiittiiiitititiititiitiitittttiiiiiiitiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiitiiiiiiif f f ff ff fffffffffffffffff fffffffffffffffffffffff fffffffffffffffffff m

pprprrososososososooososososososososoosoooosooooooosooooosoooooooooossooooooooooooooooooooooooooooooosoooosoooooosoooosoososse

leeeebibibibibibibibbbibibibibibbbbiiibibibbibbbibiiibibbibibiibibiibbibibibibibbibibibiibibbbbbbibbbibbibbbibibbbiibiibbbiiibiibiiiibbbiiiiibibbbihhhhhhhhhhhhhhhhhhh

teeertrtrtrtrtrtrtttttttrttttttttrtrttrttrttttttrtrtrttrtttrtttttrtrttttttttrtrttrrtttrttttttrtttrttttrtttrtttttrtttrtttttrtrtrtrtrtttttttttteeeneeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee

kkkakaaaan n nnnnnnnnn n n nnnnnnnn n n nnnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnn nnn nnnn n nnnnnnn nnnnn a

mmmomoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooleleleleleleelleelllellllllllllllllllllllllelellllelllellllllell

wwwwada

sssamp

hhhhubu

DDDDiagr

GGGGam

19

Gambar 2. Diagram Blok Sistem KCKT

2.5.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilang

gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul

dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan

mengacaukan analisis.

2.5.2 Fase Gerak Pada KCKT

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut

yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya

elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-kompo-

nen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase

20

gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas

pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari-

pada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya

polaritas pelarut.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan

dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol

atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase

normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran

pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau

menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.

2.5.3 Pompa pada KCKT

Pompa yang digunakan untuk KCKT adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa

harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya

mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan

fase gerak dengan kecepatan alir 1-3 mL/menit. Untuk tujuan prepa-

ratif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak

adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung

secara tepat, reproduksibel, konstan dan bebas dari gangguan.

2.5.4 Injektor/Penyuntikan Sampel Pada KCKT

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke

dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom

menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan

katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sampel loop)

internal atau eksternal.

Pada saat pengisian sampel digelontor melewati keluk sampel

dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan,

katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan

2222.5.5.5.5.5.555555555555555555555555555555555.5555555555555555555555555555555555 33333333333333333333333333

2222.5.4

21

menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk

sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%.

2.5.5 Kolom Pada KCKT

Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat.

Panjang kolom antara 10-30 cm dengan diameter dalam 4,5-5,0 mm.

Kolom diisi dengan yang sesuai untuk pemisahan sampel tertentu.

Kolom untuk pemisahan analitik umumnya mempunyai diameter

dalam 2-4 mm. Kolom dapat dipanaskan sampai 60oC agar dihasilkan

pemisahan yang lebih efisien. Jika tidak dinyatakan lain, kolom

dipertahankan pada suhu kamar.

Fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara

kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren

dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam

karena adanya residu gugus silanol (Si-OH), Oktadesil silan (ODS atau

C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena

mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,

sedang, maupun tinggi. Fase diam eksklusi dan penukar ion dapat

menggunakan silika atau polimer.

2.5.6 Detektor KCKT

Detektor pada KCKT ada 2 yaitu (1) Detektor universal (yang

mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak

bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri

massa, dan (2) Detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi

analit secara spesifik dan selektif, seperti detector UV-VIS, detektor

fluoresensi dan elektro kimia.

2.5.7 Komputer, Integrator atau Rekorder.

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder,

dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektro-

nik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu

kromatogram.

