IDENTIFIKASI SPESIES MIKROORGANI

SME SAMPEL

I. Tujuan

Mahasiswa dapat menggunakan teknik pewarnaan, pengkulturan,

dan uji biokimia yang telah didapat sebelumnya untuk menentukan

spesies kultur bakteri yang belum diketahui

II. Dasar teori

1

Dalam biologi, sistem tata nama binomial merupakan sistem

formal penamaan organisme yang  dikenalkan oleh Carl Linnaeus,

maka sejak saat itu nama ilmiah suatu makhluk hidup terdiri atas dua

nama atau kata yaitu kata pertama menunjukan genus (penulisannya diawali

dengan huruf kapital) dan kata kedua menunjukan nama spesiesnya, misal

Staphylococcus epidermidis, nama Staphylococcus merupakan nama

genus, sedangkan epidermidis merupakan nama spesies. Spesies

berasal dari bahasa Latin “species” yang merupakan tingkatan dalam

taksonomi yang terkecil (tingkatan terendah dalam tingkat taksonomi),

biasanya digunakan untuk mengklasifikasi organisme baik yang hidup

maupun organisme yang fosil. (sumber dari: anonim. Binomial Nomenclatrure.

http://www.absolute astronomy.com /topics/Binomial_nomenclature).

Metode identifikasi dapat digunakan juga sampai mengetahui spesies

dari suatu bakteri. Penggunakan kunci dikotomi akan sangat

membantu praktikan sehingga tidak perlu melakukan semua uji untuk

dapat mengetahui spesies dari sampel bakteri yang tidak diketahui.

Dikotomi adalah pembagian organisme sesuai karakteristik yang

muncul pada suatu kelompok dan karakteristik tersebut tidak

ditemukan pada kelompok yang lain. Dikotomi sebagai bagian proses

identifikasi spesies (kunci dikotomi) merupakan sekelompok pertanyaan

berkesinambungan (“series of question”) dimana tiap lajur panah

merupakan set dari karakteristik organisme yang ujungnya atau akhir

menunjukkan pada spesies tertentu. (sumber dari: anonim. Dichotomy.

http://www.absoluteastronomy.com/topics/Dichotomy)

Identifikasi spesies mikroorganisme tidak seperti identifikasi

genus, dimana praktikan diharuskan mengkultur mikroorganisme pada

semua media uji. Pada identifikasi spesies, langkah awal yang

dilakukan adalah dengan pewarnaan gram dan dilanjutkan dengan uji

biokimia.

PEWARNAAN GRAM

2

Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan

Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan

teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus

dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Pewarnaan gram bakteri berfungsi untuk mengetahui jenis gram

(positif yang ditandai dengan warna biru-ungu atau negatif yang

ditandai dengan warna merah) dan bentuk dari sel bakteri.

Gb 1. Perbedaan dinding sel bakteri Gram Positif dengan Gram

Negatif

Metode pewarnaan gram membutuhkan 4 jenis larutan atau reagen,

antara lain: kristal gentian violet (Gram I), iod (GramII), etanol 96%

(GramIII), dan safranin (Gram IV). (sumber dari: anonim. Gram staining.

http://www.absoluteastronomy.com/topics/Gram_staining).

Prinsip dasar dari metode pewarnaan gram adalah harus dilakukan

adalah fiksasi, fiksasi berfungsi untuk membunuh dan melekatkan

bakteri pada kaca objek sehingga pewarnaan dapat dilakukan dengan

baik. Setelah itu baru dilanjutkan dengan penambahan senyawa-

senyawa pewarna. Reagen pertama yang digunakan  disebut warna

dasar yaitu karbol gentian violet. Pewarna ini akan menempel pada

lapisanpoeptidoglikan gram positif dan LPS pada gram negative.

