IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

65
1 LAPORAN AKHIR PENELITIAN LEKTOR IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL DIFERENSIASI MESENCHYMAL STEM CELL (MSCs) MENCIT YANG DIINDUKSI EKSTRAK BUNGA Delonix regia Dr. Kartini Eriani, M.Si 197004211999032001 dr. Ichsan, M.Sc 197710062003121001 Dr. Silmi Mariya 197002121994032001 Dibiayai oleh: Universitas Syiah Kuala, Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, Sesuai dengan Surat Perjanjian Penugasan Pelaksanaan Penelitian Lektor Tahun Anggaran 2019 Nomor: 522/UN11/SPK/PNBP/2019 tanggal 08 Februari 2019 FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SYIAH KUALA OKTOBER, 2019

Transcript of IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

Page 1: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

1

LAPORAN AKHIR

PENELITIAN LEKTOR

IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL DIFERENSIASI

MESENCHYMAL STEM CELL (MSCs) MENCIT YANG DIINDUKSI

EKSTRAK BUNGA Delonix regia

Dr Kartini Eriani MSi 197004211999032001

dr Ichsan MSc 197710062003121001

Dr Silmi Mariya 197002121994032001

Dibiayai oleh

Universitas Syiah Kuala

Kementerian Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi

Sesuai dengan Surat Perjanjian Penugasan

Pelaksanaan Penelitian Lektor Tahun Anggaran 2019

Nomor 522UN11SPKPNBP2019 tanggal 08 Februari 2019

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU

PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SYIAH KUALA

OKTOBER 2019

ii

RINGKASAN

Teknologi sel punca (stem cell) memiliki potensi dalam upaya penyembuhan penyakit

degeneratif Tujuan penelitian ini yaitu mengidentifikasi gen yang diekspresikan oleh

sel tulang hasil diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus) yang diinduksi ekstrak etanol bunga flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf menggunakan Real Time PCR Penelitian ini dilaksanakan di

Laboratorium Riset Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

dan Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala dari

bulan Febuari 2019 sampai Oktober 2019 Penelitian ini menggunakan metode

Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan dan 4 ulangan Perlakuan berupa

penambahan ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) yang terdiri dari dosis 00

mgml sebagai kontrol (tanpa penambahan ekstrak) 06 mgml 07 mgml 08 mgml

dan 09 mgml Media kultur yang digunakan adalah modified Dulbeccorsquos Modified

Eaglersquos Medium (mDMEM) Sel sumsum tulang mencit yang diperoleh secara aspirasi

dikultur selama 7 hari dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37 degC Parameter penelitian

ini yaitu hasil kurva amplifikasi yang ditampilkan pada software CFX-96 Biorad yang

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer sel tulang yang digunakan

Primer yang digunakan adalah alkaline-phosphatase (ALP) Hasil penelitian

menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga flamboyan dengan dosis yang digunakan

mampu menginduksi diferensiasi sel punca menjadi sel tulang berupa osteoblas

iii

PRAKATA

Syukur alhamdulillah peneliti ucapkan kepada Allah swt sehingga kami dapat

menyelesaikan laporan kemajuan penelitian lektor yang berjudul rdquoIdentifikasi

Ekspresi Gen Sel Tulang Hasil Diferensiasi Mesenchymal Stem Cell (MSCs) Mencit

yang Diinduksi Ekstrak Bunga Delonix regia Shalawat dan salam kami sanjungkan

kepada Nabi Besar Muhammad saw beserta sahabat dan sanak keluarganya

Laporan kemajuan penelitian tahap satu guna memenuhi salah satu persyaratan

dalam pelaksanaan penelitian yang didanai oleh PNBP melalui Lembaga Penelitian

Universitas Syiah Kuala Laporan kemajuan penelitian ini disusun berdasarkan hasil

penelitian yang dilaksanakan di Laboratorium Riset Biologi FMIPA Laboratorium

Riset FKH Unsyiah dan Laboratorium Kultur PSSP IPB

Penulis banyak mendapatkan bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak

selama pelaksanaan penelitian yang masih terus berlangsung sampai saat ini Oleh

karenanya penulis mengucapkan terimakasih kepada

1 Dr Taufik Fuadi Abidin SSi MTech selaku Ketua Lembaga Penelitian

Universitas Syiah Kuala

2 Prof Dr drh Darmawi MSi selaku kepala Laboratorium Riset FKH Unsyiah

3 Dr Silmi Mariya MSi selaku Kepala Laboratorium Kultur PSSP IPB yang telah

mengizinkan penulis untuk penelitian di BIB Saree dengan segala fasilitas yang ada

4 Dr Drh Huda S Darusman MSi selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata IPB

yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini

5 Serta seluruh teknisi lapangan dan Laboratorium PSSP yang tidak mungkin disebut

satu persatu

Harapan penulis semoga penelitian ini dapat kami selesaikan sesuai proposal

yang kami ajukan dan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan

masyarakat dan pemerintah

Banda Aceh 30 Agustus 2019

Penulis

iv

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN i

DAFTAR ISI ii

RINGKASAN iii

BAB 1 PENDAHULUAN 1

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 4

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT 5

BAB 4 METODE PENELITIAN 6

41 Pemeliharaan hewan coba 6

42 Pengambilan sampel Delonix regia 6

43 Ekstraksi 6

44 Pembuatan medium kultur mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS) 6

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang 7

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

48 Parameter Penelitian 9

49 Analisis Data Penelitian 10

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI 11

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 22

DAFTAR PUSTAKA 23

LAMPIRAN 27

1 Biodata Peneliti 28

2 Artikel immiah 41

3 Foto dan Gambar Aktifitas 47

1

BAB 1 PENDAHULUAN

Status degeneratif merupakan salah-satu penyakit dengan tingkat kematian yang

cukup tinggi Penyakit kronis ini berhubungan pada proses degenerasi atau ketuaan

sehingga penyakit ini banyak ditemukan pada usia lanjut (Handajani et al 2010)

Kondisi yang terjadi adalah sulitnya pengobatan dan layanan kesehatan

mengakibatkan pasien degeneratif tidak mendapatkan terapi secara maksimal

Kebanyakan pasien ini lebih memilih berdiam diri dan tidak terlalu mementingkan

kesehatannya

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mencatat pada tahun 2012 sedikitnya ada

839 juta kasus degenerative dan diperkirakan menjadi 115 milyar pada tahun 2025

atau sekitar 29 dari total penduduk dunia dimana penderitanya lebih banyak pada

wanita (30) dibanding pria (29) WHO juga menambahkan bahwa South East Asia

pada tahun 2008 dilaporkan bahwa terdapat sebanyak 55 kematian disebabkan oleh

penyakit degenerative

Prevalensi penyakit degeneratif di Indonesia sendiri juga semakin meningkat

Terdapat faktor pemicu utama terhadap kasus ini yaitu meliputi status gaya hidup dan

sosial ekonomi Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 dilaporkan

bahwa terdapat kasus penyakit degeneratif di masyarakat belum terdiagnosis dengan

baik Sebagai contoh yaitu pada kasus hipertensi diketahui terdapat angka sebesar

317 dimana hanya 72 penduduk yang sudah mengetahui memiliki penyakit

degeneratif berupa hipertensi dan hanya 04 kasus yang minum obat hipertensi

Potensi stem cell dalam menyembuhkan berbagai penyakit degeneratif telah

menjadi harapan baru bagi masyarakat (Wobus dan Boheler 2006) Namun biaya

yang harus dikeluarkan untuk sekali terapi stem cell mencapai ratusan juta rupiah

Mengingat biaya terapi yang cukup besar maka terapi ini hanya dapat dirasakan oleh

masyarakat tingkat ekonomi menengah keatas sedangkan masyarakat dibawahnya

tidak Hal ini menimbulkan kesenjangan sosial dan kesenjangan hak sehat bagi

masyarakat Besarnya biaya terapi stem cell tidak terlepas dari mahalnya biaya

operasional produksi stem cell di laboratorium dan biaya aplikasi bagi pasien Salah

satu usaha yang telah dilakukan untuk menekan biaya produksi stem cell adalah

mencari senyawa kimia dari alam sebagai penginduksi diferensiasi stem cell menjadi

sel spesifik sebagai media kultur

Tumbuhan flamboyan Delonix regia (Boj ex Hook) Raf mengandung beberapa

senyawa seperti terpenoid tannin cardiac glycosides dan anthroquuinoes yang

2

berpotensi sebagai antioksidan (Singh dan Kumar 2014) saponin alkaloid

hidrokarbon fitotoksin dan karoten (Shanmukha et al 2011) Bagian bunga D regia

mengandung karotenoid galaktomannon (Jungalwala dan Cama 1962) tannin

saponin flavonoid steroid (Shanmukha et al 2011) dan alkaloid (Pharekh dan

Chanda 2007) Menurut (Jungalwala dan Chama 1962) kandungan karotenoid pada

bunga D regia berperan untuk mengatur komunikasi antar sel memberikan respon

imun transformasi neoplastik pengontrol pertumbuhan dan sebagai regulator enzim

yang bekerja sebagai detoksifikasi karsinogen (Pryor et al 2000)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Eriani et al (2018) menggunakan

ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) secara in vitro mendapatkan hasil

diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus musculus) berupa

nerve-like cell dan fibroblast-like cell dengan pewarnaan HE Selain itu ditemukan sel

yang memiliki karakteristik berbentuk bulat letak inti sel berada di samping dan

berwarna gelap yang menyerupai karakteristik osteoblast Namun penentuan jenis sel

ini tidak dapat dilakukan secara visual melainkan dengan menggunakan teknik

identifikasi berdasarkan ekspresi gen dari setiap sel untuk mendapatkan hasil yang

akurat Salah satu teknik yang digunakan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA

spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA dan memberikan informasi

mengenai urutan basa nukleotida dari sampel yang digunakan (Hewajuli dan

Dharmayanti 2014) Dengan demikian gen yang diekpresikan dapat diketahui dan

membuktikan jenis sel yang diperoleh Oleh karena itu penelitian ini penting

dilakukan untuk mengetahui dan membuktikan bahwa hasil diferensiasi dan proliferasi

sel punca mesenkimal berupa sel tulang menggunakan RT-PCR

Tabel 1 Rencana Target Capaian Tahunan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

TS TS+1 TS+2

1 Publikasi Ilmiah Internasional Ada

Nasional Terakreditasi

2 Pemakalah dalam temu ilmiah Internasional Ada

Nasional

3 Invited speaker dalam temu

ilmiah

Internasional

Nasional

4 Visiting Lecturer Internasional

5 Hak Kekayaan Intelektual (HKI) Paten

Paten Sederhana

Hak Cipta

Merek Dagang

Rahasia Dagang

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 2: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

ii

RINGKASAN

Teknologi sel punca (stem cell) memiliki potensi dalam upaya penyembuhan penyakit

degeneratif Tujuan penelitian ini yaitu mengidentifikasi gen yang diekspresikan oleh

sel tulang hasil diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus) yang diinduksi ekstrak etanol bunga flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf menggunakan Real Time PCR Penelitian ini dilaksanakan di

Laboratorium Riset Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

dan Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala dari

bulan Febuari 2019 sampai Oktober 2019 Penelitian ini menggunakan metode

Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan dan 4 ulangan Perlakuan berupa

penambahan ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) yang terdiri dari dosis 00

mgml sebagai kontrol (tanpa penambahan ekstrak) 06 mgml 07 mgml 08 mgml

dan 09 mgml Media kultur yang digunakan adalah modified Dulbeccorsquos Modified

Eaglersquos Medium (mDMEM) Sel sumsum tulang mencit yang diperoleh secara aspirasi

dikultur selama 7 hari dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37 degC Parameter penelitian

ini yaitu hasil kurva amplifikasi yang ditampilkan pada software CFX-96 Biorad yang

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer sel tulang yang digunakan

Primer yang digunakan adalah alkaline-phosphatase (ALP) Hasil penelitian

menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga flamboyan dengan dosis yang digunakan

mampu menginduksi diferensiasi sel punca menjadi sel tulang berupa osteoblas

iii

PRAKATA

Syukur alhamdulillah peneliti ucapkan kepada Allah swt sehingga kami dapat

menyelesaikan laporan kemajuan penelitian lektor yang berjudul rdquoIdentifikasi

Ekspresi Gen Sel Tulang Hasil Diferensiasi Mesenchymal Stem Cell (MSCs) Mencit

yang Diinduksi Ekstrak Bunga Delonix regia Shalawat dan salam kami sanjungkan

kepada Nabi Besar Muhammad saw beserta sahabat dan sanak keluarganya

Laporan kemajuan penelitian tahap satu guna memenuhi salah satu persyaratan

dalam pelaksanaan penelitian yang didanai oleh PNBP melalui Lembaga Penelitian

Universitas Syiah Kuala Laporan kemajuan penelitian ini disusun berdasarkan hasil

penelitian yang dilaksanakan di Laboratorium Riset Biologi FMIPA Laboratorium

Riset FKH Unsyiah dan Laboratorium Kultur PSSP IPB

Penulis banyak mendapatkan bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak

selama pelaksanaan penelitian yang masih terus berlangsung sampai saat ini Oleh

karenanya penulis mengucapkan terimakasih kepada

1 Dr Taufik Fuadi Abidin SSi MTech selaku Ketua Lembaga Penelitian

Universitas Syiah Kuala

2 Prof Dr drh Darmawi MSi selaku kepala Laboratorium Riset FKH Unsyiah

3 Dr Silmi Mariya MSi selaku Kepala Laboratorium Kultur PSSP IPB yang telah

mengizinkan penulis untuk penelitian di BIB Saree dengan segala fasilitas yang ada

4 Dr Drh Huda S Darusman MSi selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata IPB

yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini

5 Serta seluruh teknisi lapangan dan Laboratorium PSSP yang tidak mungkin disebut

satu persatu

Harapan penulis semoga penelitian ini dapat kami selesaikan sesuai proposal

yang kami ajukan dan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan

masyarakat dan pemerintah

Banda Aceh 30 Agustus 2019

Penulis

iv

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN i

DAFTAR ISI ii

RINGKASAN iii

BAB 1 PENDAHULUAN 1

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 4

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT 5

BAB 4 METODE PENELITIAN 6

41 Pemeliharaan hewan coba 6

42 Pengambilan sampel Delonix regia 6

43 Ekstraksi 6

44 Pembuatan medium kultur mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS) 6

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang 7

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

48 Parameter Penelitian 9

49 Analisis Data Penelitian 10

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI 11

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 22

DAFTAR PUSTAKA 23

LAMPIRAN 27

1 Biodata Peneliti 28

2 Artikel immiah 41

3 Foto dan Gambar Aktifitas 47

1

BAB 1 PENDAHULUAN

Status degeneratif merupakan salah-satu penyakit dengan tingkat kematian yang

cukup tinggi Penyakit kronis ini berhubungan pada proses degenerasi atau ketuaan

sehingga penyakit ini banyak ditemukan pada usia lanjut (Handajani et al 2010)

Kondisi yang terjadi adalah sulitnya pengobatan dan layanan kesehatan

mengakibatkan pasien degeneratif tidak mendapatkan terapi secara maksimal

Kebanyakan pasien ini lebih memilih berdiam diri dan tidak terlalu mementingkan

kesehatannya

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mencatat pada tahun 2012 sedikitnya ada

839 juta kasus degenerative dan diperkirakan menjadi 115 milyar pada tahun 2025

atau sekitar 29 dari total penduduk dunia dimana penderitanya lebih banyak pada

wanita (30) dibanding pria (29) WHO juga menambahkan bahwa South East Asia

pada tahun 2008 dilaporkan bahwa terdapat sebanyak 55 kematian disebabkan oleh

penyakit degenerative

Prevalensi penyakit degeneratif di Indonesia sendiri juga semakin meningkat

Terdapat faktor pemicu utama terhadap kasus ini yaitu meliputi status gaya hidup dan

sosial ekonomi Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 dilaporkan

bahwa terdapat kasus penyakit degeneratif di masyarakat belum terdiagnosis dengan

baik Sebagai contoh yaitu pada kasus hipertensi diketahui terdapat angka sebesar

317 dimana hanya 72 penduduk yang sudah mengetahui memiliki penyakit

degeneratif berupa hipertensi dan hanya 04 kasus yang minum obat hipertensi

Potensi stem cell dalam menyembuhkan berbagai penyakit degeneratif telah

menjadi harapan baru bagi masyarakat (Wobus dan Boheler 2006) Namun biaya

yang harus dikeluarkan untuk sekali terapi stem cell mencapai ratusan juta rupiah