22

2.6 VALIDASI METODE ANALISIS

Suatu metode analisis terdiri atas serangkaian langkah yang harus

diikuti untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan

teknik tertentu. Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam melakukan

pemilihan metode analisis adalah: tujuan analisis, biaya yang dibutuhkan,

serta waktu yang diperlukan; level analit yang diharapkan dan batas deteksi

yang diperlukan; macam sampel yang akan dianalisis serta pra-perlakuan

sampel yang dibutuhkan; jumlah sampel yang dianalisis; ketepatan dan

ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif; ketersediaan bahan

rujukan, senyawa baku, bahan-bahan kimia, dan pelarut yang dibutuhkan;

peralatan yang tersedia; kemungkinan adanya gangguan pada saat deteksi

atau pada saat pengukuran sampel. Menurut Rohman dan Ibnu (2007),

kriteria yang harus dipenuhi suatu metode analisis yang baik adalah:

1. Peka (sensitive) artinya metode harus dapat digunakan untuk mene-

tapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil.

2. Selektif, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, metode

tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain.

3. Tepat (precise) artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil

analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran

(penetapan).

4. Teliti (accurate) artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata

(mean) yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya (true value).

5. Kasar (rugged) artinya ada perubahan komposisi pelarut atau variasi

lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil analisis.

6. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak

memerlukan waktu dan biaya.

Pengembangan metode analisis biasanya didasarkan pada metode yang

sudah ada menggunakan instrumen yang sama atau hampir sama. Pengem-

bangan metode analisis biasanya membutuhkan syarat-syarat metode

tertentu dan memutuskan jenis alat yang akan digunakan. Pada tahap

pengembangan metode, keputusan yang terkait dengan pemilihan kolom,

2.6 VVVVAL

diik

tek

pepp m

sesesseseseesesesesesesesesesseseeseseseseseseeseseeseseeseseesessesesesseeeseseesseseessseeseseeesseeeeeeeeeeseeeseesseeseesses rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr

yayayayayayyayyayayyayayyyayayayayayayyayyayyyayyyayyyyyayyayayyyyyyaayayayyyayyyyayayyayayyayyyyayyyyyyayyyyyyyyayaayayyayyyyyayyayyyyyyyyyyayyaaayyyyyyyyyyyyyy n

sasasasasasasasasasasasssasasasasaasassasaasaaaasasasasasasaaaassaaassassassasssaaassssaasasssassssassssaassasasassasassam

kekekekekekeekekekekkekekeekkekeekkekekekekekkekekkkkkkeekekekkkkekekkkekeeekkeekekeeeekekkkkkkkkeekkekkkkekkkkkkkkkeeet

rururururururururururururururrurruuuuuuuruurururrururuururuuurrruuurruuuurururruruurrurururuurruuurruurruurrrurrruurruurruurrr jjjjjjjjjjj

pepepepppepepeppeppepepepepepeppepepppepeepeepepepepepepepeppeepeepeepeppeepppepepepppepeeppepepeppppppeeppeeppppeppepppppppppppppppppp r

atatatatataatatattatatattatatataatatatatatataataattataaaaaaatatattataataatatatataaatataaaataataaattatataataattaaattataaaataatattaataattaattaatataataaaaaatattatttttaaa

kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkrirrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr

1.1.1.1.1.1.111.111111.11.11111111.1.11.1.1.11111111.111.1.11111111.11111111.1111111.1111111.1111111

2.2.2222.2.222.2222.2.222222.222222222.2222.2.2.22.2.2222222222222222222222222222222222222222222222222

3.

4.

5.

6.6.6.6.6666.6.66666.66666666.6666.66.6.66666.6666666.6666.666.6.6.6666.666.66666.6.6.6.6...66

sususuususuuususuuuuusuuuuuuuususuusuuusuuusususuuuusuuusuuuuuususuuuuusuuuusuuuuus dddddddddddddddddddd

bababababababababababababbabbbbbbbababbbbbbabbbbbbbbbbbbbbbbaaaaaaaaan

tetettetetetetetttetttettttettttttttttetteeeteteteteeteeeteeerrr

pepepepepepeppeppepepepepepeppepeepepepepppepepepepeppeppepppppppppppppeeeeeppeeeepppppepepepeeennnn

23

fase gerak, detektor dan metode kuantisasi harus diperhatikan. Ada beberapa

alasan tertentu untuk pengembangan metode analisis yang baru, yaitu:

1. Belum ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam suatu matriks

sampel tertentu.