3

Reagen kedua untuk memperkuat penempelan warna pada

membran sel bakteri yaitu pewarna lugol. Sedangkan raegen ke 3

yaitu etanol absolute digunakan untuk mencuci warna (decolorizing

agent). Lunturnya tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi

dinding sel, bakteri gram negative yang mempunyai LPS warnanya

akan luntur karena lemak larut dalam alkohol, dan sedangkan warna

pada dinding sel bakteri gram positif tidak luntur karena warna sudah

terikat pada dinding sel.

Dengan kata lain, pemberian etanol memiliki 2 fungsi yaitu pada

gram positif alkohol mengakibatkan peptidoglikan terdehidrasi

sehingga ukuran porinya mengecil. Ini mengakibatkan kristal violet

tidak dapat keluar dari sitoplasma. Sedangkan pada gram negatif

alkohol mencuci dinding sel dan meninggalkan lubang kecil pada

peptidoglikan. Ini mengakibakan kristal violet tercuci keluar dan sel

menjadi tidak berwarna. Reagen yang terakhir adalah warna

pembanding yaitu fuchsin, pewarna tandingan ini akan masuk ke

dinding sel bakteri gram negatif. Sehingga didapat perbedaan warna

antara gram negative dan gram positif dari warna yang terlihat.

Dari hasil yang didapat, bakteri dapat diamati bentuk , ukuran, dan

jenis gram bakteri. Berikut ini adalah skema dari pewarnaan gram.

Gb 2. Pewarnaan Gram Bakteri Gram Positif dan Negatif

4

Setelah pewarnaan gram selesai kita lakukan, kita lakukan

pengamatan di mikroskop untuk melihat bentuk dan jenis bakteri.

Bentuk bakteri sendiri ada bermacam-macam antara lain cocci (bulat),

bacilli (batang),vibrio (koma), coccobaccil, dan masih banyak lagi.

Dari berbagai bentuk tersebut, bentuk paling umum yang dimiliki oleh

sebagian besar bakteri adalah bentuk cocci dan bacilli.

Setelah kita mengetahui bentuk dan jenis gram bakteri (gram

positif atau negatif), kita dapat melakukan berbagai uji biokimia yang

jalurnya telah ditentukan berdasarkan kunci dikotomi. Kita ikuti uji

apa yang harus dilakukan setelah kita ketahui bentuk dan jenis

gramnya, tiap bakteri dengan bentuk dan jenis gram yang berbeda

akan melalui jalur uji yang berbeda.

Dari hasil uji tersebut kita bisa menentukan lagi uji apa yang harus

kita lakukan selanjutnya,hal itu terus kita lakukan hingga akhirnya kita

dapat menentukan spesies bakteri sampel kita. Berikut ini adalah

kunci dikotomi untuk penentuan spesies bakteri gram positif dan

negatif :

5

6

7

a. Indol

Media ini biasanya digunakan

dalam indetifikasi yang cepat.  Hasil

uji indol yang diperoleh negatif

karena tidak terbentuk lapisan (cincin)

berwarna merah muda pada

permukaan biakan, artinya bakteri ini 

tidak membentuk indol dari tryptopan

sebagai sumber carbon, yang dapat

diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan

merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein,

sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh

mikroorganisme akibat penguraian protein(Anonim, 2008)

b.    MR-VP

1.      Uji MR

Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah

ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam

campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung

8

dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan

menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator

metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH seredndah itu maka

indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini

peragi asam campuran(Anonim, 2008)

2.      Uji VP

Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada

medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir

fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin)  (Anonim,

2008)

9

c.       SIM

Hasil yang diperoleh pada uji ini

adalah positif, hal ini terlihat adanya

penyebaran yang berwarna putih seperti

akar disekitar inokulasi. Hal ini

menunjukan adanya pergerakan dari bakteri

yang diinokulasikan, yang berarti bahwa

bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga

terlihat ada warna hitam, yang berarti

bakteri ini menghasilkan Hidrogen Sulfit

(H2S) (Anonim, 2008)

10

 

d.      Simmons Citrate

Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai dengan tidak

terjadinya perubahan warna. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim

sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam

sel(Anonim, 2008)