Mengingat biaya terapi yang cukup besar maka terapi ini hanya dapat dirasakan oleh

masyarakat tingkat ekonomi menengah keatas sedangkan masyarakat dibawahnya

tidak Hal ini menimbulkan kesenjangan sosial dan kesenjangan hak sehat bagi

masyarakat Besarnya biaya terapi stem cell tidak terlepas dari mahalnya biaya

operasional produksi stem cell di laboratorium dan biaya aplikasi bagi pasien Salah

satu usaha yang telah dilakukan untuk menekan biaya produksi stem cell adalah

mencari senyawa kimia dari alam sebagai penginduksi diferensiasi stem cell menjadi

sel spesifik sebagai media kultur

Tumbuhan flamboyan Delonix regia (Boj ex Hook) Raf mengandung beberapa

senyawa seperti terpenoid tannin cardiac glycosides dan anthroquuinoes yang

2

berpotensi sebagai antioksidan (Singh dan Kumar 2014) saponin alkaloid

hidrokarbon fitotoksin dan karoten (Shanmukha et al 2011) Bagian bunga D regia

mengandung karotenoid galaktomannon (Jungalwala dan Cama 1962) tannin

saponin flavonoid steroid (Shanmukha et al 2011) dan alkaloid (Pharekh dan

Chanda 2007) Menurut (Jungalwala dan Chama 1962) kandungan karotenoid pada

bunga D regia berperan untuk mengatur komunikasi antar sel memberikan respon

imun transformasi neoplastik pengontrol pertumbuhan dan sebagai regulator enzim

yang bekerja sebagai detoksifikasi karsinogen (Pryor et al 2000)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Eriani et al (2018) menggunakan

ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) secara in vitro mendapatkan hasil

diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus musculus) berupa

nerve-like cell dan fibroblast-like cell dengan pewarnaan HE Selain itu ditemukan sel

yang memiliki karakteristik berbentuk bulat letak inti sel berada di samping dan

berwarna gelap yang menyerupai karakteristik osteoblast Namun penentuan jenis sel

ini tidak dapat dilakukan secara visual melainkan dengan menggunakan teknik

identifikasi berdasarkan ekspresi gen dari setiap sel untuk mendapatkan hasil yang

akurat Salah satu teknik yang digunakan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA

spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA dan memberikan informasi

mengenai urutan basa nukleotida dari sampel yang digunakan (Hewajuli dan

Dharmayanti 2014) Dengan demikian gen yang diekpresikan dapat diketahui dan

membuktikan jenis sel yang diperoleh Oleh karena itu penelitian ini penting

dilakukan untuk mengetahui dan membuktikan bahwa hasil diferensiasi dan proliferasi

sel punca mesenkimal berupa sel tulang menggunakan RT-PCR

Tabel 1 Rencana Target Capaian Tahunan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

TS TS+1 TS+2

1 Publikasi Ilmiah Internasional Ada

Nasional Terakreditasi

2 Pemakalah dalam temu ilmiah Internasional Ada

Nasional

3 Invited speaker dalam temu

ilmiah

Internasional

Nasional

4 Visiting Lecturer Internasional

5 Hak Kekayaan Intelektual (HKI) Paten

Paten Sederhana

Hak Cipta

Merek Dagang

Rahasia Dagang

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 3: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

iii

PRAKATA

Syukur alhamdulillah peneliti ucapkan kepada Allah swt sehingga kami dapat

menyelesaikan laporan kemajuan penelitian lektor yang berjudul rdquoIdentifikasi

Ekspresi Gen Sel Tulang Hasil Diferensiasi Mesenchymal Stem Cell (MSCs) Mencit

yang Diinduksi Ekstrak Bunga Delonix regia Shalawat dan salam kami sanjungkan

kepada Nabi Besar Muhammad saw beserta sahabat dan sanak keluarganya

Laporan kemajuan penelitian tahap satu guna memenuhi salah satu persyaratan

dalam pelaksanaan penelitian yang didanai oleh PNBP melalui Lembaga Penelitian

Universitas Syiah Kuala Laporan kemajuan penelitian ini disusun berdasarkan hasil

penelitian yang dilaksanakan di Laboratorium Riset Biologi FMIPA Laboratorium

Riset FKH Unsyiah dan Laboratorium Kultur PSSP IPB

Penulis banyak mendapatkan bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak

selama pelaksanaan penelitian yang masih terus berlangsung sampai saat ini Oleh

karenanya penulis mengucapkan terimakasih kepada

1 Dr Taufik Fuadi Abidin SSi MTech selaku Ketua Lembaga Penelitian

Universitas Syiah Kuala

2 Prof Dr drh Darmawi MSi selaku kepala Laboratorium Riset FKH Unsyiah

3 Dr Silmi Mariya MSi selaku Kepala Laboratorium Kultur PSSP IPB yang telah

mengizinkan penulis untuk penelitian di BIB Saree dengan segala fasilitas yang ada

4 Dr Drh Huda S Darusman MSi selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata IPB

yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini

5 Serta seluruh teknisi lapangan dan Laboratorium PSSP yang tidak mungkin disebut

satu persatu

Harapan penulis semoga penelitian ini dapat kami selesaikan sesuai proposal

yang kami ajukan dan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan

masyarakat dan pemerintah

Banda Aceh 30 Agustus 2019

Penulis

iv

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN i

DAFTAR ISI ii

RINGKASAN iii

BAB 1 PENDAHULUAN 1

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 4

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT 5

BAB 4 METODE PENELITIAN 6

41 Pemeliharaan hewan coba 6

42 Pengambilan sampel Delonix regia 6

43 Ekstraksi 6

44 Pembuatan medium kultur mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS) 6

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang 7

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

48 Parameter Penelitian 9

49 Analisis Data Penelitian 10

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI 11

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 22

DAFTAR PUSTAKA 23

LAMPIRAN 27

1 Biodata Peneliti 28

2 Artikel immiah 41

3 Foto dan Gambar Aktifitas 47

1

BAB 1 PENDAHULUAN

Status degeneratif merupakan salah-satu penyakit dengan tingkat kematian yang

cukup tinggi Penyakit kronis ini berhubungan pada proses degenerasi atau ketuaan

sehingga penyakit ini banyak ditemukan pada usia lanjut (Handajani et al 2010)

Kondisi yang terjadi adalah sulitnya pengobatan dan layanan kesehatan

mengakibatkan pasien degeneratif tidak mendapatkan terapi secara maksimal

Kebanyakan pasien ini lebih memilih berdiam diri dan tidak terlalu mementingkan

kesehatannya

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mencatat pada tahun 2012 sedikitnya ada

839 juta kasus degenerative dan diperkirakan menjadi 115 milyar pada tahun 2025

atau sekitar 29 dari total penduduk dunia dimana penderitanya lebih banyak pada

wanita (30) dibanding pria (29) WHO juga menambahkan bahwa South East Asia

pada tahun 2008 dilaporkan bahwa terdapat sebanyak 55 kematian disebabkan oleh

penyakit degenerative

Prevalensi penyakit degeneratif di Indonesia sendiri juga semakin meningkat

Terdapat faktor pemicu utama terhadap kasus ini yaitu meliputi status gaya hidup dan

sosial ekonomi Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 dilaporkan

bahwa terdapat kasus penyakit degeneratif di masyarakat belum terdiagnosis dengan

baik Sebagai contoh yaitu pada kasus hipertensi diketahui terdapat angka sebesar

317 dimana hanya 72 penduduk yang sudah mengetahui memiliki penyakit

degeneratif berupa hipertensi dan hanya 04 kasus yang minum obat hipertensi

Potensi stem cell dalam menyembuhkan berbagai penyakit degeneratif telah

menjadi harapan baru bagi masyarakat (Wobus dan Boheler 2006) Namun biaya

yang harus dikeluarkan untuk sekali terapi stem cell mencapai ratusan juta rupiah

Mengingat biaya terapi yang cukup besar maka terapi ini hanya dapat dirasakan oleh

masyarakat tingkat ekonomi menengah keatas sedangkan masyarakat dibawahnya

tidak Hal ini menimbulkan kesenjangan sosial dan kesenjangan hak sehat bagi

masyarakat Besarnya biaya terapi stem cell tidak terlepas dari mahalnya biaya

operasional produksi stem cell di laboratorium dan biaya aplikasi bagi pasien Salah

satu usaha yang telah dilakukan untuk menekan biaya produksi stem cell adalah

mencari senyawa kimia dari alam sebagai penginduksi diferensiasi stem cell menjadi

sel spesifik sebagai media kultur

Tumbuhan flamboyan Delonix regia (Boj ex Hook) Raf mengandung beberapa

senyawa seperti terpenoid tannin cardiac glycosides dan anthroquuinoes yang

2

berpotensi sebagai antioksidan (Singh dan Kumar 2014) saponin alkaloid

hidrokarbon fitotoksin dan karoten (Shanmukha et al 2011) Bagian bunga D regia

mengandung karotenoid galaktomannon (Jungalwala dan Cama 1962) tannin

saponin flavonoid steroid (Shanmukha et al 2011) dan alkaloid (Pharekh dan

Chanda 2007) Menurut (Jungalwala dan Chama 1962) kandungan karotenoid pada

bunga D regia berperan untuk mengatur komunikasi antar sel memberikan respon

imun transformasi neoplastik pengontrol pertumbuhan dan sebagai regulator enzim

yang bekerja sebagai detoksifikasi karsinogen (Pryor et al 2000)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Eriani et al (2018) menggunakan

ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) secara in vitro mendapatkan hasil

diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus musculus) berupa

nerve-like cell dan fibroblast-like cell dengan pewarnaan HE Selain itu ditemukan sel

yang memiliki karakteristik berbentuk bulat letak inti sel berada di samping dan

berwarna gelap yang menyerupai karakteristik osteoblast Namun penentuan jenis sel

ini tidak dapat dilakukan secara visual melainkan dengan menggunakan teknik

identifikasi berdasarkan ekspresi gen dari setiap sel untuk mendapatkan hasil yang

akurat Salah satu teknik yang digunakan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA

spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA dan memberikan informasi

mengenai urutan basa nukleotida dari sampel yang digunakan (Hewajuli dan

Dharmayanti 2014) Dengan demikian gen yang diekpresikan dapat diketahui dan

membuktikan jenis sel yang diperoleh Oleh karena itu penelitian ini penting

dilakukan untuk mengetahui dan membuktikan bahwa hasil diferensiasi dan proliferasi

sel punca mesenkimal berupa sel tulang menggunakan RT-PCR

Tabel 1 Rencana Target Capaian Tahunan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

TS TS+1 TS+2

1 Publikasi Ilmiah Internasional Ada

Nasional Terakreditasi

2 Pemakalah dalam temu ilmiah Internasional Ada

Nasional

3 Invited speaker dalam temu

ilmiah

Internasional

Nasional

4 Visiting Lecturer Internasional

5 Hak Kekayaan Intelektual (HKI) Paten

Paten Sederhana

Hak Cipta

Merek Dagang

Rahasia Dagang

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 4: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

iv

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN i

DAFTAR ISI ii

RINGKASAN iii

BAB 1 PENDAHULUAN 1

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 4

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT 5

BAB 4 METODE PENELITIAN 6

41 Pemeliharaan hewan coba 6

42 Pengambilan sampel Delonix regia 6

43 Ekstraksi 6

44 Pembuatan medium kultur mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS) 6

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang 7

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang 7

48 Parameter Penelitian 9

49 Analisis Data Penelitian 10

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI 11

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 22

DAFTAR PUSTAKA 23

LAMPIRAN 27

1 Biodata Peneliti 28

2 Artikel immiah 41

3 Foto dan Gambar Aktifitas 47

1

BAB 1 PENDAHULUAN

Status degeneratif merupakan salah-satu penyakit dengan tingkat kematian yang

cukup tinggi Penyakit kronis ini berhubungan pada proses degenerasi atau ketuaan

sehingga penyakit ini banyak ditemukan pada usia lanjut (Handajani et al 2010)

Kondisi yang terjadi adalah sulitnya pengobatan dan layanan kesehatan

mengakibatkan pasien degeneratif tidak mendapatkan terapi secara maksimal

Kebanyakan pasien ini lebih memilih berdiam diri dan tidak terlalu mementingkan

kesehatannya

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mencatat pada tahun 2012 sedikitnya ada

839 juta kasus degenerative dan diperkirakan menjadi 115 milyar pada tahun 2025

atau sekitar 29 dari total penduduk dunia dimana penderitanya lebih banyak pada

wanita (30) dibanding pria (29) WHO juga menambahkan bahwa South East Asia

pada tahun 2008 dilaporkan bahwa terdapat sebanyak 55 kematian disebabkan oleh

penyakit degenerative

Prevalensi penyakit degeneratif di Indonesia sendiri juga semakin meningkat

Terdapat faktor pemicu utama terhadap kasus ini yaitu meliputi status gaya hidup dan

sosial ekonomi Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 dilaporkan

bahwa terdapat kasus penyakit degeneratif di masyarakat belum terdiagnosis dengan

baik Sebagai contoh yaitu pada kasus hipertensi diketahui terdapat angka sebesar

317 dimana hanya 72 penduduk yang sudah mengetahui memiliki penyakit

degeneratif berupa hipertensi dan hanya 04 kasus yang minum obat hipertensi

Potensi stem cell dalam menyembuhkan berbagai penyakit degeneratif telah

menjadi harapan baru bagi masyarakat (Wobus dan Boheler 2006) Namun biaya

yang harus dikeluarkan untuk sekali terapi stem cell mencapai ratusan juta rupiah

Mengingat biaya terapi yang cukup besar maka terapi ini hanya dapat dirasakan oleh

masyarakat tingkat ekonomi menengah keatas sedangkan masyarakat dibawahnya

tidak Hal ini menimbulkan kesenjangan sosial dan kesenjangan hak sehat bagi

masyarakat Besarnya biaya terapi stem cell tidak terlepas dari mahalnya biaya

operasional produksi stem cell di laboratorium dan biaya aplikasi bagi pasien Salah

satu usaha yang telah dilakukan untuk menekan biaya produksi stem cell adalah

mencari senyawa kimia dari alam sebagai penginduksi diferensiasi stem cell menjadi

sel spesifik sebagai media kultur

Tumbuhan flamboyan Delonix regia (Boj ex Hook) Raf mengandung beberapa

senyawa seperti terpenoid tannin cardiac glycosides dan anthroquuinoes yang

2

berpotensi sebagai antioksidan (Singh dan Kumar 2014) saponin alkaloid

hidrokarbon fitotoksin dan karoten (Shanmukha et al 2011) Bagian bunga D regia

mengandung karotenoid galaktomannon (Jungalwala dan Cama 1962) tannin

saponin flavonoid steroid (Shanmukha et al 2011) dan alkaloid (Pharekh dan

Chanda 2007) Menurut (Jungalwala dan Chama 1962) kandungan karotenoid pada

bunga D regia berperan untuk mengatur komunikasi antar sel memberikan respon

imun transformasi neoplastik pengontrol pertumbuhan dan sebagai regulator enzim

yang bekerja sebagai detoksifikasi karsinogen (Pryor et al 2000)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Eriani et al (2018) menggunakan

ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) secara in vitro mendapatkan hasil

diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus musculus) berupa

nerve-like cell dan fibroblast-like cell dengan pewarnaan HE Selain itu ditemukan sel

yang memiliki karakteristik berbentuk bulat letak inti sel berada di samping dan

berwarna gelap yang menyerupai karakteristik osteoblast Namun penentuan jenis sel

ini tidak dapat dilakukan secara visual melainkan dengan menggunakan teknik

identifikasi berdasarkan ekspresi gen dari setiap sel untuk mendapatkan hasil yang

akurat Salah satu teknik yang digunakan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA

spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA dan memberikan informasi

mengenai urutan basa nukleotida dari sampel yang digunakan (Hewajuli dan

Dharmayanti 2014) Dengan demikian gen yang diekpresikan dapat diketahui dan

membuktikan jenis sel yang diperoleh Oleh karena itu penelitian ini penting

dilakukan untuk mengetahui dan membuktikan bahwa hasil diferensiasi dan proliferasi

sel punca mesenkimal berupa sel tulang menggunakan RT-PCR

Tabel 1 Rencana Target Capaian Tahunan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

TS TS+1 TS+2

1 Publikasi Ilmiah Internasional Ada

Nasional Terakreditasi

2 Pemakalah dalam temu ilmiah Internasional Ada

Nasional

3 Invited speaker dalam temu

ilmiah

Internasional

Nasional

4 Visiting Lecturer Internasional

5 Hak Kekayaan Intelektual (HKI) Paten

Paten Sederhana

Hak Cipta

Merek Dagang

Rahasia Dagang

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 5: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

1

BAB 1 PENDAHULUAN

Status degeneratif merupakan salah-satu penyakit dengan tingkat kematian yang

cukup tinggi Penyakit kronis ini berhubungan pada proses degenerasi atau ketuaan

sehingga penyakit ini banyak ditemukan pada usia lanjut (Handajani et al 2010)

Kondisi yang terjadi adalah sulitnya pengobatan dan layanan kesehatan

mengakibatkan pasien degeneratif tidak mendapatkan terapi secara maksimal

Kebanyakan pasien ini lebih memilih berdiam diri dan tidak terlalu mementingkan

kesehatannya

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mencatat pada tahun 2012 sedikitnya ada