2. Metode yang sudah ada terlalu rumit, terlalu banyak tahap perlakuan

yang dapat menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah ada tidak

reliabel (presisi dan akurasinya rendah).

3. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu dan energi

yang besar atau tidak dapat diotomatisasikan.

4. Metode yang sudah ada tidak memberikan sensitivitas atau spesifisitas

yang mencukupi pada sampel yang dituju.

5. Adanya kebutuhan untuk pengembangan metode alternatif, baik untuk

alasan legal atau alasan saintifik.

Suatu metode perlu divalidasi terlebih dahulu sebelum metode

tersebut digunakan untuk penggunaan lebih lanjut, sehingga metode tersebut

dapat menjamin bahwa analisis yang dilakukan dapat dipercaya dan sesuai

dengan tujuan penggunaanya serta dapat diandalkan untuk mengambil

keputusan. Metode analisis yang akan digunakan harus disesuaikan dengan

kondisi laboratorium, peralatan dan pereaksi yang tersedia. Walaupun

metode analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit masih sulit didapat,

namun metode analisis vitamin A dalam produk pangan dengan meng-

gunakan peralatan moderen, diantaranya dengan menggunakan KCKT sudah

banyak yang dikembangkan oleh peneliti terdahulu. Namun kelemahanya

dari metode yang ada adalah kerumitan dalam penyiapan sampel (saponi-

fikasi, ekstraksi dan pemekatan atau penguapan pelarut organik yang

digunakan). Metode analisis yang dikembangkan oleh peneliti ini dipilih

karena memiliki banyak kelebihan, yaitu metodenya tanpa proses saponi-

fikasi, ekstraksi dan penguapan pelarut organik yang digunakan sehingga

waktu analisinya relatif lebih cepat.

Menurut Gunzler (1996), validasi metode adalah menetapkan dengan

percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk

kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan hasil

24

pengujian yang dimaksudkan. Karakreristik unjuk kerja (parameter) yang

ditetapkan mencakup: presisi, akurasi, selektivitas dan spesifisitas, batas

deteksi, batas kuantisasi, rentang, linieritas, sensitivitas dan kekasaran

(ruggedness). Menurut Harmita (2004), beberapa parameter analisis yang

harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis yaitu kecermatan

(akurasi), keseksamaan (presisi), selektivitas (spesifisitas), linearitas dan

rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi, ketangguhan metode

(ruggedness) dan kekuatan metode (robustness).

Validasi metode adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan

bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu tujuan khusus

dipenuhi. Proses validasi suatu metode biasanya sangat dekat dengan proses

pengembangan suatu metode. Sebuah metode harus divalidasi bila kinerja

parameter metode uji tersebut belum valid atau belum dibuktikan valid

untuk penggunaan analisis khusus (BSN 2005).

Tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana

penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal,

dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar.

Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh

suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti ( Hadi, 2007)

Menurut USP Convention (2009), presisi adalah derajat kesesuaian

diantara hasil uji individu (berdiri sendiri) jika metode uji dilakukan

berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen.

Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku

relatif (koefisien variasi) dari serangkaian pengukuran. Presisi hendaknya

dilakukan pada tiga tingkat berbeda yaitu: ripitabilitas, presisi intermediat

dan reprodusibilitas. Ripitabilitas adalah penggunaan metode pengujian di

dalam satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggu-

nakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah

kondisi sekonstan mungkin. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai

variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari yang berbeda atau personil

penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama.