 

e.       TSIA

·                    Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena

bakteri bersifat basa ini menandakan bahwa bakteri ini tidak

memfermentasi laktosa dan sukrosa(Anonim, 2008)

·                    Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan Co2

dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S

positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini

terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion

11

yang akan menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe++  yang

terdapat pada media dan menghasilkan endapan hitam(Anonim, 2008)

·                    Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini

menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Media ini biasanya

digunakan untuk membedakan Salmonella dan Shigella dengan bakteri

Gram negatif bentuk batang lainnya bedasarkan pola fermentasi penghasil

hydrogen sulfide. Untuk pengamatan pola-pola pengunaan karbohidrat.

TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa

0,1% dan phenol red sebagai indicator yang menyebabkan perubahan

warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga

mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S,

ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk

membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakterinya(Anonim, 2008)

 

f.        Uji gula-gula(Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)

Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu

memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi

perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna

12

kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada

media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang

diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi

berbentuk gas(Anonim, 2008)

g. Uji Urease

Urease merupakan salah satu bentuk enzim yang berperan dalam

proses perkecambahan. Enzim urease memiliki substrat spesifik yaitu urea.

Enzim ini dapat mengkatalis reaksi pemecahan urea yang bersifat patogen

dalam sel tumbuhan menjadi amonia dan CO2. Urease ditemukan terutama

dalam kuantitas besar pada jackbean dan kedelai juga terdapat pada

beberapa jaringan hewan dan pencernaan mikroorganisme. Urease

ditemukan pada berbagai macam organisme seperti bakteri, jamur dan

tumbuhan tingkat tinggi. Urease pada lingkungan berperan dalam jalur

sistem transportasi nitrogen.

(NH2)2CO urease

→

H 2 O CO2 + 2NH3

Reaksi enzimatis yang melibatkan enzim urease tergolong ke dalam

reaksi hidrolisa dimana aktivitasnya dipengaruhi oleh adanya air.

Uji urease atau uji hidrolisis urea digunakan untuk mengidentifikasi

kelompok Proteus dari patogen-patogen gram negatif lainnya. Salah satu

ciri khas Proteus ialah kemampuannya menghasilkan enzim urease yang

dapat melepaskan amoniak dari molekul urea. Ciri ini tidak dimiliki oleh

bakteri lain yang mungkin dikelirukan dengan Proteus.

Medium yang digunakan dalam uji ini adalah kaldu urea yang

merupakan larutan ekstrak khamir dan urea yang diberi larutan penyangga.

Medium tersebut juga mengandung merah fenol sebagai indikator pH. Bila

mikroba yang diidentifikasi menghasilkan urease, maka amonia yang

13

dilepaskan ke dalam medium akan menaikan pH. Bila pH menjadi makin

tinggi maka merah fenol akan berubah warna dari kuning menjadi merah

keunguan (Hadioetomo, 1985).

h. Uji Reduksi Nitrat

Dalam keadaan kekurangan oksigen atau pada mikroorganisme yang

bersifat anaerob dan tidak memiliki enzim sitokrom oksidase (sitokrom

aa3), maka mikroorganisme akan menggunakan molekul bukan oksigen

sebagai akseptor elektron terakhir. Nitrat (NO3-) digunakan oleh

mikroorganisme tertentu sebagai akseptor elektron terakhir dengan cara

mereduksi nitrat menjadi nitrit (NO2-). Beberapa mikroorganisme

mereduksikan nitrit menjadi gas nitrogen (N2).

NO3- + 2e- + 2 H+ nitratase

→ NO2

- + H2O

2NO2- + 7e- + 8 H+ nitratase

→ N2(g) + 4 H2O

Kemampuan mereduksi nitrat dapat digunakan sebagai ciri dalam

identifikasi bakteri Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa mampu

menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir. E. coli

mereduksikan nitrat menjadi nitrit sedangkan P. aeruginosa mampu

mereduksikannnya lebih lanjut menjadi N2. Sebaliknya Straphylococcus

epidermis tidak dapat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron

terakhir.