839 juta kasus degenerative dan diperkirakan menjadi 115 milyar pada tahun 2025

atau sekitar 29 dari total penduduk dunia dimana penderitanya lebih banyak pada

wanita (30) dibanding pria (29) WHO juga menambahkan bahwa South East Asia

pada tahun 2008 dilaporkan bahwa terdapat sebanyak 55 kematian disebabkan oleh

penyakit degenerative

Prevalensi penyakit degeneratif di Indonesia sendiri juga semakin meningkat

Terdapat faktor pemicu utama terhadap kasus ini yaitu meliputi status gaya hidup dan

sosial ekonomi Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2007 dilaporkan

bahwa terdapat kasus penyakit degeneratif di masyarakat belum terdiagnosis dengan

baik Sebagai contoh yaitu pada kasus hipertensi diketahui terdapat angka sebesar

317 dimana hanya 72 penduduk yang sudah mengetahui memiliki penyakit

degeneratif berupa hipertensi dan hanya 04 kasus yang minum obat hipertensi

Potensi stem cell dalam menyembuhkan berbagai penyakit degeneratif telah

menjadi harapan baru bagi masyarakat (Wobus dan Boheler 2006) Namun biaya

yang harus dikeluarkan untuk sekali terapi stem cell mencapai ratusan juta rupiah

Mengingat biaya terapi yang cukup besar maka terapi ini hanya dapat dirasakan oleh

masyarakat tingkat ekonomi menengah keatas sedangkan masyarakat dibawahnya

tidak Hal ini menimbulkan kesenjangan sosial dan kesenjangan hak sehat bagi

masyarakat Besarnya biaya terapi stem cell tidak terlepas dari mahalnya biaya

operasional produksi stem cell di laboratorium dan biaya aplikasi bagi pasien Salah

satu usaha yang telah dilakukan untuk menekan biaya produksi stem cell adalah

mencari senyawa kimia dari alam sebagai penginduksi diferensiasi stem cell menjadi

sel spesifik sebagai media kultur

Tumbuhan flamboyan Delonix regia (Boj ex Hook) Raf mengandung beberapa

senyawa seperti terpenoid tannin cardiac glycosides dan anthroquuinoes yang

2

berpotensi sebagai antioksidan (Singh dan Kumar 2014) saponin alkaloid

hidrokarbon fitotoksin dan karoten (Shanmukha et al 2011) Bagian bunga D regia

mengandung karotenoid galaktomannon (Jungalwala dan Cama 1962) tannin

saponin flavonoid steroid (Shanmukha et al 2011) dan alkaloid (Pharekh dan

Chanda 2007) Menurut (Jungalwala dan Chama 1962) kandungan karotenoid pada

bunga D regia berperan untuk mengatur komunikasi antar sel memberikan respon

imun transformasi neoplastik pengontrol pertumbuhan dan sebagai regulator enzim

yang bekerja sebagai detoksifikasi karsinogen (Pryor et al 2000)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Eriani et al (2018) menggunakan

ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) secara in vitro mendapatkan hasil

diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus musculus) berupa

nerve-like cell dan fibroblast-like cell dengan pewarnaan HE Selain itu ditemukan sel

yang memiliki karakteristik berbentuk bulat letak inti sel berada di samping dan

berwarna gelap yang menyerupai karakteristik osteoblast Namun penentuan jenis sel

ini tidak dapat dilakukan secara visual melainkan dengan menggunakan teknik

identifikasi berdasarkan ekspresi gen dari setiap sel untuk mendapatkan hasil yang

akurat Salah satu teknik yang digunakan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA

spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA dan memberikan informasi

mengenai urutan basa nukleotida dari sampel yang digunakan (Hewajuli dan

Dharmayanti 2014) Dengan demikian gen yang diekpresikan dapat diketahui dan

membuktikan jenis sel yang diperoleh Oleh karena itu penelitian ini penting

dilakukan untuk mengetahui dan membuktikan bahwa hasil diferensiasi dan proliferasi

sel punca mesenkimal berupa sel tulang menggunakan RT-PCR

Tabel 1 Rencana Target Capaian Tahunan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

TS TS+1 TS+2

1 Publikasi Ilmiah Internasional Ada

Nasional Terakreditasi

2 Pemakalah dalam temu ilmiah Internasional Ada

Nasional

3 Invited speaker dalam temu

ilmiah

Internasional

Nasional

4 Visiting Lecturer Internasional

5 Hak Kekayaan Intelektual (HKI) Paten

Paten Sederhana

Hak Cipta

Merek Dagang

Rahasia Dagang

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 6: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

2

berpotensi sebagai antioksidan (Singh dan Kumar 2014) saponin alkaloid

hidrokarbon fitotoksin dan karoten (Shanmukha et al 2011) Bagian bunga D regia

mengandung karotenoid galaktomannon (Jungalwala dan Cama 1962) tannin

saponin flavonoid steroid (Shanmukha et al 2011) dan alkaloid (Pharekh dan

Chanda 2007) Menurut (Jungalwala dan Chama 1962) kandungan karotenoid pada

bunga D regia berperan untuk mengatur komunikasi antar sel memberikan respon

imun transformasi neoplastik pengontrol pertumbuhan dan sebagai regulator enzim

yang bekerja sebagai detoksifikasi karsinogen (Pryor et al 2000)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Eriani et al (2018) menggunakan

ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) secara in vitro mendapatkan hasil

diferensiasi sel punca mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus musculus) berupa

nerve-like cell dan fibroblast-like cell dengan pewarnaan HE Selain itu ditemukan sel

yang memiliki karakteristik berbentuk bulat letak inti sel berada di samping dan

berwarna gelap yang menyerupai karakteristik osteoblast Namun penentuan jenis sel

ini tidak dapat dilakukan secara visual melainkan dengan menggunakan teknik

identifikasi berdasarkan ekspresi gen dari setiap sel untuk mendapatkan hasil yang

akurat Salah satu teknik yang digunakan adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA

spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA dan memberikan informasi

mengenai urutan basa nukleotida dari sampel yang digunakan (Hewajuli dan

Dharmayanti 2014) Dengan demikian gen yang diekpresikan dapat diketahui dan

membuktikan jenis sel yang diperoleh Oleh karena itu penelitian ini penting

dilakukan untuk mengetahui dan membuktikan bahwa hasil diferensiasi dan proliferasi

sel punca mesenkimal berupa sel tulang menggunakan RT-PCR

Tabel 1 Rencana Target Capaian Tahunan

No Jenis Luaran Indikator Capaian

TS TS+1 TS+2

1 Publikasi Ilmiah Internasional Ada

Nasional Terakreditasi

2 Pemakalah dalam temu ilmiah Internasional Ada

Nasional

3 Invited speaker dalam temu

ilmiah

Internasional

Nasional

4 Visiting Lecturer Internasional

5 Hak Kekayaan Intelektual (HKI) Paten

Paten Sederhana

Hak Cipta

Merek Dagang

Rahasia Dagang

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 7: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

3

Desain Produk Industri Ada

Indikasi Geografis

Perlindungan Varietas Tanaman

Perlindungan Topograri Sirkuit

Terpadu

6 Teknologi Tepat Guna

7 ModelPurwarupaDesainKarya SeniRekayasa Sosial

8 Buku Ajar (ISBN) Ada

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 8: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia yang bersifat sebagai

antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang dapat menetralkan aksi radikal

bebas Radikal bebas merupakan molekul yang dapat memicu kerusakan sel

meningkatkan risiko kanker dan penyakit jantung Asupan tinggi antioksidan seperti

vitamin C vitamin E selenium β-carotene dan carotenoid lain dianjurkan pada

penderita diabetes melitus (Franz 2012) β-carotene dapat memperbaiki metabolisme

lipid pada penderita diabetes dengan menurunkan sintesis total kolesterol LDL (Low

Density Lipoprotein) dan VLDL (Very Low Density Lipoprotein) (Mooradian et al

1994)

Bunga D regia mengandung senyawa fitokimia kelompok flavonoid yang

cukup tinggi Flavonoid merupakan senyawa fenolik alam (seringkali dalam formasi

polifenol) yang memiliki sifat antioksidan (Zhai et al 1998) Senyawa-senyawa ini

bertanggung jawab terhadap zat warna merah ungu biru dan sebagian zat warna

kuning dalam tumbuhan Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan

senyawa induk ldquoflavonldquo yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan

juga lazim ditemukan Sebagian besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat

pada molekul gula sebagai glikosida dan dalam bentuk campuran jarang sekali

dijumpai berupa senyawa tunggal Flavonoid dapat digunakan sebagai obat karena

mempunyai bermacam macam bioaktifitas seperti antiinflamasi antikanker

antifertilitas antiviral antidiabetes antidepresant diuretik (Tarmizi 2008)

Kandungan senyawa kimia pada bunga D regia adalah flavonoid tannin

alkaloid saponin steroid karotenoid dan turunannya yaitu lycopene phytoene β-

karoten prolycopene neolycopene δ-lycopene dan γ-lycopene Selain itu juga

terkandung senyawa kimia berupa phenolic acid dan turunannya yaitu gallic acid

protocatehuic acid salisylic acid trans-cinnamic acid dan clhrogenic acid Senyawa

lainnya adalah anthocyanins dan turunannya yaitu cyanidin-3-glucoside cyanidin-3-

gentiobioside dan β-sitosterol (Singh dan Kumar 2014)

Penelitian ini adalah kelanjutan dari beberapa penelitian sebelumnya Penelitian

tentang potensi ekstrak Delonix regia terhadap peningkatan imunostimulan dan uji

toksisitas secara in vivo pada hewan model telah dilaporkan oleh Eriani et al (2018)

terhadap peningkatan dan kapasitas makrofag (Rosnizar et al (2017) Berdasarkan

hasil penelitian Eriani et al (2018) senyawa fitokimia dalam bunga flamboyan (D

regia) mampu menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 9: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

5

menjadi nerve-like cell fibroblast-like cell dan diduga osteoblast-like cell yang

diidentifikasi dengan pewarnaan HE Hasil tersebut menjadi informasi penting dalam

kajian perbanyakan (kultur) stem cell sehingga perlu dikembangkan guna peningkatan

kesehatan masyarakat Untuk itu setiap hasil diferensiasi stem cell perlu diuji kembali

dan dikonfirmasi melalui analisis molekuler Produk sel yang teramplifikasi

merupakan hasil terjemahan secara signifikan yang mendeskripsikan fungsi senyawa

ekstrak D regia sebagai media alternatif media kultur sel terbaru

Ekstrak D regia terbukti dapat meningkatkan proliferasi dan diferensiasi

mesenchymal stem cell secara in vitro namun penelitian tersebut masih perlu

dilanjutkan mengingat parameter yang digunakan masih berupa parameter morfologi

Pendeteksian akan keberadaan osteoblas dan osteosit hasil proliferasi dan diferensiasi

sel MSC perlu dilakukan secara molekuler agar hasil yang didapat lebih akurat

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak

metanol Delonik regia terhadap hasil ekspresi gen Alkaline Phosphatase dan Beta

Actin sebagai indikasi keberadaan osteosit menggunakan qPCR Sedangkan manfaat

penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah dan bermanfaat dalam aplikasi

klinis untuk membantu penyembuhan penyakit degeneratif pada tulang melalui

teknologi sel puncastem cell terutama osteoporosis

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 10: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

6

BAB 4 METODE PENELITIAN

41 Pemeliharaan hewan coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur

Balb-C (Mus musculus) Hewan yang digunakan berumur dua bulan dan memiliki

berat badan rata-rata 30 g Kandang mencit berukuran 48 cm x 36 cm x 13 cm yang

ditutupi dengan jaring-jaring kawat pada bagian atasnya Bagian alas dari kandang

diisi dengan sekam padi setinggi 3 cm dari permukaan dasar kandang Pemberian

makan dan minum dilakukan secara ad libitum

42 Pengambilan sampel bunga D regia

Sampel bunga D regia yang digunakan berasal dari kawasan Banda Aceh dan

sekitarnya Kemudian petal bunga dipisahkan dengan bagian bunga lainnya Petal

dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian dipotong-potong dan dikeringkan

tanpa terkena sinar matahari langsung Petal bunga D regia yang sudah kering

kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga menjadi bubuk

homogen (Pasaribu et al 2015)

43 Ekstraksi

Sebanyak 1000 g bubuk bunga D regia disiapkan terlebih dahulu Kemudian

sampel dimaserasi dengan metanol absolut selama 3 x 24 jam Setelah itu disaring

menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtratnya Filtrat hasil penyaringan

kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 550C sampai

diperoleh ekstrak kental Ekstrak yang diperoleh selanjutnya ditempatkan dalam botol

tertutup dan disimpan di lemari pendingin pada suhu 4-80C Ekstrak dibuat dalam

bentuk suspensi berupa ekstrak cair yang dilarutkan dengan akuades untuk

mempermudah pemberian kepada hewan coba (Pasaribu et al 2015)

44 Pembuatan medium kultur (modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium)

mDMEM dan phosphate buffer saline (PBS)

Media kultur mDMEM dibuat sebanyak 100 ml dengan cara terlebih dahulu

menimbang DMEM-Powder sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker

selanjutnya ditambahkan aquadest 100 mL dan diaduk rata Natrium hipoklorit

(NaHCO3) ditimbang sebanyak 037 g dan dicampurkan ke dalam larutan pada gelas

beker Pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow) Larutan

AANE dan ITS masing-masing sebanyak 100 microL gentamycin 125 microL NBCS 1 mL

ditambahkan ke dalam gelas beker Kemudian larutan disterilkan menggunakan

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 11: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

7

mikrofilter dengan ukuran pori 022 microm dan dimasukkan ke dalam botol penyimpanan

Botol diberi label dan tutup botol direkatkan dengan parafilm Selanjutnya disimpan

dalam lemari pendingin

Larutan stok PBS terdapat dua jenis sesuai penggunaannya yaitu larutan stok

PBS untuk sentrifugasi dan untuk pencucian gelatin Larutan stok PBS yang digunakan

untuk proses sentrifugasi dibuat dengan mencampurkan 096 g PBS-Powder dengan

100 mL aquadest dan ditambahkan NBCS sebanyak 01 mL Sedangkan pembuatan

larutan stok untuk pencuci gelatin hanya dengan melarutkan 096 g PBS-Powder dalam

100 mL aquadest Kedua larutan stok PBS ini ditambahkan gentamycin masing-

masing sebanyak 125 microL saat akan digunakan Selanjutnya larutan stok PBS

dimasukkan dalam botol diberi label dan direkatkan tutup botol dengan parafilm

selanjutnya larutan stok PBS disimpan dalam lemari pendingin

45 Persiapan kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

Kaca penutup diletakkan dalam cawan petri dan dilapisi gelatin 01 sebanyak

1 mL selama satu jam pada suhu kamar Cawan petri dibersihkan dari gelatin dengan

cara dibilas dengan menggunakan larutan modified phosphate buffer saline (mPBS)

dan dibiarkan selama 5 menit Selanjutnya cawan petri diisi dengan modified

Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) sebanyak 2 mL dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5 selama satu jam pada suhu 37degC

46 Isolasi dan kultur primer Mesenchymal Stem cell (MSC) sumsum tulang

Mencit dikorbankan dengan metode dislokasi servikalis Selanjutnya

dilakukan pengambilan tulang femur dan tibia Tulang dibersihkan dari jaringan otot

dan lemak yang dilakukan dalam larutan mPBS Setelah bersih tulang dimasukkan

dalam cawan petri yang berisi larutan mPBS steril Kemudian kedua bagian ujung

tulang femur dan tibia dipotong dengan gunting

Sumsum tulang dibilas dengan mPBS menggunakan spuid Sumsum tulang

dikeluarkan dengan cara memasukkan kanul spuid yang berisi mPBS ke dalam rongga

tulang Setelah kanul spuid masuk pada rongga tulang mPBS dikeluarkan sehingga

sumsum tulang terdorong untuk keluar Suspensi sumsum tulang ditampung dalam

cawan petri Pemipetan dilakukan secara berulang dan disentrifugasi selama 10 menit

pada kecepatan 3000 rpm Hasil sentrifugasi dicuci dengan mPBS sebanyak empat kali

dan satu kali dicuci dengan mDMEM Sebelum diinkubasi jumlah sel dihitung

menggunakan hemositometer dengan rumus perhitungan total sel (selml) (Djuwita et

al 2010)

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 12: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

8

Total sel (selml) = rata-rata jumlah sel pada 5 kotak x faktor pengencer x 104

Selanjutnya suspensi sumsum tulang dengan konsentrasi 1 x 106 dimasukkan

ke dalam cawan petri yang telah berisi medium mDMEM sebanyak 1 mL Kemudian

diinkubasi dalam inkubator CO2 5 pada suhu 37degC (Kang et al 2005) Kemudian

dilakukan evaluasi setelah satu hari inkubasi dan dilakukan pergantian medium serta

penambahan ekstrak C quadrangula sesuai dengan dosis perlakuan yang digunakan

sebanyak 10 microL Medium kultur diganti setiap dua hari sekali dan kultur dilakukan

sampai hari ketujuh (Djuwita et al 2012)

47 Evaluasi hasil kultur Mesenchymal Stem Cell (MSC) sumsum tulang

1 Isolasi total RNA

Isolasi total RNA menggunakan ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

(Promega Z6011) Sel kultur yang telah diperoleh dimasukkan dalam tabung sentrifus

steril dan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 5 menit Sel pelet hasil

sentrifugasi dicuci dengan PBS dingin steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan

300 rpm selama 5 menit dan supernatan dipisahkan dengan hati-hati Kemudian buffer

BL dan TG ditambahkan sebanyak 250 microl dan di vortex atau pipetting selama 5 detik