Reprodusibilitas atau disebut juga ruggedness adalah penggunaan metode

pen

dite

det

(ru

har

(((ak

rerererererererererererererererrererererererererereererererrerreerererererererrrrerererererererererrererererererererrerrerrerereerereeeeeennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r((((((rr(r(((r(r(r(r(r(r((r(r(((((r(r((r(((r(r(r(r(r((r(rr(r(r((r(r(rr(rrr(r(r(r(r(r(rrr((r(r(rrrrr(r(rrr(r(r(rrr(rr((rr(r(r((rr(rr(r(r(r((r(r(r((((r((((r(r(((((( uuuuuuuuuuuuuuuuu

bubububububuububububbububuubububuubbububububuubububbbbububuuuubuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuububbuubbbuubbubbububbbbuuuuuuuuk

dididididididididididididididdiddiiididddididididdddddididdididididdididididdididdiddddididiidiididddddiddddidiiddddiiddddiiddiippppppppppppppppppppppppppp

pepepepppepepepepeepepepepepepeppepeppepeepeepeepeepepepeepepepeepeepeepeepeeppeepepeppepepeepepepeppppppeepeeeeeeepeppppppppeeppppppppp n

papapapapapapapapapapapapapaapapppppapapapaapapappapappapapapapappapapapppapappapaapapappapaaaappappaaapapppapapappaapappapaaappaappapappapappaaaapaaaaappppppppppp r

unununununununnunununununununuuununnunnunununnunnunnunnnuuuunuunnnnunnnunuunuunuunnnnnunuunnuuununnnununnuuunnuunnt

pepepeepepepepepepepeeeeeppepeepeeeeeeppepepepepepeepepepepepeeepepeepeepepepeeepeepeppeppeppepppeepepppeppepeeeeppppeeeeepepepepppppepppepppppppppppppppp n

dididididididididididddiddididididididididididididididdididddiidididddidiiiidiididiiddidiidiididididiiiiiddddddiididiiddiiiiidididddiiididdddidiiiiididiidiiiiddddidddddddidd mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

DeDeDeDeDeDDDeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD

sua

dia

ber

Pre

rela

dididdididididdidididididddidididididiidididdiidididdidiididididiiididdididddidddidddiddddididdddidiiddddiiiiidddiddidiididiiidddddiiidddddddiiiiddd lllllllllllalalllalllalllallllllllllllllllllllllllllllllllllll

daddadadadaddadadadadadadddddddddadadddadadddaddadadddadadadaddadadadaddadaddaaddadadadaddadaddaddadadadaadadadaaddaadaadaadadaaadadaaaaadaad n

dadadadadadadaddadadadadadadadadadaddaaddadadadadadaddadadadadaddadadadadaddadddddadaddadadadaaddaaaadadaaadadaaaaaaaaaaaaal

nananananannnnanannanannannaaanananannnnannnanannnnnnnanannannannnannnnannnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnnananannannaakkkkkkkkkkkkkkkkkkkk

kokokokokookokokokookokokokookokokokookokookookookokokokokokokookoooookooooookokoookookokokookokooookoonnnnn

vvavvavavavavavavvvvavavvavvavavvvavavvvvvvavvvvvvavvvvavvvvvvvaavvvaavaar

pepeppepepepepeppeppepeppepppeppeppppeppeppppppepppppppepepepppepepppeepepepepepepepeeeppp n

ReRReReReRReReReReReReReRReReReReRRRReReReRRReRReRRRRRReReRRRReRRRRReRRRRRReRRRRRRRRRRRRRRRRReRRRRRRRRRRReRRReReRReRRRReReeeppp

25

pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji

kolaborasi.

Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau

kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai

nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima (USP Convention

2009). Akurasi dari suatu metode dapat dilakukan dengan cara: mengguna-

kan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah

dikarakterisasi dan akurasinya telah ditetapkan atau dengan cara menghitung

persen perolehan kembali terhadap sampel yang sudah dispike (Wood R

1998). Kriteria kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergan-

tung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan

metode (RSD) (Oktavia, 2006). Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level

konsentrasi dinilai terhadap rentang % rekoveri pada Tabel 5.

Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan

antara analit yang dituju dan komponen lain / bentuk-bentuk analit lain yang

mungkin ada dalam matrik untuk mengukur secara akurat dan spesifik analit

dalam matriks sampel dengan adanya zat pengganggu. Selektivitas sering-

kali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode

yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan

berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan

dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan

lain yang ditambahkan (Oktavia, 2006).

Tabel 5. Keberterimaan akurasi berdasarkan % rekoveri

No % Analit Rasio Analit SatuanRentang

keberterimaan (% Rekoveri)

1 100 1 100 % 98 – 1022 10 10 -1 10 % 98 – 1023 1 10 -2 1 % 97 – 1034 0,1 10 -3 1000 ppm 95 – 1055 0,01 10 -4 100 ppm 90 – 1076 0,001 10 -5 10 ppm 80 – 1107 0,0001 10 -6 1 ppm 80 – 1108 0,00001 10 -7 100 ppb 80 – 1109 0,000001 10 -8 10 ppb 60 – 115

10 0,0000001 10 -9 1 ppb 40 – 120

26

Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang

sebanding/berbanding lurus terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada

kisaran konsentrasi tertentu. Menentukan kemampuan suatu metode untuk

mendapatkan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit (Oktavia,

2006).

Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar

analitnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima.

Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan peng-

ujian terhadap sampel yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang

metoda menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan

yang dinyatakan dalam presisi, akurasi (trueness) dan linieritas (Oktavia,

2006).

Batas Deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingan dengan

blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi

merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas

terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan

seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung

pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis

yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan

mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis

instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko

beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. Batas deteksi

dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari

kurva kalibrasi (Oktavia, 2006).

seb

kis

me

200

ananananananananananananaananananananananannananannaaananannanananananaananannanaanananananaaannnanannaanannaannnnaanannnaananannannannannaannaanaanaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

DiDiDiDiDDDDiDiDiDiDDiDDiDDDiDDDiiDiDDiDDDDDiiDiDiDiDiDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDit

ujujujujujujujuujujujujujujujujujujujujujujujujuujujujujjuujujuujjjuujjujujujujujujujjjujujjjujjujjujjjujujjuuujjujujujujuujujuujuujuuuujujjujjujuuuujjujuujujuuujujuuujujjjjjjjiiaiiiiiiiiiii

memememmmmmemmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

yayayayayayayayayayayaayayyayayyayyyaaaaayaayayayyayyayayaaayyyaaayyyaaayayayyayaayyayayyaayyyyayyaayyaayyyayayyaayyaayyaayyayyy n

20202020202020022020202002020220202020202022020202020202020200020202000202000200202020020002002002002000200220202020222220020000000222222200

didididdidididddidididdididdididiididdididdididddddddddiddiddididididdiiididdiiididdididddddididiidiiiddidiididiiiddddidiidddidiiid dddddddddd

blblblbblblbblblblbblblblbllblblblblblblbblbllllblbblbbblblbllblblblblllbllbllblblbbllblbbbbllbbbllblbbbllblbbbblllbblblblllbllllbbblbbbllllllllllllbllllllblblbbbb aaaaaaaa

mememmmmememememmmmmeemmmmemmmmeemmmmmmmmmmemmmmmmemmmmmememmemememmemmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

tetetetetetetteeteteteeteteteeteeeeeteeeeeteteeeeteeeeteeeeeteteeeteeeeteeeeeeeeeeteteteeeeeeeeteeeeeeeteeeeeteeeeeeeeeeeeeerkrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr

sesesesssesesesesesesssseeseessseseseeessesesseseseessseeesesseseeeeseeeeeeeeeseseeeseeeseeeeeessseesessssssekkkk

pad

yan

me

inst

beb

dan

kukukkukukukukukkukukukukukukukukukukuukukukkukukukukukuukukukukukuukukkkukukuukukukukukukukukukukukkukkukukukkkuuukukukukuuuukuuuukuukkuuuukuuukkkkkkkukuukukkkukukuuurrrrrrrrrrrrrrrr