14

Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam

kaldu nutrien yang mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung

Durham. Setelah masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung

Durham dan keberadaan nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap

dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas N2

berasal dari penguraian sempurna nitrat sedangkan CO2 merupakan produk

respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit dalam media dapat diuji dengan

penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin yang akan bereaksi dengan

nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah

atau merah muda (Lay, 1994).

i. Uji Katalase

Beberapa bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2

dengan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-).

Kedua bahan ini merupakan bahan yang toksik dan menghancurkan

kompenen sel dengan sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan

diri seperti dengan produksi O2 atau akan terbunuh.

Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis

superoksids yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase

yang dapat mendekstruksi hidrogen peroksida.Katalase adalah enzim yang

mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan

O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga

15

mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguarikan

zat toksik tersebut.Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi

kelompok bakteri bentuk kokkus, dalam membedakan Staphylococcus dan

Streptococcus. Dimana kelompok streptococcus bersifat katalase negative

dan Staphylococcus bersifat katalase positif. Penentuan adanya katalase ini

terlihat dari pembentukan gelembung udara di sekitar koloni setelah

ditambahkan larutan H2O2 3%. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh

enzim terlihat sebagai berikut :

superoksida

2 O2 + 2H+ O2 + H2O2

Dismutase

Katalase

H2O2 H2O + ½ O2(gelembung udara)

Peroksidase

j. Uji Litmus Milk

Media yang dipakai dalam uji ini adalah litmus milk yaitu media

yang terdiri dari 2 komponen utama yaitu susu dan litmus. Litmus

milk adalah medium berbasis susu untuk membedakan spesies antar bakteri. Laktosa,

16

litmus dan kasein terkandung dalam medium yang dapat dimetabolisme oleh tipe

bakteri yang berbeda. Penambahan litmus lebih mengarah pada perubahan pH

berlaku sebagai oksidasi dan reduksi indikator. Tes sendiri menunjukan ketika

bakteri dapat menfermentasikan laktosa, mereduksi litmus, membentuk gas,

membentuk gumpalan atau memulai peptonisasi. Jadi uji ini bertujuan

untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan komponen-

komponen yang terdapat pada susu, misalnya laktosa, protein susu

(kasein), lacto-albumin, dan lactoglobulin.

Dan untuk mendeteksi perubahan digunakan indikator litmus.

Bakteri-bakteri yang mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon, berarti

mempunyai enzim galaktosidase yang dapat memecah molekul laktosa

menjadi glukosa. Proses berikutnya adalah fermentasi karbohirat yang

akan menghasilkan asam sebagai produk akhirnya. Oleh karena adanya

asam maka akan mengakibatkan perubahan warna litmus dari ungu

menjadi merah muda. Perubahan warna litmus ini akan terjadi disekitar pH

4.

Fermentasi biasanya diikuti juga dengan pembentukan gas. Gas

yang terbentuk umumnya adalah gas hidrogen dan gas karbondioksida.

Pembentukan gas ini dapat menyebabkan muncul retakan pada curd yang

terbentuk. Selain mendekteksi peristiwa diatas, uji litmus milk dapat

digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mereduksi litmus.

Litmus ini tereduksi akibat adanya peranan litmus sebagai akseptor

electron dalam proses metabolisme bakteri tersebut. Pereduksian litmus ini

akan mengubah warna media dari ungu menjadi putih susu. Aktivitas biokimia

bakteri dapat menghasilkan dua jenis curd, yaitu acid curd dan rennet curd

bergantung pada mekanisme pembentukannya.