Isopropanol ditambahkan sebanyak 85 microl dan dihomogenkan menggunakan vorteks

selama 5 detik Minicolumn dimasukkan dalam tabung koleksi dan lysate dimasukkan

kedalam minicolumn tersebut Liquid didalam tabung koleksi dibuang dan minicolumn

dimasukkan kembali kedalam tabung koleksi RNA Wash Solution sebanyak 500 microl

dimasukkan kedalam minicolumn dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000-14000

rpm selama 30 detik

DNase I incubation solution disiapkan dengan penambahan beberapa reagen

sesuai protokol dan dicampurkan dengan pemipetan secara perlahan (tidak

menggunakan vorteks) DNase I incubation solution ditambahkan sebanyak 30microl pada

membran Minicolumn dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 20deg-25degC kemudian

Column Wash Solution ditambahkan sebanyak 200 microl pada minicolumn dan

disentrifugasi dengan kecepatan12000-14000 rpm selama 15 detik selanjutnya RNA

Wash Solution ditambahkan sebanyak 500 microl dan disentrifugasi dengan

kecepatan12000-14000 rpm selama 30 detik Tabung koleksi dibuang beserta dengan

supernatan Minicolumn dipindahkan ke dalam tabung koleksi baru dan RNA Wash

Solution ditambahkan sebanyak 300 microl dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi

selama 2 menit ReliaPrepTM Minicolumn yang berada pada tabung koleksi

dipindahkan pada tabung elusi Nuclease-free water ditambahkan pada membran

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 13: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

9

minicolumn sebanyak 30 microl Tabung minicolumn dibuang dan tabung elusi ditutup

Tabung elusi mengandung RNA purifikasi dan setelahnya dilakukan sintesis cDNA

2 Sintesis cDNA

Sintesis cDNA menggunakan GoScriptTM Reverse Transcription System

(Promega A5000) RNA dan primer mix disiapkan dengan cara mencampurkan 1 microl

sampel RNA random primer sebanyak 01 microl dan nuclease free-water sebanyak 39

microl yang kemudian dipanaskan pada suhu 70degC selama 5 menit Komponen reverse

transcription reaction mix disiapkan dengan cara mencampurkan GoScriptTM5

reaction buffer sebanyak 4 microl MgCl2 sebanyak 12 microl PCR nucleotid mix sebanyak

10 microl recombinan RNasin ribonuclease inhibitor sebanyak 05 microl GoScriptTM reverse

transcriptase sebanyak 10 dan nuclease free-water sebanyak 73 microl Reverse

transcription master mix ditambahkan sebanyak 15 microl pada setiap tabung yang berisi

sampel Selanjutnya dilakukan reaksi reverse transcription pada mesin RT-PCR

dengan tahapan anneal pada suhu 25degC selama 5 menit tahap extend pada suhu 37degC

selama 1 jam dan tahap inactivated reverse transcriptase pada suhu 70degC selama 15

menit Sampel cDNA yang telah diperoleh disimpan dalam lemari penyimpanan

dengan suhu -20degC sebelum dilakukan proses reaksi amplifikasi pada PCR

3 Analisis ekspresi gen menggunakan RT-PCR

Proses qPCR dilakukan menggunakan kit GoTaqreg qPCR Master Mix

(Promega A6001) Reagen qPCR Master Mix disiapkan dengan cara mencampurkan

GoTaqreg qPCR Master Mix sebanyak 125 microl nuclease free-water sebanyak 75 microl dan

primer masing-masing sebanyak 2 microl Selanjutnya dimasukkan sampel cDNA

sebanyak 3 microl pada setiap tabung reaksi dan ditambahkan dengan qPCR Master Mix

yang telah dibuat Semua sampel dimasukkan kedalam mesin RT-PCR Biorad

Tabel 2 Jenis primer yang digunakan dalam penelitian

Jenis Primer Primer Forward Primer Reverse

Beta-actin 5rsquo ATGAAGATCCTGACCGAGCG 3rsquo 5rsquo TACTTGCGCTCAGGAGGAGC 3rsquo

Alkaline-

phosphatase 5rsquo GAGCAGGAACAGAAGTTTGC 3rsquo 5rsquo GTTGCAGGGTCTGGAGAGTA 3rsquo

48 Parameter Penelitian

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah hasil amplifikasi yang

ditampilkan berdasarkan grafik pada software PCR (CFX-96 Biorad) yang

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 14: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

10

menunjukkan kesesuaian antara gen sel target dan primer yang digunakan DNA yang

teramplifikasi menunjukkan spesifitas hasil kultur sel dari sel tulang

49 Analisis Data Penelitian

Analisis data dilakukan secara deskriptif sesuai dengan kurva amplifikasi yang

diperoleh dari hasil RT-PCR Perbedaan hasil amplifikasi dianalisis dengan

menggunakan rumus Livaks R = 2ΔCt (R = 2[Ct sample ndash Ct control])

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 15: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

11

BAB 5 HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI

51 Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Hasil pengamatan diferensiasi MSC dalam medium kultur dengan ekstrak

etanol bunga flamboyan (Dregia) diperoleh tiga jenis sel yang diduga hasil

diferensiasi MSC sumsum tulang mencit (Mus musculus) yaitu menyerupai sel

fibroblas sel saraf dan sel osteoblas Sel fibroblas ditandai dengan adanya penjuluran

sitoplasma dan memiliki inti sel berbentuk lonjong Sel fibroblas hasil diferensiasi

MSC pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 51

Gambar 51 Morfologi sel fibroblas dalam medium kultur

(A Inti sel B Penjuluran sitoplasma)

Gambar 51 memperlihatkan kesesuaian morfologi sel fibroblas pada medium

kultur dengan pernyataan Mescher (2010) yang mengatakan bahwa morfologi

fibroblas aktif ditandai dengan adanya percabangan pada sitoplasma inti sel berbentuk

lonjong besar dan berwarna pucat serta sitoplasmanya penuh dengan retikulum

endoplasma kasar Sel fibroblas terlibat dalam proses penyembuhan luka dan proses

fisologis dalam tiap jaringan dan organ dalam tubuh selain itu sel fibroblas juga

terlibat aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen (Kurniawati et al

2015) Berdasarkan informasi tersebut sel fibroblas yang diperoleh dari hasil

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 16: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

12

diferensiasi MSC dapat diaplikasikan dalam terapi sel punca (stem cell) pada penderita

luka bakar dan penderita aging (penuaan)

Jenis sel kedua yang dijumpai dalam medium kultur adalah menyerupai sel

saraf Sel saraf dalam medium kultur ditandai dengan adanya penjuluran sitoplasma

ke segala arah dan memiliki inti sel yang terletak di bagian sentral Sel saraf yang

dijumpai pada medium kultur dapat dilihat pada Gambar 42 di bawah ini

Gambar 52 Morfologi sel saraf dalam medium kultur a Sel saraf muda b Sel saraf

dewasa (A Inti sel B Sitoplasma C Akson)

Gambar 52 menunjukkan bahwa terjadi proses perkembangan sel saraf dalam

medium kultur yang diikuti proses maturasi Sel saraf muda memiliki volume

sitoplasma lebih banyak dengan penjuluran lebih pendek (Gambar 52a) Sebaliknya

Gambar 52b merupakan sel saraf dewasa dengan penjuluran sitoplasma membentuk

akson lebih panjang Berdasarkan Gambar 52 badan sel saraf dewasa terlihat lebih

kecil dibandingkan dengan badan sel saraf muda hal ini terjadi akibat penurunan

volume sitoplasma yang diikuti pembentukan penjuluran sitoplasma menjadi akson

dan dendrit

Sel ketiga hasil diferensiasi MSC adalah sel tulang yang secara morfologi

menyerupai osteoblas dengan ciri-ciri sel berbentuk bulat letak inti sel berada di

sentral dan berukuran besar sebagaimana yang terlihat pada Gambar 53 dibawah ini

a b

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 17: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

13

Gambar 53 Morfologi sel osteoblast dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Kontrol b Pada dosis 06 mgml

(A Inti sel B Sitoplasma)

Karakteristik sel pada Gambar 53 sesuai dengan pernyataan (Djuwita et al

2012) yang mengatakan bahwa osteoblas yang aktif mensintesis matriks tulang

memiliki inti sel yang besar apparatus golgi dan retikulum endoplasma yang banyak

Akan tetapi osteoblas akan berubah bentuk menjadi kuboid yang besar setelah

proteoblas berhenti mengalami proliferasi

Gambar 54 Morfologi sel tulang dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) a Pada dosis 07 mgml b Pada

dosis 08 mgml (A Inti sel B Sitoplasma C Penjuluran sitoplasma)

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 18: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

14

Sel osteoblas pada Gambar 54 memperlihatkan bentuk yang sedikit berbeda

Sel tulang pada (Gambar 54a) memperlihatkan morfologi sel yang berbentuk bulat

dan memiliki inti sel yang besar sedangkan pada (Gambar 54b) memperlihatkan

morfologi sel tulang yang berukuran besar memiliki inti sel yang besar dan terdapat

sedikit penjuluran pada sitoplasmanya Hal ini disebabkan karena terjadinya

transformasi osteoblas menuju osteosit yang melibatkan perubahan morfologi serta

penurunan ukuran diameter sel Osteosit adalah sel yang berasal dari osteoblas dan sel

yang membentuk komponen selular utama pada tulang yang dewasa Osteosit

merupakan sel dewasa yang memiliki aparatus golgi dan retikulum endoplasma kasar

yang lebih sedikit tetapi memiliki lisosom yang lebih banyak dibandingkan dengan

osteoblas dan memiliki penjuluran pada sitoplasmanya (Stevenson dan Marsh 2007)

Beberapa studi menunjukkan bahwa ukuran osteosit berbeda-beda tergantung pada

tipe tulang dan aktivitas serta ukuran dari osteoblas Bentuk dan ukuran dari osteosit

yang baru tertanam pada tulang juga dapat bervariasi Hal ini tergantung pada umur

masing-masing osteosit dan tingkat kematangan osteosit (Dallas dan Bonewald 2010)

Gambar 55 Morfologi sel osteoblas dalam medium kultur yang ditambahkan ekstrak

etanol bunga flamboyan (D regia) dosis 09 mgml (A Inti sel B

Sitoplasma)

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 19: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

15

Osteoblas merupakan sel tulang yang berperan dalam menghasilkan bahan

organik untuk menyusun tulang Sel yang secara morfologi menyerupai osteoblas

dalam medium kultur merupakan sel yang menjadi target identifikasi pada penelitian

ini Pengidentifikasian sel yang menyerupai osteoblas ini dilakukan secara molekular

dengan mengidentifikasi gen alkaline phosphatase (ALP) sebagai penanda keberadaan

dari sel tersebut ALP merupakan gen pertama yang terdeteksi pada progenitor sel

osteoblas pada proses diferensiasi osteoblas (Zur Nieden et al 2003) dan penanda sel

tulang yang paling sering digunakan (Singer dan Eyre 2008) ALP sering digunakan

untuk mengukur aktivitas osteoblas karena sebagian besar ALP yang berada dalam

serum berasal dari osteoblas (Singer dan Eyre 2008) Berdasarkan pengamatan secara

visual dalam medium kultur sel yang menyerupai osteoblas ini diperoleh pada kultur

MSC kontrol dan semua sampel yang diberikan perlakuan dosis ekstrak etanol bunga

D regia dan dilanjutkan dengan identifikasi DNA sel target secara molekular

berdasarkan ekspresi gen ALP menggunakan mesin RT-PCR

52 Identifikasi Osteoblas Menggunakan Real Time PCR

Teknik identifikasi molekular yang sering digunakan adalah identifikasi

menggunakan Real Time PCR (RT-PCR) Hasil analisis menggunakan RT-PCR

diperoleh dalam bentuk kurva yang ditampilkan pada layar komputer dengan software

yang ditentukan Kurva amplifikasi (amplification curve) dan kurva puncak pelelehan

(melt peak curve) merupakan dua kurva yang diperlukan dalam analisis hasil

identifikasi menggunakan RT-PCR sebagaimana yang dilakukan pada penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang akurat

Hasil identifikasi molekular yang dinyatakan berdasarkan kurva amplifikasi

menggambarkan bahwa sampel dengan primer β-aktin teramplifikasi di atas garis

ambang batas (base line threshold) dengan awal siklus terampilifikasi relatif sama dan

hasil analisis menggunakan melt peak curve menggambarkan bahwa semua sampel

dengan primer β-aktin memiliki titik puncak pelelehan pada suhu yang sama Hal ini

menyatakan bahwa sampel dengan primer β-aktin pada semua perlakuan adalah

homogen karena tidak membentuk titik puncak pelelehan yang berbeda Analisis kurva

ampilifikasi pada sampel dengan primer ALP menggambarkan bahwa keempat sampel

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 20: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

16

uji (U1 U2 U3 dan U4) teramplifikasi di atas base line threshold sedangkan pada

sampel kontrol (U0) menunjukkan hasil negatif terhadap osteoblast dikarenakan grafik

sigmoid berada dibawah base line threshold Begitu juga hasil evaluasi menggunakan

melt peak curve yang menggambarkan bahwa keempat sampel uji dengan primer ALP

memiliki titik puncak suhu pelelehan yang sama sehingga tidak adanya hasil false

positive

Amplifikasi yang dijalankan pada mesin RT-PCR ditampilkan dalam bentuk

kurva pada layar komputer dengan software Biorad CFX-96 dengan spesifikasi

perlakuan sampel uji P0U0 P1U1 P2U2 P3U3 dan P4U4 ditampilkan pada Gambar 46

di bawah ini

Gambar 56 Kurva amplifikasi sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Hasil kurva amplifikasi yang diperoleh dari pengujian menggunakan mesin

RT-PCR menunjukkan bahwa sampel uji memperlihatkan hasil yang positif keculi

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 21: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …

17

pada perlakuan kontrol dengan primer ALP dimana garis berada di bawah base line

threshold Hasil amplifikasi yang diperoleh melewati garis ambang batas (base line

threshold) dimana setiap sinyal flouresen terbaca dan menunjukkan DNA yang

teramplifikasi Base line threshold merupakan garis horizontal pada sumbu x (garis

lurus berwarna hijau) yang menjadi tolak ukur grafik sigmoid sampel yang

teramplifikasi Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas flouresen semakin

banyak produk amplifikasi yang dihasilkan maka akan semakin besar akumulasi

flouresen yang terbaca (NurrsquoUtami 2011) Kurva amplifikasi juga menunjukkan

bahwa jumlah siklus teramplifikasinya setiap sampel berbeda-beda berdasarkan

dengan primer yang digunakan Sampel dengan primer β-aktin yang merupakan

reference gene dari DNA sel target telah teramplifikasi pada siklus ke 26 sedangkan

sampel dengan primer alkaline phosphatase (ALP) teramplifikasi pada siklus ke 32

Perbedaan siklus teramplifikasinya setiap sampel diduga dipengaruhi oleh

desain dan konsentrasi primer banyak siklus PCR serta suhu annealing yang

digunakan pada proses amplifikasi PCR Menurut Grunenwald (2003) proses

amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter antara lain kualitas dan

konsentrasi DNA template desain dan konsentrasi primer konsentrasi ion

magnesium konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP) buffer PCR konsentrasi Taq

polymerase siklus PCR dan penggunaan teknik hotstart Selain itu perbedaan ini

disebabkan karena β-aktin merupakan protein yang sangat penting bagi sel eukariotik

Protein ini berperan penting untuk membentuk jaringan yang memberikan dukungan

mekanik sel menentukan bentuk sel pergerakan sel dan pembelahan sel Sifat dari

gen aktin adalah housekeeping gene yaitu gen yang memiliki tingkat ekspresi yang

stabil di berbagai jaringan pada semua tahapan perkembangan Sifat ini menjadikan

gen aktin digunakan sebagai kontrol internal (reference gene) pada analisis ekspresi

gen menggunakan metode qRT-PCR (Hannum et al 2010) Oleh karena itu sampel

dengan primer β-aktin akan lebih mudah teramplifikasi dibandingkan sampel dengan

primer ALP yang merupakan primer dari DNA sel target Berdasarkan kurva

amplifikasi 56 sampel dengan primer β-aktin lebih cepat teramplifikasi dengan nilai

Relative Fluorecent Units (RFU) yang tinggi Nilai RFU menyatakan akumulasi

flouresen yang terbaca Semakin tinggi nilai RFU maka semakin banyak produk

amplifikasi (amplikon) yang dihasilkan

Peningkatan fluoresen ditandai dengan terbentuknya grafik sigmoid seperti

yang tergambar pada Gambar 56 (garis berwarna hijau) yang akan berpotongan

18

dengan base line threshold Penelitian ini menggunakan label flouresen berupa SYBR

green I SYBR green I akan mengukur intensitas flouresen secara proporsional sesuai

dengan produk PCR yang dihasilkan Akumulasi dari amplikon PCR meningkat

seiring dengan meningkatnya siklus reaksi yang menunjukkan bahwa molekul SYBR

green I berikatan dengan DNA Akan tetapi SYBR green I merupakan label flouresen

yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal pengujian false-positive

karena terbentuknya produk yang tidak spesifik Sensitifitas deteksi dengan

menggunakan SYBR green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer spesifisitas

primer yang rendah konsentrasi primer dapat membatasi produk amplifikasi dan

terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR Faktor-faktor ini dapat

mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang

dapat berikatan dengan SYBR green I dan menghasilkan sinyal flouresen Oleh karena

itu perlu dilakukannya analisis formasi dari kurva pelelehan (melting curve) dan kurva

puncak pelelehan (melt peak curve) (Pestana et al 2010) Melt peak curve dapat

menunjukkan ada atau tidaknya produk non-spesifik Kurva puncak pelelehan sampel

uji dilampirkan pada Gambar 57

19

Gambar 57 Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) sampel uji

Keterangan

P Primer β-aktin U Primer alkaline phosphatase

P0 Kontrol U0 Kontrol

P1 Dosis 06 mgml U1 Dosis 06 mgml

P2 Dosis 07 mgml U2 Dosis 07 mgml

P3 Dosis 08 mgml U3 Dosis 08 mgml

P4 Dosis 09 mgml U3 Dosis 09 mgml

Gambar 57 menunjukkan bahwa grafik sigmoid untuk semua sampel dengan

primer β-aktin berada di atas base line threshold akan tetapi satu sampel dengan

primer ALP yaitu pada perlakuan kontrol (U0) berada dibawah base line threshold

Hal ini menunjukkan bahwa semua sampel memiliki sel hidup yang ditunjukkan

dengan adanya senyawa β-actin pada setiap sampel Akan tetapi hasil pengamatan

morfologi sel osteoblast yang ada pada perlakuan kontrol tidak dapat di buktikan

sebagai sel osteoblast hal ini dikarenakan pada perlakuan kontrol grafik sigmoid

berada dibawah base line threshold Hasil yang diperoleh dari grafik amplikasi juga di

dukung oleh analisis grafik puncak pelelehan (melt peak curve) Hasil dapat dikatakan

positif apabila titik puncak pelelehan yang diperoleh juga berada di atas base line

threshold dan pada satu titik yang sama sedangkan apabila terbentuk produk non-

spesifik maka grafik akan berada di bawah base line threshold atau akan membentuk

titik puncak pada suhu yang berbeda dengan amplikon dari produk spesifik atau melt

20

peak dapat pula memiliki lebih dari satu puncak suhu Pestana et al (2010)

mengatakan bahwa semua produk PCR untuk primer set tertentu harus memiliki nilai

suhu pelelehan (Tm) yang sama kecuali jika terdapat adanya mispriming kontaminasi

atau primer-dimer Berdasarkan kurva (Gambar 57) produk PCR yang dihasilkan

adalah homogen dengan semua sampel uji memiliki nilai Tm yang sama

Hasil analisis formasi melt peak curve menunjukkan bahwa pada sampel uji

U1 U2 U3 dan U4 terdapat sel osteoblast dikarenakan grafik sigmoid pada melt peak

curve berada di atas base line threshold Sedangkan sel osteoblast dikatakan negatif

pada sampel kontrol (U0) Selain itu dapat dinyatakan bahwa sel yang secara

morfologi menyerupai sel osteoblast pada dosis ekstrak 06 mgml 07 mgml 08

mgml dan 09 mgml merupakan sel osteoblast secara ekspresi gen sedangkan pada

sampel kontrol yang secara morfologi juga menunjukkan adanya sel osteoblast

dinyatakan negatif berdasarkan ekspresi gen Hal ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol bunga D regia mampu menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC menjadi

osteoblas dengan terdeteksinya gen ALP

Kandungan kimia pada bunga Dregia yang dapat memicu diferensiasi

osteoblas adalah flavonoid seperti yang dilaporkan oleh Zhang et al (2008) bahwa

senyawa flavonoid dapat memicu diferensiasi osteoblas sehingga dengan

menggunakan dosis yang tepat MSC dapat berdiferensiasi menjadi osteoblas Selain

itu tumbuhan flamboyan yang tergolong kelompok polong-polongan dari Familia

Fabacea ini diduga memiliki kandungan fitoestrogen Fitoestrogen merupakan

senyawa yang ditemukan pada tumbuhan kacang-kacangan dan merupakan senyawa

yang mirip dengan estrogen Salah satu jenis dari fitoestrogen adalah isoflavonoid

yang terdiri dari genistein dan daidzein Genistein yang merupakan komponen dalam

fitoestrogen dapat menstimulasi diferensiasi sel punca sumsum tulang menjadi

osteoblas Diferensiasi tersebut terjadi karena adanya peningkatan Cbfa-1 (Ducy

2000) dan Transforming Growth Factor beta-1 (TGFacirc-1) (Heim et al 2004)

Senyawa Cbfa-1 adalah faktor transkripsi pada sel progenitor menjadi osteoblas dan

berperan dalam mengontrol proses perkembangan diferensiasi dan pematangan fungsi

osteoblas (Ducy 2000) Senyawa TGFacirc-1 mengatur gen transkripsi pada sel melalui

sinyal reseptor (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) melaporkan bahwa genistein

dan daidzein juga dapat meningkatkan proliferasi osteoblas melalui proses sintesis

protein dengan mengatur sintesis Cbfa-1 dan Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2)

(Federici et al 2004)

21

Penelitian Eriani et al (2018) yang juga menggunakan ekstrak etanol bunga

(D regia) memperoleh hasil berdasarkan pengamatan morfologi terdapat sel yang

menyerupai osteoblas pada dosis ekstrak etanol bunga D regia 08 mgml

Berdasarkan hasil penelitian ini ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) dengan

dosis 08 mgml dan 09 mgml terbukti dapat memicu proliferasi dan diferensiasi MSC

menjadi osteoblas Berdasarkan informasi tersebut maka dosis ekstrak etanol bunga

D regia sebesar 08 mgml dan 09 mgml dapat dijadikan salah satu faktor yang dapat

menginduksi proliferasi dan diferensiasi MSC dalam medium kultur menjadi

osteoblas Sehingga hasil kultur MSC berupa osteoblas ini dapat diaplikasikan pada

penderita osteoporosis melalui terapi stem cell

22

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah

1 Pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D regia) memberikan pengaruh

terhadap diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit

2 Deteksi dengan RT-PCR menunjukkan 4 sampel positif teramplifikasi gen alkaline

phosphatase sebagai penyandi sel tulang

3 Analisis RT-PCR menunjukkan pemberian ekstrak etanol bunga flamboyan (D

regia) pada dosis 06 mgml 07 mgml 08 mgml dan 09 mgml mampu

menginduksi diferensiasi mesenchymal stem cell sumsum tulang mencit menjadi

osteoblas

Sedangkan saran yang dapat diberikan dari penelitian ini adalah perlunya

dilakukan uji toksisitas dari Delonik regia terhadap kondisi sel pada medium kultur

Juga diharapkan di masa yang akan datang penelitian lanjutan mengenai aplikasi klinis

sel punca mesenkimal terhadap penyakit degeneratif lebih banyak dilakukan demi

kemajuan ilmu pengetahuan di Indonesia

23

DAFTAR PUSTAKA

Adje F Lozano Y F Meudec E Lozano P Adima A Agbo Nrsquozi G dan

Gaydou E M 2008 Anthocyanin Characterization of Pilot Plant Water

Extract of Delonix regia Flowers Molecules 13 1238-1245

Aryulina D Muslim C Manaf S dan Winarni WE 2004 Biologi 2 SMA dan MA

Untuk Kelas XI Penerbit Esis Erlangga Jakarta

httpbibitbungacomtanaman-flamboyan-royal-ponciana Diakses pada

tanggal 18 April 2016

Azab S s dan Daim M A 2013 Phytochemical Cytotoxic Hepatoprotective

Antioxidant Properties of Delonix regia Leaves Extract Med Chem Res 22

4269-4277

Bunga bibit 2015 Tanaman Flamboyan (Royal Ponciana)

Black EM Lowings JP Smith J Heaton PR dan McElhinney LM 2002 A rapid

RT-PCR Method to Differentiate six established genotypes of Rabies and

Rabies-Related Viruses Using TaqMan Technology J Virol Methods 105 25-

35

Borah P 2011 Primer Designing for PCR Sci Vis Vol 11 (3) 134-136

Ceriana R Djuwita I dan Wresdiyati T 2014 Ekstrak Batang Sipatah-Patah

Meningkatkan Proliferasi san Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum

Tulang Jurnal Veteriner 4 (15) 436-445

Chamberlain G Fox J Ashton B dan Middleton J 2007 Concise Review

Mesenchymal Stem Cell Their Phenotype Differentiation Capacity

Immunological Features and Potential for Homing Tissue Specifik Stem Cells

25 2739-2749

Chantratia W Sukasem C Kaewpongsri S Srichunrusami C Pairoj W

Thitithanyanont A Chaichoune K Ratanakron P Songsrem T

Damrongwatanapokin S dan Landt O 2008 Qualitative Detection of Avian

Influenza A (H5N1) Viruses a comperative evaluation of four real-time

nucleic acid amplification methods Mol Cell Probes 22 (5-6) 287-293

Chen C S 2002 Phorbol Ester Induced Elevated Oxidative Activity and Alkalization

in a Subset of Lysosome BMC Cell Biol 3 1-11

Dallas S L and Bonewald L F 2010 Dynamics Of The Transition From Osteoblast

to Osteocyte NIH Public Access 437-443

Djuwita I Pratiwi I A Wiranto A dan Sabri M 2012 Proliferasi dan Diferensiasi

Sel Tulang Tikus Dalam Medium Kultur In Vitro yang Mengandung Ekstrak

Batang Cissus quadrangular Salibs (Sipatah-Patah) Jurnal Kedokteran

Hewan 2(6) 78

Djuwita I Riyacumala V Mohamad K Prasetyaningtijas W E dan Nurhidayat

2012 Pertumbuhan dan Sekresi Protein Hasil Kultur Primer Sel-Sel Serebrum

Anak Tikus Jurnal Veteriner 13 (2) 125-135

Ducy P 2000 CBFA1 A Molecular Switch on Osteoblast Biology Developmental

Dynamics 219(4) 461-471

Effendi A 2009 Skripsi Pengaruh Conditioned Medium RAT Embryonic Fibroblast

(CM- REF) Dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Dalam

Medium Terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchyal Stem

Cell Sumsum Tulang Tikus Dalam Kultur In Vitro Fakultas Kedokteran

Hewan Institut Pertanian Bogor Bogor

24

Federici E Garrett R Quintin A 2004 Soybean Extract and Its Isoflavones Genistein

and Daidzein Stimulate BMP-2 Expression and Bone Formation by Inhibiting

the Mevalonate Pathway in Osteoblast Cells Bone 34 54-54

Grunenwald 2003 Methods in Molecular Biology PCR Protocols Second Edition

Edited by John M S Bartlett and David Starling Humana Press 603-610

Halim D Murti H Sandra F Boediono A Djuwantono T dan Boenjamin S

2010 Stem Cell Dasar Teori dan Aplikasi Klinis Erlangga Jakarta

Hannum S Akashi K Suharsono U W Hartana A Yokota A dan Suharsono

2010 Isolasi Fragmen cDNA Dari Gen Penyandi Aktin Dari Melastoma

malabathricum Makara Sains 2 (14) 163-167

Heim M Frank O Kampmann G Sochocky N Pennimpede T Fuchs P

Hunziker W Weber P Martin I dan Bendik I 2004 The Fhytoestrogen

Genistein Enhances Osteogenesis and Repress Adipogenic Differentiation of

Human Primary Bone Marrow Stromal Cells Endocrinology 145 (2) 848-859

Hewajuli D A dan Dharmayanti 2014 Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Disease Dalam Yuwono T 2006 Teori dan

Aplikasi Polymerase Chain Reaction Penerbit Andi Yogyakarta

Hoffbrand A V Moss P A H dan Pettit J E 2006 Essential Haematology 5th

Asia Blackwell Publishing 129-181

Huldani 2012 Referat Biomarker Remodeling Tulang Fakultas Kedokteran

Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin Dalam Thomas SDC 2012

Bone Tunovour Markers 35 156-158

Jahan I Rahman S M Rahman S M Kaisar A M Islam S M Wahab A dan

Rashid A M 2010 Chemical and Biological Investigations of Delonix regia

(Bojer ex Hook) Raf Acta Pharm 60 207-215

Jungalwala F B dan Chama H R 1962 Carotenoids in Delonix regia (Gulmohar)

Flower Biochemical Journal 85 1-8

Junqueira L C dan Carneiro J 2005 Basic Histology 11th Ed Mc Graw Hill New

York

Kawiyana S K 2009 Osteoporosis Patogenesis Diagnosis dan Penanganan Terkini

(2)10

Kenneth LJ dan Thomas SD 2001 Analysis of Relative Gene Expression Data

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method Applied

Biosystems Foster City California and Department of Pharmaceutical

Science College of Pharmacy Washington State University Pullman

Washington 25 402-408

Kuehnel W 2003 Color Atlas of Cytology Histology and Microscopic Anatomy 4th

Ed Thieme Stuttgart New York

Kumar A V Shaik R dan Yeshwanth D 2013 Phytochemical Evaluation of

Delonix regia Samanea saman Bauhinia variegatga International Journal of

Research in Pharmacy and Chemistry 3(4) 768-772

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D dan Putri T 2015

Kultur Primer Fibroblas Penelitian Pendahuluan Artikel Penelitian 38(1) 34

Kusumo DA 2012 Eprintundipacid Tanggal akses 26 Januari 2016

Lubis NDA 2011 Repositoryusuacidgtbitstream Tanggal akses 28 Desember

2015

Mariajancyrani J Chandramohan G Saravanan P dan Savaraj S 2013 In-Vitro

Antioxidant Potential of Delonix regia Leaves Scholars Academic Journal of

Pharmacy (SAJP) 2(6) 468-471

25

Margono A 2012 Potensi Sel Punca Mesenkhim Asal Jaringan Lemak dengan

Produk Plasma untuk Produk Plasma untuk Regenerasi Sel Odontoblas

Jaringan Pulpa In-Vitro Disertasi Fakultas Kedokteran Gigi Program Doktor

Ilmu Kedokteran Gigi Universitas Indonesia Jakarta Dalam Cherly T

Gomillion KJLB Stem Cells and Adipose Tissue Engineering J of

Biomaterials 2006 6052

Mescher A L 2010 Junqueiras Basic Histology Twelfth Edition The McGraw-Hill

Companies Inc

Masters R J Palsson O B dan Thomson A J 2007 Human Cell Culture 6

Embryonic Stem Cells Spinger Netherlands

National Institutes of Health US 2009 The Adult Stem Cell In Stem Cell

Information httpstemcellsnihgovinfoscireportpageschapter4aspx

Tanggal Akses 16 Maret 2016

Nurrsquoutami A D 2011 Metode Analisis Isolasi Identifikasi Salmonella Thyparium

Pada Susu Dengan Metode Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Skripsi Institute Pertanian Bogor Bogor

Ogita M Rached M T Dworakowski E Bilezikian P dan Kousteni S 2008

Differentiation and proliferation of Periosteal Osteoblast Progenitors Are

Differentially Regulated by Estrogens and Intermittent Parathyroid Hormon

Adminiatration Endocrinology 149(11) 5713-5723

Phareks J dan Chanda S 2007 Antibacterial and Phytochemical Studies on Twelve

Species of Indian Medicinal Plants African Journal of Biomedical Research

10 175-181

Ponnusami V Aravindhan R Karthik N R Ramadoss G dan Srivastava S N

2009 Adsorpsion of Methylen Blue Onto Gilmohar Plant Leaf Powder

Equilibrium Kinetic and Thermodinamic Analysis Journal of Evironmental

Protection Science 3 1-10

Prayoga W dan Wardani A K 2015 Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi

Salmoella sp Kajian Pustaka Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(2)

Price S A dan Wilson L M 1995 Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses

Penyakit EGC Jakarta

Pryor W A Stahl W dan Rock C L 2000 Beta Carotene from Biochemistry to

Clinical Trials Nutrition Reviews 58 39-53

Roberts A B Flanders K C Heine U I Jakoule S Kondaiah P Kim S J dan

Sporn M B 1990 Transforming Growth Factor- acirc Multifunctional Regulator

Differentiation and Development Philosiphical Transaction of the Royal

Society of London 327 145-154

Sandhaanam S D Pathalam G Dorairaj S Savariar V amp Research Departement

of Advanced Zoology and Biotecnology 2013 Mesenchymal Stem Cell

(MSC) Identification Proliferation and Diferentiation A Review Article

Sardjono T Caroline Setiawan M Friska Saputra V dan Aniko A 2009

Application of a Modified Methode For Stem Cell Isolation from Lipoaspirates

in a Basic Lab Stem Cell Isolation From Lipoaspirates 18 (2)