Acid curd terbentuk karena adanya asam organik pada media dan

dapat menyebabkan presipitasi berupa calcium caseinate dari kasein susu

membentuk gumpalan yang tidak dapat larut. Gumpalan yang

terbentuk keras dan tidak dapat berpindah dari dinding tabung walaupun

tabung dimiringkan. Sedangkan rennet curd, diproduksi oleh beberapa

17

organisme yang mampu memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja

pada kasein dan membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion

kalsium akan diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk

gumpalan lembut dan bersifat semi-solid. Apabila tabung digoyangkan,

maka gumpalan akan ikut bergerak. Bagian lain dari susu yang dapat

digunakan adalah protein susu.

Beberapa bakteri dapat menghasilkan enzim proteolisis yang dapat

memecah protein menjadi asam amino dan hal itu dapat dilihat dari media

yang menjadi jernih kecoklatan. Proses pemecahan ini akan

mengakibatkan pelepasan amonia yang akan meningkatkan kebasaan dari

media. Naiknya nilai pH ini akan menimbulkan pita berwarna ungu tua

pada bagian atasmedia. Kegunaan lainnya, uji litmus milk juga dapat

digunakan untuk menguji kemampuan bakteri dalam mendegradasi kasein.

Degradasi dari kasein menjadi rantai polipeptida yang lebih pendek

ini diikuti dengan pelepasan produk akhir yang bersifat basa yang

mengakibatkan perubahan warna litmus dari ungu menjadi biru tua.

18

III. Alat dan Bahan

Alat :

Spiritus

Jarum Ose

Tabung Reaksi

Objek Glass

Beaker Glass

Erlenmeyer

Cawan Petri

Pengaduk

Bahan

Kultur

Kultur yang digunakan berupa bakteri yang diberi kode dan merupakan

kultur murni yang ditumbuhkan pada trypticase soy agar slant.

Media

Trypticase Soy Agar

(TSA)

Phenol red lactose

broths

Phenol red glucose

broths

Simmons citrate agar

SIM

Litmus Milk broth

NB-KNO3

Reagen

Crystal violet

Gram’s iodine

Ethanol 96%

Fuschin

Reagen Kovacs

Solution A dan B

Bubuk Zn

19

IV. Cara Kerja

Pewarnaan Gram

1. Menyiapkan kaca obyek bebas lemak, meneteskan NaCl pada kaca obyek lalu

dengan jarum ose bakteri diambil dari biakan padat dan diletakkan pada

tetesan NaCl. Lalu dibiarkan mengering diudara.

2. Setelah itu dilakukan fiksasi untuk melekatkan olesan bakteri pada kaca

obyek dengan cara melewatkan olesan yang telah kering di atas api spiritus

beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap atas).

3. Lalu olesan bakteri diberikan dengan beberapa tetes larutan karbol gentian

violet (gram I), lalu dibiarkan selama 3 menit dan dibilas dengan air.

4. Lalu olesan bakteri diberikan dengan larutan lugol (gram II) beberapa tetes,

lalu dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan air.

5. Setelah itu dicuci dengan larutan gram III (alkohol 96%) dengan

memiringkan preparat kemudian ditetesi pelan-pelan dengan gram III hingga

tidak ada pewarna yang terlunturkan dan dibilas dengan air.

6. Setelah itu preparat ditetesi dengan larutan fuchsin (gram IV) beberapa tetes.

Didiamkan selama 3 menit.

7. Preparat dibilas dengan air dan dikeringkan di udara atau dengan menyerap

kelebihan air dengan tissue.

8. Preparat dilihat di mikroskop dengan perbesaran 1000 X.

9. Mencatat warna dan morfologi sel bakteri

Uji Biokimia (Sesuaikan dengan Skema Identifikasi Spesies)

1. Menginokulasi sampel pada trypticase soy agar slant

2. Gunakan kultur yang didapat untuk berbagai uji biokimia.

Phenol Red Laktose Broth

Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam

pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.

Phenol Red Glucose Broth

20

Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam

pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.

SIM Agar Deep Tube

Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam

pada media padat dengan menusukkan ose dan diinkubasi pada suhu

37ºC selama 24-27 jam.

o Setelah itu ditambahkan reagen Kovac’s beberapa tetes dan

diamati.