Stevenson J S and Mars M S 2007 An Atlas of Osteoporosis Thrid Edition Informa

Healtcare London UK

Shabir G Anwar F Sultan B Khalid Z M Afzal M Khan Q M dan

Ashrafuzzaman M 2011 Antioxidant and Antimicrobial Attributes and

Phenolic of Different Solvent Extracts From Leaves Flowers and Bark of

Gold Mohar [Delonix regia (Bojer ex Hook) Raf] Molecules 16 (9) 7302-

7319

26

Shanmukha I Patel H P Patel J dan Riyazunnisa 2011 Quantification of Total

Phenol and Flavonoid Content of Delonix regia Flowers International Journal

of ChemTech Research 3 (1) 280-283

Singer FR dan Eyre D R 2008 Using Biochemical Markers of Bone Turnover in

Clinical Practice Cleveland Clinic Journal 75(10) 739-750

Singh S dan Kumar N S 2014 A Review Introduction to Genus Delonix World

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3(6) 2042-2055

Steenis C G G J Bloembergen S dan Eyma P J 2013 Flora untuk Sekolah di

Indonesia Moeso S Soenarto H Soerjo SA Wibisono Margono P dan

Soemantr W Editor Cetakan VI Pradnya Paramita Jakarta halaman 35-49

169-172

Suryani I 2015 Pengujian Ekstrak Etanol Bunga Flamboyan Delonix regia (Boj ex

Hook) Raf Terhadap Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal

Sumsum Tulang Mencit (Mus musculus) Skripsi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala Banda

Aceh

Tortora G J dan Derrickson B H 2009 Vision Principle of Anatomy and Physiology

12th Ed Philadephia Jhon Wiley and Sons Publisher 8 604

USDA (Uniteed States Departement of Agriculture) 2015 Delonix regia (Bojer Ex

Hook)RafRoyalPoinciana

httpplantsusdagovcoreprofilesymbol=DERE Tanggal akses 14 Januari

2016

Wardhana W 2012 Faktor-Faktor Risiko Osteoporosis Pada Pasien Dengan Usia Di

Atas 50 Tahun Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

Semarang

Widjiati Madyawati Sri P Rimayanti A dan Budiayanto A 2015 Terapi Sel

Punca Mesenkimal Sumsum Tulang Tikus dalam Meregenerasi Sel

Sitotrofoblas Nekrosis yang Dipapar Carbon Black Jurnal Veteriner 16 (2)

265-273

Wislow T 2001 httpstemcellsnihgovStatisticResourcesinfoscireportimage21

Jpg Tanggal akses 25 Januari 2016

Wobus A M dan Boheler K R 2006 Stem Cells Springer Germany

Yusuf H 2011 Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf Badan Perbenihan Tanaman

Hutan Sulawesi

Yusuf Z K 2010 Polymerase Chain Reaction (PCR) Jurnal Saintek Staf Pengajar

Jurusan Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo

Gorontalo 5 (6)

Zhang DW Cheng Y Wang NL Zhang J C Yang M S dan Yao X S 2008

Effect of Total Flavonoids and Plavonol Glycosides from Epimedium

Koreanum Nakai on The Proliferation and Differentiation of Primary

Osteoblast Phytomedicine 15(2) 55-61

Zur NiedenNI KempkaG AhrHJ 2003 In Vitro Differentiation of Embryonic

Stem Cells Into Mineralized Osteoblasts Differentiation 71 18ndash27

28

Lampiran 1 Format Biodata KetuaAnggota Tim Peneliti

BIODATA KETUA PENGUSUL

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr Kartini Eriani MSi

2 Jenis Kelamin P

3

2

Jabatan Fungsional Lektor

4 NIP 197004211999032001

5 NIDN 0021047001

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 21 April 1970

7 Alamat Rumah Jl Purnawirawan No 11 Geuceu Komplek

8

9

9

Nomor HP 085277060751

9 Alamat Kantor Jl Syeh Abdurrauf No 3 Darussalam

SSyiah Kuala Darussalam Banda Aceh 23111 10 Nomor TeleponFax 065141793

11 Alamat e-mail Kartini_erianiunsyiahacid

12 Lulusan yg telah dihasilkan S1 = 19 orang S2 =1 orang S3 =

13

Mata Kuliah yg diampu 1 Struktur Hewan

2 Perkembangan Hewan

3 Pengantar Bioteknologi

4 Reproduksi Hewan

5 Endokrinologi

6 Bioteknologi Hewan

7 Imunologi (S2)

8 Kriopreservasi (S2)

9 Manipulasi Embrio (S2)

10 Sitogenetika (S2)

B Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Bidang Ilmu Biologi Biologi Biologi

Tahun Masuk- Lulus 1989-1994 1995-1998 2000 ndash 2005

Judul

SkripsiThesisDisertasi

Pengamatan

Siklus Estrus

Melalui

Preparat Ulas

Vagina Mencit

(Mus musculus

albinus)

Pengaruh Penambahan

Asam Amino Dalam

Medium Kultur Bebas

Serum Terhadap

Perkembangan

Preimplantasi Embrio

Mencit In Vitro

Viabilitas Gamet

Setelah Preservasi

Ovarium dan

Epididimis Serta

Pemanfaatannya

Untuk Produksi

Embrio Kucing

Secara In Vitro

Nama

PembimbingPromotor

Dra Sunarti

MS

Prof Dr drh Yuhara

Sukra

Dr drh Hasim DEA

Prof Dr drh

Yuhara Sukra

Prof Dr drh Arief

Boediono

29

Drs Abdul

Hadi mahmud

MS

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr drh Ita Djuwita

MPhil

Dr Sony Heru

Sumarsono MSc

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2009 Pengaruh Asap Rokok terhadap Infertilitas

(Kualitas Spermatozoa Defek Makroskopis

dan Mikroskopis Testis) pada Mencit Jantan

(Mus musculus albinus)

Risbin

Iptekdok

Litbangkes

125

2 2015 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 70

3 2015 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 65

4 2016 Optimalisasi Potensi Kerbau dalam Usaha

Meningkatkan Ketahanan Pangan di Aceh

dengan metode Pembekuan Spermatozoa

Project 7in1 130

5 2016 Analisis Genomik dan proteomik

Plasmodium berghe sebagai Model Kajian

terhadap Infeksi Malaria pada Manusia

DIKTI 60

6 2018 Kripreservasi Sperma Ikan Depik (Rasbora

tawarensis) Spesies Endemik dan Terancam

Punah di Danau Laut Tawar Provinsi Aceh

DRPM

DIKTI

7 2018 Kriopreservasi Sperma Ikan Kawan

(Propuntius tawarensis) Pengujian Jenis Ikan

dan Konsentrasi Antioksidan

PNBP 86

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2014 IbM Pemanfaatan Sampah Plastik di Perkampungan Tsunami Indonesia-Tiongkok Desa Neuhen Aceh Besar

Dikti 32

2 2015 Pemanfaatan Produk Ekstrak Daun Kedondong Pagar (Lannea coromandelica) untuk Meningkatkan Kesehatan dan Daya Tahan Tubuh Unggas

BOPTN 30

30

3 2015 Aplikasi Inseminasi Buatan Menggunakan Semen Beku Aceh dalam Meningkatkan Perekonomian Peternak di Aceh besar

BOPTN 20

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Alam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTah

un

1 Development of Domestic Cat

Embryo Produced by Preserved sperm

Hayati Journal of

Biosciences

ISSN 1978-3019

Scopus

1542008

2 Viabilas Spermatozoa yang Dikoleksi

dari Ejakulat Duktus Deferens dan

Epididimis Kambing Kacang (Capra

capri) setelah Kriopreservasi

Natural

ISSN 1141-8513

912009

3 The effect of cigarettes smoke

exposured cause fertility of male mice

(Mus musculus)

Natural

ISSN 1141-8513

102 2010

4 Pengaruh pemberian ekstrak etanol

akar anting-anting (Acalypha indica L)

terhadap kualitas spermatozoa mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

1812010

5 Potency of java gingseng (Talinum

paniculatum Gaertn) root exttract on

quality and viability of mice sperm

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

6 The potential of jarak cina (Jatropha

multifida L) secretion in healing new-

wounded mice

Natural

ISSN 1141-8513

1112011

7 Produksi embrio kucing secara in vitro

dari spermatozoa hasil preservasi

melalui fertilisasi mikro

Jurnal Kedokteran Hewan

ISSN 0854-1159

712013

8 Efek ekstrak etanol akar anting-anting

(Acalypha indica L) terhadap Libido

mencit

Jurnal Kedokteran Yarsi

ISSN 0854-1159

2112013

9 A preliminary observation on the effect

of sperm extenders on the fertilization

and hatching rates of seurukan fish

(Osteochilus vittatus) eggs

ACCL Bioflux

ISSN 1844-9166 (online)

ISSN 1844-8143 (print)

Scopus

922016

10 The effect of equilibration time on semen

freezing of local swamp

buffalo (Bubalus bubalis) with

combination extender of lactose and

glycerol

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

DOI

1013057nusbioscin090113

912017

11 Fertilization and development of mice

(Mus musculus) embryo in vitro after

Nusantara Bioscience

ISSN 2087-3948

E ISSN 2087-3956

922017

31

supplementing the extract of Pandanus

conoideus

DOI

1013057nusbioscin090216

12 Effect of Temperature Shock on the

Triploidization Success of Seurukan Fish

(Osteochilus vittatus)

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

922017

13 Cryopreservation Of Acehnese Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Semen With

Combination of Glycerol and Lactose

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

932017

14 Utilization of Oocytes Collected From

Preserved Ovarian for In Vitro

Production of Cat Embryos

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1012018

15 Quality Enhancement of Aceh Swamp

Buffalo (Bubalus bubalis) Frozen

Semen by Supplementing β-Carotene

Tropical Animals Science

Journal

2615-790X (Online)

2615-787X (Print)

scopus

4112018

16 Potensi Ekstrak Daun Flamboyan

[Delonix regia (Boj Ex Hook) Raf]

terhadap Peningkatan Aktivitas dan

Kapasitas Makrofag

Jurnal BioLeuser

2597-6753

132017

17 Immunostimulatory Effect of

Methanol Extract of Flamboyant Leaf

[Delonix regia (Boj ex Hook) Raf] in

Mice

Jurnal Natural

1411-8513 (Print)

2541-4062 (Online)

1812018

18 Neurogenic Differentiation of Bone

Marrow Mesenchymal-Like Stem Cell

Induced by Delonix regia Flowers

Extract

Biosaintifika

p-ISSN 2085-191X

e-ISSN 2338-76109

Acredited

1022018

19 Effect of glutathione on sperm quality

after shor-term cryopreservation in

seurukan fish Osteochilus vittatus

(Ciprinidae)

Theriogenology

ISSN 0093-691X

Jurnal Internasional

1222018

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No

Nama Pertemuan

IlmiahSeminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat

1

Seminar Nasional

XXI Perhimpunan

Biologi Indonesia

Perkembangan Preimplantasi

Embrio mencit dalam Kultur

Bebas Serum

5 Maret 2012

Banda Aceh

Indonesia

32

2 Aceh veterinary

International

Adaptation Process of Simeulue

Wild Buffalo to Spermatozoa

Freezing as Aplication of

Artificial Insemination

12-13 Oktober 2015

Banda Aceh

Indonesia

3

Seminar Nasional

Masyarakat

Biodiversitas

Indonesia

Fertilisasi dan perkembangan

embrio preimplantasi mencit (Mus

musculus) secara in vitro setelah

pemberian ekstrak buah merah

(Pandanus conoideus)

17 September 2016

Bogor

Indonesia

4

The 6th Annual

International

Conference

Study of adaptation of simeuleu

wild buffallo behavior for semen

collection

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

5

The 6th Annual

International

Conference

Detection of erythrocyte

membrane protein of mice

infected plasmodium berghei by

using western blot analysis

4-6 Oktober 2016

Banda Aceh

Indonesia

6

Seminar Nasional

Biologi ke-5

Universitas Negeri

Semarang

Effect of temperature shock on the

successful of triploidization of the

Seurukan fish Osteochilus vittatus

29 Oktober 2016

Semarang

Indonesia

7

International

Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj Ex

Hook) Raf Extract on

differentiation of bone marrow

mesenchymal stem cell

proliferation

4-6 November 2016

Surakarta

Indonesia

8

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM

CELL FOR THE

FUTURE

MEDICINE FROM

BASIC TO CLINIC

2017

Alkaline Phosphatase Expression

Obtained with Mesenchymal Stem

Cells Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur 2017

Surabaya Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

- - - - -

H Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No JudulTema HKI Tahun Jenis Nomor PID

- - - - -

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya

dalam 5 Tahun Terakhir

33

No JudulTemarekayasa sosial

lainnya yang telah diterapkan Tahun

Tempat

penerapan

Respon

masyarakat

- - - - -

J Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah asosiasi atau

institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan

Institusi Pemberi Penghargaan Tahun

Darussalam 06 Juni 2018

Pengusul

Dr Kartini Eriani MSi

NIP 19700421 1999032001

mahfudhah25gmailcomgt

34

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 1

A Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr Ichsan MSc

LP 2 Jenis Kelamin L

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli IIIa

4 NIP 197710062003121001

5 NIDN 0006107704

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh 06 Oktober 1977

7 E-mail drIchsangoegmailcom

8 Nomor TeleponHP 081269201523

9 Alamat Kantor Fakultas Kedokteran UNSYIAH Jl

Kopelma Darussalam

10 Nomor TeleponFaks -

11 Lulusan yang Telah Dihasilkan S1= 2 orang S2= - S3= -

13

Mata Kuliah yg Diampu

1 Mikrobiologi

1 Fisiologi Mikroba

2 Mikologi

3 Mikrobiologi Industri

4 Pengantar Biologi

1 Bioteknologi Hewan

2 Imunobiologi

3 Parasitologi

4 Biologi Molekuler

5 Bioteknologi

2 Anatomi

3 Histologi

4 Bakteriologi

5 Imunologi

B Riwayat Pendidikan S-1 S-2

Nama Perguruan Tinggi Universitas Syiah

Kuala

Georg-August-University

Goettingen Jerman

Bidang Ilmu Pendidikan Dokter Biologi Molekuler

Tahun Masuk- Lulus 1996-2002 2006 ndash 2008

Judul

SkripsiThesisDisertasi

- Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on Ancient

Bone Material of Several

Samples

(Establishment Of The PCR)

Nama

PembimbingPromotor

- Prof Dr med Uwe Groszlig

DR phil nat Raimond Luumlgert

C Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

N

o Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jml (Juta

Rp)

1 2014 Antibiotic susceptibility profile of

microorganisms causing blood stream infection

in Indonesia 2008-2013

Mandiri -

35

2 2014 Pre Feasibility Study of Project ldquoRe-

Engineering Hospital and Health Facilities In

Selected Aceh Districtsrdquo

Swasta 300

3 2016 Induksi ekstrak etanol bunga flamboyan [

Delonix regia (boj ex hook) raf] terhadap

proliferasi dan diferensiasi sel punca

mesenkimal sumsum tulang mencit (Mus

musculus)

DRPM 50

D Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

No

Tahun

Judul Pengabdian

Pendanaan

Sumber Jumlah

(Juta Rp)

E Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume

NomorTahun

1 Identification of thymocyte subset by

multicolour flow cytometry analysis

(ED LSR II) - FACSDriva - FlowJo

software

Indonesian Journal of

Biotechnology 13 1044-

7 2089-2241

13 1044-7

2089-

22412008

2 The roles of microRNAs on

tuberculosis infection Meaning or

myth

Tuberculosis (Edinb) 93

596-605 1472-9792

93 596-605

1472-

97922013

3 Host genome polymorphisms and

tuberculosis infection What we have

to say

Egyptian Journal of Chest

Diseases and

Tuberculosis 62 173-

185 0422-7638

62 173-185

0422-

76382014

F Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

IlmiahSeminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1

DAAD-Indonesian-German-

Springschool on ldquoTropical

Medicine Infectious Diseases

and Molecular Biologyrdquo

Application of PCR ndash Tb in

ancient bones

08-22 March

2009 Goettingen

- Germany

2 International Symposium on

Moleculare Tropical Medicine

Detection Of Tuberculosis

Staphylococcus Aureus and

Salmonella Thyphi on

Ancient Bone Material of

Several Samples

(Establishment Of The PCR)

17 ndash 18 Maret

2010

UGM ndash

Yogyakarta

Indonesia

36

3 International Conference on

Biodiversity

The induction of flamboyant

flowers Delonic regia (Boj

Ex Hook) Raf Extract on

differentiation of bone

marrow mesenchymal stem

cell proliferation

4-6 November

2016

Surakarta

Indonesia

4

SYMPOSIUM amp

WORKSHOP STEM CELL

FOR THE FUTURE

MEDICINE FROM BASIC

TO CLINIC 2017

Alkaline Phosphatase

Expression Obtained with

Mesenchymal Stem Cells

Induced by Flamboyant

Flower Extract Delonix regia

(Boj Ex Hook) Raf

13-14 Agustur

2017

Surabaya

Indonesia

G Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Global Health

A Challenge for

Interdisciplinary Research

2012 406

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

047-7 )

2 Maternal Child Health

Interdiciplinary Aspects

within the Perspective of

Global Health

2013 546

(collaborative

writers)

Universitaumltsverlag

Goumlttingen

( ISBN 978-3-86395-

084-2 )

H Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir

No

JudulTema HKI

Tahun

Jenis

Nomor PID

1

2

Dst

I Pengalaman Merumuskan Kebijakan PublikRekayasa Sosial Lainnya dalam

10 Tahun Terakhir

No JudulTemaJenis Rekayasa Sosial

Lainnya yang Telah

Diterapkan

Tahun Tempat

Penerapan

Respon

Masyarakat

1

2

Dst

J Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari Pemerintah Asosiasi

atau Institusi lainnya)

No

Jenis Penghargaan Institusi Pemberi

Penghargaan

Tahun

1

2

37

Dst

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan saya sanggup menerima sanksi

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah

satu persyaratan dalam pengajuan penugasan Penelitian Lektor tahun 2018

Banda Aceh 11 Desember 2018

Pengusul

(dr Ichsan MSc)

NIP 197710062003121001

38

BIODATA ANGGOTA PENGUSUL 2

A Identitas

a Nama Lengkap Silmi Mariya

b Jenis Kelamin P

c NIP 19700212 199403 2 001

d NIK 3271055202700012

e Hp 08161138304

f E-mail mariyasilmigmailcom

g Jabatan Struktural Kepala Program Biomedis PSSP IPB

h Jabatan Fungsional Staf peneliti

i Bidang Kepakaran Kultur Sel Hewan dan Sel punca

j Institusi Asal Pusat Studi Satwa Primata IPB

k Alamat Institusi Jalan Lodaya II no 5 Bogor

l TelponFaks Institusi 0251-83136370251-8360712

m Alamat Rumah Vila Bogor Indah Blok AA6 no 36

Kedung Halang Bogor

n TelponFaks Rumah 0251-8666375

B Pendidikan

Program Sarjana Magister Doktoral Perguruan Tinggi

Asal Universitas

Pakuan Bogor

Institut Pertanian

Bogor

Institut Pertanian

Bogor Konsentrasi Ilmu Biologi Primatologi Primatologi

Tahun Lulus 2004 2010 2018 Judul Tugas Akhir

(skripsitesisdisert

asi)

Produksi

Poliklonal

Antibodi

Parvovirus asal

Telur Ayam Arab

Diferensiasi

Kardiomiosit asal

Sel punca

mesenkimal

Wharton Jelly

Monyet Ekor

Panjang

Kultur mamosfir

kelenjar susu

monyet ekor

panjang dan

responnya

terhadap

pemberian

genistein

C Pengalaman Riset 5 (lima) Tahun Terakhir (diurut berdasarkan

tahun terakhir)

Judul Riset

Tahun

Riset

(dari

dan

sampai

dengan)

Nilai

Pendanaa

n Riset

Sumber

Pendana

an Riset

Peran

Posisi

Mitra

Riset

39

The Effect of

Soy Isoflavone

on mammary

gland stem

cells for the

protection

against breast

cancer risk

2015-2018 200000000

per tahun

selama 3

tahun

Insinas Kultur sel

punca

kelenjar susu

Monyet ekor

panjang dan

uji senyawa

genisiteinAn

ggota Peneliti

Primate

Research

Center

Wake Forest

University

PENGEMBA

NGAN

KULTUR SEL

EPITEL

DAN SEL

PUNCA

KELENJAR

SUSU

BERSUMBER

JARINGAN

PAYUDARA

SATWA

PRIMATA

2015 200000000 Hibah

Publikasi

Kerjasama

Luar Negeri

Kultur sel

epitel kelenjar

susu Monyet

ekor panjang

Anggota

Peneliti

D Prestasi (yang relevan dengan judul riset)

1 Publikasi

(1) Williams JK SMariya M Furth A Atala S Soker 2013

Isolation and Characterization of Non Human Primate Amniotic Fluid-

Derived Stem Cells Research Paper Journal and Science Application

Biomedicine Vol 1 Issue 1

(2) Kamal A F Iskandriati D Dilogo I H Siregar NC Hutagalung

EU Yusuf A A Mariya S Husodo K 2013 Comparison of cultured

mesenchymal stem cells derived from bone marrow or peripheral blood

of rats Journal of Exp Itgr Med

(3) Surya M Iskandriati D Mariya S Saepuloh U Permanawati Sajuthi

D Pamungks J 2016 Primary Tupaia javanica hepatocytes culture

as in vitro replication system for ape hepatitis B viruses Vol 10 No

22016

(4) Silmi Mariya Fitriya Nur Annisa Dewi Irma Herawati Suparto

Gregory K Wilkerson J Mark Cline Permanawati Diah Iskandriati

I Nengah Budiarsa Dondin Sajuthi 2017 Mammary Gland Cell

Culture of Macaca fascicularis as a Reservoir for Stem Cells

HAYATI Journal of Biosciences 24 136 -141

40

(5) J Koudy Williams Silmi Mariya Irma Suparto 2017 Gender Age

and Differences in Stem Cell Expression and Efficacy Journal of

Stem Cell Research amp Therapeutics Volume 3 Issue 2 ndash 2017

Bogor 30 Oktober 2019

Anggota Pengusul

Dr Silmi Mariya MSi

NIP197002121994032001

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

1

ALKALINE PHOSPHATASE EXPRESSION FROM MICE MESENCHYMAL STEM 1

CELLS INDUCED BY FLOWER (Delonix regia) EXTRACT 2

3

Kartini Eriani1 Debi Anggraini1 Yudha Bintoro2 Ichsan Ichsan3 Silmi Mariya4 and Al 4

Azhar5 5

6

1Department of Biology Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Syiah Kuala Jl 7

Syech Abdurrauf No 3 Banda Aceh 23111 Indonesia 8

2Department of Molecular Biology Faculty of Medicine Abulyatama University Jl Tgk Tanoh 9

Abee Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 10

3Department of Microbiology Faculty of Medicine Univesitas Syiah Kuala Jl Tgk Tanoh Abee 11

Darussalam-Banda Aceh 23111 Indonesia 12

4Primate Research Center Bogor Agricultural University Jalan Lodaya II5 Bogor 16151 13

Indonesia 14

5Faculty of Veterinary Medicine Universitas Syiah Kuala Jl Tgk Hasan Krueng Kalee No4 15

Banda Aceh 23111 Indonesia 16

17

Corresponding author e-mail kartini_erianiunsyiahacid 18

19

ABSTRACT 20

Flamboyant flower (Delonix regia) extract can increase proliferation and differentiation 21

rates of mesenchymal stem cells into specific cells such as bone nerve and fibroblast cells The 22

extract possess metabolic compounds that may act as antibiotics anti-inflammatory antimicrobial 23

diuretic anthelmentic astringent leucorrhoea and potentially increase the bodys metabolism 24

normally This study aimed to investigate expression level of alkaline phosphatase (ALP) by mice 25

mesenchymal stem cells treated with flamboyant flower extract in vitro Here mice bone marrow 26

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

2

cell cultures were treated with flamboyant flower extracts of 06 mgml (P1) 07 mgml (P2) 08 27

mgml (P3) and 09 mgml (P4) Untreated cell culture was used as negative control (P0) 28

Expression of alkaline phosphatase gene was measured by RT-qPCR method The results showed 29

mice mesenchymal stem cell could differentiate into bone nerve and fibroblast cells The addition 30

of flamboyant flower extract range from 06-09 mgml significantly (plt005) influenced the 31

expression of alkaline phosphatase by differentiating mesenchymal stem cells The highest 32

expression was found at the stem cells treated with flamboyant flower extract of 08 mgml 013 33

times compared with control In conclusion flamboyant flower extracts treatment might increase 34

the expression of alkaline phosphatase in differentiating mesenchymal stem cells 35

36

Keywords Alkaline Phosphatase Actin Beta flamboyant flower extract qPCR 37

38

INTRODUCTION 39

Flamboyant (Delonix regia) is a medicinal plant with potential to be used as a traditional 40

medicine Previous phytochemical analysis showed that the plant contains terpenoids tannins 41

cardiac glycosides and anthroquinones that may act as antioxidants anti-diarrheals anti-42

inflammatories hepatoprotectives and antimicrobials (Singh amp Kumar 2014) Flower extract 43

contains carotenoids that function to regulate enzyme activities and communication between cells 44

as well as to provide immune response neoplastic transformation and growth control (Pryor et al 45

2000) 46

Previous studies have identified the role of flamboyant flower extract in improving human 47

health (Wang et al 2016) and in particular extracts from the flower may be beneficial in curing 48

degenerative diseases (Eriani et al 2019) In general degenerative diseases are difficult to cure and 49

the involvement of this plant can play a role in the development of new medical advances in the use 50

of stem cells to cure disease This flower extract has been predicted (Eriani et al 2019) to increase 51

the rate of cell culture differentiation in vitro The number of compounds contained in the flower 52

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

3

extract is positively correlated with the rate of cell growth within the culture medium Based on 53

morphological observations Eriani et al (2018) reported that the addition of flamboyant flower 54

extract to culture media was able to promote differentiation of mice stem cell into fibroblasts and 55

nerve like cellsThis previous research focused on determining optimal dosage of flamboyant flower 56

extract for the induction of cell culture differentiation based on morphological observation with a 57

standard microscopic method using hematoxylin eosin (HE) staining The results showed that an 58

increase in flamboyant flower extracts was able to induce cell differentiation into osteoblasts These 59

cells had a dark rounded nucleus located either on the side or at the edge of the cell Accuracy of 60

determining stem cell differentiation based on morphological evaluation however might be limited 61

by morphological similarities of different cells Additional methods are therefore needed to 62

provide more convincing results such as by examining expression of specific genes or molecules 63

involved in and required for cell division Measuring the changes in expression of these molecules 64

by actively differentiated cells could provide biochemical markers of cell differentiation 65

Alkaline phosphatase is among the molecules exhibiting increased expression at the time of 66

cell cleavage and differentiation (Singer amp Eyre 2008) This enzyme is able to accelerate the 67

formation of cell framework increase cell links and induce metabolic processes Alkaline 68

phosphatase is closely related to the regulation of cell cycle body minerals and cell growth It is 69

possible that the change in alkaline phosphatase gene expression might provide a specific molecular 70

marker for the differentiation of mesenchymal stem cell cultures induced by different dosages of 71

flamboyant flower extract Therefore this study was conducted to investigate the potential of 72

flamboyant flower extracts to induce bone cell differentiation by analyzing the expression rate of 73

alkaline phosphatase gene by the actively differentiated mesenchymal stem cells 74

75

MATERIALS AND METHODS 76

Flamboyant flower extraction 77

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

4

Flower extracts were prepared by maceration using ethanol 96 as a solvent Briefly 78

simplicia powders (500 grams) were soaked in 15 liters of ethanol 96 for three days Filtrate was 79

obtained by filtering macerate using a filter paper and stored in a bottle container at room 80

temperature The entire filtrate was concentrated using a rotary vacuum evaporator at 60 degC and 80-81

90 rpm for three days Subsequently the extracts were weighed and stored in a sealed dark 82

container 83

84

Animals 85

Animals used in this study were male mice Balb-C strain aged two months old with an 86

average body weight of 30 g The mice were kept in cages sized 48 cm x 36 cm x 13 cm containing 87

dry rice husk Food and drink were given ad libitum 88

89

Preparation of Mesenchymal Stem Cell (MSCs) cultures from bone marrow 90

Petri dishes (35 mm diameters) were coated with gelatin 01 for one hour at room 91

temperature Petri dishes were cleaned from gelatin by rinsing them in a 1x modified phosphate 92

buffer saline (mPBS) solution and dried for 5 minutes Each petri dish was then filled with 2 ml of 93

modified Dulbeccorsquos modified eaglesrsquos medium (mDMEM) and incubated at 37 degC in a 5 CO2 94

incubator for 1 hour 95

96

Isolation of primary culture of bone marrow MSCs 97

The mice were anaesthetized using a combination of 001 ml of ketamine (Troy 98

Laboratories PTY Limited) and 001 ml of xylazine (Troy Laboratories PTY Limited) All mice 99

were dissected for femur and tibia bones collection Under a sterile condition the bones were 100

cleaned from muscles washed in mPBS and cut on both the ends The bone marrows were flushed 101

out from bone cavity with mPBS using the syringe Bone marrow suspensions were collected in a 102

petri dish by repetitive pipetting and spun at 3000 rpm for 10 minutes Cell pellets were washed 103

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

5

four times with mPBS and once with mDMEM The cells were resuspended in mDMEM final 104

concentration of 1x106 and incubated for 24 hours Cells that adhered to plastic were considered as 105

mesenchymal stem cell (MSC) (Halim et al 2010) In duplicate MSC-like cells were cultured in 106

mDMEM medium supplemented with D regia extracts of 0 (mv) (control) 04 (mv) (P1) 107

06 (mv) (P2) and 08 (mv) (P3) and 09 (mv) (P4) Cell mixtures were then incubated at 37 108

degC in a 5 CO2 incubator for 7 days with mDMEM replacement every two days On day 8 cell 109

pellets were harvested and subjected for RNA analysis by using RT-PCR 110

111

RNA Analysis 112

RNA isolation was performed using ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System (Promega 113

Z6011) In brief cell cultures was transferred to a 15 ml micro-tube and spun at 300 rpm for 5 114

minutes Cell pellets were washed in a sterile cold PBS and spun at 300 rpm for 5 mins 115

Supernatants were added with BL and TG buffers (250 microl each) and mixed by short vortexing 116

Isopropanol 85 microl was added to the mixture and homogenized by short vortexing All solution was 117

transferred to a minicolumn (in a collection tube) and spun at 14000 pm for 10 minutes After 118

discarding filtrate minicolumn was put back to the collection tube added with 500 microl of RNA Wash 119

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 30 seconds DNase I incubation (30 microl) was added to 120

minicolumn and incubated at 20-25 degC for 15 mins The column was added with 200 microl of Wash 121

Solution and spun at 12000-14000 rpm for 15 seconds RNA Wash Solution (500 microl) was added 122

dan the column was respun at 12000-14000 rpm for 30 seconds The minicolumn was transferred 123

to a new collection tube added with 300 microl of RNA Wash Solution and spun at 14000 for 2 mins 124

Minicolumn was transferred to a new elution tube added with 30 microl of nuclease-free water and 125

spun at 14000 rpm for 1 min Purified RNA obtained was stored at -70 degC 126

127

cDNA Synthesis 128

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

6

The cDNA formation process was performed using the GoScript Reverse Transcription 129

System (Promega A5000) Here a RNA reaction mixture was prepared by mixing 1 microl of RNA 130

sample 01 microl of random primer and 39 microl nuclease free water and heated at 70 degC for 5 minutes 131

Reverse transcription reaction mixture was prepared by mixing 4 microl of GoScriptTM5 reaction buffer 132

12 microl of MgCl2 1 microl of PCR nucleotide mix 05 microl of RNasin ribonuclease inhibitor recombinant 133

1 microl of GoScriptTM reverse transcriptase and 73 microl of nuclease free-water Reverse transcription 134

master mix 15 microl was added to each reaction sample reverse transcription reaction was run using a 135

BioRad thermal-cycler at the following condition annealing at 25degC for 5 mins extension at 37degC 136

for 1 hour and reverse transcriptase inactivation at 70 degC for 15 mins The cDNA solutions 137

obtained were stored at -20 degC 138

139

qPCR master mix preparation 140

The RT-qPCR process is performed using the GoTaqreg qPCR Master Mix (Promega 141

A6001) Briefly a 25 μl reaction mixture was prepared by mixing 125 microl of GoTaqreg qPCR master 142

mix 75 microl of nuclease free-water 2 microl of each primer and 3 microl of cDNA samples The qPCR 143

reaction was run at a Biorad RT-PCR machine Alkaline phosphatase primers used were 5-144

CAGACCCTCCCCACGAGT-3 (forward) and 5-GTCTTGGAGAGGGCCACAAA-3 (reverse) 145

Beta actin gene amplified using forward primer 5-ATGAAGATCCTGACCGAGCG-3 and reverse 146

primer 5-TACTTGCGCTCAGGAGGAGGC-3 was use as a reference 147

148

Ethics 149

This research used the protocols approved by the Research Ethics Committee of the Faculty 150

of Veterinary Medicine Syiah Kuala University 151

152

Statistical Analysis 153

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

7

Data of gene expression was statistically analyzed using unpaired singe tailed t-test with 154

level of significance of 005 155

156

Bioinformatics Analysis 157

Primary prediction of alkaline phosphatase were analyzed in silico to see RT-qPCR 158

amplification optimization using online resources namely httpgenatlasmedecineuniv-paris5fr 159

and httpprimer3pluscomcgibindevprimer3pluscgi 160

161

RESULTS AND DISCUSSION 162

Stem cell differentiation 163

Microscopic analysis showed morphological characteristics of cells differentiated from 164

mesenchymal stem cells (Figure 1-2) Three cells might differentiate from the mice originated bone 165

marrow stem cells were fibroblasts nerve cells and bone cells As shown in Figure 1A-B fibroblast 166

like cells had morphology characteristic of branching in cytoplasm oval-shaped large-pore and 167

pale oval cores accumulated by rough endoplasmic reticulum Most fibroblasts have components of 168

collagen fibers that function to maintain the integrity of cell membranes 169

Morphologically cells resemble to nerve cells had cytoplasmic elongations in some parts 170

and a centrally located nucleus These protein-rich cells normally play important roles in electrical 171

polarization of cells by forming a synapse bridge along neurons for signal transduction Young 172

nerve cells had more cytoplasmic components but relatively short streaks The development of 173

young nerve cells into mature nerve cells required many organic components especially proteins 174

that are important for maintaining integrity of cell membrane This is contrast to adult nerve cells 175

that already have a relatively stable cytoplasmic volume and many axons and dendrites 176

accompanied by long 177

Morphological characteristics of bone cells are similar to that of osteoblasts namely round 178

shaped cells have a large centrally located nucleus (Figure 2) The transformation phase of 179