NB-KNO3

Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam

pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.

o Tambahkan solution A dan B beberapa tetes dan amati. Bila

media tidak berubah warna menjadi merah, tambahkan serbuk

Zn dan amati.

Simmons Citrate Agar Slant

Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam

pada media padat dengan menggores zig-zag pada permukaan media

dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.

Litmus Milk

Mengambil 1 ose kultur sampel secara aseptis, setelah itu ditanam

pada media cair dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-27 jam.

21

V. Hasil Percobaan

1. Bakteri A

22

2. Bakteri B

23

24

VI. Pembahasan

Pada percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan spesies dari

masing-masing sampel yang didapatkan. Ada 2 sampel yang diuji.

Berikut pembahasan untuk masing-masing bakteri uji :

1. Bakteri A

Uji pertama untuk penentuan spesies adalah dengan

pewarnaan gram. Bakteri A setelah diuji pewarnaan gram,

menunjukkan hasil gram negatif. Gram negatif tampak dari warna

pink dan bentuk sel yang basil.

Setelah melalui tahap pewarnaan gram, pada tabel skema

identifikasi bahwa langkah pengidentifikasian yang selanjutnya

adalah pengulturan sampel pada lactose broth.

Dari hasil pengamatan terlihat bahwa tidak terdapat

perubahan warna pada broth dan tidak terbentuk gelembung udara.

Uji ini menunjukkan bahwa bakteri sampel A tidak dapat

memfermentasikan laktosa sehingga sampel dinyatakan negatif

pada uji ini.

Untuk teknik identifikasi selanjutnya didasarkan pada

lactose broth negatif yang mengarah pada uji glukosa. Pada uji

glukosa ini, bakteri A dikulturkan pada broth yang mengandung

glukosa dan menunjukkan hasil yang negatif

Hasil uji glukosa menunjukkan hasil yang negatif,

selanjutnya, sesuai dengan tabel identifikasi yang ada, maka uji

dilanjutkan dengan uji reduksi nitrat. Uji nitrat dilakukan dengan

menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu nutrien yang

mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung Durham. Setelah

masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung Durham

dan keberadaan nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap

dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas

25

N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat sedangkan CO2

merupakan produk respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit dalam

media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin

yang akan bereaksi dengan nitrit yang menunjukkan perubahan

warna media menjadi merah atau merah muda. Sehingga dari Uji

tersebut dinyatakan positif.

Langkah identifikasi yang terakhir adalah dengan uji litmus

milk. Uji ini dilakukan dengan menginokulasi bakteri dalam media

litmus milk. Pada uji yang dilakukan ditunjukkan dengan

perubahan warna media menjadi ungu lebih muda dan terbentuk

rennert curd. Ini dikarenakan adanya perubahan pH yang terjadi

pada media dan curd terbentuk karena bakteri mampu

memproduksi renin, suatu enzim yang bekerja pada kasein dan

membentuk paracasein yang dengan keberadaan ion kalsium akan

diubah menjadi calcium paracaseinate dan membentuk gumpalan

lembut dan bersifat semi-solid. Selain itu curd yang terbentuk retak

karena produksi gas hidrogen dan karbondioksida.

Dari semua hasil pengujian yang dilakukan diatas, maka

dapat diketahui spesies bakteri bersangkutan. Berdasarkan skema

identifikasi spesies, dilihat dari jalur-jalur pengujian yang

dilakukan, dapat diketahui dan disimpulkan bahwa bakteri A

merupakan Pseudomonas Aeruginosa.

2. Bakteri B

Pengidentifikasian bakteri B diawali dengan pewarnaan

gram. Hasil dari pewarnaan gram menunjukkan apakah bakteri uji

termasuk dalam strain negatif ataupun positif. Dari hasil

percobaan, didapatkan bahwa bakteri B merupakan bakteri gram

negatif dengan bentuk sel basil. Hasil ditunjukkan oleh gambar

dibawah ini.

26

Uji yang dilakukan selanjutnya adalah uji lactose. Bakteri B

diinokulasikan dalam media phenol red lactose broth. Uji lactose

positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari

merah menjadi kuning yang menandakan terbentuknya gas, dan

terbentuk gelembung gas pada tabung Durham. Hasil dari uji

lactose ditunjukkan oleh gambar di bawah ini.

Langkah identifikasi dilanjutkan dengan uji indol pada

media SIM. Uji ini untuk mengetahui apakah bakteri dapat

mendegradasi triptofan dan membentuk indol. Setelah bakteri

diinokulasi pada media dan diinkubasi, perlu penambahan reagen

Kovac untuk mengetahui perubahan warna media menjadi merah

ataupun terbentuknya cicin merah. Bakteri B menunjukkan hasil

yang negatif untuk uji ini. Hasil ditunjukkan oleh gambar di bawah

ini.

Yang seharusnya hasil dari uji ini positif. Kesalahan ini

dapat disebabkan oleh SIM yang rusak karena yang digunakan

adalah SIM yang sudah cair yang seharusya menggunakan SIM

yang baik. Selain itu, faktor kurang lamanya waktu untuk inokulasi

dapat menjadi salah satu alasan hasil negatif. Karena inokulum

masih beradaptasi dengan media. Penyebab yang ketiga bisa karena

tidak ada inokulum yang tertanam pada media agar SIM karena

kesalahan dalam pengambilan inokulum.

Pengujian lebih lanjut dilakukan dengan uji citrate. Uji ini

dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri ini mempunyai enzim

sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam

sel produksi . Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai

dengan tidak terjadinya perubahan warna. Artinya asam dari

bakteri bersangkutan tinggi atau tidak.

Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan

spesies dari bakteri B. Berdasarkan skema identifikasi spesies,

27

alur-alur percobaan yang dilakukan menunjukkan bahwa bakteri B

merupakan Escherichia Coli.

28

VII. Kesimpulan

Spesies bakteri dapat dianalisa berdasarkan kekhasan morfologi

dan fisiologi. Kekhasan ini dapat dianalisa melalui uji pewarnaan

Gram (morfologi) dan uji Biokimia (fisiologi). Penentuan spesies

bakteri dilakukan dengan mengikuti alur skema identifikasi spesies.

Setiap melakukan 1 uji dan didapatkan hasilnya, langkah untuk

identifikasi berikutnya sesuai dengan yang tertera pada skema sampai

mendapatkan spesies dari bakteri uji.

Hasil analisa menunjukkan bahwa bakteri A adalah, bakteri B

adalah Escherichia coli.

VIII. Daftar Pustaka

Aiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of

Biotechnology. 4: 125–1529.

Liu Q. 2005. Understanding Starch and Their Role in Foods. Taylor &

Francis Group, LLC.

Sale BS. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc. Graw

Hill Book Company, Inc.

Poedjiadi A. 1994. Dasar – dasar Biokimia. Penerbit Universitas

Indonesia.

Reddy NS, Nimmagadda A & Rao KR. 2003. An overview of

themicrobial α-Amylase family. African Journal of

Biotechnology. 2: 645–648.

Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher.

Benson HJ. 1994. Microbiological applications. Win C. Brown

Publication.

29

LAMPIRAN

Lampiran 1 (Hasil Pewarnaan Gram)

Gambar 1.1Bakteri A

Gambar 1.2Bakteri B

Lampiran 2 (Hasil Uji Biokimia)

Hasil Sampel A Hasil Sampel B

Gambar 2.1aMedia Phenol Red Lactose Broth

Gambar 2.1bMedia Phenol Red Lactose Broth

30

Gambar 2.2aMedia Phenol Red Glucose Broth

Gambar 2.2bMedia SIM Agar Deep Tube

Gambar 2.3aMedia NB-KNO3

Gambar 2.3bMedia SCA slant

Gambar 2.4aMedia Litmus Milk

31