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

8

osteoblast cells into osteocytes was accompanied by decreased cell diameter cytoplasm elongation 180

less bulky apparatus and reticular endoplasmic reticulum but had more lysosomes compared to 181

osteoblasts 182

183

184

185

Figure 1 Morphology of fibroblast and nerve like cells in culture media Above images show 186

fibroblast cell nucleus (A) and cytoplasmic elongation (B) Bottom images showed 187

morphology of young (C-1) and adult nerve cells (C-2) a Cell nucleus b Cytoplasma c 188

Axon 189

190

The expression of alkaline phosphatase gene 191

To provide more accurate cell differentiation validation one osteoblast differentiated from 192

mesenchymal stem cells was subjected to RT-qPCR method for quantification of alkaline 193

phosphatase (ALP) gene expression Previous studies on osteoblast formation indicated that ALP is 194

progenitor of osteoblast cell development (Singer amp Eyre 2008)5 Here beta actin mRNA was used 195

as a positive control for gene expression The results showed that ALP gene amplification was seen 196

through the PCR amplification curve of osteoblast differentiated from mice MSCs treated with all 197

four doses (06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml) of flamboyant flower extracts (Figure 198

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

9

3A-C) The highest ALP expression occurred at cells treated with flamboyant flower extract 08 199

mgml (Figure 4) 200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

Figure 3 The qPCR amplification of ALP gene expressed by mice MSCs treated with D regia 217

flower extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml The blue and purple 218

curves show the expression of alkalin phosphatase (ALP) and beta actin genes 219

respectively A Melting peak of DNA template B Melting curve of DNA template and 220

C Amplification cycle starts from cycle 20 to 36 221

222

As illustrated in Figure 3-C the ALP amplicons were formed in cycle 36 and that of beta-223

actin was amplified in cycle 20 Amplification of ALP started at cycle 30 whereas that of beta actin 224

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

10

began at cycle 20 Melting peak of amplification curves (Figure 3-A) indicated variation in 225

temperature requirements for elongation (annealing) of the two protein DNAs Melting peak of beta 226

actin amplification was about 85 C and those of ALP ranged from 75-85 C 227

228

229

Figure 4 Level of ALP expression among stem cells treated with different doses of flamboyant 230

flowers extract 231

232

This study is an early stage performed to find out potential use of alkaline phosphatase 233

(ALP) as a specific marker for successful mesenchymal stem cells differentiation induced by 234

flamboyant flower extract Systematically preliminary studies were done to investigate effects of 235

flamboyant flower extract on mesenchymal stem cell differentiation based on morphological 236

observation Standard microscopic examination using hematoxylin eosin (HE) staining protocol 237

showed that the administration of flamboyant flower extract in the concentrations ranged from 06-238

09 mgml successfully induced the differentiation of mice mesenchymal stem cells into fibroblast 239

nerve cell-like cells and bone cell-like cells (Figure 1-2) The results obtained therefore support 240

findings previosly reported by Eriani et al (2018) that flamboyant flower extract was able to induce 241

the differentiation of mice bone marrow originated mesenchymal stem cells into fibroblast and 242

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

11

nerve cells The study presented additional data about potential of the extract to stimulate 243

differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into bone cells 244

Next moleculer analysis was done to validate cell differentiation and to identify to potential 245

of alkaline phosphatase (ALP) as a molecular marker for bone stem cells differentiation This was 246

done by qPCR using forward and reverse primers specific for ALP gene Samples used were mRNA 247

extracted from fibroblast differentiated from mesenchymal stem cells Beta actin DNA amplified 248

using appropriate primers was used as positive control The approach successfully observed ALP 249

expression in all treatment groups (Figure 3A-C) Mesenchymal stem cells treated with flamboyant 250

flower extracts of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml expressed 009 013 023 and 251

012 times alkaline phosphatase more than that of untreated controls These were significant 252

(plt005) compared to that of negative control The best treatment for the highest ALP expression 253

was the administration of 08 mgml flamboyant flower extracts (Figure 4) Altogether results 254

obtained showed potential of ALP as the specific marker for mesenchymal stem cells differentiation 255

into osteoblast cells 256

Most celullar biological processes in the body require the involvement of chemical 257

metabolites encoded gene and related pathways During differentiation process several molecular 258

messengers are synthesized to initiate the cascade of cell formation The OKTO4 SSEA3 SSEA4 259

SSEA1 TRA-1-60 and TRA-1-81 are among molecules play important roles in cell differentiation 260

[10] Previous study using human embryonic stem cell found increased synthesis of OCT4 261

NANOG ALP and stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) during cell differentiation in vitro 262

(OrsquoConnor et al 2008)[10] Therefore differentiation of mesenchymal embryonic and 263

hematopoeietic stem cells might be traced based on the presence of these signaling molecules in 264

cells 265

Activation of these so called transcriptional factors might accelerate differentiation process 266

initiate cell division and speed up cellular metabolisms Mediator 1 (Med1) for example was able 267

to induce Noct1 signal stimulates the transcription of alkaline phosphatase gene probably by 268

Commented [D1] Apakah ini sama dengan OCT4 di bawah Apakah masing-masing singkatan ini tidak diberi kepanjangannya

Commented [D2] OKTO4

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

12

facilitating the interaction between transcription factors and RNA polymerase The importance of 269

Med1 in the formation and differentiation control of most cells including hematopoietic cells lumen 270

cells and epidermal tissue keratine has been reported (Yue et al 2011)[9] 271

Alkaline phosphatase is one of molecules plays an important role in the growth and 272

differentiation of bone cells digestive system organs and tissue formation Under normal 273

conditions concentration of alkaline phosphatase appears to incease in the formation of ATP 274

osteoblast immune response and food digestive organs as well as in cell division Increased ALP 275

expression proportional to exponential increases of bacterial populations indicated its function as 276

one of important factors for cell growth (Behera et al 2017[7] The enzyme belongs to 277

orthophosporic monoester phosphohydroxylase family was almost detectable in all parts of the 278

bodyrsquos developing cells (Pramanik et al 2016)[6] Molecular examination detects ALP presence in 279

the newborn serum placenta renal plasma pregnant women and gastrointestinal organs (Behera et 280

al 2017)[7] 281

The involvement of ALP in phosphate regulation and other chemicals metabolism as well as 282

in regulating activity of cells tissues and organs has been reported At the beginning of cell 283

development ALP concentration increases to meet cellular requirement for active bone and teeth 284

mineralizations The formation of cell frameworks becomes more robust and important to enhance 285

cell integrity essential for the continuity of metabolic processes of living cells At the end of 286

differentiation cellular ALP decreases because the enzyme is degraded into simple compounds that 287

then excreted into body circulation One study reported that ALP concentration decreases to near 288

normal when healing process of fractures was near perfect indicating a complete calcification 289

(OrsquoConnor et al 2008) [10] 290

The ability of flamboyant flower extract given to induce and activate growth factors might 291

be related to chemicals content of the plant Flamboyant flower extract contains auroxantine 292

mutatochrome and pyruvic acid that serve as diurectic anthelmintic astrigent and leucorrhoea 293

medications According to Jahan et al (2010) lupeol epilupeol β-sitosterol stigmasterol and p-294

Commented [D3] Tolong dicek ulanghellip

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

13

methoxybenzaldehyde from flamboyant flower extracts can suppress microbial populations and 295

degrade toxic properties of chemical compounds High concentration of the extract however might 296

be toxic Administration of 28 mgml of flamboyant flower extract affects the density of 297

Plasmodeum breghei in vivo [8] 298

Results of analysis on the formation of melting peak curves showed that in samples test of 299

U1 U2 U3 and U4 there were osteoblast cells because the sigmoideal graph of melting peak curve 300

existed above threshold base line whereas osteoblast cells were negative in control sample (U0) 301

Selain itu it can be said that cells that morphologically resemble to osteoblast cells in MSCs treated 302

to D regia extract of 06 mgml 07 mgml 08 mgml and 09 mgml were osteoblast cells based 303

on gene expression whereas in control sample that also morphologically showed osteoblast presence 304

was categorized negative based on gene expression These explained that methanol extract of D 305

regia flower was able to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast as shown 306

by a detectable ALP gene 307

Among chemicals contained in the flower of D regia that were able to trigger osteoblast 308

differentiation is flavonoid as reported by Zhang et al (2008) that flavonoid compounds could 309

trigger osteoblast differentiation so that the application of the extract in appropriate doses might be 310

able to make MSCs differentiate into osteoblast In addition flamboyant plant belongs to legumes 311

from the Fabacea family that was predicted to have phytoestrogen a compound resembles to 312

estrogen Important phytoestrogens contained in the flamboyant flowers are isoflavonoids named 313

genistein and daidzein Genistein could stimulate differentiation of bone marrow stem cells into 314

osteoblast The differentiation occurs due to increased Cbfa-1 (Ducy 2000) and transforming 315

growth factor beta-1 (TGF-1)(Heim et al 2004) Cbfa-1 is a transcriptional factor in the 316

differentiation of progenitor cells into osteoblast and plays a role in controlling developmental 317

differentiation and maturation processes of osteoblast (Ducy 2000) The TGF-1 regulates gene 318

transcription in cells via receptor signaling (Roberts et al 1990) Ogita et al (2008) reported that 319

genistein and daidzein also could enhance osteoblast proliferation via protein synthesis by 320

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

14

controlling the synthesis of Cbfa-1 and bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Federici et al 321

2004) 322

Study performed by Eriani et al (2018) that also used ethanol extract of D regia flowers 323

found morphologically osteoblast like cells differentiated from mice bone marrow mSCs treated by 324

D regia ethanol extract of 08 mgml Based on the results of this study therefore it can be 325

assumed that ethanol extracts of D regia flowers 08 mgml and 09 mgml were proved to be able 326

to induce proliferation and differentiation of MSCs into osteoblast Based on aforementioned 327

information ethanol extract of D regia flower in the doses of 08 mgml and 09 mgml can be used 328

as induction factors for MSCs proliferation and differentiation into osteoblast in the culture media 329

The osteoblast cells resulted might be applied in stem cell therapy for osteoporotic patients in the 330

future 331

332

Potential conflicts of interest 333

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article 334

335

CONCLUSIONS 336

The study showed that administration of flamboyant flower (D regia) extracts ranged from 337

06-09 mgml (mv) successfully induced differentiation of mice originated bone marrow 338

mesenchymal stem cells into fibroblast nerve and bone cells The potential use of alkaline 339

phosphatase gene as specific marker for mesenchymal stem cell differentiation in vitro was showed 340

by significant increased (plt005) of gene expression by the treated cells compared to that by 341

untreated control cells 342

343

ACKNOWLEDGEMENTS 344

345

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

15

This research was supported by the Research Institute of Universitas Syiah Kuala through 346

Lector Research Grant (Contract Number 522UN11SPKPNBP2019) 347

348

REFERENCES 349

Singh S Kumar NS 2014 A Review Introduction to Genus Delonix WorldJ Pharmacy 350

Pharmaceut Sci 3(6) 2042-2055 351

Pryor WA Stahl W and Rock CL 2000 Beta carotene from biochemistry to clinical trials Nutr 352

Rev 58 39-53 353

Kurniawati Y Adi S Achadiyani Suwarsa O Erlangga D and Putri T 2015 Culture of primary 354

fibroblast A preliminary research Artikel Penelitian 38(1) 34 355

Singer FR Eyre DR 2008 Using biochemical markers of bone turnover in clinical practiceCleve 356

Clin J Med75(10)739-50 357

Wang LS Lee CT Su WL Huang SC and Wang SC 2016 Delonix regia Leaf Extract (DRLE) A 358

Potential Therapeutic Agent for Cardioprotection Plos One PLOS ONE 359

|DOI101371journalpone0167768 December 9 201 360

361

362

363

364

Article within a journal 365

Andrade CC Young KI Johnson WL Villa ME Buraczyk CA Messer WB Hanley KA 2016 366

Rise and fall of vector infectivity during sequential strain displacements by mosquito-borne 367

dengue virus J Evol Biol292205-18 368

Zhang J 2016a Coinfection with type 1 and type 2 PRRSV Vet Rec 178(12)288-90 369

Zhang J 2016b Porcine deltacoronavirus Overview of infection dynamics diagnostic methods 370

prevalence and genetic evolution Virus Res 22671-84 371

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

16

Article within a journal supplement 372

Meharena HS Fan X Ahuja LG Keshwani MM McClendon CL Chen AM hellip Taylor SS 2016 373

Decoding the interactions regulating the active state mechanics of eukaryotic protein 374

kinases PLoS Biol Suppl1-23 375

In press article 376

Voong LN Xi L Sebeson AC Xiong B Wang JP Wang XZ Insights into nucleosome 377

organization in mouse embryonic stem cells through chemical mappingCell in press 378

Published abstract 379

Rijsdijk KF de Louw PGB Meijer HJM Claessens LPAM Florens FBV Baider C hellip de Boer EJ 380

2016 Restoring and conserving the remains of the ecosystem of the Dodo lessons from a 381

4200 year old multitaxic bone bed [Abstract]Island Biology 2016 279-80 382

Article within conference proceedings 383

Cao H Guo W Qin H Xu M Lehrman B Tao Y Shugart YY 2016 Integrating multiple genomic 384

data sparse representation based biomarker selection for blood pressure In Rowles T 385

editor BMC proceedings 2016 Genetic analysis workshop 19 p 283-8 386

Tran Q Gao S Vo NS Phan V 2016 Repeat complexity of genomes as a means to predict the 387

performance of short-read aligners In BICOB 2016Proceedings 2016 Apr 6-4 Las Vegas 388

Winona (US) International Society for Computers and Their Applications (ISCA) p 135-389

42 390

Book chapter or article within a book 391

Faith DP 2016 The PD phylogenetic diversity framework linking evolutionary history to feature 392

diversity for biodiversity conservation In Pellens R Grandcolas P editors Biodiversity 393

Conservation and Phylogenetic Systematics Cham (ZG) Springer International Publishing 394

p 39-56 395

Complete book 396

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

17

Reddy PP 2016 Sustainable intensification of crop production Singapore (SG) Springer 397

Singapore 398

Monograph or book in a series 399

OrsquoToole D Sondgeroth KS 2016 Histophilosis as a natural disease InHistophilussomni Edited 400

by Inzana TJ Cham (ZG) Springer International Publishing p15-48 [Compans RW 401

Honjo T et al (Series Editors) Current Topics in Microbiology and Immunology Vol 402

396] 403

Book with institutional author 404

Food and Agriculture Organization 2016 The State of Food and Agriculture 2016 (SOFA) 405

Climate change agriculture and food security Rome (IT) Food and Agriculture 406

Organization of the United Nations 407

Dissertation 408

Ayloo S 2016 Molecular and cellular approaches toward understanding dynein-driven motility 409

[Dissertation] Retrieved from University of Pennsylvania Repository (Paper 410

AAI10124524) 411

Electronic Journal Article with DOI 412

Morzillo AT Kreakie BJ Netusil NR Yeakley JA Ozawa CP Duncan SL 2016 Resident 413

perceptions of natural resources between cities and across scales in the Pacific Northwest 414

Ecol Soc [Internet] [cited 2016 Nov 30] 21(3)14 Available from 415

httpwwwecologyandsocietyorgvol21iss3art14 doi 105751ES-08478-210314 416

Electronic Journal Article Non DOI 417

Hamzah A Hapsari RI Wisnubroto EI 2016 Phytoremediation of cadmium-contaminated 418

agricultural land using indigenous plants Int J Environ Agric Res [Internet] [cited 2016 419

Dec 20] 2(1)8-14 Available from httpwwwijoearcomPaper-January-2016IJOEAR-420

JAN-2016-2pdf 421

Webpage 422

Flower Delonix regia extract in induced alkaline phosphatase expression

18

Michigan State University [Internet] 2016 Just add water New discovery in plant-disease 423

mechanism Rockville US ScienceDaily [updated 2016 Nov 23 cited 2016 Dec 10] 424

Available from httpswwwsciencedailycomreleases201611161123140238htm 425

Webpage with Personal Author 426

Cowie S [Internet] 2016 The Pantanal is national heritage protecting the worlds largest wetlands 427

London (UK) TheGuardiancom [updated 2016 Nov 12 cited 2016 Dec 22] Available 428

from httpswwwtheguardiancomglobal-development-professionals-429

network2016nov12pantanal-conservation-wetlands-brazil-paraguay-bolivia 430

Lampiran 3 Foto Kegiatan

Page 22: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 23: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 24: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 25: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 26: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 27: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 28: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 29: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 30: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 31: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 32: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 33: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 34: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 35: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 36: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 37: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 38: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 39: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 40: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 41: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 42: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 43: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 44: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 45: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 46: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 47: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 48: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 49: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 50: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 51: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 52: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 53: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 54: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 55: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 56: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 57: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 58: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 59: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 60: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 61: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 62: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …
Page 63: IDENTIFIKASI EKSPRESI GEN SEL TULANG HASIL …